CN117883638A - 一种用于制备天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的试剂盒和脱细胞方法 - Google Patents
一种用于制备天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的试剂盒和脱细胞方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于制备天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的试剂盒和脱细胞方法；所述的试剂盒包括脱细胞液A、脱细胞液B、脱细胞溶液C、脱细胞溶液D及脱细胞溶液E；所述脱细胞液A的溶质为丙酮，脱细胞液B中的溶质为Triton X‑100，所述脱细胞液C的溶质为HTHOPS,所述脱细胞液D的溶质为SDS，脱细胞溶液E的溶质为DNaseⅠ及RNase。本发明试剂盒对骺软骨连骨生物材料进行脱细胞处理时，操作简单，成本低，且能彻底地清除细胞及其内容物，在完全除去具有免疫原性的细胞及细胞内容物成分的同时，最大程度地保留了骺软骨连骨ECM的完整性，能调控细胞的黏附、迁移和增殖。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程材料领域，更特别地，涉及一种用于制备天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的试剂盒和脱细胞方法。
背景技术
因感染、创伤和关节退行性改变等因素引起的关节炎可以对患者造成持续性疼痛和活动受限，严重影响患者运动功能及生活质量。据世界卫生组织估计，60岁以上的男性有9.6％，女性有18.0％患有症状性骨关节炎，80％的患者活动受限，25％的患者不能进行日常主要活动。关节软骨的愈合能力差，骨关节炎或软骨缺损后透明软骨自然愈合能力有限，而这些缺损可导致灾难性的退行性关节炎。关节炎的本质是因软骨退变或软骨缺损导致关节持续摩擦，导致软骨细胞死亡及其细胞外基质的退变及崩解，进而产生大量炎症介质，从而产生恶性循环。虽然现在已知它是一种复杂的疾病，影响到整个关节，包括软骨、软骨下骨、滑膜和韧带，关节软骨的机械性退化和软骨下骨的交替在其发病机制中起着关键作用。关节软骨和软骨下骨紧密连接，关节软骨的营养供应除了来自关节液以外，软骨下骨的支持也同样重要。软骨下骨的作用不仅仅一种机械支持的作用。最近的证据表明，软骨和软骨下骨之间的相互作用要复杂得多。软骨下骨产生的特异性分泌因子可以调节覆盖的软骨细胞的反应。而骨关节炎患者出现关节软骨缺损，软骨下骨坏死硬化甚至出现囊性变，因此关节软骨的退变炎症以及软骨下骨坏死导致关节软骨失去软骨下骨的营养支持，最终导致关节炎的持续加重，最终导致患者的残疾。因此治疗关节炎必须同时修复关节软骨和软骨下骨，否则在没有健康的软骨下骨作为支持，关节软骨将难以得到很好的修复。
目前临床上尚未有治愈骨关节炎的药物，骨关节炎的最终结局均为关节置换术，而该手术指针把控严格，均需到达骨关节炎晚期才允许实施，在漫长的骨关节炎病程中给患者带来巨大的精神压力。目前常见的材料修复策略包括开发一种双层人工移植物分别促进透明软骨及软骨下骨的再生。例如，在Wang H的研究中，开发了基于单油酸甘油酯-透明质酸复合溶致液晶的原位自组装凝胶，作为传递kartogenin用于软骨长期再生的仿生支架。Lin D形成聚乙二醇化聚癸二酸甘油双层支架，再生全层骨软骨缺损。但上述材料均为双层分明的材料，考虑到骨软骨缺损通常涉及软骨和软骨下骨的损伤，组织支架在细胞组成、生长因子、材料组成、结构、力学性能和细胞培养条件方面必须具有离散梯度或连续梯度，因此有相当多的学者开始研发双层过渡材料和连续梯度材料。尽管骨软骨组织支架的研制在体外和体内的骨软骨再生方面都取得了良好的效果，但长期的临床随访研究并不令人满意，还需要进一步研究用于骨软骨再生的梯度组织支架。目前人工移植物材料模拟的是成熟后的骨软骨双层结构，但骨软骨再生需要一个逐渐改建和成熟的过程才能更好地契合骨软骨缺损部位，因此亟需寻找模拟修复过程中的骨软骨双相支架，而人工移植物材料难以完全模仿天然来源的生物材料的三维立体结构和成分。我们发现正在发育个体中骺软骨连骨结构与骨软骨再生中的结构十分相似，其中的信号通路过程也相类似，因此将骺软骨连骨进行脱细胞处理后可能可以作为一种新型修复骨软骨缺损的双相支架材料。
骺软骨是生长中的长骨两端干骺端的软骨组织,在次级骨化中心出现前关节软骨和骺软骨均来自于长骨两端的软骨，随着次级骨化中心的出现，两端软骨的微环境的改变分别向透明软骨和骨分化。骺软骨的静止区和增殖区中的软骨细胞能够分泌蛋白和蛋白聚糖从而形成以二型胶原为主要成分的软骨细胞外基质，与透明软骨的主要成分一致。而骺软骨肥大区的软骨细胞分泌十型胶原并迅速凋亡矿化，血管入侵该部位后成骨细胞和破骨细胞通过不断的成骨和破骨过程，最终将软骨基质改建成成熟的松质骨基质，而该过程与骨再生中软骨内成骨的修复过程十分相似。运用脱细胞技术制备细胞外支架为组织修复再生材料的制备提供可行思路，且目前能用于修复软骨联合骨的生物材料较少见报道，而骨骺连骨的生物材料修复骨关节炎则未见报道。
因此，需要一种新的骺软骨连骨生物材料的脱细胞制备方法和试剂，其不仅能去除异种组织的免疫原性，而且能最大限度地保留细胞外基质成分。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，包括脱细胞液A、脱细胞液B、脱细胞溶液C、脱细胞溶液D及脱细胞溶液E组成，其中所述脱细胞液A为体积分数为10-30％的丙酮溶液，脱细胞液B为含有体积分数1-2％的Triton X-100的PBS缓冲液，所述脱细胞液C为含有质量分数为1-2％的HTHOPS的PBS缓冲液,所述脱细胞液D为含有质量分数为1-3％的SDS的PBS缓冲液，脱细胞试剂E为含有浓度为0.01-0.10mg/ml的DNaseⅠ及RNase的PBS缓冲液。
优选地，在所述A液中，所述丙酮溶液体积分数为20％。
优选地，所述Triton X-100的体积分数为1％，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
优选地，在所述C液中，所述HTHOPS的质量分数为1％，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
优选地，在所述D液中，所述SDS的质量分数为1％，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
优选地，在所述E液中，所述DNaseⅠ及RNase的浓度均为0.01mg/ml，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
本发明还提供了一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞方法，使用上述试剂盒处理所述组织，包括用所述A液、B液、C液、D液及E液依次浸泡所述组织的步骤。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
S1：用无菌水反复漂洗骺软骨连骨生物材料；
S2：用所述A溶液处理骺软骨连骨生物材料；
S3：用无菌水漂洗经S2处理的骺软骨连骨生物材料；
S4：用所述B液处理经S3处理的骺软骨连骨生物材料；
S5：用PBS漂洗经S4处理的骺软骨连骨生物材料；
S6：用所述C液处理经S5处理的骺软骨连骨生物材料；
S7：用PBS漂洗经S6处理的骺软骨连骨生物材料；
S8：用所述D液处理经S7处理的骺软骨连骨生物材料；
S9：用PBS漂洗经S8处理的骺软骨连骨生物材料；
S10：用所述E液处理经S9处理的骺软骨连骨生物材料；
S11：用PBS漂洗经S10处理的骺软骨连骨生物材料，即可得到去细胞骺软骨连骨生物支架。
优选地，所述方法包括以下步骤：
S1：用无菌水于温度为25℃条件下反复漂洗至少5次，每次5min；
S2：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述A溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时；
S3：用无菌水漂洗经S2处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
S4：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述B溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡48小时；
S5：用PBS漂洗经S4处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
S6：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述C溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时；
S7：用PBS漂洗经S6处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
S8：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述D溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡24小时；
S9：用PBS漂洗经S8处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
S10：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述E溶液中，于温度为37℃条件下水浴24小时；
S11：用PBS漂洗经S10处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟，即可得到去细胞骺软骨连骨生物支架。
优选地，所述组织为猪的骺软骨连骨生物材料。
本发明还提供了一种去细胞生物支架，其可以通过上述方法得到。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的制备方法，具有以下有益效果：
(1)本发明首次实现对猪骺软骨连骨脱细胞材料的制备，SDS及HT HOPS同为去垢剂，相对温和，且脱细胞效果可观，能在完全去除材料中细胞及其细胞内容物的同时，更大程度地保留原有的天然细胞外基质成分和结构的完整性，且拥有良好的生物相容性。
(2)本发明材料源于幼年大白猪股骨，原材料来源广泛，可用于批量生产。
(3)本发明可定制不同尺寸的个体化骺软骨连骨生物材料，以用于满足临床上复杂多样的修复软骨联合骨的需要。
(4)本发明的脱细胞生物支架制备周期短、费用低，优于以往脱细胞基质，具有很好的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架HE染色评估图；标尺为100um
图2为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架DAPI染色评估图；标尺为100um
图3为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架各区域DNA定量检测图；***：p＜0.001
图4为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架GAGs保留定量评估图；ns：p＞0.05，***：p＜0.001
图5为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架胶原蛋白保留定量评估图；ns：p＞0.05
图6为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架三维结构保留评估图；
图7为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架细胞种植评估图；
图8为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架CCK-8评估图；ns：p＞0.05
图9为本发明脱细胞前后骺软骨连骨支架皮下包埋实验评估图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的制备
A液的配置：精确量取20ml丙酮及80ml无菌水，两种试剂加入干净的光口玻璃瓶中，摇床上震荡30min，现配现用。
B液的配置：精确量取1ml Triton X-100、0.001mol PBS、99ml无菌水加入干净的广口玻璃瓶中，摇床上震荡1h，使试剂充分溶解，现配现用。
C液的配置：精确量取1g HTHOPS、0.001mol PBS加入干净的广口玻璃瓶中并定容至100ml，摇床上震荡1h，使试剂充分溶解，现配现用。
D液的配置：精确量取1g SDS、0.001mol PBS加入干净的广口玻璃瓶中并定容至100ml，摇床上震荡1h，使试剂充分溶解，现配现用。
E液的配置：精确量取0.1mg DNaseⅠ、0.1mg RNase、0.001mol PBS加入干净的广口玻璃瓶中并定容至100ml，轻轻搅拌5min，使试剂充分溶解，现配现用。
实施例2使用实施例1的试剂盒进行脱细胞处理
(1)骺软骨连骨的取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骨骺连骨，用无菌PBS缓冲液反复漂洗5次，每次5min，去除表面的油脂、血液和组织液等杂质，然后置于4℃含抗生素(100U/ml青霉素,250mg/ml两性霉素B和100mg/ml链霉素)的PBS溶液中暂存。取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为6mm，高度为6mm的圆柱体。
(2)脱细胞流程：
用无菌水于温度为25℃条件下反复漂洗至少5次，每次5min；猪骺软骨连骨生物材料在六孔板中进行，每孔工作容量为5ml且最多每孔放置2片生物材料。将骺软骨连骨生物材料置于体积分数为20％的丙酮溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时。用无菌水漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有体积分数为1％ Triton X-100的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡48小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有质量分数为1％ HTHOPS的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有质量分数为1％ SDS的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡24小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有浓度为0.01mg/ml DNaseⅠ及0.01mg/ml RNase的PBS溶液中，于温度为37℃条件下水浴24小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟，以去除残余的试剂及细胞碎片，即可得到去细胞骺软骨连骨生物支架，置于含抗生素的PBS中，4℃保存备用。
以下为通过上述方法得到的脱细胞骺软骨连骨生物支架作为模板进行一些列性能检测，具体结果如下：
1.脱细胞效果评估
①.HE染色
将脱细胞骺软骨连骨生物支架置于体积分数4％的多聚甲醛溶液固定24小时后，置于37℃含有20％EDTA-2Na的PBS溶液中脱钙2周，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片，行HE染色后于光镜下观察组织。结果显示脱细胞骺软骨连骨生物支架中未见任何细胞成分，脱细胞后的骺软骨连骨生物支架的三层结构与天然骺软骨连骨相仿(图1)。
②.DAPI染色
将脱细胞骺软骨连骨生物支架置的石蜡切片经脱蜡、水洗，以DAPI染液浸染5min，PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察。结果显示，脱细胞骺软骨连骨生物支架中未见任何细胞核及核碎片，表明细胞已完全去除(图2)。
③.DNA定量检测
将脱细胞骺软骨连骨生物支架中的骺软骨及松质骨部分剥离，每个组分取干重质量约40～60mg。在56℃水浴中经蛋白酶K和RNase酶解，提取基因组DNA(按照DNA提取试剂盒说明操作)，以微量紫外分光光度仪测定其浓度，并计算每毫克组织DNA含量。脱细胞前的骺软骨连骨生物材料与脱细胞后的骺软骨连骨生物支架的DNA含量分别为297.23±62.55ng/mg、6.64±2.57ng/mg(p＜0.001)，结果显示，与天然材料相比，脱细胞后支架DNA含量显著降低(图3)。
2.主要成分保留评估
①.糖胺聚糖(GAGs)含量测定：糖胺聚糖(GAGs)含量：称取各组瓣膜(n＝6)干重为200mg的待测样品，剪碎。加入木瓜蛋白酶溶液10ml，60℃溶解消化3h。待测样品溶解后，以磷酸二氢钾溶液定容至20ml，加入1,9二甲基亚甲蓝染料各200ul。以分光光度计在540nm处测定各样品的吸光度值。不同浓度的硫酸软骨素标准品用于标准曲线的绘制，计算各待测样品的GAGs含量。脱细胞前的骺软骨连骨生物材料与脱细胞后的骺软骨连骨生物支架的GAGs含量分别为4.47±1.02μg/mg、3.56±1.32μg/mg(p＞0.05)，表明脱细胞后，GAGs有一定的损失(图4)。
②.胶原蛋白含量测定：根据羟脯氨酸在胶原蛋白中的含量为13.4％推算去细胞处理前后胶原含量的变化。按照羟脯氨酸测试盒说明书，精确称取脱细胞骺软骨连骨生物支架中的各组分标本各100mg(n＝5)，放入试管中并加入水解液，沸水浴20min，调节pH值至6.0～6.8。经反复离心、纯化，与标准液一起采用550nm酶标仪检测吸光度，计算每毫克组织羟脯氨酸含量，进一步推算骨膜组织的胶原含量。脱细胞前的骺软骨连骨生物材料与脱细胞后的骺软骨连骨生物支架的胶原蛋白含量分别为63.43±4.27mg/g、56.32±6.32mg/g(p＞0.05)，表明胶原含量与脱细胞前相比无明显差异(图5)。
3.主要结构保留评估
扫描电镜：标本用体积分数3％的戊二醛溶液固定24h，生理盐水浸泡15min，重复3次。乙醇梯度脱水，每次脱水15min以上，真空干燥及表面喷金处理后在扫描电镜下观察三维微观结构。结果可见支架脱细胞后三维结构保持完好，胶原纤维未见明显断裂，表明该脱细胞方法对组织结构破坏较小(图6)。
4.生物相容性评价
①.细胞培养及种植：将脱细胞骺软骨连骨生物支架铺于12孔板中，加入DMEM/F12培养基后置于37℃培养箱6min后取出备用。将小鼠骨间充质干细胞(BMSCs)原代细胞种株培养于含10％胎牛血清和含有双抗的高糖培养基中，待细胞长至80％左右用0.025％胰酶消化传代，传至第3-5代时消化重悬计数，每孔孔内铺5×104/ml细胞悬液2ml。将BMSCs分别种植于D-ECPCB和D-ECSCB复合支架上，第4天换液一次，培养至第7天后收集标本放置于4％多聚甲醛溶液中固定，并进行HE染色观察细胞种植情况。可见细胞能正常在支架中各个部位进行粘附、增殖和迁移，细胞形态未发现如细胞空心化、细胞凋亡、细胞死亡等细胞形态明显异常的改变，证明脱细胞骺软骨连骨生物支架无明显细胞毒性(图7)。
②.CCK-8实验：对特定时间点不同浓度浸提液培养细胞进行计数，以验证支架细胞毒性：将D-ECPCB和D-ECSCB复合支架在29kGy的γ辐照灭菌后，在37℃下用普通高糖培养基浸泡48h(样品/培养基的体积＝1：5)，提取并收集上清液进行进一步分析。将C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)以每孔1000个细胞的密度接种到96孔板中37℃预培养24h让细胞贴壁，后加入100μL不同浓度浸提液(0％、25％、50％、100％)，分别在第1、3、5、7天采用CCK-8试剂盒测定细胞数量，即每孔加入10μlCCK-8试剂，37℃孵育2h以定量测定细胞代谢。用Epoch微板分光光度计测定450nm处吸光度。结果表明，细胞代谢活性均无明显下降(p>0.05)，脱细胞骺软骨连骨生物支架无明显细胞毒性(图8)。
③.皮下包埋实验：取10只SD大鼠，采用4％水合氯醛进行腹腔麻醉。俯卧位固定于手术台面，背部手术区备皮、消毒、铺巾。取背部正中纵行切口，长约1.5cm，钝性分离，充分暴露皮下。取脱细胞骺软骨连骨生物支架进行皮下包埋实验，逐层缝合筋膜及皮肤，无菌敷贴覆盖。从手术日开始计算，于包埋第2周及第4周分别取出大鼠的皮下包埋物，大体观察包埋处凝胶与周围软组织的相容性，并进行组织HE染色。从手术开始到研究结束，所有SD大鼠在植入脱细胞骺软骨连骨生物支架后1周，手术创口处均未见皮肤红肿、渗液，未见有SD大鼠存在异常行为和现象，切开皮肤后肉眼观察皮下包埋支架，均未见明显血肿、积脓等异常现象。根据HE染色结果显示，各个阶段植入SD大鼠皮下组织的脱细胞骺软骨连骨生物支架周围被少量纤维结缔组织包裹。植入大鼠皮下组织2周后，宿主反应表现为骨界面中性粒细胞和单核细胞密集浸润，骨区中性粒细胞和单核细胞弥散浸润，同时可见多条血管分布，尤以松质骨区最为明显。植入后4周，纤维包膜与骨区交界处的血管明显增多。除中性粒细胞和单核细胞散在浸润外，支架周边偶见散在的多核巨细胞。此外，我们还发现，脱细胞骺软骨连骨生物支架的骺软骨出现了明显的退变现象，松质骨区域也有轻微的退变(图9)。总的来说，与那些细胞成分引起致密结缔组织沉积和/或瘢痕形成的生物材料不同，脱细胞骺软骨连骨生物支架未引起严重的免疫排斥反应。
实施例3使用实施例1的试剂盒进行脱细胞处理
(1)骺软骨连骨的取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骨骺连骨，用无菌PBS缓冲液反复漂洗5次，每次5min，去除表面的油脂、血液和组织液等杂质，然后置于4℃含抗生素(100U/ml青霉素,250mg/ml两性霉素B和100mg/ml链霉素)的PBS溶液中暂存。取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为6mm，高度为6mm的圆柱体。
(2)脱细胞流程：
用无菌水于温度为25℃条件下反复漂洗至少5次，每次5min；猪骺软骨连骨生物材料在六孔板中进行，每孔工作容量为5ml且最多每孔放置2片生物材料。将骺软骨连骨生物材料置于体积分数为10％的丙酮溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时。用无菌水漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有体积分数为1.5％ Triton X-100的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡48小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有质量分数为1.5％ HTHOPS的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有质量分数为2％SDS的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡24小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有浓度为0.05mg/ml DNaseⅠ及0.05mg/ml RNase的PBS溶液中，于温度为37℃条件下水浴24小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟，以去除残余的试剂及细胞碎片，即可得到去细胞骺软骨连骨生物支架，置于含抗生素的PBS中，4℃保存备用。
实施例4使用实施例1的试剂盒进行脱细胞处理
(1)骺软骨连骨的取材：取新鲜3月龄幼年大白猪股骨远端骨骺连骨，用无菌PBS缓冲液反复漂洗5次，每次5min，去除表面的油脂、血液和组织液等杂质，然后置于4℃含抗生素(100U/ml青霉素,250mg/ml两性霉素B和100mg/ml链霉素)的PBS溶液中暂存。取材大小视实际需求确定，通常大小取直径为6mm，高度为6mm的圆柱体。
(2)脱细胞流程：
用无菌水于温度为25℃条件下反复漂洗至少5次，每次5min；猪骺软骨连骨生物材料在六孔板中进行，每孔工作容量为5ml且最多每孔放置2片生物材料。将骺软骨连骨生物材料置于体积分数为30％的丙酮溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时。用无菌水漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有体积分数为2％ Triton X-100的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡48小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有质量分数为2％ HTHOPS的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有质量分数为3％ SDS的PBS缓冲液中，于温度为25℃条件下持续震荡24小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟。将骺软骨连骨生物材料置于含有浓度为0.1mg/ml DNaseⅠ及0.1mg/ml RNase的PBS溶液中，于温度为37℃条件下水浴24小时。用PBS漂洗5次，每次30分钟，以去除残余的试剂及细胞碎片，即可得到去细胞骺软骨连骨生物支架，置于含抗生素的PBS中，4℃保存备用。
Claims (10)
1.一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：包括脱细胞液A、脱细胞液B、脱细胞溶液C、脱细胞溶液D及脱细胞溶液E组成，其中所述脱细胞液A为体积分数为10-30％的丙酮溶液，脱细胞液B为含有体积分数1-2％的Triton X-100的PBS缓冲液，所述脱细胞液C为含有质量分数为1-2％的3-烯丙氧基-2-羟基-1-丙烷磺酸钠盐的PBS缓冲液,所述脱细胞液D为含有质量分数为1-3％的十二烷基硫酸钠的PBS缓冲液，脱细胞试剂E为含有浓度为0.01-0.10mg/ml的DNaseⅠ及RNase的PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞液A中，所述丙酮溶液体积分数为20％。
3.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞液B中，所述Triton X-100的体积分数为1％，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
4.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞溶液C中，所述HTHOPS的质量分数为1％，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
5.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞溶液D中，所述SDS的质量分数为1％，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
6.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞溶液E中，所述DNaseⅠ及RNase的浓度均为0.01mg/ml，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的脱细胞方法，其特征在于：所述的试剂盒处理骺软骨连骨生物材料，包括用所述脱细胞液A、脱细胞液B、脱细胞溶液C、脱细胞溶液D及脱细胞溶液E依次浸泡所述组织的骺软骨连骨生物材料。
8.根据权利要求7所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的脱细胞方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：用无菌水反复漂洗骺软骨连骨生物材料；
S2：用所述脱细胞液A处理骺软骨连骨生物材料；
S3：用无菌水漂洗经S2处理的骺软骨连骨生物材料；
S4：用所述脱细胞液B处理经S3处理的骺软骨连骨生物材料；
S5：用PBS漂洗经S4处理的骺软骨连骨生物材料；
S6：用所述脱细胞溶液C处理经S5处理的骺软骨连骨生物材料；
S7：用PBS漂洗经S6处理的骺软骨连骨生物材料；
S8：用所述脱细胞溶液D处理经S7处理的骺软骨连骨生物材料；
S9：用PBS漂洗经S8处理的骺软骨连骨生物材料；
S10：用所述脱细胞溶液E处理经S9处理的骺软骨连骨生物材料；
S11：用PBS漂洗经S10处理的骺软骨连骨生物材料，即可得到去细胞骺软骨连骨生物支架。
9.根据权利要求7所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的脱细胞方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：用无菌水于温度为25℃条件下反复漂洗骺软骨连骨生物材料至少5次，每次5min；
S2：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述脱细胞液A中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时；
S3：用无菌水漂洗经S2处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
S4：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述脱细胞液B中，于温度为25℃条件下持续震荡48小时；
S5：用PBS漂洗经S4处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
S6：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述脱细胞溶液C中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时；
S7：用PBS漂洗经S6处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
S8：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述脱细胞溶液D中，于温度为25℃条件下持续震荡24小时；
S9：用PBS漂洗经S8处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
S10：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述脱细胞溶液E中，于温度为37℃条件下水浴24小时；
S11：用PBS漂洗经S10处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟，即可得到去细胞骺软骨连骨生物支架。
10.根据权利要求7或8或9所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的脱细胞方法，其特征在于：如权利要求1或中任一项所述用于去除组织细胞的去细胞方法，其特征在于，所述组织为猪骺软骨连骨生物材料。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311441280.5A CN117883638A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 一种用于制备天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的试剂盒和脱细胞方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311441280.5A CN117883638A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 一种用于制备天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的试剂盒和脱细胞方法 |
Publications (1)
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| CN117883638A true CN117883638A (zh) | 2024-04-16 |
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ID=90643577
Family Applications (1)
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| CN202311441280.5A Pending CN117883638A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 一种用于制备天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的试剂盒和脱细胞方法 |
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-
2023
- 2023-11-01 CN CN202311441280.5A patent/CN117883638A/zh active Pending
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