CN117887744A - 用靶向密封蛋白18.2的嵌合抗原受体治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及使用靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体T细胞和/或抗原结合结构域治疗癌症的组合物和方法。

Description

用靶向密封蛋白18.2的嵌合抗原受体治疗癌症的组合物和 方法
发明背景
技术领域
本披露涉及使用嵌合抗原受体T细胞来治疗癌症。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是特定形式的基于细胞的免疫疗法，该免疫疗法使用工程改造的T细胞对抗癌症。在CAR T细胞疗法中，直接从患者的血液(自体)或从经修饰的供体来源细胞(同种异体)中收获T细胞，进行离体工程改造以表达含有抗原结合结构域和T细胞激活结构域(例如包含一个或多个共刺激结构域)的CAR，扩增至更大群体，并施用于患者。CAR T细胞用作结合至癌细胞并引起这些癌细胞的破坏的活的药物。当成功时，CART细胞治疗的作用往往会持续很长时间，如通过在临床缓解后很长时间在患者中检测CAR T细胞的持久性和扩增所证明的。
CAR的抗原结合结构域是靶向肿瘤细胞上的表面抗原的胞外区域。合适的靶抗原可以是蛋白质、磷酸化蛋白质、肽-MHC、碳水化合物、或糖脂分子。理想的靶抗原在肿瘤细胞上广泛表达，以能够靶向高比例的癌细胞，并在正常组织上表现出限制性表达，以限制肿瘤外毒性。CAR的抗原结合结构域负责指导T细胞介导的细胞毒性，并且通常由一种或多种对预期靶标具有特异性的抗体或抗体样靶向部分(例如抗体单链可变片段(scFv))构成。
CAR的T细胞激活结构域位于胞内，并响应抗原和抗原结合结构域的相互作用而激活T细胞。T细胞激活结构域可以包含一个或多个共刺激结构域，这些共刺激结构域是已知的激活性T细胞受体的胞内结构域，对于在抗原接合时驱动次级信号至CAR-T是必需的。胞内T细胞受体共刺激结构域(例如CD28或4-1BB的结构域)的掺入增强CAR-T的增殖和细胞因子分泌。CAR-T还可以掺入另外的修饰，例如多个共刺激结构域或分泌细胞因子的能力，以增强CAR-T细胞的持久性。由于共刺激结构域对CART细胞动力学、细胞毒性功能、和安全特性具有不同的影响，因此CAR构建体内的共刺激结构域的选择和位置会影响CAR T细胞的功能和命运。
CAR的胞外抗原结合结构域和胞内T细胞激活结构域通过跨膜结构域、铰链、和任选地间隔子区连接。铰链结构域是提供构象自由度以促进与肿瘤细胞上的靶抗原结合的短肽片段。它可单独使用或与设计scFv远离T细胞表面的间隔子结构域结合使用。间隔子的最佳长度取决于结合表位与细胞表面的接近度。CAR-T设计还可以包括对跨膜和铰链区的修饰，使CAR-T的持久性和对表达低抗原的细胞的反应性发生改变(Majzner Cancer Discov[癌症发现],2020年5月；10(5):702-72)。
自首次批准用于针对B淋巴细胞抗原CD19的CAR T疗法(诺华公司(Novartis))以来已经有好几年，该疗法和其他CD19 CAR-T已在小儿急性淋巴细胞性白血病、复发性或难治性非霍奇金淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中显示出有希望的临床功效(J Hematol Oncol Pharm.[血液肿瘤药物杂志]2022；12(1):30-42)。随着使用Abecma首次证明靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR-T细胞对复发性/难治性多发性骨髓瘤的临床功效，随后Carvykti于2022年获得批准，目前市场上有6种获批的CAR-T产品(Leukemia[白血病]第36卷,第1481-1484页,2022)。
最近的数据表明，CAR方法可对实体瘤有效。双唾液酸神经节苷脂2(GD2)CAR自然杀伤T细胞(NKT)疗法已显示出对神经母细胞瘤的活性(Heczey A，Nature Medicine[自然医学]第26卷,第1686-1690页,2020年)。此外，GD2 CAR-T已在儿科神经母细胞瘤患者中证明了临床功效和可控的毒性谱(Journal of Cancer Research and Clinical Oncology[癌症研究和临床肿瘤学杂志](2022)148:2643-2652)。靶向间皮素的CAR-T疗法与派姆单抗联合在恶性胸膜间皮瘤患者中显示出抗肿瘤活性和安全性(Cancer Discov[癌症发现],2021,11月11日(11):2748-2763)。CLDN18.2靶向性CAR-T的I期临床试验的中期分析表明，与胃癌三线治疗中使用的其他治疗方法相比，这些CAR-T具有良好的耐受性，并且具有良好的抗肿瘤功效(Nature Medicine[自然医学]第28卷,第1189-1198页(2022))。其他临床研究正在进行评估CAR-T疗法在各种实体瘤适应症中的安全性和功效，包括针对以下的CAR-T临床试验：GPC3(肝细胞癌，Front.Oncol.[肿瘤学前沿],2022年2月16日)、CLDN6(睾丸癌，JImmunother Cancer[免疫疗法与癌症杂志]2021；9(增刊2):A1-A1054)和PSMA(转移性去势抵抗性前列腺癌，Nat Med[自然医学]2022年4月,28(4):724-34)。然而，要想在实体瘤情况中取得成功，需要鉴定新靶标、优化CAR-T设计和制造。
遗憾的是，基于CAR T细胞的疗法的复杂性可能导致不希望的和不安全的作用。肿瘤外的作用，如神经毒性和急性呼吸窘迫综合征，是CAR T细胞疗法的潜在不良作用并且可能致命。细胞因子释放综合征(CRS)是与CAR T细胞相关的最常见的急性毒性。当淋巴细胞被高度激活并释放出过量的炎性细胞因子时，发生CRS。当测定这些因子时，有时在患有CRS的患者中观察到白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素1β、GM-CSF和/或C反应蛋白的血清升高。CRS按严重性分级并诊断为1-4级(轻度至重度)之一，其中更严重的病例的临床特征为高烧、低血压、缺氧和/或多器官毒性。一项研究报道，用抗CD19 CAR-T细胞疗法治疗的急性淋巴细胞性白血病患者中有92％经历CRS，并且50％的这些患者出现了3-4级的症状。
因此，需要另外的基于CAR T细胞的疗法以增强有效癌症治疗的医疗设备，特别是在实体瘤情况中。然而，必须设计出有效治疗癌症、同时将发生危险炎症反应(如CRS)的风险降至最低的新CAR T细胞疗法。
发明内容
本披露描述了使用CAR T细胞来治疗癌症的组合物和方法。
如下所述，在第一方面，本披露提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中该CAR包含：
(a)密封蛋白18.2(CLDN18.2)特异性的抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)一个或多个胞内结构域。
在分离的核酸序列的一些实施例中，抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、单链可变片段(scFv)、单链抗体、VHH、vNAR、纳米抗体(单结构域抗体)或其任何组合。在某些实施例中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
在分离的核酸序列的一些实施例中，抗原结合结构域是包含选自SEQ ID NO:9、19、29、39和49的氨基酸序列的scFv。
在分离的核酸序列的一些实施例中，跨膜结构域包含选自CD4、CD8α或CD28的跨膜结构域的跨膜结构域。在某些实施例中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
在分离的核酸序列的一些实施例中，一个或多个胞内结构域包含共刺激结构域或其一部分。在某些实施例中，共刺激结构域包含CD3z、CD2、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、IL-2Rβ、GITR、MyD88/CD40a共刺激结构域和/或其变体中的一种或多种。在实施例中，胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和CD28共刺激结构域。在实施例中，胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。在实施例中，胞内结构域包含CD3z共刺激结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
在分离的核酸序列的一些实施例中，CAR进一步包含铰链/间隔子结构域，任选地，其中铰链/间隔子结构域位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在某些实施例中，铰链/间隔子结构域包含IgG1铰链结构域或其变体、IgG2铰链结构域或其变体、IgG3铰链结构域或其变体、IgG4铰链结构域或其变体、IgG4P结构域、CD8铰链结构域或其变体或CD28铰链结构域或其变体。在某些实施例中，铰链/间隔子结构域是IgG4铰链/间隔子或其变体，任选地是包含S241P突变的IgG4P铰链/间隔子。
在分离的核酸序列的一些实施例中，核酸序列编码具有如SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的CAR，任选地其中核酸序列如SEQ ID NO:51中所示。
在分离的核酸序列的一些实施例中，核酸序列进一步包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸序列，任选地其中该装甲结构域位于编码CAR的核酸的3’末端或编码CAR的核酸的5’末端。在某些实施例中，装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。在实施例中，装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。在某些实施例中，装甲分子包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在实施例中，显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO:54的序列，任选地其中编码dnTGFβRII的装甲结构域具有如SEQ ID NO:53中所示的序列。
在分离的核酸序列的一些实施例中，CAR和装甲结构域在单个启动子的控制下可操作地连接。在分离的核酸序列的一些实施例中，CAR和装甲结构域通过内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。在分离的核酸序列的一些实施例中，CAR和装甲结构域通过编码可切割肽接头的核苷酸序列连接。在某些实施例中，可切割肽接头是自切割肽接头。在实施例中，可切割肽接头包含T2A肽。
在分离的核酸序列的一些实施例中，核酸序列编码选自SEQ ID NO:55、10、20、30、40和50的序列。
在第二方面，本披露提供了包含抗原结合结构域的抗CLDN18.2嵌合抗原受体(CAR)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab、或scFv；
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，VH包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，VL包含选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，CAR包含跨膜结构域和一个或多个胞内结构域。在某些实施例中，跨膜结构域包含选自CD4、CD8α或CD28的跨膜结构域的跨膜结构域。在实施例中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，一个或多个胞内结构域包含共刺激结构域或其一部分。在某些实施例中，共刺激结构域包含CD3z、CD2、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、IL-2Rβ、GITR、MyD88/CD40a共刺激结构域和/或其变体中的一种或多种。在实施例中，胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和CD28共刺激结构域。在实施例中，胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。在实施例中，胞内结构域包含CD3z共刺激结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，CAR进一步包含铰链/间隔子结构域，任选地，其中铰链/间隔子结构域位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在某些实施例中，铰链/间隔子结构域包含IgG1铰链结构域或其变体、IgG2铰链结构域或其变体、IgG3铰链结构域或其变体、IgG4铰链结构域或其变体、IgG4P结构域、CD8a铰链结构域或其变体或CD28铰链结构域或其变体。在某些实施例中，铰链/间隔子结构域是IgG4铰链/间隔子或其变体，任选地是包含S241P突变的IgG4P铰链/间隔子。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，CAR具有如SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，CAR进一步包含装甲分子。在某些实施例中，装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。在实施例中，装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。在某些实施例中，装甲分子包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在实施例中，显性负性II型TGFβ受体包含SEQID NO:54的序列。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，CAR和装甲分子通过编码可切割肽接头的核苷酸序列连接。在某些实施例中，可切割肽接头是自切割肽接头。在实施例中，可切割肽接头包含T2A肽。
在抗CLDN18.2 CAR的一些实施例中，CAR包含选自SEQ ID NO:56、10、20、30、40和50的氨基酸序列。
在第三方面，本披露提供了包含本文披露的分离的核酸序列或编码本文披露的嵌合抗原受体的载体，任选地其中该载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统，任选地其中该载体是慢病毒。
在第四方面，本披露提供了包含本文披露的载体的细胞。
在第五方面，本披露提供了包含编码本文披露的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的细胞，优选地其中该细胞包含编码氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示的CAR的核酸序列和编码序列如SEQ ID NO:54所示的显性负性II型TGFβ受体的核酸，任选地其中编码CAR的核酸序列如SEQ ID NO:51所示并且编码显性负性II型TGFβ受体的序列如SEQ ID NO:53所示。
在第六方面，本披露提供了包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab或scFv；
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
在包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞的一些实施例中，VH包含选自SEQID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。
在包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞的一些实施例中，VL包含选自SEQID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
在包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞的一些实施例中，CLDN18.2特异性抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:52中所示的序列。
在包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞的一些实施例中，细胞进一步包含装甲分子。在某些实施例中，装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。在实施例中，装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。在某些实施例中，装甲分子包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在实施例中，显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO:54的序列。
在包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞的一些实施例中，细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞和调节性T细胞。
在包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞的一些实施例中，细胞在与表达CLDN18.2的肿瘤细胞接触后表现出抗肿瘤免疫性。
在第七方面，本披露提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括：
向有需要的受试者施用有效量的细胞，该细胞包含含有抗原结合结构域的抗CLDN18.2嵌合抗原受体(CAR)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab、或scFv，
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
在治疗癌症的方法的一些实施例中，该方法进一步包括抑制肿瘤生长、诱导肿瘤消退、和/或延长受试者的存活。
在治疗癌症的方法的一些实施例中，细胞是自体细胞。在某些实施例中，自体细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞和调节性T细胞。
在治疗癌症的方法的一些实施例中，癌症是实体瘤。在某些实施例中，实体瘤是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。在实施例中，实体瘤是胰腺癌。
在第八方面，本披露提供了一种特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合部分，其包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)，其中该VH包含VH互补决定区(CDR)1、VH-CDR2、VH-CDR3；且其中该VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中
(a)该VH-CDR1包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列；
(b)该VH-CDR2包含选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列；
(c)该VH-CDR3包含选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列；
(d)该VL-CDR1包含选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列；
(e)该VL-CDR2包含选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列；和
(f)该VL-CDR3包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列。
在抗体或抗原结合部分的一些实施例中：
(a)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列；
(b)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ IDNO:12中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列；
(c)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ IDNO:22中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列；
(d)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ IDNO:32中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列；或
(e)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ IDNO:42中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列。
在抗体或抗原结合部分的一些实施例中，VH包含与选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在抗体或抗原结合部分的一些实施例中，VH包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。
在抗体或抗原结合部分的一些实施例中，VL包含与选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在抗体或抗原结合部分的一些实施例中，VL包含选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
在抗体或抗原结合部分的一些实施例中：
(a)该VH包含与SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(b)该VH包含与SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(c)该VH包含与SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(d)该VH包含与SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)该VH包含与SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在抗体或抗原结合部分的一些实施例中：
(a)该VH包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列；
(b)该VH包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列；
(c)该VH包含SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列；
(d)该VH包含SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列；或
(e)该VH包含SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列。
在第九方面，本披露提供了一种药物组合物，其包含如权利要求1至26中任一项所述的分离的核酸、如权利要求27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如权利要求51所述的载体、如权利要求52至64中任一项所述的细胞，或如权利要求72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的赋形剂。
在第十方面，本披露提供了治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用本文披露的分离的核酸、本文披露的抗CLDN18.2 CAR、本文披露的权利要求载体、本文披露的细胞、本文披露的抗体或其抗原结合部分、或本文披露的药物组合物。在某些实施例中，疾病或病症包括癌症。
在一些方面，本披露提供了治疗有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用本文披露的分离的核酸、本文披露的抗CLDN18.2 CAR、本文披露的载体、本文披露的细胞、本文披露的抗体或其抗原结合部分、或本文披露的药物组合物。在某些实施例中，癌症是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。
在一些方面，本披露提供了本文披露的分离的核酸、本文披露的抗CLDN18.2 CAR、本文披露的载体、本文披露的细胞、本文披露的抗体或抗原结合部分或本文披露的药物组合物在治疗有需要的受试者的疾病或病症中的用途。在某些实施例中，疾病或病症包括癌症。在一些方面，本披露提供了本文披露的分离的核酸、本文披露的抗CLDN18.2 CAR、本文披露的载体、本文披露的细胞、本文披露的抗体或抗原结合部分或本文披露的药物组合物在治疗有需要的受试者的癌症中的用途。在某些实施例中，癌症是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。
在第十一方面，本披露提供了一种扩增T细胞群体的方法，该方法包括：
(a)从样品中分离CD3+T细胞；
(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；
(c)激活这些CD3+T细胞；
(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；
(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞；和
(f)收获这些CAR-T细胞。
在第十二方面，本披露提供了一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：
(a)获得包含CD3+T细胞群的样品；
(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；
(c)激活这些CD3+T细胞；
(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；
(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；和
(f)收获这些CAR-T细胞。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，如权利要求89或90所述的方法，其中该CD3+T细胞群由分离的CD4+和CD8+T细胞群形成。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，培养基进一步包含人白细胞介素2(IL-2)。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，在步骤(b)中在培养基中培养约1x 106至约1x 109个CD3+T细胞。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，样品是通过白细胞单采术收集的富集的单采术产物。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，将步骤(c)中的CD3+T细胞培养约一天或约两天。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，步骤(c)中的CD3+T细胞用CD2、CD3、CD28或其任何组合的激动剂激活。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，步骤(c)中的CD3+T细胞用磁性微珠激活。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，步骤(c)中的CD3+T细胞用抗CD3抗体或其CD3结合片段和抗CD28抗体或其CD28结合片段激活。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，抗CD3抗体或其CD3结合片段以及抗CD28抗体或其CD28结合片段与磁性微珠偶联。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，在步骤(e)中将CAR-T细胞培养约2天至约10天。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，在步骤(e)中将CAR-T细胞培养约四天至约六天。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，在步骤(e)中将CAR-T细胞培养约四天。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，在步骤(e)中将CAR-T细胞培养约六天。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，人IL-21的浓度为约0.01U/mL至约0.3U/mL，并且人IL-2的浓度为约5IU/mL至约100IU/mL。在实施例中，人IL-21的浓度为约0.19U/mL。在实施例中，人IL-2的浓度为约40IU/mL。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，在步骤(b)期间搅动CD3+T细胞。
在又另一个方面，本披露提供了一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)从样品中分离CD4+和CD8+T细胞以形成CD3+T细胞群；(b)在包含浓度为40IU/mL的人白细胞介素2和浓度为0.19U/mL的人白细胞介素21的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)用包含抗CD3抗体或其CD3结合片段和抗CD28抗体或其CD28结合片段的磁珠激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；(e)将这些CAR-T细胞在培养基中培养约四天；以及(f)收获这些CAR-T细胞。在某些实施例中，载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统。在实施例中，载体是慢病毒。在某些实施例中，慢病毒以约0.25至约20的感染复数(MOI)添加。在实施例中，慢病毒以约1至约4的MOI添加。在另一个实施例中，慢病毒以约2或约4的MOI添加。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，在步骤(d)之后增加细胞培养基的体积。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，细胞培养基的体积增加至少约6倍。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，步骤(e)中的培养基每天更换至少一次。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，步骤(e)中的培养基约每12小时更换一次。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约5倍。在一些实施例中，CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约3倍。在实施例中，CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增约2倍。在又另一个实施例中，CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增约3倍。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，结合CLDN18.2的CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQ IDNO:6中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:15中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQID NO:16中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:23中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:24中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:25中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQID NO:26中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:31中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:32中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:33中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:34中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:35中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQID NO:36中所示氨基酸序列的VL-CDR3；或
(e)包含SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:42中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:44中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:45中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQID NO:46中所示氨基酸序列的VL-CDR3。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，结合CLDN18.2的CAR包含VH，该VH包含与选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，结合CLDN18.2的CAR包含VH，该VH包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，结合CLDN18.2的CAR包含VL，该VL包含与选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，结合CLDN18.2的CAR包含VL，该VL包含选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，结合CLDN18.2的CAR包含：
(a)包含与SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(b)包含与SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(c)包含与SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(d)包含与SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；或
(e)包含与SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，结合CLDN18.2的CAR包含：
(a)包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的VL；
(b)包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的VL；
(c)包含SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的VL；
(d)包含SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列的VL；或
(e)包含SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列的VL。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，结合CLDN18.2的CAR包含如SEQ ID NO:52中所示的序列。
在扩增和/或制造T细胞群体的方法的一些实施例中，编码结合CLDN18.2的CAR的核酸进一步包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸，任选地其中该装甲结构域位于编码CAR的核酸的3’末端或编码CAR的核酸的5’末端。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，CAR-T细胞包含装甲分子。在某些实施例中，装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。在实施例中，装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。在一些实施例中，装甲分子包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在实施例中，显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO:54的序列。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，CAR-T细胞配制在等渗溶液中。在某些实施例中，等渗溶液包含含有人血清白蛋白的醋酸钠林格氏液(plasmalyte)。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，等渗溶液含有约1×106至约1×109个CAR-T细胞。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，等渗溶液含有约3.4×106个CAR-T细胞。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，CAR-T细胞是TCM和TSCM细胞的混合物。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，约15％至约50％的CAR-T细胞是TSCM细胞并且表达CD45RA、CCR7和CD27，并且不表达CD45RO。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，约20％至约30％的CAR-T细胞是TSCM细胞并且表达CD45RA、CCR7和CD27，并且不表达CD45RO。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，超过50％的CAR-T细胞表达嵌合抗原受体。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，约40％至约60％的CAR-T细胞表达嵌合抗原受体。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，超过50％的CAR-T细胞表达CD8。
在扩增和/或制造T细胞群的方法的一些实施例中，约40％至约60％的CAR-T细胞表达CD8。
根据以下的详细描述以及所附权利要求，将更全面地理解本披露的这些和其他特征以及优点。应注意权利要求的范围由其中的叙述定义，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论定义。
附图说明
包括附图以提供对本披露的方法和组合物的进一步理解。附图展示了本披露的一个或多个实施例，并且与说明书一起用于解释本披露的原理和操作。
图1A-1D显示正常组织和癌组织中CLDN18.2的蛋白表达。图1A：CLDN18组织表达的人蛋白质图谱概述，包括CLDN18.1和CLDN18.2。请注意，肺中的表达升高可能是由于CLDN18.1。图1B：IHC(Abcam克隆EPR19202)用于展示具有潜在反应性的组织的CLDN18.2特异性染色。在所有正常胃人染色样品中都发现了组成型表达。在人十二指肠的布伦纳腺和隐窝中观察到病灶染色。在胆囊和胰管的增生或反应性细胞中也观察到CLDN18.2染色(与年龄相关的变化)，这种染色在胆囊中常见，在胰腺中罕见。图1C：CLDN18.2的IHC表达在食蟹猴、大鼠和NSG小鼠的正常胃组织中得以维持。表达模式在动物物种中是保守的；因此，可以在安全性研究中对该靶组织进行建模。图1D：对来自胃(G)和食管胃交界部癌(GEJC)、胰腺腺癌(PDAC)和食管腺癌(EAC)的多个肿瘤块中的CLDN18.2表达进行了检测。对总共有75个TMA核心进行G/GEJC评分，对24个核心获进行PDAC评分，对17个核心进行EAC评分。测量每个样品的表达和染色强度。该表代表具有任何表达水平的样品。
图2A-2D显示了选择的先导物的CLDN18.2结合亲和力和物种交叉反应性，如在表达人(图2A)、食蟹猴(图2B)、大鼠(图2C)或小鼠(图2D)CLDN18.2的HEK293细胞中通过流式细胞术测量所确定的。所有先导物结合人和食蟹猴CLDN18.2(99％同源性)，大多数先导物结合大鼠CLDN18.2(90％同源性)，只有一个内部先导物结合鼠CLDN18.2(89％同源性)。R347用作阴性对照。
表1提供了所选CLDN18.2抗体的CLDN18.2结合亲和力和物种交叉反应性的总结。结果报告为EC50；所有先导物均结合CLDN18.2，EC50范围为7nM至大于1μM。R347用作阴性对照。
表2总结了通过流式细胞术测量所选CLDN18.2反应性先导物的表位特征。测量了与表达CLDN18.2野生型或CLDN18.2变体的HEK293细胞的差异结合，其中设计的CLDN18.2变体与野生型CLDN18.2的差异仅在于CLDN18.1中存在的1个氨基酸。结果报告为对给定变体的结合没有影响(NE)、影响结合(INF)和消除结合(Ab)，其中负责结合丧失的残基指示负责CLDN18.2同种型特异性的残基。
图3显示通过流式细胞术测量测量所选CLDN18.2抗体与表达CLDN18.2 M149L的HEK293细胞的结合直方图。显示了在固定抗体浓度下与HEK细胞(亲本)、表达人CLDN18.2野生型或人CLDN18.2M149L的HEK293细胞结合的代表性结果。
图4A-4B显示了使用改进的ZAP测定确定的所选CLDN18.2抗体的内化特性。内化抗体表现出细胞杀伤。针对表达人CLDN18.2的HEK293(图4A)和表达人CLDN18.1的HEK293(图4B)显示了所选CLDN18.2抗体的代表性结果。插图显示HEK293群的CLDN18.2IHC染色。内化是表达CLDN18.2的细胞所特有的，因为在工程改造以表达CLDN18.1的HEK293细胞中没有观察到活性。R347是阴性对照抗体。
图5A-5E显示了代表性的CAR-T设计和数据。图5A：CAR-T设计。CAR-T的设计如图5A所示，其中CAR构建体包含CLDN18.2结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3z信号传导结构域、自切割肽和GFP/mCherry以方便检测。图5B：测定中使用的PaTu8988s细胞系的IHC图像。显示了“未分选”和“高分选”PaTu 8988s细胞沉淀的代表性IHC图像以及使用008LY1_D04的流式细胞术图(图5B)。图5C：使用PaTu 8988s“高分选”通过体外xCELLigence测定的各种克隆的细胞裂解能力。使用Agilent xCELLigence实时细胞分析系统测量CAR-T肿瘤细胞杀伤能力。随着归一化的细胞指数在x轴上降至0，监测肿瘤细胞裂解。在1个CAR-T细胞与1个肿瘤细胞的固定比例(E:T＝1:1)下，克隆ZP1I16_D05、008LY1_D04、008LYG_D08和ZP1I18_B08显示出等同且有效的细胞裂解能力，在CAR-T引入后15小时达到约50％，而克隆008M0G_G03CAR-T表现出延迟的细胞裂解，在CAR-T引入后60小时达到约50％。图5D：24小时时从测定中取出的上清液的细胞因子测量。将CAR-T细胞添加到孔中后24小时，取样25ul培养基，按照制造商的说明使用MSD ELISA测定检查T细胞分泌的促炎细胞因子。008LY1_D04和008LYG_D08的IFN-γ、IL-2和TNF-α细胞因子分泌水平最大且相对相当，而对于ZP1I16_D05和ZP1I18_B08则水平降低。检测到克隆008M0G_G03的IFNγ产量最少。对于所有条件，使用细胞培养基中不含癌细胞但仅含癌T细胞的孔作为对照。尽管存在异质表达，但在PaTu 8988s“未分选”细胞系中观察到各种克隆作为CAR-T的效力趋势相似，其中008LY1_D04和008LYG_D08仍然是最有效的。图5E：使用PaTu 8988s“未分选”细胞通过体外xCELLigence测定的各种克隆的细胞裂解能力。
表3显示了相关细胞系中人CLDN18.2表面表达的评估。QSC珠用于通过使用008LY1_D04抗体进行流式细胞术测量来定量各种细胞系上的抗原结合能力(ABC)或CLDN18.2表面受体的数量。在大多数情况下，经过工程改造以过表达CLDN18.2的细胞系具有最高的ABC水平(表3)。还包括各种细胞系的中位荧光强度(MFI)。
图6A-6D显示了使用Agilent xCELLigence实时细胞分析系统时CLDN18.2密度与008LYG_D08 CD28z CAR-T介导的细胞裂解能力的相关性。在每次评估中，对于CAR-T细胞和未转导的匹配供体T细胞而言保持等效的E:T比率。将每个癌细胞系按照每个细胞系的预定密度(每孔40-50,000个细胞)接种在eSight 96孔板中。单独的培养基用作阴性对照并且缺乏未转导的T细胞的残余活性。将具有CLDN18.2的CRISPR敲除且ABC＝0的PaTu 8988s(图6A)与每个细胞ABC＝112,058的PaTu 8988s“高分选”中的活性(图6B)进行比较。添加CAR-T细胞后15小时，使用PaTu 8988s“高分选”细胞实现最大细胞裂解，在CLDN18.2敲除细胞系中直至测定终点均未观察到细胞裂解，这证明了针对表达CLDN18.2的细胞的008LYG_D08CD28z CAR-T细胞裂解特异性。还检查了具有低受体密度的NUGC4胃癌细胞(ABC＝585/细胞，图6C)和被工程改造以表达中等CLDN18.2受体密度的AsPC1(ABC＝2819/细胞，图6D)。008LYG_D08 CD28z CAR-T能够裂解这些具有低和中等抗原表达模式的癌细胞，尽管动力学和最大裂解量有所不同。
图7A-7F显示转导的CAR-T细胞的体外表征，以及给予008LYG_D08 CD28z CAR-T的NSG小鼠的体内功效和安全特性。使用鼠交叉反应CAR-T可以同时测量肿瘤裂解能力并早期评估潜在的安全问题。CAR-T细胞是用纯化的总T细胞生成的，如材料和方法中所述。CAR-T细胞在输注前扩增12天，每两天更换一次CAR-T细胞培养基。通过评估mCherry荧光来确定CAR+表达并确定为55％(图7A)。还确定了这些CD4或CD8的CAR+细胞的百分比(图7B)，其中观察到CD8+(64％)的百分比略高于CD4+(34％)CAR-T细胞。通过经由CD62L表达检查CD45RO来确定输注前的记忆表型(图7C)，其显示008LYG_D08 CD28z CAR-T维持分化程度较低的CD62L+/CD45RO-表型。008LYG_D08 CD28z CAR-T的体内功效在6至8周龄雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(杰克逊实验室(Jackson Laboratories),NSG)小鼠中进行研究。第-10天，将10E6 PaTu 8988s“高分选”细胞皮下植入右上侧腹的CultrexTM基底膜提取物(BME)3型中。第0天，当异种移植物的平均大小达到180至200mm3时，对小鼠进行静脉内给药，单次输注3E6或9E6 008LYG_D08 CD28z CAR-T细胞、9E6未转导供体匹配的T细胞或媒剂对照。9E6 008LYG_D08 CD28z CAR-T以剂量依赖性方式导致长达65天的有效肿瘤异种移植物消退(图7D)，而没有相关的体重减轻(图7E)。3E6 008LYG_D08 CD28z CAR-T导致肿瘤停滞，并最终在60天后生长。在研究终点，通过IHC评估了代表性动物的正常胃组织；huCD3的染色表明T细胞浸润，CLDN18.2的染色表明正常的胃表达(图7F)。这些染色模式表明CLDN18.2胃表达得以维持，并且与对照动物一致。总体而言，这项研究证明了剂量依赖性且持久的肿瘤应答，没有体重减轻表明存在潜在的安全窗。
图8A-8I显示dnTGFβRII装甲的基本原理和机制证明。显示了胃、胰腺和食管腺癌样品的用TGFβ1染色的代表性IHC图像，其中一张图像显示仅免疫细胞染色呈阳性的样品，而另一张图像显示所有三种组分对TGFβ均呈阳性(图8A)。抑制性细胞因子还可导致抑制性细胞(例如Tregs和MDSC)的募集。已知TGFβ可通过受体复合物的下游信号传导诱导T细胞耗竭，并限制CAR-T的持久性和裂解能力。为了提高CAR-T在实体瘤环境中的功效，可以采用的一种方法是使用显性负性TGFβ受体II。CAR-T设计(图8B)显示使用T2A自切割肽，其使得能够在T细胞中由单个启动子驱动表达CAR和显性负性受体。CAR-T细胞是用纯化的总T细胞生成的，如材料和方法中所述。根据癌症基因组图谱计划(TCGA)数据库(美国国家癌症研究所)，具有显性负性TGFβRII的CLDN18.2 CAR-T可能在胃癌、胰腺癌和食管癌中具有优势，这些癌症在原发肿瘤中均表现出高于正常组织的TGFβ1RNA表达(图8C)。通过IHC对3个个体和适应症特异性多点肿瘤微阵列(TMA)的数据进行CLDN18.2、TGFβ1和磷酸SMAD2(仅胃和食管)分析。对于任何强度的肿瘤或免疫/基质区室，IHC表达的阳性率评分为1％。在胃癌、食管癌和胰腺癌适应症中，分别有22％、56％和55％的样品观察到TGFβ1染色；在所有适应症中，在免疫细胞和基质细胞中大量观察到TGFβ1，任何强度下细胞阳性率为1％(图8D)。还检查了Phospho SMAD2，作为胃和食管TMA中TGFβ通路激活的量度。观察到磷酸SMAD2的丰富染色，并与TGFβ1IHC相关，这表明TGFβ在这些肿瘤样品中具有活性。为了进一步支持装甲的选择，对另外的胃和胰腺TMA进行了CLDN18.2和TGFβ1的IHC染色，以覆盖更大量的患者样品，并将IHC得分转换为CLDN18.2或TGFβ1表达的最大和最小以及中值水平的热图(图8E)。在肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞中观察到不同水平的TGFβ1，并且随着CLDN18.2的表达而变化。TME的所有细胞中TGFβ的丰度和表达将增加装甲方法成功的可能性。总而言之，这些数据支持dnTGFβRII装甲作为克服肿瘤微环境和促进CAR-T活性的合理方法。在用于下游测定之前，通过流式细胞术检测表面CAR+和dnTGFβRII(图8F)。未转导的细胞对于两种标志物均呈阴性，008LYG_D08 CD28z通过抗scFv为50.1％CAR+，008LYG_D08 CD28z dnTGFβRII通过两种标志物为40.3％双阳性。为了证明体外显性负性TGFβRII装甲机制的证据，使用xCELLigence测定法测量细胞裂解，如材料和方法中所述。BXPC3(胰腺腺癌)细胞经过工程改造，可过度表达人CLDN18.2。这些细胞与未转导的供体匹配T细胞、008LYG_D08 CD28zCAR-T或008LYG_D08 CD28z dnTGFβRII装甲CAR-T在不存在或存在10ng/ml重组人TGFβ的情况下以恒定的E:T比例和匹配的T细胞总数/孔在96孔板中共培养。在仅培养基中，两种CAR-T都能有效裂解表达CLDN18.2的细胞，具有相似的效力，但使用dnTGFβRII装甲CAR-T观察到的最大细胞裂解稍更早。相反，补充有10ng/ml重组人TGFβ的培养基降低了非装甲CAR-T的细胞裂解能力，但对于表达显性阴性TGFβRII的CAR-T维持了细胞裂解(图8G)。通过蛋白质印迹监测下游信号传导能力，检查了显性负性TGFβRII机制的另外证据。早在与重组人TGFβ共孵育后15分钟，对于匹配的供体未转导T细胞和008LYG_D08 CD28z观察到下游磷酸SMAD-2/3信号传导的诱导，然而，对于008LYG_D08 CD28z dnTGFβRIICAR-T，在TGFβ暴露后达45分钟未观察到信号传导。所有组的总SMAD-2/3和负载对照肌动蛋白水平是一致的(图8H)。最后，为了证明CAR-T细胞具有克服TGFβ抑制机制的优势，进行了一系列抗原再刺激测定。在每个时间点，将相同的CAR-T细胞以固定的E:T比例(1:2)添加至工程改造为过表达CLDN18.2的BXPC3细胞。该测定是通过向培养基中添加10ng/ml重组人TGFβ来进行的。这些数据表明，装甲CAR-T细胞保持了更高水平的细胞裂解，并且在存在TGFβ的情况下，可以比非装甲CAR-T细胞进行多轮这样的细胞裂解(图8I)。
图9A-9L显示显性负性TGFβRII装甲机制的体内证据。在6至8周龄雌性NSG MHC I/II KO小鼠中进行了008LYG_D08 CD28z和008LYG_D08 CD28z dnTGFβRII装甲CAR-T的体内功效检查。CAR-T细胞是用纯化的总T细胞生成的，如材料和方法中所述。将工程改造为过表达CLDN18.2的细胞系异种移植模型PaTu 8988s(“高分选”，胰腺)和NCI-N87(胃)以及患者衍生的胰腺异种移植模型植入CultrexTM基底膜提取物(BME)中3类中并生长直至肿瘤达到平均150-200mm3。然后对动物进行静脉内给药，单次输注3E6未转导供体匹配T细胞、未装甲CAR-T或dnTGFβRII装甲CAR-T细胞，所有组在每项实验研究中都匹配等同的总T细胞输注。在PaTu 8988s模型中观察到008LYG_D08 CD28z CAR-T和008LYG_D08 CD28z dnTGFβRII装甲CAR-T细胞具有持久体内功效(图9A)，没有观察到体重减轻(图9B)。显示了CLDN18.2特异性染色(图9C)和TGFβ1染色(图9D)的代表性IHC图像。该模型在检查的CLDN18.2表达方面最高，得分为12/12，这可能反映了两种CAR-T构建体的等效活性，无论TGFβIHC得分如何。该模型的TGFβ肿瘤细胞染色得分为5/12，基质细胞区室染色得分为2.5/9。更具体地观察到，在3e6细胞的CAR-T单次输注剂量下，对于工程改造为过表达CLDN18.2的NCI-N87模型中的008LYG_D08 CD28z dnTGFβRII装甲CAR-T细胞观察到持久且卓越的体内功效(图9E)，没有观察到体重减轻(图9F)。显示了CLDN18.2特异性染色(图9G)和TGFβ1染色(图9H)的代表性IHC图像。该模型的CLDN18.2表达得分为8/12，TGFβ肿瘤细胞染色得分为1/12，基质细胞区室染色得分为5.5/9。同样，在Panc22 PDX模型中单次输注008LYG_D08 CD28z dnTGFβRII装甲CAR-T细胞后，观察到持久且卓越的体内功效，其中5/5的动物在研究终点表现出完全应答，而在008LYG_D08 CD28z CAR-T组中观察到在第20天的早期应答，但随后观察到肿瘤再生长(图9I)，没有观察到体重减轻(图9J)。显示了CLDN18.2特异性染色(图9K)和TGFβ1染色(图9L)的代表性IHC图像。该PDX模型的CLDN18.2表达得分为8/12，TGFβ肿瘤细胞染色得分为0/12，基质细胞区室染色得分为5/9。
图10A-10F显示制造对CAR-T持久性和记忆表型的影响。使用“传统制造”工艺生成的008LYG_D08 CD28z dnTGFβRII装甲CAR-T细胞与使用“缩短制造”工艺生成的细胞进行比较，在连续抗原刺激测定中并排比较，与经过工程改造过表达CLDN18.2的BxPC3细胞以E:T比例1:2共培养。在测定初期，两组都被证明在肿瘤细胞裂解方面具有相似的功效，但在重复的抗原刺激下，“传统制造”细胞在第四轮抗原刺激中裂解了低于10％的癌细胞，而“缩短制造”细胞在同一时间点仍维持43％的裂解(图10A)。在连续抗原再刺激测定期间的每个时间点，使用CD45RO通过CD62L表达对每组的CAR+T细胞进行记忆状态表型分析，其中CD62L+/CD45RO-代表初始或较低分化细胞(TN)、CD62L+/CD45RO+代表中央记忆细胞(TCM)、CD62L-/CD45RO+代表效应记忆细胞(TEM)以及CD62L-/CD45RO-代表组的最终末分化(TEFF)子集。虽然两种制造工艺在第0天都产生了具有相对相似表型的细胞群，但“传统制造”细胞在第7天和第10天具有更大比例的TEM细胞，这转化为在第14天和第17天更大比例的最终末分化TEFF，证明了制造方案对细胞功能、持续肿瘤细胞裂解和表型的影响(图10B)。在Panc06 PDX模型中，以0.3E6个细胞的CAR-T单次输注剂量，观察到“短制造”或SMART 008LYG_D08 CD28z和008LYG_D08 CD28z dnTGFβRII装甲CAR-T细胞的持久体内功效(图10E)，没有观察到体重减轻(图10F)。显示了CLDN18.2特异性染色(图10C)和TGFβ1染色(图10D)的代表性IHC图像。该模型的CLDN18.2表达得分为9/12，TGFβ肿瘤细胞染色得分为7.5/12，基质细胞区室染色得分为4/9。
图11A–11D显示在胃癌PDX模型中用来自第二T细胞供体的经008LYG_D08 CD28zdnTGFbRII装甲的CAR-T细胞治疗的胃癌异种模型的功效数据(图11C)，在1.3e6剂量下具有持久的肿瘤控\k-\[]制并且没有体重减轻(图11D)。显示了该胃-[的PDX的CLDN18.特异性染色(图11A，评分为12/12)和TGFb1染色(图11B，评分为肿瘤0/12和基质3/9)的代表性IHC图像。
图12A–12L显示了食管腺癌ES6470 PDX模型(图12A-D)、食管腺癌ES11069 PDX模型(图12E-H)和食管腺癌ES11085 PDX模型(图12I-L)中用来自第二T细胞供体的经008LYG_D08 CD28z dnTGFbRII装甲的CAR-T细胞治疗的食管腺癌异种移植模型的功效数据，具有肿瘤控制证据(图12C、12G和12K)并且在所示的各种剂量下没有显著的体重减轻(图12D、12H和12L)。显示了所选食管腺癌PDX的CLDN18.2特异性染色(图12A，评分为8/12，图12E，评分为10/12，图12I，评分为12/12)和TGFb1染色(图12B、图12F和图12J)的代表性IHC图像。
图13A–13H显示了在胰腺癌Panc22(图13A-D)和Panc19(图13E-H)的PDX模型中用来自第二T细胞供体的经008LYG_D08 CD28z dnTGFbRII装甲的CAR-T细胞治疗的胰腺癌异种移植模型中的功效数据，具有肿瘤控制的证据(图13C，13G)并且在所示的各种剂量下没有显著的体重减轻(图13D，13H)。显示了所选胰腺腺癌PDX的CLDN18.2特异性染色(图13A，评分为8/12，图13E，评分为10/12)和TGFb1染色(图13B和图13F)的代表性IHC图像。
图14A-14F显示了008LYG_DO8 CAR-T细胞在经工程改造以表达鼠CLDN18.2的黑色素瘤(B16-F10)和结肠癌(CT-26)同基因鼠模型中的功效。与B16-F10 WT细胞相比，工程改造的B16-F10+mCLDN18.2细胞的CLDN18.2阳性率为99.7％(图14A)。与CT-26 WT细胞相比，CT-26+mCLDN18.2细胞的CLDN18.2阳性率为99.6％(图14C)。008LYG_DO8 mCD28z m-dnTGFbRII的体外细胞裂解能力通过体外xCELLigence测定显示，使用B16-F10细胞和CAR-T(以10:1E:T比例)(图14B)以及CT-26细胞(以10:1和1:1比例)(图14D)，特异性地有效裂解表达CLDN18.2的细胞。单次鼠CAR-T输注导致在表达CLDN18.2的异种移植物中的特异性肿瘤生长抑制(图14F)，而没有显著的体重减轻(数据未显示)。
熟练的技术人员将理解，图中的要素是为了简单和清楚而示出的，并且不一定按比例绘制。例如，图中一些要素的尺寸可以相对于其他要素放大，以帮助提高对本披露的一个或多个实施例的理解。
具体实施方式
除非另外说明，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本披露所属领域的技术人员通常理解的含义。以下的参考文献为技术人员提供了本披露所用的多个术语的通用定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典](第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science andTechnology[剑桥科技词典](Walker编著，1988)；The Glossary of Genetics[遗传学词汇],第5版,R.Rieger等人(编著),斯普林格出版社(Springer Verlag)(1991)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology[哈珀科林斯生物学词典](1991)。除非另有指明，否则如本文所用的以下术语具有以下赋予它们的含义。
如本文所用的，术语“包含(comprise)”和“包括(include)”及其变体(例如，“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”)应理解为表示包括陈述的组分、特征、元素或步骤，或一组组分、特征、元素或步骤，但不排除任何其他组分、特征、元素或步骤，或一组组分、特征、元素或步骤。术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个可以用其他两个术语中的任一个替换，同时保留其普通含义。
除非上下文另有明确指明，否则如本文所用的单数形式“一个/种(a/an)”和“该”包括复数指示物。
本文披露的百分比可以与披露的值相差±10％、20％或30％的量，并且仍在预期披露的范围内。
除非另作说明或另外从上下文和本领域的普通技术人员所理解的明显可见，在本披露的不同实施例中表示为范围的本文的值可以采取所陈述范围内的任何具体值或子范围，至该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外明确指明。
如本文所用的，范围和量可表示为“约”某个特定值或范围。术语“约”还包括该精确量。例如，“约5％”意指“约5％”并且也指“5％”。术语“约”还可以指给定值或值的范围的±10％。因此，例如，约5％也指4.5％-5.5％。另外，“约”或“基本上包括”可以表示高达±10％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可以意指高达一个数量级或高达5倍的值。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上包括”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。除非另外从上下文显而易见，本文提供的所有数值被该术语“约”修饰。
如本文所述，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。
单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(Système International deUnites)(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则核苷酸序列以5'至3'取向从左向右书写。氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左向右书写。本文提供的标题不是本披露的不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。
如本文所用的，术语“或”和“和/或”可描述彼此组合或排斥的多个组分。例如，“x、y、和/或z”可指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y、和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”、或“x或y或z”。
如本文所用的，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何一条链或多条链。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语被包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。
如本文所用的，“蛋白质”可指单个多肽，即，如上所定义的单个氨基酸链，而且还可以指相关联的两个或更多个多肽，例如，通过二硫键、氢键、或疏水相互作用来产生多聚体蛋白。
“分离的”物质，例如分离的核酸，是不在其天然环境中的物质，尽管该分离的物质不一定是纯化的。例如，分离的核酸是不会产生于或位于其天然或自然环境(如细胞)中的核酸。分离的物质可以通过任何合适的技术分离、分馏、或至少部分纯化。
如本文所用的，术语“抗体”和“其抗原结合片段”指能够结合至抗体靶向的指定抗原的抗体的至少最小部分，例如在由B细胞产生的典型抗体的情况下，重链(VH)的可变结构域和轻链(VL)的可变结构域的至少一些互补决定区(CDR)。在一些抗体中，例如天然存在的IgG抗体，重链恒定区由铰链区和三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在一些抗体中，例如天然存在的IgG抗体，每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(本文缩写为CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插入被称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的不同细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。重链可具有或不具有C末端赖氨酸。除非本文另有说明，否则可变区中的氨基酸使用Kabat编号系统编号，恒定区中的氨基酸使用EU系统编号。
抗体或其抗原结合片段可以是或源自多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链可变片段(scFv)、单链抗体、VHH、vNAR、纳米抗体、(单结构域抗体)、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含单独的或与相反结构域的一部分结合的VL或VH结构域(例如，整个VL结构域以及具有一个、两个或三个CDR的部分VH结构域)的片段、以及通过Fab表达文库产生的片段。ScFv分子在本领域是已知的，并且描述于例如美国专利号5,892,019中。本披露涵盖的抗体分子可以是或源自免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)或子类。
如本文所用，抗体或其抗原结合片段还包括“单结构域抗体”，其是抗体，这些抗体的互补决定区是单结构域多肽的一部分。单结构域抗体的实例包括重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自常规四链抗体的单结构域抗体、工程改造的或重组的单结构域抗体。单结构域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。单结构域抗体可以是天然存在的单结构域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。特别地，骆驼科物种，例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和原驼，产生天然缺乏轻链的重链抗体。缺乏轻链的单结构域抗体的可变重链被称为“VHH”或“纳米抗体”。与传统的VH结构域类似，VHH包含四个FR和三个CDR。纳米抗体与传统抗体相比具有以下优势：它们比IgG分子更小，因此可以通过体外表达产生正确折叠的功能性纳米抗体，同时实现高产率。例如，VHH结构域、纳米抗体和含有它们的蛋白质/多肽可以利用微生物发酵生产，并且不需要使用哺乳动物表达系统；VHH结构域和纳米抗体相对较小(约15kDa，或比常规IgG小10倍)，因此显示出比这种常规4链抗体及其抗原结合片段更高的组织(包括但不限于实体瘤和其他致密组织)穿透性；VHH结构域和纳米抗体可以表现出所谓的腔结合特性(尤其是由于与常规VH结构域相比，它们具有延长的CDR3环)，因此也可以接近常规4链抗体及其抗原结合片段不能接近的靶标和表位。此外，纳米抗体非常稳定，并且能抵抗蛋白酶的作用。
如本文所用，“VHH结构域”指存在于天然存在的重链抗体中的可变结构域，以便将它们与存在于常规四链抗体中的重链可变结构域(本文称为“VH结构域”)和存在于常规四链抗体中的轻链可变结构域(本文称为“VL结构域”)相区别。在一些实施例中，本披露的重组多肽对应于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列，但是其已被“人源化”，即，用出现在来自人的常规四链抗体的VH结构域的相应位置的一个或多个氨基酸残基取代天然存在的VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本领域已知的方式进行。
在一个实施例中，本披露提供了能够结合CLDN18.2的包膜表位的重组多肽序列，例如免疫球蛋白序列(在一些实施例中，VHH抗体序列)，其中该免疫球蛋白序列包含四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，其中：
a)CDR1是SEQ ID NO:1、11、21、31或41的氨基酸序列；或选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:1、11、21、31或41的氨基酸序列具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或选自由以下组成的组：与SEQ ID No:1、11、21、31或41的氨基酸序列相比具有2个或仅1个氨基酸差异的氨基酸序列；
b)CDR2是SEQ ID NO:2、12、22、32或42的氨基酸序列；或选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:2、12、22、32或42的氨基酸序列具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或选自由以下组成的组：与SEQ ID No:2、12、22、32或42的氨基酸序列相比具有2个或仅1个氨基酸差异的氨基酸序列；
c)CDR3是SEQ ID NO:3、13、23、33或43的氨基酸序列；或选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:3、13、23、33或43的氨基酸序列具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或选自由以下组成的组：与SEQ ID No:3、13、23、33或43的氨基酸序列相比具有2个或仅1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且其中框架序列可以是任何合适的框架序列，例如单结构域抗体且特别是VHH抗体的框架序列。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原(例如人CLDN18.2)的能力的抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。抗体(例如本文所述的抗CLDN18.2抗体)的术语“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段(来自木瓜蛋白酶切割的片段)或由VL、VH、LC和CH1结构域组成的类似单价片段；(ii)F(ab')2片段(来自胃蛋白酶切割的片段)或包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的类似二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)和(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但它们可以使用重组方法，通过合成接头连接，该接头使其能够制备成单个蛋白质链形式，其中VL和VH区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如，Bird等人(1988)Science[科学]242:423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院报]85:5879-5883)。这类单链抗体还旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶裂解或化学裂解来产生抗原结合部分。
本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程改造的抗原结合多肽，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域(例如共刺激结构域)。在一些实施例中，CAR可以任选地包含间隔子结构域和/或柔性铰链结构域以提供构象自由度以有助于与靶细胞上的靶抗原的结合。在一些实施例中，CAR可以任选地包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸序列。CAR在细胞(例如免疫细胞)表面上的表达允许细胞靶向并结合特定抗原。在一些实施例中，CAR由免疫细胞(例如T细胞)表达。在一些实施例中，抗原结合结构域包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、单链可变片段(scFv)、单链抗体、VHH、vNAR、纳米抗体(单结构域抗体)或其任何组合。在一些实施例中，跨膜结构域包含选自CD4、CD8α或CD28的跨膜结构域的跨膜结构域。在一些实施例中，一个或多个胞内结构域包含共刺激结构域或其一部分。在一些实施例中，胞内结构域包含共刺激结构域或其一部分。在一些实施例中，胞内结构域包含CD3z的共刺激结构域或其变体。例如，CD3z共刺激结构域变体可能仅包含野生型CD3z中存在的三个ITAM中的1或2个功能性的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，胞内结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域选自由以下组成的组：CD3ζ共刺激结构域、CD28共刺激结构域、CD27共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域、ICOS共刺激结构域、OX-40共刺激结构域、GITR共刺激结构域、CD2共刺激结构域、IL-2Rβ共刺激结构域、MyD88/CD40共刺激结构域及其任何组合。CAR可以进一步包含“铰链区”或“间隔子”结构域。铰链/间隔子结构域的非限制性实例包括免疫球蛋白铰链/间隔子结构域，例如IgG1铰链结构域和IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域、IgG4铰链结构域、IgG4P铰链结构域(包含S241P突变的IgG4铰链结构域)、或CD8a铰链结构域、或CD28铰链结构域。
如本文所用的，术语“多核苷酸”包括单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。术语“核酸”包括任何核酸类型，如DNA或RNA。“保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有以下各项的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性的侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在一些实施例中，CLDN18.2结合部分(例如抗CLDN18.2 CAR或抗体)中预测的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。
两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数量/位置的总数×100)，考虑了缺口数目和每个缺口的长度，需要引入这些缺口以用于两个序列的最佳比对。序列比较以及两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法完成，如以下非限制性实例中所述。
两个核苷酸序列间的百分比同一性可以使用GCG软件包(免费获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以使用E.Meyers和W.Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))，其已经被结合到ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12以及缺口罚分4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol[分子生物学杂志].(48):444-453(1970))算法，其已经被结合到GCG软件包中的GAP程序里，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。
本文所述的核酸和蛋白质序列还可用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，例如鉴定相关序列。这种搜索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来执行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12进行，以获得与本文所述核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行，以获得与本文所述蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目标的有缺口的比对，可以利用如在Altschul等人,(1997)NucleicAcids Res.[核酸研究]25(17):3389-3402中所述的Gapped BLAST。当利用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以向其中连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以被连入病毒基因组。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在一旦被引入宿主细胞时整合进宿主细胞基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般来说，重组DNA技术中应用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括其他形式的表达载体，例如具有等效功能的病毒载体(例如慢病毒载体、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)或转座子(例如DNA转座子或逆转录转座子)。在某些实施例中，使用病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统将CAR和/或抗体或其抗原结合片段被包围和/或递送至细胞和/或患者。在实施例中，使用慢病毒载体。
如本文所用的，术语“载体”可指引入宿主细胞的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可以包括一种或多种可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元件。此处设想的特定类型的载体可以与病毒缔合或掺入病毒中，以促进细胞转化。
“转化的”细胞或“宿主”细胞是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。本文考虑了可将核酸分子引入这样的细胞的所有技术，这些技术包括用病毒载体转染，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸DNA。在某些实施例中，通过一种或多种技术使用病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)以及CRISPR-Cas系统转化细胞。
如本文所用的，术语“亲和力(affinity)”指抗原或靶标(如表位)与其同源结合结构域(如互补位)的结合强度的量度。如本文所用的，术语“亲合力(avidity)”指表位与互补位(即抗原与抗原结合结构域)的群体之间的复合物的总体稳定性。
术语“表位”是指抗原(例如，CLDN18.2)上嵌合抗原受体、免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点，例如，如通过用于鉴定它的特定方法所定义的。表位可以由连续氨基酸(通常是线性表位)形成，也可以由通过蛋白质三级折叠而并置的非连续氨基酸(通常是构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括处于独特空间构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫系统或免疫应答的方法治疗患有疾病或处于感染疾病或疾病复发的风险中的受试者。
“免疫应答”是本领域所理解的，并且通常是指脊椎动物体内对外来试剂或异常例如癌细胞的生物应答，该应答保护生物体免受这些试剂和由它们引起的疾病。免疫应答由免疫系统的一种或多种细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞或肝脏中的任一种产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导，该作用导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或从脊椎动物体内清除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌或其他异常细胞，或在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常人细胞或组织。免疫反应包括例如激活或抑制T细胞，例如效应T细胞、Th细胞、CD4+细胞、CD8+T细胞或Treg细胞，或激活或抑制免疫系统的任何其他细胞，例如NK细胞。
如本文所用的，当在治疗癌症的上下文中使用时，术语“治疗(treat/treatment/treatment of)”指减轻疾病病理、减轻或消除疾病症状、促进存活率提高、和/或减轻不适。例如，治疗可以是指当向受试者施用疗法时该疗法减少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至少一种临床症状和/或抑制或延迟病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发作。
如本文所用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括例如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。
如本文所用的，术语施用的治疗性物质(如CAR T细胞)的“有效量”或“治疗有效量”是足以进行特别说明或预期目的，如治疗癌症的量。“有效量”可以根据所述目的凭经验以常规方式确定。
术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或激活的T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或任何其他T细胞亚群。适合在特定实施例中使用的其他示例性T细胞群包括初始T细胞和记忆T细胞。
如本文所用，术语“增殖”是指细胞分裂的增加，细胞的对称或不对称分裂。在特定实施例中，“增殖”是指T细胞的对称或不对称分裂。当处理的样品中的细胞数量与未处理的样品中的细胞相比增加时，就会发生“增殖增加”。
本披露方法中的术语“扩增”是指增加细胞培养物中细胞数量的过程。在扩增步骤中，在一个实施例中根据补料方案，定期补料细胞并更换培养基。在特定补料方案中添加培养基的具体时间和量将取决于培养物中的细胞数量和代谢物水平。
如本文所用，术语“分化”是指降低细胞的效力或增殖或使细胞进入发育更受限状态的方法。在特定实施例中，分化的T细胞获得免疫效应细胞功能。
“免疫效应细胞”是具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的诱导)的免疫系统的任何细胞。本文考虑的示例性免疫效应细胞是T淋巴细胞，特别是细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、TIL和辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)。
“经修饰的T细胞”是指已经通过引入编码本文考虑的工程改造的CAR的多核苷酸而经修饰的T细胞。经修饰的T细胞包括遗传修饰和非遗传修饰(例如附加型或染色体外)。
如本文所用，术语“经遗传工程改造的”或“经遗传修饰的”是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质添加到细胞中的总遗传物质中。
术语“经遗传修饰的细胞”、“经修饰的细胞”和“经重定向的细胞”可互换使用。
首字母缩略词“SMART”(短操纵自动复制T细胞)是指缩短的T细胞制造和扩增过程，其中细胞在IL-21(和任选的IL-2)存在下培养。
首字母缩略词“TNT”(传统培育的T细胞)是指不使用IL-21的传统T细胞扩增过程，并且通常包括细胞培养超过7天和/或通常包括使用IL-2。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导初级应答，从而介导信号转导事件，包括但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。
“刺激分子”是指T细胞上与同源刺激配体特异性结合的分子。
如本文所用，“刺激配体”意指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上时可以与T细胞上的同源结合配偶体(称为在本文中称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初级应答，包括但不限于激活、免疫应答的起始、增殖等。刺激配体包括但不限于CD3配体，例如抗CD3抗体和CD2配体，例如抗CD2抗体，以及肽，例如CMV、HPV、EBV肽。
术语“激活”是指T细胞已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。在特定实施例中，激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其是指正在增殖的T细胞。仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要一个或多个次级或共刺激信号。因此，T细胞激活包括通过TCR/CD3复合物的初级刺激信号和一个或多个次级共刺激信号。共刺激可以通过已接收初级激活信号(例如通过CD3/TCR复合物或通过CD2的刺激)的T细胞的增殖和/或细胞因子产生来证明。
“共刺激信号”是指与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖、细胞因子产生和/或特定分子(例如CD28)上调或下调的信号。
“共刺激配体”是指结合共刺激分子的分子。共刺激配体可以是可溶的或提供在表面上。“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体(例如抗CD28抗体)特异性结合的同源结合配偶体。
如本文所用，“自体”是指来自同一受试者的细胞。在一些实施例中，本披露的细胞是自体的。
如本文所用，“同种异体”是指与比较细胞在遗传上不同的相同物种的细胞。在一些实施例中，本披露的细胞是同种异体的。
如本文所用，“同基因”是指与比较细胞在遗传上相同的不同受试者的细胞。在一些实施例中，本披露的细胞是同基因的。
如本文所用，“异基因”是指与比较细胞不同物种的细胞。在一些实施例中，本披露的细胞是异基因的。
如本文所用，术语“个体”和“受试者”通常可互换使用，并且是指表现出可以用本文别处披露的基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的癌症症状的任何动物。合适的受试者(例如，患者)包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人灵长类动物，并且优选地，人患者。典型的受试者包括患有癌症、已被诊断患有癌症、或处于癌症风险中或患有癌症的人患者。
“增强”或“促进”或“增加”或“扩增”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的应答相比，本文预期的组合物产生、引发或引起更大生理应答(即，下游效应)的能力。可测量的生理应答可包括T细胞扩增、激活、持久性的增加和/或癌细胞死亡杀伤能力的增加，以及根据本领域的理解和本文的描述显而易见的其他应答。“增加”或“增强”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包括比由媒剂或对照组合物产生的应答增加1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)(包括1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“减少”或“减低”或“减轻”或“降低”或“减弱”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的应答相比，本文预期的组合物产生、引发或引起更小生理应答(即，下游效应)的能力。“减少”或“降低”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包括比由媒剂、对照组合物产生的应答(参考应答)或特定细胞谱系中的应答减少1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)(包括1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“维持(maintain)”或“保留”或“维持(maintenance)”或“无变化”或“无实质性变化”或“无实质性减少”通常与由媒剂、对照分子/组合物产生的应答或特定细胞谱系中的应答相比，本文所考虑的组合物在细胞中产生、引发或引起较小生理应答(即下游效应)的能力。可比较的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。
综述
在一些方面，本披露涉及使用嵌合抗原受体(CAR)细胞疗法来治疗癌症的组合物和方法。更具体地，本披露涉及CAR细胞疗法，其中转化的细胞(如T细胞)表达靶向CLDN18.2的CAR。更进一步，本文披露的CAR构建体、表达该构建体的转化细胞和利用转化细胞的疗法可以提供针对表达CLDN18.2的癌症的稳健癌症治疗。本披露涉及用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞的培养方法，其产生表现出增加的抗原非依赖性激活的持续T细胞群。
不希望受理论的束缚，CLDN18.2被认为是以多种形态可行的癌症靶标，这些形态包括双特异性T细胞接合子、CAR细胞、以及单克隆抗体和抗体-药物缀合物(ADC)。此外，据信CLDN18.2是CAR细胞疗法的有希望的靶标。因此，已经如本文所述开发了抗体和源自这些抗体的CAR构建体。
CAR构建体设计
本披露的CAR构建体可具有几种组分，其中许多组分可以基于所得CAR构建体的希望的或精确的功能来选择。除了抗原结合结构域之外，CAR构建体还可具有间隔子结构域、铰链结构域、信号肽结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域(例如，一个或多个共刺激结构域)。在一些实施例中，CAR可以任选地包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸序列。选择一种组分而不是另一种(即选择来自一种受体的特定共刺激结构域，相对于来自不同受体的共刺激结构域)可影响临床功效和安全特性。
抗原结合结构域
本文预期的抗原结合结构域可包括抗体或其一个或多个抗原结合片段。一种预期的靶向CLDN18.2的CAR构建体包含单链可变片段(scFv)，该scFv含有来自对CLDN18.2具有特异性的一种或多种抗体的轻链和重链可变区，这些可变区直接连接在一起或经柔性接头(例如，具有1、2、3或更多个重复序列的G4S的重复序列)连接在一起。
如本文披露的靶向CLDN18.2的CAR的抗原结合结构域对CLDN18.2蛋白质的结合亲和力可以变化。与抗体(通常希望这些抗体具有更高亲和力)相比，在CAR的上下文中，结合亲和力与功效之间的关系可能更细微。例如，当与低亲和力的变体相比时，对源自高亲和力scFv(具有0.56nM的解离常数)的受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)-CAR的临床前研究导致治疗指数增加。相反地，已经报道了其他实例，其中，针对较低亲和力而工程改造scFv改善了具有不同抗原密度的细胞之间的区别。这可用于提高肿瘤组织与正常组织上差异表达的抗原的治疗特异性。
可以使用多种方法确定抗原结合结构域的结合亲和力。在一些实施例中，可以使用排除亲合力作用的方法。亲合力作用涉及与多个靶表位同时相互作用的多个抗原结合位点，通常涉及多聚结构。因此，亲合力在功能上代表多种相互作用的累积强度。排除亲合力作用的方法的一个实例是其中相互作用蛋白质的一种或两种是单体的/单价的任何方法，因为如果一个或两个配偶体仅含有单个相互作用位点，则多个同时相互作用是不可能的。
间隔子结构域
本披露的CAR构建体可具有间隔子结构域，以提供构象自由度，从而促进与靶细胞上的靶抗原结合。间隔子结构域的最佳长度可以取决于结合表位与靶细胞表面的接近度。例如，近端表位可能需要较长间隔子，而远端表位可能需要较短间隔子。除了促进CAR与靶抗原的结合以外，实现CAR细胞与癌细胞之间的最佳距离还可以有助于空间上阻塞大抑制分子进入CAR细胞和靶癌细胞之间形成的免疫突触。靶向CLDN18.2的CAR可具有长间隔子、中等间隔子和短间隔子。长间隔子可包括免疫球蛋白G1(IgG1)或IgG4(天然的，或具有治疗性抗体中常见的修饰，如S228P突变)的CH2CH3结构域(约220个氨基酸)，而CH3区可单独用于构建中等间隔子(约120个氨基酸)。较短间隔子可源自CD28、CD8α、CD3或CD4的区段(<60个氨基酸)。短间隔子也可源自IgG分子的铰链区。这些铰链区可源自任何IgG同种型，并且可以含有或可以不含有在治疗性抗体中常见的突变，如以上提及的S228P突变。例如，铰链结构域可包含IgG1铰链结构域或其变体、IgG2铰链结构域或其变体、IgG3铰链结构域或其变体、IgG4铰链结构域或其变体、CD8铰链结构域或其变体或CD28铰链结构域或其变体。
铰链结构域
靶向CLDN18.2的CAR也可具有铰链结构域。柔性铰链结构域是提供构象自由度以促进与肿瘤细胞上的靶抗原结合的短肽片段。它可单独使用或与间隔子序列结合使用。术语“铰链”和“间隔子”经常可互换使用-例如，可将IgG4序列视为“铰链”序列和“间隔子”序列(即，铰链/间隔子序列)。在一些实施例中，铰链结构域可以包含IgG1铰链结构域或其变体、IgG2铰链结构域或其变体、IgG3铰链结构域或其变体、IgG4铰链结构域或其变体(特别是IgG4P铰链结构域)、CD8铰链结构域或其变体或CD28铰链结构域或其变体。
靶向CLDN18.2的CAR可进一步包括包含信号肽的序列。信号肽的功能是促进细胞将CAR转移至细胞膜。实例包括IgG1重链信号多肽、Igκ或λ轻链信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2(GM-CSFR2或CSFR2)信号肽、CD8a信号多肽、或CD33信号肽。
跨膜结构域
靶向CLDN18.2的CAR可进一步包括包含跨膜结构域的序列。跨膜结构域可包括跨细胞膜的疏水α螺旋。跨膜结构域的特性没有如CAR构建体的其他方面一样经过细致地研究，但其可潜在地影响CAR表达并且与内源性膜蛋白的缔合。跨膜结构域可源自例如CD4、CD8α、或CD28。任何跨膜结构域均可用于本文披露的组合物中。在一些实施例中，跨膜结构域包含选自CD3、CD4、CD8α或CD28的跨膜结构域的跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
胞内结构域/共刺激结构域
靶向CLDN18.2的CAR还可包括形成胞内结构域和/或共刺激结构域(有时也称为信号传导结构域)的一个或多个序列。共刺激结构域是能够增强或调节免疫效应细胞的应答(即，能够启动免疫效应细胞的应答)的结构域。在一些实施例中，共刺激结构域和/或信号传导结构域可以衍生自胞内T细胞受体(TCR)信号传导结构域(例如，CD3ζ的胞质结构域，其含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的序列基序)。共刺激结构域可以包括例如来自CD3ζ(CD3z或CD3zeta)、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、CD27、GITR、CD2、IL-2Rβ和MyD88/CD40中的一个或多个的序列。在一些实施例中，共刺激结构域可以包括CD3ζ(CD3z或CD3zeta)、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、CD27、GITR、CD2、IL-2Rβ和MyD88/CD40中的一个或个的变体。例如，在实施例中，CAR共刺激结构域还可包括对CD3z结构域的修饰。例如，CD3z信号传导结构域变体可包含野生型CD3z中存在的三个ITAM中的1或2个功能性的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。共刺激结构域的选择影响CAR细胞的表型和代谢特征。例如，CD28共刺激产生具有高水平的细胞溶解能力、白细胞介素2(IL-2)分泌和糖酵解的有效的、但短暂的效应子样表型。相比之下，用携带4-1BB共刺激结构域的CAR修饰的T细胞往往在体内扩增和持续更长时间，具有增加的氧化代谢，不易耗竭，并且具有增加的产生中央记忆性T细胞的能力。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含共刺激结构域或其一部分。
在一些实施例中，胞内结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域选自由以下组成的组：CD28共刺激结构域、CD27共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域、ICOS共刺激结构域、OX-40共刺激结构域、GITR共刺激结构域、CD2共刺激结构域、IL-2Rβ共刺激结构域、MyD88/CD40共刺激结构域的胞内结构域及其任何组合。
在某些实施例中，胞内结构域包含共刺激结构域，该共刺激结构域包含胞内T细胞受体(TCR)信号传导结构域CD3ζ(或CD3z；CD3z信号传导结构域在本文中也称为“CD3z共刺激结构域”)的一部分。在一些实施例中，CD3ζ包含对CD3z格式的一个或多个修饰。例如，CD3z信号传导结构域变体可包含野生型CD3z中存在的三个ITAM中的1或2个功能性的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)(例如1XX、X1X或X2X)。
示例性CAR
根据本发明的所有方面，CAR可以包含以下或由以下组成：如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。根据本发明的所有方面，核酸CAR构建体可以包含以下或由以下组成：如SEQID NO:51所示的核酸序列。
装甲
在一些实施例中，本披露的CAR T细胞(包括TCR T细胞)可以是“装甲”CAR T细胞，其用包含编码一个或多个装甲分子的一个或多个装甲结构域的CAR构建体和/或包含编码一个或多个装甲分子的一个或多个装甲结构域的独立构建体转化(例如，使得转化的细胞表达CAR蛋白以及一个或多个装甲分子，例如调节组织微环境的细胞因子环境的细胞因子)。“装甲分子”是指当在细胞表面表达或在肿瘤微环境中分泌时抵抗肿瘤微环境中细胞的免疫抑制的蛋白质，并且可以提供本文未描述的许多另外益处，从而允许免疫抑制肿瘤微环境(TME)中的T细胞存活。在一些实施例中，装甲分子的表达可以是诱导型或组成型的。在一些实施例中，装甲分子在细胞表面表达。在一些实施例中，装甲分子分泌到细胞外以装甲CAR T细胞。装甲分子在细胞表面的表达和/或分泌到TME可以改善CAR T细胞的功效和持久性。在某些实施例中，可以敲除某些编码装甲分子的基因或有效消除它们的表达(例如，使用CRISPR)，以改善TME中CAR T细胞的功效和持久性。在本文中，此类CAR T细胞也被称为“装甲CAR T细胞”。可以根据肿瘤微环境以及先天性和适应性免疫系统的其他要素来选择装甲分子。在某些实施例中，装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。此外，研究者报道了修饰CAR-T细胞以分泌阻断PD-1的单链可变片段(scFv)，这改善了PD-L1+血液肿瘤和实体瘤的小鼠模型中的CAR-T细胞抗肿瘤活性(Rafiq,S.,Yeku,O.,Jackson,H.等人Targeteddelivery of a PD-1-blocking scFv by CAR-T cells enhances anti-tumor efficacyin vivo.[CAR-T细胞对阻断PD-1的scFv的靶向递送增强了体内抗肿瘤功效]NatBiotechnol[自然生物技术]36,847-856(2018))。在一些实施例中，装甲分子包含显性负性2型TGFβ受体(dnTGFβRII)。在某些实施例中，装甲分子包含与SEQ ID NO:54中所示氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，装甲分子包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR核酸构建体可以包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸序列(例如SEQ ID NO:53)。在某些实施例中，装甲结构域位于编码CAR的核酸的3’末端或编码CAR的核酸的5’末端。在一些实施例中，CAR和装甲结构域在单个启动子的控制下可操作地连接。在一些实施例中，CAR和装甲结构域通过内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。在一些实施例中，CAR和装甲结构域通过编码可切割肽接头(例如，自切割肽接头)的核苷酸序列连接。在某些实施例中，可切割肽接头包含T2A肽。如本文所述，2A自切割肽或2A肽是一类18-22个氨基酸长的肽，其可在细胞中蛋白质翻译过程中诱导核糖体跳跃。实例可以包括但不限于P2A(ATNFSLLKQAGDVEENPGP；SEQ ID NO:69)、E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPGP；SEQ ID NO:70)、F2A(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP；SEQ ID NO:71)和T2A(EGRGSLLTCGDVEENPGP；SEQ ID NO:72)。因此，在此类实施例中，虽然CAR核酸构建体和装甲结构域可以掺入相同的核酸载体中和/或可操作地连接，但在转录和翻译时，可以表达作为独立的蛋白质的CAR和装甲分子(由装甲结构域编码)。
示例性装甲CAR
根据本发明的所有装甲方面，CAR可包含以下或由以下组成：如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，且装甲分子可包含以下或由以下组成：如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。根据本发明的所有装甲方面，核酸CAR构建体可以编码具有如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的装甲CAR序列。在具体的实施例中，核酸CAR构建体可以包含以下或由以下组成：如SEQ ID NO:55所示的核酸序列。
CAR构建体评估
基于安全性以及持久性和中央记忆的建立，比较和评估本披露的构建体。由于其改善的安全性，有利地评估了较低亲和力(高解离率)的scFv，008LYG_D08。基于其改善的持久性和有利的体内表型(更多的中央记忆)的贡献，有利地评估了CD3z信号传导结构域和CD28共刺激结构域(两者在同一构建体中)。本披露的CLDN18.2 CAR与基于公开的靶向CLDN18.2的CAR的构建体相比是有利的。评估的细节可见于实例中。
CAR细胞产生
本披露的CAR构建体可包括本文所述的模块组分的一些组合。例如，在本披露的一些实施例中，CAR构建体包含CLDN18.2 scFv抗原结合结构域。在本披露的一些实施例中，CAR构建体包含CSFR2信号肽。在一些实施例中，CAR构建体包含携带S241P突变(IgG4P)的IgG4铰链/间隔子结构域。在一些实施例中，CAR构建体包含CD28跨膜结构域。
不同的共刺激结构域可用于本披露的CAR构建体中。在一些实施例中，CAR构建体包含共刺激结构域，该共刺激结构域包含来自CD3z的胞内结构域的信号传导结构域(例如，CD3ζ(或CD3z)的胞内T细胞受体(TCR)的信号传导结构域的一部分或其变体)。在一些实施例中，CAR构建体包含CD28共刺激结构域。在一些实施例中，CAR构建体包含4-1BB共刺激结构域。在一些实施例中，CAR构建体包含来自CD3z和CD28的共刺激结构域，如本文所述。在一些实施例中，CAR构建体包含来自CD3z和4-1BB的共刺激结构域，如本文所述。在一些实施例中，CAR构建体包含来自CD3z、CD28和4-1BB中所有的共刺激结构域，如本文所述。在一些实施例中，CAR构建体包含来自ICOS、OX-40和/或GITR的共刺激结构域。
细胞
基于CAR的细胞疗法可与多种细胞类型(如淋巴细胞)一起使用。可使用的特定细胞类型包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、恒定自然杀伤T(iNKT)细胞、αβT细胞、γδT细胞、病毒特异性T(VST)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、和调节性T细胞(Treg)。在一个实施例中，用于治疗受试者的CAR细胞是自体的。在其他实施例中，CAR细胞可来自遗传相似但不相同的供体(同种异体)。
SMART
本披露还涉及用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞的培养方法，其产生表现出增加的抗原非依赖性激活的持续T细胞群。首字母缩略词“SMART”(短操纵自动复制T细胞)是指缩短的T细胞制造和扩增过程，其中细胞在IL-21(和任选的IL-2)存在下培养。
本披露的一些方面涉及包含本文披露的多核苷酸或多肽的细胞。本披露的一些方面涉及包含(i)编码结合人CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸的细胞。在一些实施例中，细胞还包含(ii)编码装甲分子的多核苷酸。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，细胞是接受者的自体细胞。在一些实施例中，细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、γδT细胞、TSCM细胞、CMV+T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、及其任何组合。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是人细胞。
在本披露的T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞的来源。T细胞可从多种来源获得，包括例如外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本披露的某些实施例中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本披露的某些实施例中，可以从来自受试者收集的血液单位(使用本领域技术人员已知的任意数量的技术(如FicollTM分离))获得T细胞。在一个实施例中，通过单采术获得来自个体的循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞(包括T细胞)、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一个实施例中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以去除血浆级分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在可替代实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可以缺少镁，或者可以缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。同样，在没有钙的情况下的初始激活步骤导致放大的激活。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如根据制造商的说明通过使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+、无Mg2+的PBS，醋酸钠林格氏液A，或含或不含缓冲液的其他盐溶液中。可替代地，可以去除单采术样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在其他实施例中，通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和耗竭单核细胞，从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和CD45RO+T细胞。在一些实施例中，通过CD4和CD8表达的阳性选择来分离T细胞。例如，在一个实施例中，通过与抗CD4/抗CD8缀合的珠一起孵育足以阳性选择所需T细胞的时间来分离T细胞。在一个实施例中，该时间段是约30分钟。在进一步的实施例中，时间段的范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在进一步的实施例中，该时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在又另一个实施例中，该时间段是10至24小时。与其他细胞类型相比，在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或从免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞的捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD4/CD8珠结合的时间和/或通过增加或减少珠比T细胞的比率(如本文进一步描述的)，在培养开始时或在过程中的其他时间点可以优先选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少珠上或其他表面上抗CD4和/或抗CD8抗体的比率，在培养开始时或在其他所期望的时间点可以优先选择或针对T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本披露的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施例中，可能期望进行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以进行另一轮的选择。
通过阴性选择富集T细胞群体可以用针对阴性选择细胞特有的表面标记物的抗体的组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，所述流式细胞术使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16和HLA-DR的抗体。在某些实施例中，可能期望富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施例中，通过抗C25缀合珠或其他类似的选择方法来耗竭调节性T细胞。
为了通过阳性选择或阴性选择分离所期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒，如珠)的浓度。在某些实施例中，可能期望显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施例中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施例中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施例中，使用1千万个细胞/ml、1.5千万个细胞/ml、2千万个细胞/ml、2.5千万个细胞/ml、3千万个细胞/ml、3.5千万个细胞/ml、4千万个细胞/ml、4.5千万个细胞/ml、或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又另一个实施例中，使用7.5千万个细胞/ml、8千万个细胞/ml、8.5千万个细胞/ml、9千万个细胞/ml、9.5千万个细胞/ml、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。
在相关实施例中，可能期望使用较低浓度的细胞。通过显著地稀释T细胞和表面(例如颗粒，如珠)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这会选择表达大量与颗粒结合的所期望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个实施例中，所用细胞的浓度为5x106/ml。在其他实施例中，所使用的浓度可以为约1x105/ml至1x106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他实施例中，细胞可以在2℃-10℃或在室温在旋转器上以不同速度孵育不同长度的时间。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。在一些实施例中，冷冻和随后的解冻步骤可以通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度去除单核细胞来提供更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在此类情况下是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS；或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白、和7.5％DMSO，或31.25％醋酸钠林格氏液-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白、和7.5％DMSO的培养基；或含有例如Hespan和醋酸钠林格氏液A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即在-20℃或在液氮中的非受控冷冻。
在某些实施例中，在使用本披露的方法激活之前，将冷冻保存的细胞解冻并洗涤并使其在室温静置一小时。
在本披露的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增的细胞的来源，并且分离的和冷冻随后在T细胞疗法中使用的所期望的细胞(例如免T细胞)用于受益于T细胞疗法(如本文所述的那些)的任意数量的疾病或病症。在一个实施例中，血液样品或单采样品取自通常健康的受试者。在某些实施例中，血液样品或单采样品来自大体上健康的受试者，该受试者有发展疾病的风险但尚未患上疾病，并且目的细胞被分离并冷冻供以后使用。在某些实施例中，T细胞可被扩增、冷冻并在稍后使用。在某些实施例中，在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在进一步的实施例中，在任意数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采样品中分离细胞，这些治疗方式包括但不限于用药剂(如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂)、化学疗法、辐射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和辐射治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导信号转导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell[细胞]66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.[免疫学]73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.[免疫学当前观点]5:763-773,1993)。在进一步的实施例中，为患者分离细胞并冷冻以供随后与以下结合使用(例如，之前、同时或之后)：骨髓或干细胞移植，使用化学治疗剂(如氟达拉滨)、外部光束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺、或抗体(如OKT3或CAMPATH)进行的T细胞消融疗法。在另一个实施例中，细胞在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的药剂，例如美罗华)之前被分离并且可以在B细胞消融疗法之后被冷冻以用于随后的治疗。
在本披露的进一步的实施例中，T细胞是在治疗后直接从患者获得的。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗之后，特别是用破坏免疫系统的药物治疗后，在患者通常将从治疗中恢复期间治疗后不久，获得的T细胞的质量对于其离体扩增的能力可以是最佳的或改善的。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本披露的上下文中，预期在该恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施例中，动员(例如，用GM-CSF或G-CSF动员)和预处理方案可用于在受试者中产生病症，其中特别细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在疗法后确定的时间窗口期间。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞、和免疫系统的其他细胞。
T细胞的激活和扩增
无论是在对T细胞进行遗传修饰以表达期望的CAR之前还是之后，通常可以使用例如以下中描述的方法来激活和扩增T细胞：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005。
通常，本披露的T细胞通过与表面接触而扩增，该表面附接有刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群，例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或者通过与缀合至钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，可以使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，需要使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besangon，法国)，可以如使用本领域熟知的其他方法一样使用(Berg等人,TransplantProc.[移植程序]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.[免疫学方法杂志]227(1-2):53-63,1999)。
在某些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到相同的表面(即，以“顺式”形成)或分开的表面(即，以“反式”形成)。可替代地，可以将一种药剂偶联到表面而另一种药剂在溶液中。在一个实施例中，提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且提供初级激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些实施例中，两种药剂都可以在溶液中。在另一个实施例中，这些药剂可以是可溶形式，然后交联至表面，例如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于激活和扩增本披露中的T细胞。
在一个实施例中，将两种药剂固定在珠上，在相同的珠上(即“顺式”)或者分开的珠上(即“反式”)。例如，提供初级激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段，并且两种药剂以相等的分子量共固定在相同的珠上。在一个实施例中，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本披露的某些实施例中，使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。
在本披露的进一步的实施例中，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后将珠和细胞分离，然后培养细胞。在可替代的实施例中，在培养之前，药剂包被的珠和细胞不是分开的，而是一起培养的。在进一步的实施例中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的增加的连接，从而诱导细胞刺激。
适合T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小基本培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(龙沙公司(Lonza)))，其可以含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)，白细胞介素-2(IL-2)、IL-21、胰岛素、IFN-7、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、等离子体、和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、Optimizer，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一种或多种细胞因子的量。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包括在实验培养物中，而不包括在待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％CO2)。在一个实施例中，培养基是含有1％(v/v)重组血清替代品(ITSE-A)的X-VIVO 15无血清培养基。
在一个实施例中，T细胞在含有10至300IU/mL重组人IL-2的培养基中培养。在一个实施例中，T细胞在含有10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200或300IU/mL重组人IL-2的培养基中培养。在另一个实施例中，T细胞在还含有0.1至0.3U/mL之间的重组IL-21的培养基中培养。在另一个实施例中，T细胞在含有IL-2和0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、75或100U/mL的重组人IL-21培养基中培养。在另一个实施例中，T细胞在含有IL-2和0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29或0.30U/mL重组人IL-21的培养基中培养。在一个实施例中，T细胞在含有40IU/mL重组人IL-2和0.24U/mL重组人IL-21的培养基中培养。
在本披露的一个实施例中，细胞培养长达14天。在另一个实施例中，可以将混合物培养4天。T细胞在培养的任何阶段都可以被搅动。在一个实施例中，在细胞培养期间在含有IL-2和IL-21的培养基中搅动细胞。在某些实施例中，与第6天收获的CAR-T细胞相比，第4天收获的T细胞表现出更高的靶标独立杀伤活性。
本披露的抗CLDN18.2抗体
本披露的一些方面涉及特异性结合人CLDN18.2的抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)，其中VH包含VH互补决定区(CDR)1、VH-CDR2、VH-CDR3；且其中该VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。在一些实施例中，特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合部分包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)，其中VH包含VH互补决定区(CDR)1、VH-CDR2、VH-CDR3；且其中该VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中
(a)该VH-CDR1包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列；
(b)该VH-CDR2包含选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列；
(c)该VH-CDR3包含选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列；
(d)该VL-CDR1包含选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列；
(e)该VL-CDR2包含选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列；和
(f)该VL-CDR3包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列。
VH可包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。VL可包含选自SEQ IDNO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或抗原结合部分包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；和VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中：
(a)VH-CDR1包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列，VH-CDR2包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列，VH-CDR3包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列，VL-CDR1包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列，VL-CDR2包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列，以及VL-CDR3包含SEQ IDNO:6中所示氨基酸序列；
(b)VH-CDR1包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列，VH-CDR2包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列，VH-CDR3包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列，VL-CDR1包含SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列，VL-CDR2包含SEQ ID NO:15中所示氨基酸序列，以及VL-CDR3包含SEQID NO:16中所示氨基酸序列；
(c)VH-CDR1包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列，VH-CDR2包含SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列，VH-CDR3包含SEQ ID NO:23中所示氨基酸序列，VL-CDR1包含SEQ ID NO:24中所示氨基酸序列，VL-CDR2包含SEQ ID NO:25中所示氨基酸序列，以及VL-CDR3包含SEQID NO:26中所示氨基酸序列；
(d)VH-CDR1包含SEQ ID NO:31中所示氨基酸序列，VH-CDR2包含SEQ ID NO:32中所示氨基酸序列，VH-CDR3包含SEQ ID NO:33中所示氨基酸序列，VL-CDR1包含SEQ ID NO:34中所示氨基酸序列，VL-CDR2包含SEQ ID NO:35中所示氨基酸序列，以及VL-CDR3包含SEQID NO:36中所示氨基酸序列；或
(e)VH-CDR1包含SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列，VH-CDR2包含SEQ ID NO:42中所示氨基酸序列，VH-CDR3包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列，VL-CDR1包含SEQ ID NO:44中所示氨基酸序列，VL-CDR2包含SEQ ID NO:45中所示氨基酸序列，以及VL-CDR3包含SEQID NO:46中所示氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或抗原结合部分包含VH和VL，其中：
(a)该VH包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，任选地其中该抗体或抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的scFv；
(b)该VH包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列，任选地其中该抗体或抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的scFv；
(c)该VH包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列，任选地其中该抗体或抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列的scFv；
(d)该VH包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列，任选地其中该抗体或抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列的scFv；或
(e)该VH包含SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列，任选地其中该抗体或抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列的scFv。
本披露的载体、宿主细胞和药物组合物
在一些实施例中，本披露的多核苷酸存在于载体中。因此，本文提供包含本披露的多核苷酸的载体。在一些实施例中，本披露涉及包含编码如本文所述的CAR的多核苷酸的载体或载体组。在其他实施例中，本披露涉及包含编码本文披露的装甲分子的多核苷酸的载体或载体组。在其他实施例中，本披露涉及包含编码如本文所披露的特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合分子的多核苷酸的载体或载体组。
在一些实施例中，载体组包含第一载体和第二载体，其中第一载体包含编码本文披露的CAR的核酸序列，第二载体包含编码本文披露的装甲分子的核酸序列。在其他实施例中，载体包含编码本文披露的CAR的核酸序列和编码本文定义的装甲分子的装甲结构域。
本领域已知的任何载体可适用于本披露。在一些实施例中，该载体是病毒载体。在一些实施例中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体、乳头状病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(AAV)、慢病毒载体、转座子或其任何组合。在某些实施例中，使用病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统将CAR和/或抗体或其抗原结合片段被包围和/或递送至细胞和/或患者。
在其他实施例中，本文提供了包含本披露的多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施例中，本披露涉及宿主细胞，例如体外细胞，其包含编码如本文所述的CAR或TCR的多核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及宿主细胞，例如体外细胞，其包含编码如本文披露的特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合分子的多核苷酸。在其他实施例中，本披露涉及体外细胞，其包含由编码特异性结合CLDN18.2的CAR的多核苷酸编码的多肽。在其他实施例中，本披露涉及细胞，体外细胞，其包含由编码如本文所披露的特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合分子的多核苷酸编码的多肽。
任何细胞可用作本披露的多核苷酸、载体或多肽的宿主细胞。在一些实施例中，细胞可以是原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞例如哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)像埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia Marcescens)、和志贺氏杆菌(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌)、和链霉菌属(Streptomyces)。在一些实施例中，细胞是人细胞。
本披露的其他实施例涉及包含本文所述的多核苷酸、本文所述的载体、本文所述的多肽或本文所述的细胞的组合物。在一些实施例中，组合物包含药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施例中，组合物包含赋形剂。在一个实施例中，组合物包含编码CAR的多核苷酸，其中所述CAR包含特异性结合CLDN18.2的抗原结合分子。在另一个实施例中，组合物包含由本披露的多核苷酸编码的CAR，其中CAR包含特异性结合CLDN18.2的抗原结合分子。在另一个实施例中，组合物包含含有编码CAR的多核苷酸的T细胞，其中CAR包含特异性结合CLDN18.2的抗原结合分子。在另一个实施例中，组合物包含如本文所述的特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合分子。在另一个实施例中，组合物包含细胞(例如，T细胞，例如CAR-T细胞)，其包含编码含有如本文披露的特异性结合CLDN18.2的抗原结合结构域的CAR的多核苷酸。
在其他实施例中，组合物被配制用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道(如口服)递送的药物组合物。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。在某些实施例中，使用缓冲液将组合物维持在生理pH值或稍低的pH值，通常pH值范围为从约5至约8。在某些实施例中，当考虑肠胃外施用时，组合物是在药学上可接受的媒剂中的无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式，其含有或不含有另外的治疗剂。在某些实施例中，用于肠胃外注射的媒剂是含有或不含至少一种另外的治疗剂的无菌蒸馏水，被配制为适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施例中，该制剂包括所需分子与聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体的配制品，其提供产物的控制或持续释放，其随后经由储库注射递送。在某些实施例中，可植入药物递送装置用于引入所需分子。
用CAR治疗癌症
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗癌症的CAR细胞。具有本文所述用途的组合物(例如，抗体、CAR构建体、和CAR细胞)和方法尤其可用于抑制赘生性细胞的生长或扩散；特别是CLDN18.2在其中发挥作用的肿瘤细胞生长。
可通过本披露的组合物治疗的赘生物包括实体瘤，例如，肝、肺或胰腺的实体瘤。然而，本文列出的癌症不旨在进行限制。例如，本文考虑治疗的癌症类型包括例如胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌非小细胞肺癌。
在一个实施例中，此处预期用于治疗的癌症包括在癌细胞的细胞表面上表达CLDN18.2的任何癌症。本文考虑治疗的癌症可包括但不限于胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌和非小细胞肺癌。
治疗方法
本披露的CAR修饰的细胞(如CAR T细胞)可单独施用或作为具有稀释剂和/或与细胞因子或细胞群体缔合的其他组分的药物组合物施用。简言之，本披露的药物组合物可包括例如如本文所述的CAR T细胞、以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、缓冲盐水等；硫酸盐；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质、多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；辅助剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本披露的药物组合物可适于治疗(或预防)。
在一些实施例中，本披露提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含含有抗原结合结构域的抗CLDN18.2嵌合抗原受体(CAR)的细胞。抗原结合结构域可以是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab、或scFv。在某些实施例中，VH包含含有选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且VL包含含有选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ IDNO:6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。在某些实施例中，VH包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。在一些实施例中，VL包含选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。在一些实施例中，该方法进一步抑制肿瘤生长、诱导肿瘤消退、和/或延长受试者的存活。
在一些实施例中，本披露提供了治疗方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。如本文所用，本文披露的抗CLDN 18.2抗体或其抗原结合片段(或药物配制品)的“有效量”是指在必要的剂量和时间内，达到所期望治疗或预防效果的有效量。
在一些实施例中，该细胞是自体细胞。例如，该自体细胞可以选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、和调节性T细胞。
在一些实施例中，通过该方法治疗的癌症是实体瘤。例如，癌症可以是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌和非小细胞肺癌。
实施例
在一些实施例中，本披露提供：
实施例1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中该CAR包含：
(a)密封蛋白18.2(CLDN18.2)特异性的抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)一个或多个胞内结构域。
实施例2.如实施例1所述的分离的核酸序列，其中该抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、单链可变片段(scFv)、单链抗体、VHH、vNAR、纳米抗体(单结构域抗体)或其任何组合。
实施例3.如实施例2所述的分离的核酸序列，其中该抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
实施例4.如实施例3所述的分离的核酸序列，其中该抗原结合结构域是包含选自SEQ ID NO:9、19、29、39和49的氨基酸序列的scFv。
实施例5.如实施例1至4中任一项所述的分离的核酸序列，其中该跨膜结构域包含选自CD4、CD8α或CD28的跨膜结构域的跨膜结构域。
实施例6.如实施例5所述的分离的核酸序列，其中该跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
实施例7.如实施例1至6中任一项所述的分离的核酸序列，其中该一个或多个胞内结构域包含共刺激结构域或其一部分。
实施例8.如实施例7所述的分离的核酸序列，其中该共刺激结构域包含CD3z、CD2、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、IL-2Rβ、GITR、MyD88/CD40a共刺激结构域和/或其变体中的一种或多种。
实施例9.如实施例1至8中任一项所述的分离的核酸序列，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
实施例10.如实施例1至8中任一项所述的分离的核酸序列，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
实施例11.如实施例1至8中任一项所述的分离的核酸序列，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
实施例12.如实施例1至11中任一项所述的分离的核酸序列，其中该CAR进一步包含铰链/间隔子结构域，任选地，其中该铰链/间隔子结构域位于该抗原结合结构域和该跨膜结构域之间。
实施例13.如实施例12所述的分离的核酸序列，其中该铰链/间隔子结构域包含IgG1铰链结构域或其变体、IgG2铰链结构域或其变体、IgG3铰链结构域或其变体、IgG4铰链结构域或其变体、IgG4P结构域、CD8铰链结构域或其变体或CD28铰链结构域或其变体。
实施例14.如实施例13所述的分离的核酸序列，其中该铰链/间隔子结构域是IgG4铰链/间隔子或其变体，任选地是包含S241P突变的IgG4P铰链/间隔子。
实施例15.如实施例1至14中任一项所述的分离的核酸序列，其中该核酸序列编码具有如SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的CAR，任选地其中该核酸序列如SEQ ID NO:51中所示。
实施例16.如实施例1至15中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸序列，任选地其中该装甲结构域位于编码该CAR的核酸的3’末端或编码该CAR的核酸的5’末端。
实施例17.如实施例16所述的分离的核酸序列，其中该装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。
实施例18.如实施例17所述的分离的核酸序列，其中该装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。
实施例19.如实施例17或18所述的分离的核酸序列，其中该装甲分子包含与SEQID NO:54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例20.如实施例17至19中任一项所述的分离的核酸序列，其中该显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO:54的序列，任选地其中编码该dnTGFβRII的装甲结构域具有如SEQ ID NO:53中所示的序列。
实施例21.如实施例1至20中任一项所述的分离的核酸序列，其中该CAR和该装甲结构域在单个启动子的控制下可操作地连接。
实施例22.如实施例1至20中任一项所述的分离的核酸序列，其中该CAR和该装甲结构域通过内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。
实施例23.如实施例1至22中任一项所述的分离的核酸序列，其中该CAR和该装甲结构域通过编码可切割肽接头的核苷酸序列连接。
实施例24.如实施例23所述的分离的核酸序列，其中该可切割肽接头是自切割肽接头。
实施例25.如实施例23或24所述的分离的核酸序列，其中该可切割肽接头包含T2A肽。
实施例26.如实施例1至25中任一项所述的分离的核酸序列，其中该核酸序列编码选自SEQ ID NO:55、10、20、30、40和50的序列。
实施例27.一种包含抗原结合结构域的抗CLDN18.2嵌合抗原受体(CAR)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab、或scFv；
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
实施例28.如实施例27所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该VH包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。
实施例29.如实施例27或28所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该VL包含选自SEQ IDNO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
实施例30.如实施例27至29所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR包含跨膜结构域和一个或多个胞内结构域。
实施例31.如实施例27至30中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该跨膜结构域包含选自CD4、CD8α或CD28的跨膜结构域的跨膜结构域。
实施例32.如实施例31所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
实施例33.如实施例27至32中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该一个或多个胞内结构域包含共刺激结构域或其一部分。
实施例34.如实施例33所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该共刺激结构域包含CD3z、CD2、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、IL-2Rβ、GITR、MyD88/CD40a共刺激结构域和/或其变体中的一种或多种。
实施例35.如实施例30至34中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
实施例36.如实施例30至34中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
实施例37.如实施例30至34中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
实施例38.如实施例27至37中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR进一步包含铰链/间隔子结构域，任选地，其中该铰链/间隔子结构域位于该抗原结合结构域和该跨膜结构域之间。
实施例39.如实施例38所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该铰链/间隔子结构域包含IgG1铰链结构域或其变体、IgG2铰链结构域或其变体、IgG3铰链结构域或其变体、IgG4铰链结构域或其变体、IgG4P结构域、CD8a铰链结构域或其变体或CD28铰链结构域或其变体。
实施例40.如实施例39所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该铰链/间隔子结构域是IgG4铰链/间隔子或其变体，任选地是包含S241P突变的IgG4P铰链/间隔子。
实施例41.如实施例27至40中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR具有如SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。
实施例42.如实施例27至40中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR进一步包含装甲分子。
实施例43.如实施例42所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。
实施例44.如实施例43所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。
实施例45.如实施例43或44所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该装甲分子包含与SEQID NO:54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例46.如实施例43至45中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO:54的序列。
实施例47.如实施例27至46中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR和该装甲分子通过编码可切割肽接头的核苷酸序列连接。
实施例48.如实施例47所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该可切割肽接头是自切割肽接头。
实施例49.如实施例47或48所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该可切割肽接头包含T2A肽。
实施例50.如实施例27-49中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR包含选自SEQ ID NO:56、10、20、30、40和50的氨基酸序列。
实施例51.一种载体，其包含如实施例1-26中任一项所述的分离的核酸序列或编码如实施例27-50中任一项所述的嵌合抗原受体，任选地其中该载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统，任选地其中该载体是慢病毒。
实施例52.一种细胞，其包含如实施例51所述的载体。
实施例53.一种细胞，其包含编码如实施例27-50中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，优选地其中该细胞包含编码具有如SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的CAR的核酸序列和编码具有如SEQ ID NO:54中所示的序列的显性负性II型TGFβ受体的核酸，任选地其中编码该CAR的该核酸序列如SEQ ID NO:51中所示并且编码该显性负性II型TGFβ受体的该序列如SEQ ID NO:53中所示。
实施例54.一种包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab或scFv；
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
实施例55.如实施例54所述的细胞，其中该VH包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。
实施例56.如实施例54或55所述的细胞，其中该VL包含选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
实施例57.如实施例54至56中任一项所述的细胞，其中该CLDN18.2特异性抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:52中所示的序列。
实施例58.如实施例54至57中任一项所述的细胞，其中该细胞进一步包含装甲分子。
实施例59.如实施例58所述的细胞，其中该装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。
实施例60.如实施例59所述的细胞，其中该装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。
实施例61.如实施例59或60所述的细胞，其中该装甲分子包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例62.如实施例59至61中任一项所述的细胞，其中该显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO:54的序列。
实施例63.如实施例52-62中任一项所述的细胞，其中该细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞和调节性T细胞。
实施例64.如实施例63所述的细胞，其中该细胞在与表达CLDN18.2的肿瘤细胞接触后表现出抗肿瘤免疫。
实施例65.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
向有需要的受试者施用有效量的细胞，该细胞包含含有抗原结合结构域的抗CLDN18.2嵌合抗原受体(CAR)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab、或scFv，
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
实施例66.如实施例65所述的方法，其进一步包括抑制肿瘤生长、诱导肿瘤消退、和/或延长该受试者的存活。
实施例67.如实施例65所述的方法，其中该细胞是自体细胞。
实施例68.如实施例67所述的方法，其中该自体细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞和调节性T细胞。
实施例69.如实施例65-68中任一项所述的方法，其中该癌症是实体瘤。
实施例70.如实施例69所述的方法，其中该实体瘤是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。
实施例71.如实施例70所述的方法，其中该实体瘤是胰腺癌。
实施例72.一种特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)，其中该VH包含VH互补决定区(CDR)1、VH-CDR2、VH-CDR3；且其中该VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中：
(a)该VH-CDR1包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31和41的氨基酸序列；
(b)该VH-CDR2包含选自SEQ ID NO:2、12、22、32和42的氨基酸序列；
(c)该VH-CDR3包含选自SEQ ID NO:3、13、23、33和43的氨基酸序列；
(d)该VL-CDR1包含选自SEQ ID NO:4、14、24、34和44的氨基酸序列；
(e)该VL-CDR2包含选自SEQ ID NO:5、15、25、35和45的氨基酸序列；和
(f)该VL-CDR3包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36和46的氨基酸序列。
实施例73.如实施例72所述的抗体或其抗原结合部分，其中：
(a)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列；
(b)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ IDNO:12中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列；
(c)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ IDNO:22中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列；
(d)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ IDNO:32中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列；或
(e)该VH-CDR1包含SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ IDNO:42中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列。
实施例74.如实施例72所述的抗体或其抗原结合部分，其中该VH包含与选自SEQID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例75.如实施例72至74中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中该VH包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。
实施例76.如实施例72至75中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中该VL包含与选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例77.如实施例72至75中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中该VL包含选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
实施例78.如实施例72至77中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中：
(a)该VH包含与SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(b)该VH包含与SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(c)该VH包含与SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(d)该VH包含与SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)该VH包含与SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例79.如实施例72至78中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中：
(a)该VH包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列；
(b)该VH包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列；
(c)该VH包含SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列；
(d)该VH包含SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列；或
(e)该VH包含SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列。
实施例80.一种药物组合物，其包含如实施例1至26中任一项所述的分离的核酸、如实施例27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如实施例51所述的载体、如实施例52至64中任一项所述的细胞或如实施例72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的赋形剂。
实施例81.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例1至26中任一项所述的分离的核酸、如实施例27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如实施例51所述的载体、如实施例52至64中任一项所述的细胞、如实施例72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或如实施例80所述的药物组合物。
实施例82.如实施例81所述的方法，其中该疾病或病症包括癌症。
实施例83.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例1至26中任一项所述的分离的核酸、如实施例27至50中任一项所述的抗CLDN18.2CAR、如实施例51所述的载体、如实施例52至64中任一项所述的细胞、如实施例72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或如实施例80所述的药物组合物。
实施例84.如实施例82或83所述的方法，其中该癌症是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。
实施例85.如实施例1至26中任一项所述的分离的核酸、如实施例27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如实施例51所述的载体、如实施例52至64中任一项所述的细胞、如实施例72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或如实施例80所述的药物组合物在治疗有需要的受试者的疾病或病症中的用途。
实施例86.如实施例85所述的用途，其中该疾病或病症包括癌症。
实施例87.如实施例1至26中任一项所述的分离的核酸、如实施例27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如实施例51所述的载体、如实施例52至60中任一项所述的细胞、如实施例72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或如实施例80所述的药物组合物在治疗有需要的受试者的癌症中的用途。
实施例88.如实施例86或87所述的用途，其中该癌症是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。
实施例89.一种扩增T细胞群的方法，该方法包括：
(a)从样品中分离CD3+T细胞；
(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；
(c)激活这些CD3+T细胞；
(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；
(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞；和
(f)收获这些CAR-T细胞。
实施例90.一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：
(a)获得包含CD3+T细胞群的样品；
(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；
(c)激活这些CD3+T细胞；
(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；
(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；和
(f)收获这些CAR-T细胞。
实施例91.如实施例89或90所述的方法，其中该CD3+T细胞群由分离的CD4+和CD8+T细胞群形成。
实施例92.如实施例89至91中任一项所述的方法，其中该培养基进一步包含人白细胞介素2(IL-2)。
实施例93.如实施例89至92中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中在培养基中培养约1x106至约1x109个CD3+T细胞。
实施例94.如实施例89至93中任一项所述的方法，其中该样品是通过白细胞单采术收集的富集的单采术产物。
实施例95.如实施例89至94中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞培养约一天或约两天。
实施例96.如实施例89至95中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞用CD2、CD3、CD28或其任何组合的激动剂激活。
实施例97.如实施例89至96中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞用磁性微珠激活。
实施例98.如实施例89至97中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞用抗CD3抗体或其CD3结合片段和抗CD28抗体或其CD28结合片段激活。
实施例99.如实施例98所述的方法，其中将该抗CD3抗体或其CD3结合片段和该抗CD28抗体或其CD28结合片段与磁性微珠偶联。
实施例100.如实施例89至99中任一项所述的方法，其中将这些CAR-T细胞在步骤(e)中培养约两天至约十天。
实施例101.如实施例89至99中任一项所述的方法，其中将这些CAR-T细胞在步骤(e)中培养约四天至约六天。
实施例102.如实施例101所述的方法，其中将这些CAR-T细胞在步骤(e)中培养约四天。
实施例103.如实施例101所述的方法，其中将这些CAR-T细胞在步骤(e)中培养约六天。
实施例104.如实施例92至103中任一项所述的方法，其中人IL-21的浓度为约0.01U/mL至约0.3U/mL，并且人IL-2的浓度为约5IU/mL至约100IU/mL。
实施例105.如实施例89至104中任一项所述的方法，其中人IL-21的浓度为约0.19U/mL。
实施例106.如实施例105所述的方法，其中人IL-2的浓度为约40IU/mL。
实施例107.如实施例89至106中任一项所述的方法，其中在步骤(b)期间搅动这些CD3+T细胞。
实施例108.一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)从样品中分离CD4+和CD8+T细胞以形成CD3+T细胞群；(b)在包含浓度为40IU/mL的人白细胞介素2和浓度为0.19U/mL的人白细胞介素21的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)用包含抗CD3抗体或其CD3结合片段和抗CD28抗体或其CD28结合片段的磁珠激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；(e)将这些CAR-T细胞在培养基中培养约四天；以及(f)收获这些CAR-T细胞。
实施例109.如实施例89至108中任一项所述的方法，其中该载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统。
实施例110.如实施例89至109中任一项所述的方法，其中该载体是慢病毒。
实施例111.如实施例110所述的方法，其中该慢病毒以约0.25至约20的感染复数(MOI)添加。
实施例112.如实施例111所述的方法，其中该慢病毒以约1至约4的MOI添加。
实施例113.如实施例111所述的方法，其中该慢病毒以约2或约4的MOI添加。
实施例114.如实施例89至113中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后该细胞培养基的体积增加。
实施例115.如实施例114所述的方法，其中该细胞培养基的体积增加至少约6倍。
实施例116.如实施例89至115中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的培养基每天至少更换一次。
实施例117.如实施例89至116中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的培养基约每12小时更换。
实施例118.如实施例89至117中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约5倍。
实施例119.如实施例89至117中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约3倍。
实施例120.如实施例119所述的方法，其中这些CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增约2倍。
实施例121.如实施例119所述的方法，其中这些CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增约3倍。
实施例122.如实施例89至121中任一项所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQ IDNO:6中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:15中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQID NO:16中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:23中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:24中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:25中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQID NO:26中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:31中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:32中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:33中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:34中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:35中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQID NO:36中所示氨基酸序列的VL-CDR3；或
(e)包含SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO:42中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO:44中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO:45中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQID NO:46中所示氨基酸序列的VL-CDR3。
实施例123.如实施例122所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含VH，该VH包含与选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例124.如实施例122所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含VH，该VH包含选自SEQ ID NO:7、17、27、37和47的氨基酸序列。
实施例125.如实施例122至124中任一项所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含VL，该VL包含与选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例126.如实施例125所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含VL，该VL包含选自SEQ ID NO:8、18、28、38和48的氨基酸序列。
实施例127.如实施例122至126中任一项所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含：
(a)包含与SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(b)包含与SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(c)包含与SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(d)包含与SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；或
(e)包含与SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL。
实施例128.如实施例127所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含：
(a)包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的VL；
(b)包含SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的VL；
(c)包含SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的VL；
(d)包含SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列的VL；或
(e)包含SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列的VL。
实施例129.如实施例89至125中任一项所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含如SEQ ID NO:52中所示的序列。
实施例130.如实施例89至129中任一项所述的方法，其中编码结合CLDN18.2的该CAR的核酸进一步包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸序列，任选地其中该装甲结构域位于编码该CAR的核酸的3’末端或编码该CAR的核酸的5’末端。
实施例131.如实施例89至129中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞包含装甲分子。
实施例132.如实施例130或131所述的方法，其中该装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。
实施例133.如实施例130至132中任一项所述的方法，其中该装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。
实施例134.如实施例130至133中任一项所述的方法，其中该装甲分子包含与SEQID NO:54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例135.如实施例132至134中任一项所述的方法，其中该显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO:54的序列。
实施例136.如实施例89至113530中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞配制在等渗溶液中。
实施例137.如实施例136所述的方法，其中该等渗溶液包含含有人血清白蛋白的醋酸钠林格氏液。
实施例138.如实施例136或实施例137所述的方法，其中该等渗溶液含有约1x 106至约1x 109个CAR-T细胞。
实施例139.如实施例138所述的方法，其中该等渗溶液含有约3.4×106个CAR-T细胞。
实施例140.如实施例89至139中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞是TCM和TSCM细胞的混合物。
实施例141.如实施例140所述的方法，其中约15％至约50％的这些CAR-T细胞是TSCM细胞并且表达CD45RA、CCR7和CD27，并且不表达CD45RO。
实施例142.如实施例141所述的方法，其中约20％至约30％的这些CAR-T细胞是TSCM细胞并且表达CD45RA、CCR7和CD27，并且不表达CD45RO。
实施例143.如实施例89至142中任一项所述的方法，其中超过50％的这些CAR-T细胞表达嵌合抗原受体。
实施例144.如实施例143所述的方法，其中约40％至约60％的这些CAR-T细胞表达嵌合抗原受体。
实施例145.如实施例89至144中任一项所述的方法，其中超过50％的这些CAR-T细胞表达CD8。
实施例146.如实施例145所述的方法，其中约40％至约60％的这些CAR-T细胞表达CD8。
应理解，本文所述的说明书的特定方面不限于呈现的特定实施例，并且可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并且并不旨在进行限制，除非本文特别定义。此外，如技术人员将认识到的，本文披露的特定实施例可与本文披露的其他实施例结合而不受限制。
实例
以下实例示例了本披露的具体实施例及其各种用途。阐述它们仅出于解释目的并且不应以任何方式解释为限制本披露的范围。
背景
嵌合抗原受体T细胞疗法对所谓的液体肿瘤或血液、骨髓或淋巴结中发生的癌症表现出卓越的抗肿瘤活性。然而，对实体瘤具有有效活性的CAR-T疗法一直难以捉摸。没有转化至实体瘤的原因是多方面的，但可归因于几个因素。首先是选择限制正常组织表达的抗原，以防止所谓的“中靶、脱靶肿瘤毒性”。因此，成功的CAR-T关键的首要方面之一是选择肿瘤相关抗原，理想情况下肿瘤细胞上的表达增加，而正常组织中的表达有限或限制进入。CLDN18是一种良好表征的四跨膜蛋白，参与紧密连接的形成以及细胞屏障功能和细胞极性的维持。已鉴定出CLDN18的两种不同亚型，即CLDN18.1和CLDN18.2，每种亚型都具有不同的正常组织表达模式，其中在胃粘膜的分化细胞中发现CLDN18.2的正常组织表达最多。在大部分胰腺癌、胃癌和食管腺癌中观察到CLDN18.2水平升高，在其他癌症适应症(包括结直肠癌、卵巢癌和胆管树癌)中也有一定表达，但普遍性较低。CLDN18.2的表达跨动物物种维持，与食蟹猴的同源性为99％，与鼠的同源性为89％，与大鼠CLDN18.2的同源性为90％。
将血液系统恶性肿瘤中的CAR-T成功转化至实体瘤的另一个挑战是，一旦CAR-T能够持续存在并渗透到肿瘤部位，它们通常会面临高度免疫抑制性肿瘤微环境。这包括TME中存在抑制性免疫细胞，例如Treg、骨髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，它们促进肿瘤细胞增殖、转移和分泌可以关闭T细胞功能的抑制性细胞因子，例如IL-4、IL-10和TGFβ。
在实体瘤中达到有效应答的另一个障碍是开发能够在回输后继续扩增和持续存在的CAR-T细胞，以防止潜在的肿瘤再生或复发。已经确定，选择或生成具有较低分化或TSCM表型的CAR-T细胞可以赋予CAR-T产品增强的自我更新和增殖能力，这可以导致增强的持久性和更稳健的抗肿瘤应答(Gattinoni,Nat Med[自然医学]2011；17:1290-7)。分化程度较低的CAR-T的生成可以通过多种方法来完成，包括缩短和优化的制造方案。为了将CAR-T递送给患者，T细胞从患者血液中分离出来，然后进行基因工程改造和离体制造，经历多次倍增和扩增，直到达到向患者给药或回输的CAR-T数量。优化生产策略以生成富含这些分化程度较低的细胞的输注产品是生成具有增强的抗肿瘤活性潜力的更持久的CAR-T细胞的一种手段。
材料和方法：
细胞系：
所有细胞均按照供应商的建议在培养基中培养，并维持在37℃、湿润气氛、5％CO2的组织培养瓶中。Aspc1、BxPC3、HEK293和NCI-N87获自美国组织培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)。NUGC4获自理研生物资源研究中心(Riken BioResource Research)(日本茨城县)。SNU-601获自韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)(韩国首尔)。内源表达CLDN18.2的PaTu 8988s细胞系(“未分选”)获自DSMZ保藏中心(德国不伦瑞克)。
慢病毒制备
为了生成表达CLDN18变体的细胞系，编码人CLDN18.2(Uniprot：P56856-2)、人CLDN18.1(Uniprot：P56856-1)、人CLDN18.2 M149L、人CLDN18.2 Q29M、人CLDN18.2 N37D、人CLDN18.2 A42S、人CLDN18.2 N45Q、人CLDN18.2 Q47E、人CLDN18.2 E56Q、人CLDN18.2G65P、人CLDN18.2 L69I、食蟹猴CLDN18.2(Uniprot：A0A2K5VV62)、食蟹猴CLDN18.1(Uniprot：A0A2K5VVB4)、大鼠CLDN18.2(Uniprot：Q5I0E5)、大鼠CLDN18.1(Uniprot：P56857-3)、小鼠CLDN18.2(Uniprot：P56857-3)和小鼠CLDN18.1(Uniprot：P56857)的DNA获自整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)(科拉尔维尔(Coralville)、衣阿华州)，并转移至来自系统生物科学公司(System Biosciences)(帕洛阿尔托(Palo Alto)、加利福尼亚州)的慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体。pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体表达掺入多克隆位点(MCS)的基因和用于抗生素选择的嘌呤霉素抗性基因。此外，将编码人、食蟹猴、大鼠和小鼠CLDN18.2的DNA转移到经修饰的慢病毒pCDH1-CMV-MCS-EF1-Puro-T2A-GFP载体中。经修饰的pCDH1-CMV-MCS-EF1-Puro-T2A-GFP载体表达掺入MCS的基因、用于抗生素选择的嘌呤霉素抗性基因和GFP，这被证明可用于高通量筛选。
为了生成慢病毒，将慢病毒载体与pPACKH1(系统生物科学公司，目录号LV500A-1)共转染至悬浮HEK293细胞中，并在37℃、8％CO2和125RPM下孵育过夜。转染后第1天，将含有转染细胞的培养物以2500RPM离心5分钟。弃去培养物上清液，将沉淀的细胞重悬浮于30mL新鲜FreeStyle 293培养基中，并在37℃、8％CO2和125RPM下孵育。转染后第2天，将悬浮HEK293培养物转移至50mL锥形管中，并以2500RPM离心5分钟。过滤含有慢病毒的培养物上清液并以100,000x g离心2小时。将沉淀的慢病毒重悬于600μL Opti-MEM(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)目录号31985062)中，等分于冷冻管中，并保存在-80℃下。
为了生成表达CLDN18变体的悬浮HEK293细胞，将悬浮HEK293在15mL中稀释至4E5个细胞/mL，并用50μL 50x浓缩慢病毒转导。将细胞在37℃、8％CO2和125RPM下生长3天，然后用2μg/mL嘌呤霉素进行选择、扩增并储存。Aspc1、HEK293、NCI-N87、BxPC3和NUGC4类似地用慢病毒转导并用嘌呤霉素选择，尽管培养基和培养要求不同。
实例1.抗CLDN18.2抗体和/或其抗原结合片段的开发和表征基于细胞的噬菌体选择，用于分离CLDN18.2特异性先导物
CLDN18.2反应性scFv先导物是通过基于细胞的噬菌体选择产生的。表达人CLDN18.2的经工程改造的HEK293细胞(克隆D2＝约150,000个受体/细胞)用作源抗原，用于从重组框架(REF)单链可变片段(scFv)噬菌体库中选择CLDN18.2反应性噬菌体。REF噬菌体文库是基于IGHV1-69*01和IGLV1-44*01种系的天然合成VH-VL scFv文库；CDR H1-2和CDRL1-2包含完全种系序列，其中文库多样性(1x109)源自CDRH3中的9个随机氨基酸(ARXXXXXXXXDX；SEQ ID NO:57)和CDR L3中的5个随机氨基酸(AAWDXXXXXVV；SEQ ID NO:58)。
简而言之，将表达人CLDN18.2(克隆D2)的HEK293细胞和含有1012个噬菌体的REF噬菌体文库的等分试样在补充有10％FBS的DMEM中在室温下轻轻振荡封闭1小时然后将封闭的细胞和文库轻轻振荡孵育1小时，用PBS充分洗涤细胞和结合的噬菌体，并通过添加三乙胺(TEA)回收噬菌体。回收的噬菌体用于在37℃下感染指数生长的TG11小时。使用受感染的TG1培养物的等分试样来滴定选择输出，并将剩余的受感染的TG1培养物以3000RPM离心10分钟。弃去培养上清液，将代表受感染的TG1的沉淀重悬浮于500μL 2xTYCG(含有100μg/mL羧苄青霉素和2％葡萄糖的2xYT培养基)中，铺在2xTYCG琼脂生物测定板上，并在30℃下孵育过夜。将含有羧苄青霉素抗性TG1的生物测定板刮擦并转移至含有10mL 2xTYCG的50mL聚丙烯管中。选择输出的等分试样准备用于长期储存、DNA分离和噬菌体拯救。为了长期储存，将1200μL选择输出转移至含有600μL 50％(v/v)甘油的冷冻管中，并储存在-80℃下。对于DNA分离，根据制造商的方案，使用Plasmid Plus Maxi Kit(凯杰公司(Qiagen)，目录号12963)从选择输出中分离噬菌粒DNA。分离的DNA储存于-20℃。
对于噬菌体拯救，使用50-100μL选择输出来接种50mL 2xYTCG，并在37℃和250RPM下生长，直至达到OD600 0.5。将一部分培养物(25mL)转移至50mL聚丙烯管中，用M13KO7辅助噬菌体(MOI>10)在37℃下超感染1小时(静置30分钟，150RPM振荡30分钟)。然后将辅助噬菌体感染的选择输出以3000RPM离心10分钟。弃去含有辅助噬菌体的细胞上清液，将细胞沉淀重悬浮于25mL 2xTYCK(含有100μg/mL羧苄青霉素和30μg/mL卡那霉素的2xTY培养基)中，并在25℃和250RPM在250mL Erlenmeyer培养烧瓶中生长过夜。将过夜培养物转移至50mL聚丙烯管中，并在4℃下以4750RPM离心15分钟。将细胞上清液转移至新鲜的50mL聚丙烯管中，并在4℃下以8000RPM离心25分钟。然后将含有扩增噬菌体的上清液转移至含有6mL PEG/NaCl的新鲜50mL聚丙烯管中，轻轻混合，并在冰上孵育1小时。通过在4℃、8000RPM下离心25分钟收获PEG沉淀的噬菌体。弃去上清液，将噬菌体沉淀重悬浮于1mL PBS-LT(补充有0.01％(v/v)Tween 20的磷酸盐缓冲盐水)中，并转移至1.5mL Eppendorf管中。然后将噬菌体悬浮液在4℃下以24,000x g离心10分钟以去除污染细菌。将800μL上清液转移至含有200μL PEG-NaCl的新鲜1.5mL Eppendorf管中，并在冰上孵育15分钟。然后将两次PEG沉淀的噬菌体在4℃下以4,000xg离心10分钟。弃去上清液，将噬菌体沉淀重悬浮于400μL PBS-LT中，并转移至新鲜的1.5mL Eppendorf管中。然后将噬菌体悬浮液在4℃下以24,000xg离心10分钟。然后将纯的可溶性噬菌体转移至新鲜的1.5mL Eppendorf管中，测定滴度并储存在4℃下。
总之，在表达CLDN18.2的HEK293细胞上进行了三轮噬菌体选择，其中噬菌体选择表现出CLDN18.2反应性先导物的逐轮富集。第二轮选择输出表现出良好的特异性和多样性谱，并被用作大规模筛选的基础。
针对CLDN18.2特异性筛选先导物
将来自噬菌体选择的候选scFv转化为scFv-Fc格式，以便通过流式细胞术进行筛选。通过评估候选物scFv-Fc与表达衍生自人、大鼠和小鼠以及PaTu 8988s的CLDN18.2和CLDN18.1的HEK293的结合，评估CLDN18.2同种型反应性和特异性。PaTu 8988s是一种内源性表达人CLDN18.2的胰腺癌衍生细胞系。
简而言之，将来自选择输出的批量噬菌粒DNA用NotI(新英格兰生物实验室(NewEngland BioLabs),R3189)和SfiI(新英格兰生物实验室,R0123)在37℃下消化6小时，以及在50℃下消化6小时。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰贵公司，目录号28706)对代表scFv编码序列的DNA片段进行凝胶纯化，使用T4连接酶(新英格兰生物实验室，M0202)连接到NotI和SfiI消化的pSpliceV4中，并转化进入One Shot TOP10细胞(新英格兰生物实验室，C3019)。pSpliceV4载体编码哺乳动物信号序列、多克隆位点和人IgG Fc结构域。转化体在250RPM和37℃下生长1.5小时，铺在2xTYCG琼脂生物测定板上并在37℃下孵育过夜。
通过ClonePix选择代表单个转化体的88个细菌菌落，并将其转移到每个含有1.2mL 2xTY培养基(补充有100μg/mL羧苄青霉素)的96深孔板中；其余孔留空并用于阳性和阴性筛选对照。接种的培养板用两层透气膜密封，并在800RPM和37℃下生长过夜。将50μL过夜培养物转移至含有50μL 50％(v/v)甘油的96孔圆底板(VWR目录号73520-474)中，并保存在-80℃下。根据制造商的方案，使用NucleoSpin 96质粒试剂盒(马歇雷-纳格尔公司(Macherey-Nagel)，目录号740625.4)从剩余的细菌培养物中分离DNA，不同之处在于，在室温下孵育5-10分钟后，DNA在120μL无核酸酶水中洗脱。96孔圆底板中所得的DNA(35-45ng/μL)储存于-20℃。
使用瞬时转染来生成候选scFv-Fc。简言之，在转染前一天将悬浮HEK293分成0.7E6个细胞/mL的密度。转染当天，向每个孔中添加0.53μL 293Fectin(赛默飞世尔科技公司目录号12347019)、24μL Opti-MEM和10μL pSpliceV4 DNA(350-450ng)进行转染。293Fectin、Opti-MEM和DNA在室温下孵育20-25分钟，然后添加350μL悬浮HEK293培养物。含有转染的细胞的板用两个透气膜密封，并在37℃、8％CO2和350RPM下孵育。转染后3天后，每孔培养物补充150μL FreeStyle 293表达培养基，并再培养3天。转染后第6天，使用96孔过滤器(密理博公司(Millipore)，目录号MSHVS4510)和真空设备过滤含有候选scFv-Fc的培养物。对澄清的转染上清液进行定量，并立即通过流式细胞术测量进行结合实验测试。
为了筛选悬浮HEK293细胞，通过流式细胞术同时评估CLDN18.2和CLDN18.1结合和特异性。简而言之，将25,000个表达人CLDN18.2和绿色荧光蛋白(GFP)的悬浮HEK293和25,000个表达人CLDN18.1的悬浮HEK293液洗涤并重悬浮于50μL FACS缓冲液(PBS，pH 7.2，补充有2％FBS、2mM EDTA和0.1％叠氮化钠)中。将25μL FACS缓冲液和25μL澄清的转染上清液添加到相应的孔中。将稀释的候选scFv-Fc与混合细胞悬浮液在冰上孵育30分钟。用冰冷的FACS缓冲液彻底清洗细胞结合的scFv-Fc，然后用Alexa647AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)目录号109-606-98)在冰上染色30分钟。然后用冰冷的FACS缓冲液充分洗涤细胞，并用补充有DAPI(赛默飞世尔科技公司目录号62248)的FACS缓冲液在冰上染色10分钟。所有筛选评估均包含针对CLDN18.2结合的阳性和阴性对照；5μg/mL阳性对照CLDN18.2抗体用作阳性对照，仅二抗用作阴性对照。在IntelliCyt iQue(IntelliCyt公司)上评估候选scFv-Fc与细胞的结合。首先针对活细胞/死细胞对细胞群进行门控，然后根据GFP+/GFP-进行门控。表现出CLDN18.2+细胞结合(GFP+)但不表现出CLDN18.1+细胞结合(GFP-)的ScFv-Fc被认为是潜在的先导物并进行了进一步表征。
通过流式细胞术，以类似于对人CLDN18.2和CLDN18.1完成的方式，对大鼠CLDN18.2而非大鼠CLDN18.1以及单独的小鼠CLDN18.2而非小鼠CLDN18.1的候选scFv-Fc结合特异性进行了评估。食蟹猴CLDN18.2在相关胞外结构域中与人CLDN18.2具有相同的序列；因此，不优先筛选食蟹猴CLDN18.2。
相反，候选scFv-Fc与PaTu 8988s(一种内源表达人CLDN18.2的胰腺癌细胞系)的结合被用来确认CLDN18.2结合能力。简而言之，PaTu 8988s细胞用澄清的scFv-Fc上清液染色，用FACS缓冲液洗涤，用Alexa647AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG染色，用FACS缓冲液洗涤，并用补充有DAPI的FACS缓冲液染色。在带有活/死细胞门控的IntelliCytiQue上评估候选scFv-Fc与细胞的结合。
总之，从筛选的2640个候选scFv-Fc中鉴定出444个潜在先导物。在444个潜在先导物中，442个表现出与PaTu 8988s(CLDN18.2+)细胞的强结合。在442个潜在先导物中，359个显示出与大鼠CLDN18.2而不是与大鼠CLDN18.1的强结合；然而，在442个潜在先导物中，只有一个显示出与小鼠CLDN18.2而不是与小鼠CLDN18.1的强结合。
CLDN18.2特异性先导物的DNA测序
由EuroFins(美国)使用pSpliceFwd(5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTT-3'；SEQ IDNO:59)和pMcoFcRev(5'-CTGATCATCAGGGTGTCCTTGG-3'；SEQ ID NO:60)从pSpliceV4 DNA制备物中回收编码所有442个CLDN18.2特异性scFv的DNA序列。使用DNASTAR软件(麦迪逊，威斯康星州)对结果进行分析，并鉴定出218个独特的CLDN18.2特异性先导物。
IgG1形式的先导物的亲和力和交叉反应性评估
有希望的CLDN18.2特异性先导物被转换为IgG1形式，以进行亲和力和交叉反应性评估。很大程度上由于REF文库固有的受限随机性，许多CLDN18.2特异性序列可分为新VH和VL、常见VH和新VL、变体VH和新VL、或变体VH和常见VL。因此，优先先导物表现出：(1)对PaTu8988s具有高结合能力，(2)在人、大鼠和小鼠评估中对CLDN18.2具有高选择性；和(3)独特的CDRH3序列，目的是鉴定具有独特特性的抗体。
通过PCR扩增编码有希望的CLDN18.2特异性先导物的VH和VL的DNA，并使用NEBuilder HiFi DNA组装母混合物(新英格兰生物实验室，目录号E2621)组装进入适当消化的pOE-IgG1(λLC)。简而言之，将100μg PCR产物、50μg消化的pOE-IgG1(λLC)、10μLNEBuilder HiFi DNA组装母混合物放入200μL PCR管中的20μL反应液中。将组装混合物短暂离心并在50℃下孵育1小时。孵育后，将1μl组装产物转化至One Shot TOP10细胞(新英格兰生物实验室，C3019)中。转化体在250RPM和37℃下生长1小时，铺在2xTYC琼脂板上并在37℃下孵育过夜。羧苄青霉素抗性群落在2xYTC培养基中于37℃培养过夜。使用QIAprep SpinMiniprep试剂盒(凯杰公司，目录号27106)从接种的培养物中分离DNA。使用P130s FOR(5'-CCGTCGCCGCCACCATGGAC-3'；SEQ ID NO:61)、P219 REV(5'-CTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3'；SEQID NO:62)、信号肽_内含子FOR(5’-GGAGCTGTATCATCCTCTTC-3’；SEQ ID NO:63)和P220 REV(5'-GAGATGCTACTGGGGCAACGG-3’；SEQ ID NO:64)对DNA进行测序。序列验证的表达构建体用于瞬时转染。
使用中国仓鼠卵巢来源的G22细胞进行瞬时转染。简而言之，使用LIPOFECTAMINETM将含有有希望的CLDN18.2特异性VH和VL结构域的pOE-IgG1(λLC)载体转染至G22细胞中。转染后3天和7天使用专有物料供养转染的G22。转染后第10天收获转染上清液，通过MabSelect SuRE亲和色谱和尺寸排阻色谱进行过滤和纯化。纯化的抗体是纯的且不含聚集体(>98.0％单体)。
然后通过流式细胞术表征纯化的CLDN18.2抗体的亲和力和交叉反应性。简要地。将表达人、食蟹猴、大鼠或小鼠CLDN18.2的HEK293细胞重悬浮于FACS缓冲液中，用不同抗体浓度(0-533nM)染色，用FACS缓冲液洗涤，用Alexa647AffiniPure F(ab')2山羊抗人IgG片段染色，用FACS缓冲液洗涤并用补充有DAPI的FACS缓冲液染色。在带有活/死细胞门控的FACSymphony(BD)上评估抗体与细胞的结合。使用中值荧光强度(MFI)的直方图计算给定浓度下每种抗体的几何平均值(FlowJo,LLC)。在Prism(GraphPad)中绘制几何平均值并用于计算结合EC50。显示了5种抗体(ZP1I16_D05 IgG1、008LY1_D04 IgG1、08LYG_D08IgG1、008M0G_G03 IgG1、ZP1I18_B08 IgG1)和1种阴性对照抗体(R347 IgG1)的代表性结果，尽管还对31种其他有希望的抗体进行了表征(表1)。
结果表明，ZP1I16_D05 IgG1、008LY1_D04 IgG1、08LYG_D08 IgG1、008M0G_G03IgG1、ZP1I18_B08 IgG1结合人和食蟹猴CLDN18.2，ZP1I16_D05 IgG1、08LYG_D08 IgG1、008M 0G_G03 IgG1、ZP1I18_B08 IgG1结合大鼠CLDN18.2。并且，只有08LYG_D08 IgG1结合小鼠CLDN18.2。人和啮齿类动物CLDN18.2结合的差异表明，这些抗体具有包含胞外环1(ECL1)和胞外环2(ECL2)上残基的构象表位，因为啮齿类动物CLDN18.2在ECL2中具有微小差异，但具有相同的ECL1。此外，所有结合亲和力和交叉反应性评估均与以scFv-Fc形式进行的筛选结果一致。
有希望的CLDN18.2抗体的表位评估
结合表位的特征，特别是膜邻近性，已被证明对CAR-T和T细胞接合器介导的细胞溶解作用的效力产生关键影响。因此，开发了一些方法来表征有希望的CLDN18.2抗体的表位，并对转换为CAR-T形式的先导物进行优先排序。
为此，通过流式细胞术表征了与人CLDN18.2野生型和变体结合的有希望的抗体。通过生成与野生型仅存在人CLDN18.1中出现的一个氨基酸的差异的人CLDN18.2变体，变体聚焦于人CLDN18.2特异性的决定簇。通过这种方式，我们可以将抗体表位区分到特定区域，并可能确保突变不会显著干扰整体CLDN18.2结构和表面表达。为此目的，生成了表达CLDN18.2 Q29M、CLDN18.2 N37D、CLDN18.2 A42S、CLDN18.2 N45Q、CLDN18.2 Q47E、CLDN18.2 E56Q、CLDN18.2 G65P或CLDN18.2 L69I的HEK293。
与CLDN18.2特异性筛选类似，用CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(C34554)标记25,000个表达野生型CLDN18.2的HEK293细胞，并在96孔圆底板中与每孔50μL FACS缓冲液中的25,000个表达变体CLDN18.2的未标记HEK293混合。对于每种表征的抗体，需要8个孔来确定CLDN18.2特异性。细胞混合物用FACS缓冲液中的抗体(终浓度10-20μg/mL)在冰上标记30分钟，用FACS缓冲液洗涤，用Alexa647AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG在冰上染色30分钟，用FACS缓冲液洗涤，并用补充有DAPI的FACS染色10分钟。在带有活/死细胞、FITC+(CLDN18.2野生型)和FITC-(CLDN18.2变体)细胞门控的MACSQuant流式细胞仪(美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec))上评估抗体与细胞的结合。
对于不参与结合表位的变体，FITC+和FITC-细胞群在APC通道中表现出等同的MFI。对于直接参与结合表位的变体，FITC+细胞群在APC通道中表现出强烈的结合，而FITC-细胞群则表现出很少或没有信号。
测试了三十六种有希望的CLDN18.2抗体。结果总结于表2中。有意义的是，大多数被表征的抗体都具有对Q47E和L69I变体(如008LY1_D04 IgG1)敏感的表位，这可能表明REF文库本质上偏爱这种CLDN18.2表位。然而，还鉴定出了其他表位。例如，ZP1I16_D05IgG1对N45Q和Q47E敏感；08LYG_D08 IgG1对N45Q、Q47E、E56Q和E65P敏感，并具有透膜表位；并且，008M0G_G03和ZP1I18_B08IgG1对N45Q、Q47E和L69I敏感。
出人意料的是，ZP1I16_D05 IgG1和ZP1I18_B08 IgG1具有相同的VH结构域，仅CDRL3中的3个连续残基不同，但它们的表位却显著不同。
评估抗体与表达CLDN18.2 M149L的HEK293的结合
还评估了有希望的抗体与人CLDN18.2 M149L的结合，因为人CLDN18.2 M149L是一种天然的CLDN18.2变体，在CLDN18.2+癌症患者群体中以低水平存在。简而言之，将表达人CLDN18.2 M149L的HEK293用FACS缓冲液中10μg/mL的有希望的CLDN18.2抗体子集染色30分钟，用FACS缓冲液洗涤，用Alexa647AffiniPure F(ab')2山羊抗人IgG片段染色，用FACS缓冲液洗涤，并用含有DAPI的FACS缓冲液染色。在带有活/死细胞门控的FACSymphony(BD)上评估抗体与细胞的结合。使用平均荧光强度(MFI)的直方图评估与CLDN18.2 M149L的结合。结果如图3所示。
内化的表征
除了有希望的CLDN18.2抗体亲和力、交叉反应性和表位表征之外，还评估了抗体内化。为此，在经修饰的ZAP测定(高级靶向系统公司(Advanced Targeting Systems))中筛选了36种有希望的CLDN18.2抗体、阳性对照抗体和阴性对照抗体(R347 IgG1)，其中与有效的DNA损伤性细胞毒素缀合的抗人Fc Fab抗体(50kDa)用于评估通过细胞死亡的内化作用。简言之，在第0天，将表达CLDN18.1或CLDN18.2的HEK293细胞铺板于组织培养处理的394孔板(康宁公司(Corning)3765)中。第二天，将具有恒定浓度的毒素缀合的Fab的培养基储备液制备为板1中的溶液1，仅该溶液对CLDN18.2靶向细胞显示出最小的毒性。第二板是用每种测试和对照抗体的稀释系列制成的。将储备溶液1与稀释曲线中各抗体的培养基以1:1混合，使得抗人Fc Fab抗体的终浓度恒定并且测试抗CLDN18.2抗体呈系列。将该混合物以1:2稀释度添加到含有CLDN18.2+细胞系的四个复制孔中(384孔板中20μl混合物加20ul培养基)，并将板在37℃和5％CO2下培养6天。在终点时，根据制造商的方案，使用CellTiter-发光活力测定(CTG，普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)评估活力，并使用EnVision发光计(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)读取发光。细胞活力测定如下：(处理的样品的平均发光/对照样品的平均发光)x100。IC50值通过GraphPadPrism软件通过逻辑非线性回归分析确定。
在内化测定中测试的36种有希望的CLDN18.2抗体中，35种表现出内化表型，其中ZP1I18_B08 IgG1是唯一不表现出内化的抗体(图4A)。相反，在工程改造表达CLDN18.1的细胞中没有观察到内化(图4B)。
实例2.抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的CAR转化
在完全表征的36种有希望的CLDN18.2抗体中，对于转换为CAR形式并进行体外和体内评估而言5种CLDN18.2抗体是优先的。基于ZP1I16_D05、008LY1_D04、008LYG_D08、008M0G_G03、ZP1I18_B08的抗体对CLDN18.2表现出高亲和力和特异性，在相关毒理学物种中保持理想的交叉反应性，并具有独特的构象表位和内化特征。
为了生成编码CLDN18.2反应性CAR的慢病毒表达载体，从pSpliceV4中PCR扩增编码ZP1I16_D05、008LY1_D04、008LYG_D08、008M0G_G03、ZP1I18_B08 scFv序列的DNA并进行凝胶纯化。然后将编码ScFv的PCR产物组装进入适当消化的pESRC-CD33前导序列-MCS-IgG4P-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2a-GFP或pESRC-CD33前导序列-MCS-IgG4P-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2a-mCherry。这些构建体包含编码CD33前导序列、具有S241P突变的IgG4铰链(IgG4P)、CD28跨膜结构域、4-1BB胞质结构域和CD3z胞质结构域变体、自切割T2a肽以及绿色荧光蛋白(GFP)或mCherry的序列。简而言之，将100μg PCR产物、50μg消化的pESRC-MCS-IgG4P-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2a-GFP/mCherry、10μL NEBuilder HiFi DNA组装母混合物放入200μL PCR管中的20μL反应液中。将组装混合物短暂离心并在50℃下孵育1小时。孵育后，将1μl组装产物转化至One Shot TOP10细胞(新英格兰生物实验室，C3019)中。转化体在250RPM和37℃下生长1小时，铺在2xTYC琼脂板上并在37℃下孵育过夜。羧苄青霉素抗性群落在2xYTC培养基中于37℃培养过夜。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司，目录号27106)从接种的培养物中分离DNA。使用以下对DNA进行测序：EF1 FOR(5'-TTCGTTTTCTGTTCTGCGCCG-3'；SEQ ID NO:65)和4-1BB REV(5'-TGTACAGCAGCTTCTTTCTGCC-3'；SEQ ID NO:66)(对于含有4-1BB的载体)或EF1 FOR和CMS312s(5'-AGCCGTACATGAACTGAGGG-3'；SEQ ID NO:67)。使用序列验证的构建体来生成慢病毒。
还探索了可替代的CAR形式，包括可替代的铰链(CD8、CD28)、跨膜结构域(CD8)、共刺激结构域(CD28)和CD3ζ结构域(1XX、X1X、X2X ITAM变体)。
CAR-T制造
对于“传统制造”CAR-T生产以及随后在体外和体内测定中的使用，根据制造商方案使用Dynabeads(英杰公司(Invitrogen))激活来自健康供体的纯化人总T细胞(CD4和CD8)，并且将细胞在含有5％人AB血清(威利生物医药公司(Valley Biomedical))和人IL-2(300IU/ml，派普泰克公司(Peprotech))的AIM-V培养基中生长。过夜激活后，除了聚凝胺(1ug/ml)之外，还以MOI＝5将慢病毒添加到T细胞，并将细胞在37℃、2500rpm下离心2小时。添加慢病毒后72小时，磁性去除Dynabeads并更换培养基，使细胞达到0.5E6/ml的最终细胞浓度。细胞在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养，并在扩增期间根据需要进行拆分。通常按照“传统制造”方案在转导后10至14天使用或冷冻保存细胞。
为了“缩短制造”CAR-T细胞生产以及随后在体外和体内测定中的使用，纯化的人总T细胞(CD4和CD8)从健康供体收集并用Transact(1:17.5v/v比，美天旎公司(Miltenyi))在摇瓶中的完全培养基中激活，然后将烧瓶放入51rpm的培养箱(37℃和5％CO2，被动湿度控制)。使用X-VIVO15(龙沙公司(Lonza))+40u/mL IL-2(美天旎公司)+0.24u/mL IL-21(美天旎公司)+1x ITSEA(InVitria公司)制备缩短的制造CAR-T细胞完全培养基。过夜激活后，将慢病毒以MOI＝1.5添加到T细胞，并在2小时后将另外的完全培养基添加到摇床上。此时摇床速度增加至69rpm。监测细胞的活力，并每天更换培养基，以将细胞浓度保持在1.5e6直至第4天。通常按照“缩短制造”方案在转导后第4天使用或冷冻保存细胞。
为了确定CAR+转导的水平，使用了以下试剂或方法之一：通过流式细胞术监测标记有AF647的抗Fab检测试剂(杰克逊公司(Jackson)，目录号109-606-006)、与Alexa-Fluor647缀合的抗008LYG_D08 scFv试剂或与CAR慢病毒共表达的GFP或mCherry蛋白。为了测定dnTGFβRII表面表达的水平，使用了抗TGFβRIIPE(博奇公司(BioLegend)Cat#399703)。将细胞在FACS缓冲液中洗涤3x，并用上述试剂在4℃下在黑暗中染色30分钟。然后将细胞另外洗涤三次并重悬浮于含有DAPI的FACS缓冲液中以对活/死细胞进行门控。使用FACSymphony仪器(BD)进行采集，并使用FlowJo软件(树星公司(Treestar),阿什兰(Ashland),俄勒冈州)分析数据。
对于“传统”和“缩短制造”CAR-T细胞，在扩增的最后一天，使用CS-10冷冻介质(干细胞公司(StemCell))冷冻保存细胞，并以每1ml CS-10最多放置100e6个细胞，然后将小瓶放入冷细胞容器(CoolCell Container)(康宁公司)中，放入-80℃冰箱中48小时，此时将小瓶转移到液氮中进行长期储存。
CLDN18.2表达的定量流式细胞术
如所述进行CLDN18.2的定量表面表达。对于细胞系CLDN18.2表达的流式细胞术评估，用PBS洗涤贴壁细胞，然后通过TrypLE Express从烧瓶中取出，重悬浮于完全培养基中，然后使用Vi-Cell Blu细胞活力分析仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，波利斯，印第安纳州)进行计数。将细胞在FACS缓冲液(1X PBS加2％FBS)中以每孔2x105个细胞一式两份铺在圆底96孔板中，并在4℃下以1200rpm离心4分钟。在剩余的测定中，细胞保持在4℃(冰上)。使用直接与Alexa Fluor 647缀合的10μg/mL 008LY1_D04或008LYG_D08对细胞进行表面染色，并在4℃下于黑暗中孵育30分钟。然后将细胞洗涤三次并重悬浮于含有DAPI的FACS缓冲液中以对活/死细胞进行门控。出于定量目的，每次测定中还包括QuantumTMSimply珠(邦斯实验室公司(Bangs Laboratories,Inc.),费舍尔(Fishers),印第安纳州)，并以与癌细胞相同的方式进行染色。使用FACSymphony仪器(BD)进行细胞和珠的数据采集，并使用FlowJo软件(树星公司,阿什兰,俄勒冈州)分析数据。使用邦斯实验室公司提供的QuickCal分析模板将平均荧光强度(MFI)转换为抗体结合能力(ABC)值。
经修饰的细胞系生成方案
使用CLDN18.2特异性试剂进行的初始流式细胞术显示PaTu8988s“未分选”细胞系中存在阳性和阴性细胞的混合/异质细胞群。使用流式细胞术辅助细胞分选，使用FACSAria融合细胞分选仪(BD)(其产生同质且高表达的细胞系)生成PaTu 8988s“高分选”细胞系。
对于CLDN18.2的CRISPR/Cas9敲除，多指导RNA购自Synthego公司(雷德伍德城(Redwood City)，加利福尼亚州)，Cas9购自整合DNA技术公司(IDT，科拉尔维尔(Coralville)，爱荷华州)。核糖核蛋白(RNP)复合物按照Synthego公司建议的方案进行组装(sgRNA与Cas9的比例为9:1)。将细胞和预复合的RNP在Eppendorf管中混合，并转移至RUOOC-25x3盒(MaxCyte公司，罗克维尔(Rockville)，马里兰州)中，并使用ExPERT GTx电穿孔仪(MaxCyte公司)按照优化方案9进行电穿孔。细胞重复三轮该敲除方案。
蛋白质印迹
使用FACSAria融合细胞分选仪(BD)对CAR-T细胞进行分选，生成100％纯的CAR+群。然后将这些细胞与1ng/ml重组人TGFβ共培养不同时间段，此时将细胞置于冰上并在RIPA缓冲液+1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂中裂解以进行蛋白质检测。根据制造商的方案，使用Novex NuPage凝胶(4-12％)对裂解物进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后使用Invitrogen iBlot转移到硝酸纤维素膜上。通过HRP缀合抗体和超灵敏增强化学发光(ECL)底物(赛默科技公司(Thermo Scientific))用Image Quant生物分子成像系统检测磷酸SMAD-2/3(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)(CST)Cat 8828S)、总SMAD-2/3(细胞信号传导技术公司(CST)Cat 8685S)和作为上样对照的β-肌动蛋白(西格玛公司A3854)。
免疫组织化学
收集新鲜组织并在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，转移到70％乙醇中，然后使用组织加工机(Tissue Tek Tissue Processor)通过标准组织处理方法进行处理，随后包埋到石蜡块中并在室温下保存。实验前，将每个样品的5μm组织切片在60℃下烘烤1小时。
使用自动化Leica Bond RX IHC染色平台(莱卡公司(Leica)，米尔顿凯恩斯(Milton Keynes)，英国)进行免疫组织化学(IHC)。使用Bond ER2溶液在100℃进行抗原修复30分钟后，将过氧化物酶块孵育5分钟。将CLDN18.2一抗(艾博抗公司(Abcam)，克隆EPR19202)以在含有背景降低成分的Dako稀释液(安捷伦公司(Agilent)cat S3022)中稀释的0.5或1.0μg/ml的浓度孵育60分钟。使用Bond Polymer Refine检测试剂盒证明了IHC结合。
与针对TGFβ的方案类似，但有以下修改。使用Bond ER2溶液在100℃下修复抗原20分钟，然后使用过氧化物酶块修复10分钟，并使用S-Block 1/1(Ventana公司)修复15分钟。将TGFβ1一抗(艾博抗公司ab215715)以在含有背景降低成分的Dako稀释液中稀释的1.74ug/ml(1:300)的浓度孵育60分钟。
使用Ventana Discovery染色平台进行初级磷酸SMAD2 IHC。脱蜡后，在98℃的CC1溶液中进行抗原修复40分钟，并将抑制剂孵育12分钟。接下来，以0.435ug/ml(1:200)的浓度添加一抗(细胞信号传导技术公司138D4)，36℃孵育36分钟，二抗兔HRP孵育16分钟，DAB孵育8分钟，苏木精孵育12分钟并发蓝处理12分钟。
用DPX封固剂盖玻片后，病理学家对载玻片进行扫描、检查和评分，评估表达CLDN18.2的肿瘤细胞的比例、染色强度和染色的细胞定位。所有载玻片均使用LeicaAperio Scanscope AT2病理载玻片扫描仪(莱卡公司，米尔顿凯恩斯，英国)进行数字扫描。CLDN18.2 IHC评分使用以下方法生成：确定具有任何表达水平(0-4等级)的细胞比例，然后确定染色强度(1-3等级)。CLDN18.2总分(0-12)是通过将比例得分乘以强度得分来确定的。相同的评分系统也用于肿瘤细胞中TGFβ的表达。基质组分的评分如下进行，因为肿瘤样品中基质细胞存在的总量有所不同：基质细胞存在的总量(0-3等级)乘以染色的总体强度(1-3等级)以获得基质染色值(0-9)。
体外xCELLigence
使用Agilent xCELLigence实时细胞分析系统评估CAR-T体外活性。第0天，仪器数据收集计划设置为在75小时的时间段内每10分钟测量一次阻抗。癌细胞按照每个细胞系确定的最佳密度进行铺板，形成汇合单层(96孔eSight板每孔40,000-65,000个细胞)，最终体积为100ul，并在将板装入eSight仪器之前，允许板在室温下放置30分钟。第二天，通过流式细胞术监测CAR-T细胞的表面CAR+，然后洗涤3次CAR-T细胞培养基并放入肿瘤细胞完全培养基中。将CAR-T以匹配的总CAR-T+效应子比靶标比率和匹配的总T细胞数量添加到孔中，以解释克隆之间转导效率的差异，从而导致最终孔体积为200ul。随着归一化的细胞指数在x轴上降至0，实时监测肿瘤细胞裂解。
ELISA
在添加CAR-T细胞后24小时，从用于体外xCELLigence测定的96孔eSight板中，小心地从200ul孔中收集25ul细胞/CAR-T上清液。能够以多重形式检测促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α或IL-2(MSD公司，洛克维尔，马里兰州)的多点V-Plex测定或单重IFN-γELISA系统(R&D系统公司(R&D Systems)，明尼阿波利斯，明尼苏达州)用于下游细胞因子分泌评估。对于这两种ELISA，测定都是根据制造商的方案进行的。
连续抗原再刺激测定
为了确定CAR-T细胞能够进行多少轮重复的连续抗原杀伤，使用连续体外共培养测定来评估多轮抗原激发后CAR-T细胞的靶向杀伤能力和持久能力。第0天，将CAR-T细胞和经过工程改造以过表达CLDN18.2的BxPC3细胞以1:2ET比例铺板并孵育3天。如果CAR-T细胞仍然存活并裂解肿瘤细胞，则每3-4天用新鲜的BxPC3+CLDN18.2细胞重新激发CAR-T细胞，并使用流式细胞术测定表面CAR+表达并维持相同的E:T比率。每轮重新激发后，对CAR-T细胞进行计数以确定扩增情况，以16,000rpm的速度离心5分钟，然后重悬浮于新鲜培养基中。每次激发后24小时和72小时后收集培养物上清液。通过ELISA(R&D系统公司)测量IFN-γ水平。每次抗原激发结束时，在CAR-T上进行多参数流式细胞术，以监测细胞记忆表型、激活和耗竭标志物。CAR-T细胞在FACS缓冲液中洗涤，然后针对标志物(包括但不限于CD8、CD4、CD45、CD62L、CD45RO、CD70、CD27、CD223、PD-1、LAG3和TIM3(博奇公司，BD生物科学公司和R&D系统公司))与抗体混合物一起孵育，并在冰上孵育30分钟。CAR阳性通过使用与Alexa-Fluor 647抗体缀合的抗008LYG_D08 scFv试剂和/或与PE抗体缀合的抗TGFβRII来确定。使用活/死染色剂(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))排除死细胞。此外，使用CellTiter-试剂(普洛麦格公司)测定BxPC3+CLDN18.2细胞杀伤作用。
体内动物研究：
所有动物实验均在实验动物护理评估协会(AALAC)认可的机构中根据机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南和适当的动物研究批准进行。研究使用了6至8周大的雌性NOD。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(杰克逊实验室(Jackson Laboratories),NSG)小鼠或6至8周龄雌性NOD。如所示的Cg-Prkdcscid H2-Ab1em1Mvw H2-K1tm1BpeH2-D1tm1BpeIl2rgtm1Wjl/SzJ(杰克逊，NSG MHC I/II KO)小鼠。
Cultrex基底膜提取物(BME)3型是一种专门用于体内异种移植和肿瘤移植模型的胞外基质水凝胶。它以1:1的比例使用(PBS:BME)。每只小鼠均进行皮下注射，总体积200ul。将1000万个PaTu8988S“高分选”细胞注射到右侧腹，总体积为200ul(PBS:BME，1:1)。对于工程改造以过表达CLDN18.2的NCI-N87，将500万个细胞注射到右侧腹，总体积为200ul(PBS:BME，1:1)。
对于PDX肿瘤片段植入：将肿瘤组织置于含有基础RPMI培养基的无菌培养皿中，并切成约3mm x 3mm的小块。可以使用新鲜收获的组织或冷冻原料中解冻的碎片。可以使用套管针如下植入碎片：将3mm x 3mm碎片放入11号套管针中。然后使用套管针将肿瘤碎片皮下递送到小鼠的右侧腹中。
对于所有研究，在研究期间每周测量两次肿瘤体积和体重。
黑色素瘤和结肠癌的同基因鼠模型
图14A-14F显示了来自经工程改造以表达鼠CLDN18.2的黑色素瘤(B16-F10)和结肠癌(CT-26)的同基因鼠模型的数据。该模型用于显示携带008LYG_DO8 scFv但在这种情况下用鼠CD28共刺激结构域和鼠CD3z信号传导结构域工程改造的CAR-T细胞的功效。CAR-T细胞进一步用小鼠显性负性TGFbRII装甲。由于008LYG_DO8scFv具有鼠交叉反应性，因此这些模型可用于检查用鼠CD28和鼠CD3z以及鼠显性负性TGFbRII工程改造的008LYG_DO8 CAR-T在淋巴细胞耗竭后免疫活性小鼠中的功效。
008LYG_DO8 mCD28z m-dnTGFbRIICAR-T的体内功效研究在6至8周龄雌性BALB/cJ小鼠(杰克逊实验室)小鼠中进行。在第-7天，将5e5个CT-26WT或CT-26+mCLDN18.2细胞皮下植入右上腹。在第-1天，小鼠接受3Gy的全身照射作为淋巴细胞耗竭的手段，在第0天，异种移植物的平均大小达到150至215mm3(CT-26+mCLDN18.2肿瘤在随机分组时略大于wt)时，小鼠通过单次输注9e6个008LYG_D08 mCD28z m-dnTGFbRIICAR-T细胞或9e6个未转导的供体匹配鼠T细胞进行静脉内给药。这种单次鼠CAR-T输注导致在表达CLDN18.2的异种移植物中的特异性肿瘤生长抑制(图14F)，而没有显著的体重减轻(数据未显示)。
讨论：
虽然使用靶向CD19和BCMA的CAR-T治疗血液肿瘤已得到了有希望的临床数据(JHematol Oncol Pharm.[血液肿瘤药物杂志]2022；12(1):30-42，Leukemia[白血病],第36卷,第1481-1484页,2022)，将这一成功转化至实体瘤环境并不简单。众所周知，工程改造的CAR-T细胞在实体瘤微环境中将面临多重障碍，包括但不限于肿瘤靶抗原表达的异质性、CAR-T细胞向肿瘤的运输和浸润受损以及CAR-T细胞到达时将面临高度免疫抑制和敌对的肿瘤微环境。因此，需要仔细考虑CAR-T设计、理想的输注CAR-T表型和优化的制造，以通过这种治疗方法实现实体瘤的临床应答。
CLDN18.2是一种正在胃癌、胰腺癌和胃食管交界癌中通过多种方式(包括ADCC和CDC诱导单克隆抗体、抗体药物缀合物、T细胞接合剂和CAR-T)进行临床探索的抗原。众所周知，CLDN18.2也在正常胃粘膜的分化细胞上表达，因此确定最佳安全窗至关重要。施用靶向CAR-T CT041的CLDN18.2后临床数据的中期分析显示了在胃癌患者中的抗肿瘤功效和可耐受的安全特性(Nature Medicine[自然医学]第28卷,第1189-1198页(2022))。血液学环境中肿瘤应答的持久性与患者体内CAR-T细胞的持久性有关。首次输注后，CT041在外周血中的中位持续时间为28天(Nature Medicine[自然医学]第28卷,第1189-1198页(2022)，这表明CAR-T产品还有改进的空间。在本披露中，对维持鼠交叉反应性的先导CAR-T构建体的鉴定除了相关啮齿动物模型中的功效读出之外还能够进行安全性的早期评估，并优化CAR-T设计以实现最大的潜在临床益处。例如具有显性负性TGFβRII的装甲可以改善本披露的CLDN18.2 CAR-T在临床环境中的持久性。图10中显示的Panc06 PDX模型中持久体内功效的数据支持了这一点。
功能性CAR的关键组分是抗原结合结构域和一个或多个胞内结构域(例如共刺激结构域和/或信号传导结构域)。本文中，已披露的数据强烈支持基于008LYG_D08 scFv的CAR对表达CLDN18.2的体外(图5C、5E)和体内(图7D)细胞系表现出有效的细胞毒性作用。此外，008LYG_D08 scFv固有的独特特征，包括其低CLDN18.2亲和力、近膜和构象表位以及内化表型(图4)，是CAR-T细胞疗法中优选行为的原因。另外，其中披露的数据证明008LYG_D08CD28zCAR-T能够在呈现高、中和低CLDN18.2表面受体密度水平的癌细胞中诱导肿瘤细胞裂解，表明所披露的008LYG_D08 CD28z CAR-T可能对存在不同水平受体密度的异质性肿瘤有效(表3)。
表达CLDN18.2的细胞中CAR-T细胞杀伤的特异性通过靶抗原被CRISPR/Cas9敲除的细胞中缺乏活性来证明(图6B)。
显性负性TGFβRII的添加也将通过使细胞克服存在于胃癌、胰腺癌和食管癌的肿瘤微环境中的过量和抑制性TGFβ而给008LYG_D08CD28z CAR-T细胞带来益处(图8C-E)。该文件披露的数据表明，在慢病毒构建体中包含这种装甲策略可以阻断SMAD2/3的下游磷酸化(图8H)，从而导致CAR-T细胞的生成，这些细胞可以通过多轮抗原再激发而增殖和持续存在并且继续裂解未装甲对应物之外的肿瘤细胞(图8I)。
在携带内源性过表达CLDN18.2的胰腺细胞系(图9A-D)或经工程改造过表达CLDN18.2的胃细胞系(图9E-H)的异种移植物的动物模型中，以及在胰腺癌患者衍生的异种移植物模型(图9I-L)中(所有模型都具有不同水平的CLDN18.2和TGFβ1表达)，进一步举例说明了装甲化的另外益处。在所有情况下，008LYG_D08 CD28zdnTGFβRII装甲的CAR-T都能产生有效的肿瘤消退，这种消退是持久的，并且与任何体重减轻无关，表明这是一种有前途的CAR-T产品。
优化和“缩短”的制造(SMART)生产的CAR-T细胞产品与“传统”制造产品相比，能够持续更长时间，维持分化程度较低的T细胞表型，并维持肿瘤细胞裂解以进行另外几轮的再刺激(图10A)。“缩短”的制造转化至CAR-T，通过细胞表面CD62L/CR45RO表达监测，其表现出分化程度较低的表型。(图10B)这一起可以在临床上转化至CAR-T产品，该产品具有在减少输注剂量下具有功效和持续CAR-T功能的潜力。在代表性患者衍生的胰腺癌异种移植模型中以低CAR-T输注剂量观察到持久的肿瘤消退(图10E)，其中没有观察到体重减轻(图10F)。使用优化和“缩短”的制造工艺从第二T细胞供体获得的低CAR-T输注剂量下在胰腺癌异种移植模型中也观察到持续的肿瘤消退(图13A-H)。
在代表性患者衍生的胃癌(图11)和食管癌(图12)异种移植模型中，在低CAR-T输注剂量下也观察到持久的肿瘤消退。
使用黑色素瘤和结肠癌的同基因鼠模型来证明所披露的实施例在免疫活性小鼠中的功效。特别地，携带与鼠CD28共刺激和鼠CD3z信号传导结构域偶联的008LYG_DO8 scFv并使用鼠显性负性TGF-β装甲的CAR-T细胞抑制了免疫活性小鼠中表达CLDN18.2的异种移植物特异性的肿瘤生长(图14F)。
总而言之，其中披露的组分证明了CAR-T产品由独特且有效的scFv、显性负性TGFβ装甲构成，并利用缩短的制造过程进行生产以产生有利的CAR-T输注细胞表型，从而产生良好分化的具有已证实功效和治疗潜力的最终CAR-T产品。
表4.序列
本文描述的实施例可以在不存在本文未具体披露的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实践。将已经采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制性的，并且不意图在使用这样的术语和表达时排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在所要求保护的实施例的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过实施例、任选特征具体披露了本发明，但是本领域技术人员可以对本文披露的概念进行修改和变化，并且认为这样的修改和变化可以处于由说明书和所附权利要求书限定的这些实施例的范围内。尽管本披露的一些方面可被视为特别有利，但是预期本披露不限于本披露的这些特定方面。
如果组的一个、多于一个或全部成员存在于、使用于或以其他方式相关于给出的产品或方法，则在该组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书被认为是满意的，除非有相反的指明或另外从上下文明显可见。本披露包括实施例，在这些实施例中，组中的恰好一个成员存在于、使用于或以其他方式相关于给出的产品或方法。本披露包括实施例，在这些实施例中，组中的多于一个或全部成员存在于、使用于或以其他方式相关于给出的产品或方法。
此外，本披露涵盖其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、元素、条款和说明性术语引入另一权利要求中的所有变化、组合和排列。例如，可以对附属于另一权利要求的任何权利要求加以修改，以使其包括一个或多个在附属于同一基础权利要求的任何其他权利要求中所见的限制。在元素以列表(例如以马库什组(Markush group)形式)呈现的情况下，还披露了元素的每个亚组，并且可以从该组中去除任何元素。
应当理解，通常，在本披露或本披露的方面被称作包含特定元素和/或特征的情况下，本披露或本披露的方面的某些实施例由这样的元素和/或特征组成或基本上由其组成。出于简洁目的，这些实施例没有在本文以文字具体地陈述。
本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用以相同的程度并入本文，如同每份单独的专利和出版物特别地且单独地指出通过引用并入。在本申请的任何部分中的任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这样的参考文献可用作针对本披露的现有技术。

Claims (146)

1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中该CAR包含：
(a)密封蛋白18.2(CLDN18.2)特异性的抗原结合结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)一个或多个胞内结构域。
2.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中该抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、单链可变片段(scFv)、单链抗体、VHH、vNAR、纳米抗体(单结构域抗体)或其任何组合。
3.如权利要求2所述的分离的核酸序列，其中该抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
4.如权利要求3所述的分离的核酸序列，其中该抗原结合结构域是包含选自SEQ IDNO：9、19、29、39和49的氨基酸序列的scFv。
5.如权利要求1至4中任一项所述的分离的核酸序列，其中该跨膜结构域包含选自CD4、CD8α或CD28的跨膜结构域的跨膜结构域。
6.如权利要求5所述的分离的核酸序列，其中该跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的核酸序列，其中该一个或多个胞内结构域包含共刺激结构域或其一部分。
8.如权利要求7所述的分离的核酸序列，其中该共刺激结构域包含CD3z、CD2、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、IL-2Rβ、GITR、MyD88/CD40a共刺激结构域和/或其变体中的一种或多种。
9.如权利要求1至8中任一项所述的分离的核酸序列，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
10.如权利要求1至8中任一项所述的分离的核酸序列，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
11.如权利要求1至8中任一项所述的分离的核酸序列，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
12.如权利要求1至11中任一项所述的分离的核酸序列，其中该CAR进一步包含铰链/间隔子结构域，任选地，其中该铰链/间隔子结构域位于该抗原结合结构域和该跨膜结构域之间。
13.如权利要求12所述的分离的核酸序列，其中该铰链/间隔子结构域包含IgG1铰链结构域或其变体、IgG2铰链结构域或其变体、IgG3铰链结构域或其变体、IgG4铰链结构域或其变体、IgG4P结构域、CD8铰链结构域或其变体或CD28铰链结构域或其变体。
14.如权利要求13所述的分离的核酸序列，其中该铰链/间隔子结构域是IgG4铰链/间隔子或其变体，任选地是包含S241P突变的IgG4P铰链/间隔子。
15.如权利要求1至14中任一项所述的分离的核酸序列，其中该核酸序列编码具有如SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的CAR，任选地其中该核酸序列如SEQ ID NO：51中所示。
16.如权利要求1至15中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸序列，任选地其中该装甲结构域位于编码该CAR的核酸的3’末端或编码该CAR的核酸的5’末端。
17.如权利要求16所述的分离的核酸序列，其中该装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。
18.如权利要求17所述的分离的核酸序列，其中该装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。
19.如权利要求17或18所述的分离的核酸序列，其中该装甲分子包含与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
20.如权利要求17至19中任一项所述的分离的核酸序列，其中该显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO：54的序列，任选地其中编码该dnTGFβRII的装甲结构域具有如SEQ IDNO：53中所示的序列。
21.如权利要求1至20中任一项所述的分离的核酸序列，其中该CAR和该装甲结构域在单个启动子的控制下可操作地连接。
22.如权利要求1至20中任一项所述的分离的核酸序列，其中该CAR和该装甲结构域通过内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。
23.如权利要求1至22中任一项所述的分离的核酸序列，其中该CAR和该装甲结构域通过编码可切割肽接头的核苷酸序列连接。
24.如权利要求23所述的分离的核酸序列，其中该可切割肽接头是自切割肽接头。
25.如权利要求23或24所述的分离的核酸序列，其中该可切割肽接头包含T2A肽。
26.如权利要求1至25中任一项所述的分离的核酸序列，其中该核酸序列编码选自SEQID NO：55、10、20、30、40和50的序列。
27.一种包含抗原结合结构域的抗CLDN18.2嵌合抗原受体(CAR)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab、或scFv；
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO：1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO：2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO：3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO：4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO：5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO：6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
28.如权利要求27所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该VH包含选自SEQ ID NO：7、17、27、37和47的氨基酸序列。
29.如权利要求27或28所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该VL包含选自SEQ ID NO：8、18、28、38和48的氨基酸序列。
30.如权利要求27至29所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR包含跨膜结构域和一个或多个胞内结构域。
31.如权利要求27至30中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该跨膜结构域包含选自CD4、CD8α或CD28的跨膜结构域的跨膜结构域。
32.如权利要求31所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
33.如权利要求27至32中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该一个或多个胞内结构域包含共刺激结构域或其一部分。
34.如权利要求33所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该共刺激结构域包含CD3z、CD2、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、IL-2Rβ、GITR、MyD88/CD40a共刺激结构域和/或其变体中的一种或多种。
35.如权利要求30至34中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
36.如权利要求30至34中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
37.如权利要求30至34中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该胞内结构域包含CD3z共刺激结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。
38.如权利要求27至37中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR进一步包含铰链/间隔子结构域，任选地，其中该铰链/间隔子结构域位于该抗原结合结构域和该跨膜结构域之间。
39.如权利要求38所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该铰链/间隔子结构域包含IgG1铰链结构域或其变体、IgG2铰链结构域或其变体、IgG3铰链结构域或其变体、IgG4铰链结构域或其变体、IgG4P结构域、CD8a铰链结构域或其变体或CD28铰链结构域或其变体。
40.如权利要求39所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该铰链/间隔子结构域是IgG4铰链/间隔子或其变体，任选地是包含S241P突变的IgG4P铰链/间隔子。
41.如权利要求27至40中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR具有如SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列。
42.如权利要求27至40中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR进一步包含装甲分子。
43.如权利要求42所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。
44.如权利要求43所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。
45.如权利要求43或44所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该装甲分子包含与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
46.如权利要求43至45中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO：54的序列。
47.如权利要求27至46中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR和该装甲分子通过编码可切割肽接头的核苷酸序列连接。
48.如权利要求47所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该可切割肽接头是自切割肽接头。
49.如权利要求47或48所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该可切割肽接头包含T2A肽。
50.如权利要求27-49中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR，其中该CAR包含选自SEQ IDNO：56、10、20、30、40和50的氨基酸序列。
51.一种载体，其包含如权利要求1-26中任一项所述的分离的核酸序列或编码如权利要求27-50中任一项所述的嵌合抗原受体，任选地其中该载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统，任选地其中该载体是慢病毒。
52.一种细胞，其包含如权利要求51所述的载体。
53.一种细胞，其包含编码如权利要求27-50中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，优选地其中该细胞包含编码具有如SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的CAR的核酸序列和编码具有如SEQ ID NO：54中所示的序列的显性负性II型TGFβ受体的核酸，任选地其中编码该CAR的该核酸序列如SEQ ID NO：51中所示并且编码该显性负性II型TGFβ受体的该序列如SEQ ID NO：53中所示。
54.一种包含CLDN18.2特异性抗原结合结构域的细胞，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab或scFv；
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO：1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO：2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO：3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO：4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO：5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO：6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
55.如权利要求54所述的细胞，其中该VH包含选自SEQ ID NO：7、17、27、37和47的氨基酸序列。
56.如权利要求54或55所述的细胞，其中该VL包含选自SEQID NO：8、18、28、38和48的氨基酸序列。
57.如权利要求54至56中任一项所述的细胞，其中该CLDN18.2特异性抗原结合结构域包含如SEQ ID NO：52中所示的序列。
58.如权利要求54至57中任一项所述的细胞，其中该细胞进一步包含装甲分子。
59.如权利要求58所述的细胞，其中该装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。
60.如权利要求59所述的细胞，其中该装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。
61.如权利要求59或60所述的细胞，其中该装甲分子包含与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
62.如权利要求59至61中任一项所述的细胞，其中该显性负性II型TGFβ受体包含SEQID NO：54的序列。
63.如权利要求52-62中任一项所述的细胞，其中该细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞和调节性T细胞。
64.如权利要求63所述的细胞，其中该细胞在与表达CLDN18.2的肿瘤细胞接触后表现出抗肿瘤免疫。
65.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
向有需要的受试者施用有效量的细胞，该细胞包含含有抗原结合结构域的抗CLDN18.2嵌合抗原受体(CAR)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体、Fab、或scFv，
其中该VH包含含有选自SEQ ID NO：1、11、21、31和41的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO：2、12、22、32和42的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO：3、13、23、33和43的氨基酸序列的CDR3；并且
其中该VL包含含有选自SEQ ID NO：4、14、24、34和44的氨基酸序列的CDR1；含有选自SEQ ID NO：5、15、25、35和45的氨基酸序列的CDR2；以及含有选自SEQ ID NO：6、16、26、36和46的氨基酸序列的CDR3。
66.如权利要求65所述的方法，其进一步包括抑制肿瘤生长、诱导肿瘤消退、和/或延长该受试者的存活。
67.如权利要求65所述的方法，其中该细胞是自体细胞。
68.如权利要求67所述的方法，其中该自体细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞和调节性T细胞。
69.如权利要求65-68中任一项所述的方法，其中该癌症是实体瘤。
70.如权利要求69所述的方法，其中该实体瘤是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。
71.如权利要求70所述的方法，其中该实体瘤是胰腺癌。
72.一种特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)，其中该VH包含VH互补决定区(CDR)1、VH-CDR2、VH-CDR3；且其中该VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中
(a)该VH-CDR1包含选自SEQ ID NO：1、11、21、31和41的氨基酸序列；
(b)该VH-CDR2包含选自SEQ ID NO：2、12、22、32和42的氨基酸序列；
(c)该VH-CDR3包含选自SEQ ID NO：3、13、23、33和43的氨基酸序列；
(d)该VL-CDR1包含选自SEQ ID NO：4、14、24、34和44的氨基酸序列；
(e)该VL-CDR2包含选自SEQ ID NO：5、15、25、35和45的氨基酸序列；以及
(f)该VL-CDR3包含选自SEQ ID NO：6、16、26、36和46的氨基酸序列。
73.如权利要求72所述的抗体或其抗原结合部分，其中：
(a)该VH-CDR1包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQID NO：4中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列；
(b)该VH-CDR1包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ ID NO∶12中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列；
(c)该VH-CDR1包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列；
(d)该VH-CDR1包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列；或
(e)该VH-CDR1包含SEQ ID NO：41中所示的氨基酸序列，该VH-CDR2包含SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列，该VH-CDR3包含SEQ ID NO：43中所示的氨基酸序列，该VL-CDR1包含SEQ ID NO：44中所示的氨基酸序列，该VL-CDR2包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含SEQ ID NO：46中所示的氨基酸序列。
74.如权利要求72所述的抗体或其抗原结合部分，其中该VH包含与选自SEQ ID NO：7、17、27、37和47的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
75.如权利要求72至74中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中该VH包含选自SEQID NO：7、17、27、37和47的氨基酸序列。
76.如权利要求72至75中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中该VL包含与选自SEQ ID NO：8、18、28、38和48的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
77.如权利要求72至75中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中该VL包含选自SEQID NO：8、18、28、38和48的氨基酸序列。
78.如权利要求72至77中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中：
(a)该VH包含与SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(b)该VH包含与SEQ ID NO：17中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(c)该VH包含与SEQ ID NO：27中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO：28中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；
(d)该VH包含与SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO：38中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)该VH包含与SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO：48中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
79.如权利要求72至78中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中：
(a)该VH包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列；
(b)该VH包含SEQ ID NO：17中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列；
(c)该VH包含SEQ ID NO：27中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO：28中所示氨基酸序列；
(d)该VH包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO：38中所示氨基酸序列；或
(e)该VH包含SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO：48中所示氨基酸序列。
80.一种药物组合物，其包含如权利要求1至26中任一项所述的分离的核酸、如权利要求27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如权利要求51所述的载体、如权利要求52至64中任一项所述的细胞或如权利要求72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的赋形剂。
81.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1至26中任一项所述的分离的核酸、如权利要求27至50中任一项所述的抗CLDN18.2CAR、如权利要求51所述的载体、如权利要求52至64中任一项所述的细胞、如权利要求72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或如权利要求80所述的药物组合物。
82.如权利要求81所述的方法，其中该疾病或病症包含癌症。
83.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1至26中任一项所述的分离的核酸、如权利要求27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如权利要求51所述的载体、如权利要求52至64中任一项所述的细胞、如权利要求72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或如权利要求80所述的药物组合物。
84.如权利要求82或83所述的方法，其中该癌症是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。
85.如权利要求1至26中任一项所述的分离的核酸、如权利要求27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如权利要求51所述的载体、如权利要求52至64中任一项所述的细胞、如权利要求72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或如权利要求80所述的药物组合物在治疗有需要的受试者的疾病或病症中的用途。
86.如权利要求85所述的用途，其中该疾病或病症包含癌症。
87.如权利要求1至26中任一项所述的分离的核酸、如权利要求27至50中任一项所述的抗CLDN18.2 CAR、如权利要求51所述的载体、如权利要求52至60中任一项所述的细胞、如权利要求72至79中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、或如权利要求80所述的药物组合物在治疗有需要的受试者的癌症中的用途。
88.如权利要求86或87所述的用途，其中该癌症是胃癌、胃食管结合部癌(GEJ；例如远端食管癌、近端胃癌和贲门癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、胆管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或非小细胞肺癌。
89.一种扩增T细胞群的方法，该方法包括：
(a)从样品中分离CD3+T细胞；
(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；
(c)激活这些CD3+T细胞；
(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；
(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞；以及
(f)收获这些CAR-T细胞。
90.一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：
(a)获得包含CD3+T细胞群的样品；
(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；
(c)激活这些CD3+T细胞；
(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；
(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；以及
(f)收获这些CAR-T细胞。
91.如权利要求89或90所述的方法，其中该CD3+T细胞群由分离的CD4+和CD8+T细胞群形成。
92.如权利要求89至91中任一项所述的方法，其中该培养基进一步包含人白细胞介素2(IL-2)。
93.如权利要求89至92中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中在该培养基中培养约1x106至约1x109个CD3+T细胞。
94.如权利要求89至93中任一项所述的方法，其中该样品是通过白细胞单采术收集的富集的单采术产物。
95.如权利要求89至94中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞培养约一天或约两天。
96.如权利要求89至95中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞用CD2、CD3、CD28或其任何组合的激动剂激活。
97.如权利要求89至96中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞用磁性微珠激活。
98.如权利要求89至97中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞用抗CD3抗体或其CD3结合片段和抗CD28抗体或其CD28结合片段激活。
99.如权利要求98所述的方法，其中将该抗CD3抗体或其CD3结合片段和该抗CD28抗体或其CD28结合片段与磁性微珠偶联。
100.如权利要求89至99中任一项所述的方法，其中将这些CAR-T细胞在步骤(e)中培养约两天至约十天。
101.如权利要求89至99中任一项所述的方法，其中将这些CAR-T细胞在步骤(e)中培养约四天至约六天。
102.如权利要求101所述的方法，其中将这些CAR-T细胞在步骤(e)中培养约四天。
103.如权利要求101所述的方法，其中将这些CAR-T细胞在步骤(e)中培养约六天。
104.如权利要求92至103中任一项所述的方法，其中人IL-21的浓度为约0.01U/mL至约0.3U/mL，并且人IL-2的浓度为约5IU/mL至约100IU/mL。
105.如权利要求89至104中任一项所述的方法，其中人IL-21的浓度为约0.19U/mL。
106.如权利要求105所述的方法，其中人IL-2的浓度为约40IU/mL。
107.如权利要求89至106中任一项所述的方法，其中在步骤(b)期间搅动这些CD3+T细胞。
108.一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)从样品中分离CD4+和CD8+T细胞以形成CD3+T细胞群；(b)在包含浓度为40IU/mL的人白细胞介素2和浓度为0.19U/mL的人白细胞介素21的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)用包含抗CD3抗体或其CD3结合片段和抗CD28抗体或其CD28结合片段的磁珠激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞；(e)将这些CAR-T细胞在培养基中培养约四天；以及(f)收获这些CAR-T细胞。
109.如权利要求89至108中任一项所述的方法，其中该载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统。
110.如权利要求89至109中任一项所述的方法，其中该载体是慢病毒。
111.如权利要求110所述的方法，其中该慢病毒以约0.25至约20的感染复数(MOI)添加。
112.如权利要求111所述的方法，其中该慢病毒以约1至约4的MOI添加。
113.如权利要求111所述的方法，其中该慢病毒以约2或约4的MOI添加。
114.如权利要求89至113中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后该细胞培养基的体积增加。
115.如权利要求114所述的方法，其中该细胞培养基的体积增加至少约6倍。
116.如权利要求89至115中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的培养基每天至少更换一次。
117.如权利要求89至116中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的培养基约每12小时更换。
118.如权利要求89至117中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约5倍。
119.如权利要求89至117中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约3倍。
120.如权利要求119所述的方法，其中这些CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增约2倍。
121.如权利要求119所述的方法，其中这些CAR-T细胞在步骤(e)期间扩增约3倍。
122.如权利要求89至121中任一项所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(b)包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQ IDNO：16中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(c)包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQ IDNO：26中所示氨基酸序列的VL-CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO：33中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO：34中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：35中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQ IDNO：36中所示氨基酸序列的VL-CDR3；或
(e)包含SEQ ID NO：41中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：42中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO：43中所示氨基酸序列的VH-CDR3，包含SEQ ID NO：44中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：45中所示氨基酸序列的VL-CDR2，和包含SEQ IDNO：46中所示氨基酸序列的VL-CDR3。
123.如权利要求122所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含VH，该VH包含与选自SEQ ID NO：7、17、27、37和47的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
124.如权利要求122所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含VH，该VH包含选自SEQID NO：7、17、27、37和47的氨基酸序列。
125.如权利要求122至124中任一项所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含VL，该VL包含与选自SEQ ID NO：8、18、28、38和48的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
126.如权利要求125所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含VL，该VL包含选自SEQID NO：8、18、28、38和48的氨基酸序列。
127.如权利要求122至126中任一项所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含：
(a)包含与SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(b)包含与SEQ ID NO：17中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(c)包含与SEQ ID NO：27中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO：28中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
(d)包含与SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO：38中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL；或
(e)包含与SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VH，以及包含与SEQ ID NO：48中所示氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的VL。
128.如权利要求127所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含：
(a)包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的VL；
(b)包含SEQ ID NO：17中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列的VL；
(c)包含SEQ ID NO：27中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：28中所示氨基酸序列的VL；
(d)包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：38中所示氨基酸序列的VL；或
(e)包含SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：48中所示氨基酸序列的VL。
129.如权利要求89至125中任一项所述的方法，其中结合CLDN18.2的该CAR包含如SEQID NO：52中所示的序列。
130.如权利要求89至129中任一项所述的方法，其中编码结合CLDN18.2的该CAR的核酸进一步包含装甲结构域，该装甲结构域包含编码装甲分子的核酸序列，任选地其中该装甲结构域位于编码该CAR的核酸的3’末端或编码该CAR的核酸的5’末端。
131.如权利要求89至129中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞包含装甲分子。
132.如权利要求130或131所述的方法，其中该装甲分子选自显性负性II型TGFβ受体、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、杂合IL-4/IL-7受体、杂合IL-7/IL-2受体和显性负性HIF1α。
133.如权利要求130至132中任一项所述的方法，其中该装甲分子包含显性负性II型TGFβ受体(dnTGFβRII)。
134.如权利要求130至133中任一项所述的方法，其中该装甲分子包含与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
135.如权利要求132至134中任一项所述的方法，其中该显性负性II型TGFβ受体包含SEQ ID NO：54的序列。
136.如权利要求89至113530中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞配制在等渗溶液中。
137.如权利要求136所述的方法，其中该等渗溶液包含含有人血清白蛋白的醋酸钠林格氏液。
138.如权利要求136或权利要求137所述的方法，其中该等渗溶液含有约1x106至约1x109个CAR-T细胞。
139.如权利要求138所述的方法，其中该等渗溶液含有约3.4x106个CAR-T细胞。
140.如权利要求89至139中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞是TCM和TSCM细胞的混合物。
141.如权利要求140所述的方法，其中约15％至约50％的这些CAR-T细胞是TSCM细胞并且表达CD45RA、CCR7和CD27，并且不表达CD45RO。
142.如权利要求141所述的方法，其中约20％至约30％的这些CAR-T细胞是TSCM细胞并且表达CD45RA、CCR7和CD27，并且不表达CD45RO。
143.如权利要求89至142中任一项所述的方法，其中超过50％的这些CAR-T细胞表达嵌合抗原受体。
144.如权利要求143所述的方法，其中约40％至约60％的这些CAR-T细胞表达嵌合抗原受体。
145.如权利要求89至144中任一项所述的方法，其中超过50％的这些CAR-T细胞表达CD8。
146.如权利要求145所述的方法，其中约40％至约60％的这些CAR-T细胞表达CD8。
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