CN117886905A - 中国人群中发热伴血小板减少综合征病毒的t细胞优势表位的鉴定和应用 - Google Patents
中国人群中发热伴血小板减少综合征病毒的t细胞优势表位的鉴定和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了中国人群中发热伴血小板减少综合征病毒的T细胞优势表位的鉴定和应用，属于免疫检测和疫苗研发领域。本发明筛选得到57条来源中国SFTS康复人群的SFTSV阳性表位。本发明对阳性表位激发CD4+或CD8+T细胞反应进行验证，其中仅能激发CD4+T细胞反应的单肽有1条，仅能激发CD8+T细胞反应的单肽有21条，能同时激发CD4+和CD8+T细胞反应的单肽有10条。本发明鉴定得到15条CD8+T阳性表位，这些序列为今后SFTSV疫苗研发、新型治疗药物研发和诊断检测试剂盒的的开发提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及中国人群中发热伴血小板减少综合征病毒的T细胞优势表位的鉴定和应用，属于免疫检测和疫苗研发领域。
背景技术
2009年在中国首次发现一种发热伴血小板减少综合征病毒(Severe Fever withThrombocytopenia Syndrome Virus，SFTSV)，能引起发热伴血小板减少综合征(SFTS)，随后从2010年到2016年10月，全国23个省有报告病例，其中18省有实验室确诊病例。2012年随后在韩国和日本也有报道，疾病死亡率最高可达30％。目前尚无有效使用的疫苗，开发安全有效的疫苗是控制SFTSV传播的重要手段之一。T细胞在病毒清除中发挥着非常重要的作用，抗原提呈细胞通过表面的人白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)递呈抗原多肽，再结合T细胞受体后发挥效应，但是受到HLA限制性的影响，基于此，筛选到适合于中国人群的免疫优势的T细胞表位，以用于T细胞免疫检测技术和相关疫苗的研发。
T细胞优势表位的筛选基于酶联免疫斑点检测实验(Enzyme-linkedImmunospotAssay，ELISpot)，该技术结合了外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)体外培养技术与酶联免疫斑点吸附实验，能够检测到单个细胞分泌细胞因子IFN-γ的情况。其原理是：用PVDF膜为底的96孔板包被上特异性的抗IFN-γ单克隆抗体以捕获细胞分泌的IFN-γ，在培养板的孔内加入待检测的抗原多肽刺激物和细胞进行培养。在抗原多肽刺激物的刺激下，特异性T细胞就会在对应的时间段分泌IFN-γ，此时细胞因子就被包被在膜上的抗体所捕获。洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用HRP酶标记的亲和素与生物素结合，最后加入酶的底物AEC进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点，每一个斑点就对应一个分泌细胞因子的特异性T细胞。
使用基于流式细胞术的胞内因子染色(ICS)对以上筛选到的T细胞表位进行阳性确认，以及明确表位激发的是CD4+或CD8+T细胞分泌细胞因子。胞内因子染色的原理是体外培养后的PBMCs与高浓度的单肽共孵育1h，在抗原多肽的刺激下特异性T细胞进行活化。随后向细胞中加入GolgiStop(含莫能菌素)和GolgiPlug(含布雷菲德菌素A)阻断特异性T细胞把细胞因子转运到胞外，共孵育9h。细胞孵育后，对死细胞通过染料进行标记，再用抗细胞表面标志物的抗体进行细胞表面染色。随后使用破膜固定缓冲液进行细胞的固定和破膜，用抗细胞因子抗体进行胞内细胞因子的染色。最后使用流式细胞仪进行数据采集。
T细胞识别多肽受到个体HLA分型的限制，不同地区的人群具有不同的HLA分型特点，在中国人群中，占主要比例的HLA-A分型包括HLA-A*02/A*11/A*24/A*26/A*30/A*31/A*33，HLA-B分型包括HLA-B*13/B*15/B*40/B*46/B*51/B*58等。目前尚缺乏在SFTS康复者中大规模鉴定T细胞表位的研究。当前，国内外在病毒T细胞表位鉴定中，多数采用软件直接预测特定HLA分型的8-10个氨基端的短肽，利用特定HLA分型的感染病毒的康复者来鉴定是否是阳性表位，这种方法鉴定的表位局限于个别HLA分型，不够全面，且缺乏适用于中国人群的较为优势表位系统而全面的筛选。
发明内容
目前尚无研究在中国SFTS康复人群中对SFTSV的T细胞表位进行全面的筛选，本发明鉴定了覆盖SFTSV全蛋白组的RNA依赖的聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)、包膜糖蛋白Gn(Envelope glycoprotein N)和Gc(Envelope glycoprotein C)、NP(Nucleocapsid protein)和NS(Nonstructural protein)。通过以上方法，共筛选出SFTSV阳性表位57条，其中RdRp蛋白来源的单肽有21条，糖蛋白Gn来源的单肽有7条，糖蛋白Gc来源的单肽有6条，NP蛋白来源的单肽有9条，NS蛋白来源的单肽有14条。其中鉴定出免疫优势T细胞表位共22条，RdRp蛋白有7条，糖蛋白Gn有3条，糖蛋白Gc有2条，NP蛋白有5条，NS蛋白有5条。本发明使用ICS的方法对57条阳性表位中的32条对激发CD4+或CD8+T细胞反应进行验证，其中仅能激发CD4+T细胞反应的单肽有1条，仅能激发CD8+T细胞反应的单肽有21条，能同时激发CD4+和CD8+T细胞表位有10条。本发明鉴定出的优势表位可用于T细胞免疫检测技术和疫苗的研发。
本发明提供了发热伴血小板减少综合征病毒的T细胞反应长肽，所述T细胞反应长肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.57任一所示。
本发明提供了发热伴血小板减少综合征病毒来源的CD8+T细胞表位肽，所述CD8+T细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.60，SEQ ID NO.62～SEQ ID NO.71任一所示。
本发明提供了编码所述T细胞反应长肽或所述CD8+T细胞表位肽的核酸。
本发明提供了携带所述核酸的重组载体。
在一种实施方式中，所述重组载体包括腺病毒载体、慢病毒载体或原核表达载体。
本发明提供了含有所述核酸或所述重组载体的宿主细胞。
在一种实施方式中，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞或原核细胞。
本发明提供了一种肽库，包括如下(a)～(c)任一：
(a)由权利要求1所述T细胞反应长肽中的任意一条或多条组成的肽库；
(b)由权利要求2所述CD8+T细胞表位肽中的任意一条或多条组成的肽库；
(c)由(a)和(b)组成的肽库。
本发明提供了一种药物，所述药物包含所述T细胞反应长肽，或所述CD8+T细胞表位肽，或所述肽库。
在一种实施方式中，所述药物还包含药学上可接受的载体。
本发明提供了一种疫苗，所述疫苗含有所述T细胞反应长肽，或所述CD8+T细胞表位肽，或所述肽库。
本发明提供了所述T细胞反应长肽，或所述CD8+T细胞表位肽，所述肽库在制备中国人群特异性SFTSV疫苗中的应用。
在一种实施方式中，所述疫苗包括表位疫苗、蛋白疫苗或核酸疫苗。
在一种实施方式中，所述疫苗还包括载体，所述载体包括脂质、热激活蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白、钥孔血蓝蛋白。
在一种实施方式中，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂包括弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
本发明提供了所述T细胞反应长肽，或所述CD8+T细胞表位肽，所述肽库在制备中国人群SFTSV T细胞免疫检测试剂盒中的应用。
在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有IFN-γ单克隆抗体。
在一种实施方式中，所述试剂盒中还设置有ELISpot反应板，ELISpot上预包被捕获T细胞分泌的IFN-γ的单克隆抗体。
在一种实施方式中，所述ELISpot板上预包被有捕获IFN-γ的单克隆抗体。
本发明还提供了所述T细胞反应长肽，或所述CD8+T细胞表位肽，所述肽库在制备细胞疗法或过继疗法试剂盒中的应用。
本发明还提供了所述T细胞反应长肽或所述CD8+T细胞表位肽或所述核酸或所述重组载体或所述宿主细胞或所述肽库在制备预防、治疗或检测SFTSV的制品中的应用。
在一种实施方式中，所述制品包括疫苗、药物或检测试剂。
在一种实施方式中，所述检测试剂包括试剂或试剂盒。
在一种实施方式中，氨基酸序列如SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.72所示的SFTSVCD8+T细胞表位肽能够与MHC-I类分子结合，其中，当多肽与MHC-I类分子结合时能被CD8+T细胞识别。
有益效果：
本发明技术方案使用PeptGen网站设计了394条覆盖SFTSV的RdRp、包膜糖蛋白、NP和NS蛋白长度为15-20个氨基酸的多肽，相邻多肽之间重叠10个氨基酸，其中RdRp有233条，包膜糖蛋白有115条，NP蛋白有26条，NS蛋白有30条。
将394条多肽序列一一进行ELISpot验证，筛选到57条来源于中国人群的SFTSV阳性长肽，覆盖了中国人群的HLA分型，其中RdRp蛋白来源的单肽有21条，糖蛋白Gn来源的单肽有7条，糖蛋白Gc来源的单肽有6条，NP蛋白来源的单肽有9条，NS蛋白来源的单肽有14条。其中鉴定出免疫优势T细胞表位共22条，RdRp蛋白有7条，糖蛋白Gn有3条，糖蛋白Gc有2条，NP蛋白有5条，NS蛋白有5条。本发明使用ICS的方法对57条中的32条阳性表位激发CD4+或CD8+T细胞反应进行验证，其中仅能激发CD4+T细胞反应的单肽有1条，仅能激发CD8+T细胞反应的单肽有21条，能同时激发CD4+和CD8+T细胞反应的单肽有10条。
本发明鉴定得到15条CD8+T细胞表位，这些序列为今后SFTSV疫苗研发、新型治疗药物研发和诊断检测试剂盒的开发提供了基础。
附图说明
图1：SFTSV来源的阳性T细胞表位；
图2：流式细胞术检测表位特异性CD8+T细胞分泌细胞因子；
图3：流式细胞术检测表位特异性CD4+T细胞分泌细胞因子。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
流式SSO分型技术测定PBMCs的HLA分型：其中细胞中DNA的提取使用康为世纪血液基因组柱式小量提取试剂盒(0.1-1mL)(Cat#CW2087S)
1、样本处理
提取200μL血液样本时，向离心管中加入血样后，可直接进行下一步操作；
当提取血液样本体积少于200μL时，加入Buffer GR补足至200μL，再进行下一步操作；
当提取血液样本体积大于200μL时，加入1-2.5倍体积的Buffer RCL，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心1min，小心弃掉上清，如果还有红色沉淀，可重复上述步骤一次。然后向沉淀中加入200μLBuffer GR，震荡至彻底混匀，然后进行下一步操作。
2、向上述溶液中加入20μL蛋白酶K，混匀。
3、加入200μLBuffer GL，震荡至彻底混匀。
4、56℃水浴10min，期间颠倒混匀数次。
5、加入200μL无水乙醇，颠倒混匀，短暂离心。
6、将步骤5中的液体全部转移至已装入收集管的吸附柱中，液体较多可分多次加入。12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，吸附柱重新放回至收集管中。
7、向吸附柱中加入500μLBuffer GW1(使用前确认已加入相应体积的无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。
8、向吸附柱中加入500μLBuffer GW2(使用前确认已加入相应体积的无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。
9、12000rpm离心2min，弃掉收集管中废液，吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
10、将吸附柱放置于一个新的离心管中，悬空滴入50μL灭菌水，室温放置2-5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液。
11、将提取的研究对象的血液DNA送至北京曼泰里生物技术有限公司，公司采用美国ONE LAMBDA公司的流式SSO分型技术测定HLA分型。每个样本均进行了HLA-A和B两个基因位点的检测。
实施例1多肽的制备
通过PeptGen网站设计了394条覆盖SFTSV的RdRp、包膜糖蛋白(Gn和Gc)、NP和NS蛋白长度为15-20个氨基酸的多肽，相邻多肽之间重叠10个氨基酸，其中RdRp有233条，包膜糖蛋白有115条，NP蛋白有26条，NS蛋白有30条。把这些多肽混合成3个包含100条多肽和1个94条多肽的肽库，作为抗原刺激物用于PBMCs的体外培养。具体制备方法是，用DMSO溶解合成的多肽，目标浓度为20μg/μl，充分混合均匀，每条多肽取1μl混合成肽库。
实施例2阳性多肽的免疫原性强弱谱的鉴定
利用实施例1制备的单条多肽或肽库刺激SFTSV康复期病例的PBMCs，鉴定阳性多肽的免疫原性强弱谱，具体步骤如下：
(1)研究对象外周血PBMCs的分离与冻存
a)主要试剂耗材
外周血采集：抗凝管、促凝管和采血针。
外周血PBMCs分离：外周血淋巴细胞分离管(Cat#DKW-LST-24015SK)、RPMI 1640培养基(Gibco)、50mL离心管、15mL离心管和巴氏吸管。
外周血PBMCs冻存：胎牛血清(FBS，Gibco)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma)、细胞冻存管(Thermo)、细胞冻存盒、81孔细胞盒和异丙醇。
b)主要试剂配制
细胞冻存溶液I：只含FBS。
细胞冻存溶液II：含20％DMSO的FBS。
c)实验步骤
1)分离管预处理：新鲜外周抗凝血采用人淋巴细胞分离管分离PBMCs，分离管使用前先短暂离心，使管内分离液集中在管底部。
2)样本离心：用RPMI 1640培养基对抗凝血进行1.5-2倍稀释，把稀释抗凝血缓慢加入细胞分离管中，使用水平转子离心机进行离心，参数设置为800g，室温，15min，升速加速度设置为3，降速加速度设置为1。
3)吸取白膜层及清洗细胞：分离管中间的白膜层即为PBMCs，使用巴氏吸管吸出后，使用RPMI 1640培养基洗涤2次，离心机参数设置为600g，室温，10min，去上清再重悬细胞。
4)细胞冻存：以下以冻存1支细胞管为例，先取500μL溶液I重悬细胞，再取500μL溶液II先慢后快加入细胞中，混合后加入冻存管中，细胞冻存管放入装有异丙醇的冻存盒内，放入-80℃冰箱过夜，把细胞冻存管移入液氮罐长期保存，溶液I和溶液II的体积根据冻存细胞管的数量等量递增。
(2)肽库的体外刺激和PBMCs培养
a)主要试剂耗材
PBMCs的复苏和计数：RPMI 1640培养基、FBS、青链霉素、50mL离心管、15mL离心管、细胞计数板、细胞计数器、台盼蓝染液和水浴箱。
PBMCs的培养：RPMI 1640培养基、FBS、青链霉素、24孔细胞培养板、人重组IL-2、人重组IL-7、50mL离心管、15mL离心管、细胞孵育箱。
b)主要试剂配制
RPMI 1640完全培养基：含10％FBS和1％青链霉素。
c)实验步骤
详细实验步骤参考发明人前期发表的文献(Liu,W.J.et al.J Infect Dis2016)；总之，PBMCs经过体外刺激和培养后，收获细胞，进行后续ELISpot和流式胞内因子检测实验。
(3)ELISpot检测特异性T细胞分泌IFN-γ
a)主要试剂耗材
PVDF膜为底的96孔板、包被抗体(Purified anti-IFN-γ)、检测抗体(Biotinylated anti-IFN-γ)、亲和素-HRP结合物(Streptavidin-HRP)、过氧化物酶显色底物(AEC)、豆蔻酰佛波醇乙酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)、RPMI 1640培养基、FBS、青链霉素、50mL离心管、15mL离心管、细胞孵育箱和ELISpot读板仪(CTL-Immunospot S5 Versa)。
b)主要试剂配制
RPMI 1640完全培养基：含10％FBS和1％青链霉素；
PBST溶液：含0.05％Tween-20的PBS溶液；
检测抗体稀释溶液：把Biotinylated anti-IFN-γ按照1:250比例稀释到含10％FBS的PBS溶液中；
二抗抗体稀释溶液：把Streptavidin-HRP结合物按照1:100比例稀释到含10％FBS的PBS溶液中。
c)实验步骤
详细实验步骤参考发明人前期发表的文献(Ji,W.et al.Mol Immunol 2019)。
为了量化抗原特异性反应，从实验组中减去阴性对照组中的斑点数量，结果以每5×104个PBMCs表达斑点形成细胞(SFC)来计数。评价标准如下：阴性对照SFC<5个/5×104个，阳性反应定义为SFC＞10个/5×104个；否则，阳性反应被定义为结果至少是阴性对照组的两倍。
结果如表1和图1所示，最终筛选出SFTSV阳性表位共57条，其中RdRp蛋白来源的表位有21条，糖蛋白Gn来源的表位有7条，糖蛋白Gc来源的表位有6条，NP蛋白来源的表位有9条，NS蛋白来源的表位有14条，覆盖了中国人群的HLA类型，综合ELISpot检测结果中IFN-γ的分泌强弱以及针对不同表位的存在阳性反应的人数，其中鉴定出免疫优势T细胞表位共22条，RdRp蛋白有7条，糖蛋白Gn有3条，糖蛋白Gc有2条，NP蛋白有5条，NS蛋白有5条，见表1。
表1SFTSV阳性表位
*标记为免疫优势T细胞表位；N/A表示无获取数据。
实施例3阳性多肽特异性CD4+或CD8+T细胞分泌细胞因子鉴定
(1)ICS检测特异性CD4+或CD8+T细胞分泌细胞因子
a)主要试剂耗材
流式抗体：Fixable Viability Dye(Biolegend，USA)、抗人抗体CD3[anti-CD3-APC(BD Pharmingen，clone HIT3a，1:200，Cat#555342)或-FITC(Biolegend，clone UCHT1，1:200，Cat#300440)]、抗人抗体CD4[anti-CD4-APC-Cy7(BD Pharmingen，clone RPA-T4，1:200，Cat#557871)或-Percp-Cy5.5(Biolegend，clone OKT4，1:200，Cat#317428)]、抗人抗体CD8[anti-CD8a PE(BD Pharmingen，clone HIT8a，1:200，Cat#555635)或anti-CD8-BV510(Biolegend，clone SK1，1:200，Cat#344732)]、anti-IFN-γ-Pe-Cy7(Biolegend，clone B27，1:200，Cat#506518)，anti-IL-2-FITC(BD Pharmingen，clone MQ1-17H12，1:200，Cat#554565)或-APC(Biolegend，clone MQ1-17H12，1:200，Cat#500310)和anti-TNF-α-Percp-Cy5.5(BD Pharmingen，clone MAb11，1:200，Cat#560679)或-PE(Biolegend，clone MAb11，1:200，Cat#502909)。
其它试剂耗材：GolgiStop(BD Bioscience，USA)、GolgiPlug(BD Bioscience，USA)、细胞破膜固定试剂盒(BD Bioscience，Cat#554715)、Staining buffer(BD)、5mL流式管(BD)。
b)主要试剂配制
FACS溶液：含0.5％FBS的PBS溶液；
荧光标记死细胞染液：1μL荧光标记染料加1mL PBS缓冲液。
c)实验步骤
详细实验步骤参考发明人前期发表的文献(Zhang,J.et al.Clin Infect Dis2022)。
结果如图2和图3所示，使用ICS的方法最终对57条中的32条阳性表位激发CD4+或CD8+T细胞反应进行验证，其中仅能激发CD4+T细胞反应的单肽有1条，仅能激发CD8+T细胞反应的单肽有21条，能同时激发CD4+和CD8+T细胞反应有10条。
实施例4预测CD8+T阳性表位
本发明共筛选出57条SFTSV阳性多肽，根据阳性多肽对应的康复个体的HLA分型，使用NetMHCpan-4.1网站进行CD8+T细胞表位的预测。判断预测多肽与HLA分型的结合力的标准如下：1、当Affinity<50且％Rank<0.5定义为强结合力；2、当Affinity<500且％Rank<2定义为弱结合力。
本发明把所预测到的强结合力和弱结合力多肽进行ELISpot实验验证，最终鉴定到15条CD8+T细胞表位，如表2所示。
表2 CD8+T细胞表位
实施例5多肽在细胞免疫检测中的应用
将实施例2中提供的SFTSV阳性表位多肽序列对应的合成多肽、核酸表达多肽或其它形式的能够产生免疫原的相关组分，应用于发热伴血小板减少综合征病人、康复者、动物实验等的SFTS细胞免疫水平检测。
实施例6多肽在制备疫苗中的应用
将实施例2中提供的SFTSV阳性表位多肽对应的序列，以合成多肽，或核酸序列合成RNA或DNA片段在体内或体外多肽的表达，用于提供SFTSV的免疫原，将多肽与一定的疫苗载体连接获得疫苗。
实施例7多肽在细胞疗法中的应用
根据实施例2中的方法，分离单个患者的PBMCs，将细胞与实施例2中提供的多肽在培养基中进行体外刺激，诱导完成后检测T细胞针对SFTSV的杀伤能力，通过分选获得特异性T细胞，用于患者的SFTS治疗。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.发热伴血小板减少综合征病毒的T细胞反应长肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.57任一所示。
2.发热伴血小板减少综合征病毒来源的CD8+T细胞表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.60，SEQ ID NO.62～SEQ ID NO.71任一所示。
3.编码权利要求1所述T细胞反应长肽或权利要求2所述CD8+T细胞表位肽的核酸。
4.携带权利要求3所述核酸的重组载体。
5.含有权利要求3所述核酸或权利要求4所述重组载体的宿主细胞。
6.一种肽库，其特征在于，包括如下(a)～(c)任一：
(a)由权利要求1所述T细胞反应长肽中的任意一条或多条组成的肽库；
(b)由权利要求2所述CD8+T细胞表位肽中的任意一条或多条组成的肽库；
(c)由(a)和(b)组成的肽库。
7.权利要求6所述的肽库在制备中国人群HLA特异发热伴血小板减少综合征病毒疫苗中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括表位疫苗。
9.权利要求6所述的肽库在制备细胞疗法或过继疗法试剂盒中的应用。
10.权利要求1所述T细胞反应长肽、或权利要求2所述CD8+T细胞表位肽、或权利要求3所述的核酸、或权利要求4所述的重组载体、或权利要求5所述的宿主细胞、或权利要求6所述肽库在制备预防、治疗或检测发热伴血小板减少综合征病毒的制品中的应用；可选的，所述制品包括疫苗、药物或检测试剂。
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