CN117881412A

CN117881412A - 包括hapln1的用于预防或治疗纤维性疾病的组合物

Info

Publication number: CN117881412A
Application number: CN202280054108.1A
Authority: CN
Inventors: 金大敬; 金容珣; 白文正; 表廷勋; 大卫·金; 朴勇玮; 廉旻雅
Original assignee: Harpsaians Co ltd; Industry Academic Cooperation Foundation of Chung Ang University
Current assignee: Harpsaians Co ltd; Industry Academic Cooperation Foundation of Chung Ang University
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2022-08-02
Publication date: 2024-04-12
Also published as: CA3228288A1; EP4382115A1; AU2022322679A1; WO2023014062A1; JP2024530029A; KR102646367B1; KR20230097071A

Abstract

本发明公开一种用于预防或治疗纤维性疾病的药物组合物，其包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1；HAPLN1)或编码其的基因作为有效成分，以及利用所述组合物的预防或治疗纤维性疾病的方法。根据本发明，可以通过预防和抑制细胞或组织的纤维化，从根本上抑制由纤维化诱发的各种疾病的发生或进展，从而预防或治疗该疾病。

Description

包括HAPLN1的用于预防或治疗纤维性疾病的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于修复由纤维化引起的各种组织损伤并预防或治疗纤维性疾病的组合物，其包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan linkprotein 1；HAPLN1)或编码其的基因作为有效成分。具体地，本发明涉及一种用于修复和再生组织纤维化和由此引起的损伤的组合物，其含有HAPLN1作为有效成分。另外，本发明涉及一种用于修复和恢复由纤维化引起的各种组织损伤和功能丧失且用于预防或治疗包括纤维性疾病的老化性·退行性疾病的组合物。

此外，本发明公开一种用于预防或治疗纤维性疾病的组合物以及利用所述组合物的预防或抑制细胞纤维化的方法。根据本发明，提出了一种可以通过预防和抑制细胞纤维化来从根本上抑制和治疗由于细胞纤维化进行干预而引起的各种疾病的发生或进展的可能性。

背景技术

肺部变硬如石头般的“肺纤维化症(Lung Fibrosis)”的医学定义是指健康的肺组织因某种原因变成疤痕(scar)组织，导致肺组织变厚或变硬状态的疾病。就如在韩国发生的加湿器杀菌剂事件，明确地已知其原因是加湿器中用于维持杀菌作用的特定有害化学物质，但肺部在没有明确原因的情况下硬化的疾病是“特发性肺纤维化症(IPF，IdiopathicPulmonary Fibrosis)”。这种疾病在组织学上是一种间质性肺疾病(Interstitial LungDisease，ILD)，其显示出特征为肺实质的炎症和纤维化的“普通型间质性肺炎”(UsualInterstitial Pneumonia，UIP)症状，并已知各种危险因素包括高龄(aging)、吸烟、胃食管反流疾病、环境性·职业性暴露、粉尘工作、辐射暴露、自身免疫、药物成瘾、过敏性肺炎、病毒·病原菌感染以及家族史等。然而，尽管近年来医学技术发达且科学家也做出了努力，但尚为发现这种疾病的病因。平均发病年龄为69岁，主要发生于高龄人士中，男性发病率为女性的2倍或更高，且预后也较差。在作为具有代表性的肺纤维化症的“特发性肺纤维化症”的情况下，韩国的患者人数为每10万人中就有1.7人，其病因不明，是一种难以治疗的非常可怕的疾病。平均生存期为60个月，但每年有14％的患者因感染(infection)等而引致急性恶化(exacerbation)发生。当发生急性恶化时，生存期急剧下降至15个月。

肺纤维化症患者的肺泡壁因疤痕(scar)组织而变厚，且随着这些疤痕组织逐渐恶化，肺实质组织被破坏。此时，特别地，吸入空气的吸气变得困难，因此无法吸入足够的空气来向血液供给氧气。结果，肺泡(alveoli)无法发挥其原有功能，出现呼吸急促、频繁干咳、疲劳症、以及指尖和脚趾出现棒状型的特征性变化，并诱发作为三个主要症状的咳嗽、劳力性呼吸困难和由痰引起的水泡音(Crackle)。最近正流行的流行病COVID-19病毒也在肺部发生感染和炎症时，在痊愈过程中也引起肺纤维化。

纤维化最著名的危险因素是高龄(aging)。特别地，研究肺组织病变的研究人员最近发现了肺纤维化症患者具有细胞老化(cellular senescence)的征候即其肺细胞无法维持分裂和生长的事实。基于细胞老化的理论，包括人类在内的有机体的老化被报道为是由于在生理上没有用处且反而会促进病理状况的老化细胞积累而造成，且老化是细胞进入一系列称为细胞周期停滞(cell cycle arrest)的过程，不再以正常速度分裂且生成细胞的现象。根据最近的报道，对于老年肺炎(elderly pneumonia)，系统地说明了细胞老化对纤维化症的影响。(Yanagi 2017，Int.J.Mol.Sci.18，503)。

随着吸烟或年龄增长而发生的细胞内DNA损伤和染色体“末分段磨损”，即端粒损耗(telomere attrition)与因高龄而引起的免疫老化(immunosenescence)现象一起进展，不仅清除体内存在的老化细胞存在限制，而且细胞也放弃增殖并且无法增加数量(cellgrowth arrest)，同时反而向细胞外分泌白细胞介素1β(IL-1β)等的称为衰老相关分泌物(SASP，senescence-associated secretory phenotype)的炎症·老化诱导性物质，因此还影响周围的正常细胞，使其变成老化细胞。随着老化细胞数量的增加，分泌更多的SASP，导致伴有慢性低度炎症(chronic low-grade inflammation)的病理状态，同时组织的再生和修复能力自然逐渐下降，最终正常的肺组织结构开始被破坏，特别地在高龄者的情况下，随着他们具有的各种合并因素增加，结果对各种外部病攻击的抵抗力降低(highvulnerability)，导致最初发生的纤维化症进一步发展并恶化。

换言之，本发明人注意到如上所述的肺纤维化症的危险因素为高龄，并为了发掘可预防或治疗该疾病发病的“血液中的内源性物质”，通过年轻和老龄小鼠之间的异种共生(heterochronic parabiosi)和利用蛋白质组学技术的定性·定量分析法来进行探索，在该过程中，注意到透明质酸(hyaluronan，HA)和蛋白多糖(proteoglycan)连接蛋白(hyaluronan and proteoglycan link protein1；HAPLN1)是最有可能性的物质。根据各种文献，HAPLN1蛋白是在脊椎动物软骨(cartilage)中最初发现的细胞外基质(ECM；extracellular matrix)的构成蛋白之一，据报道，其不仅起到稳定透明质酸和蛋白多糖的结构聚集体(aggregate)的作用，还起到使得此时结合的蛋白多糖之间的间隔结合得非常致密的作用，从而起到铰链(hinge)作用以造出瓶刷(bottle-brush)形状。本发明人证明出，重组人蛋白HAPLN1(recombinant human HAPLN1；rhHAPLN1)通过其铰链型连接功能实际上抑制其伙伴分子即高分子量(high molecular weight)HA(HMW HA)和聚蛋白多糖(aggrecan)(蛋白多糖的一种)的分解，从而可以减少作为损伤相关分子模式(DAMPs，damage-associated molecular patterns)物质的低分子量(low molecular weight)HA(LMW HA)或32-mer肽的生成。

肌成纤维细胞(myofibroblast)是纤维性疾病中过度形成胶原蛋白等纤维组织的主要细胞。这些肌成纤维细胞特征性地出现α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达，因此，αSMA表达水平是可以得知肌成纤维细胞表达水平的重要指标。实际上，据报道，在特发性肺纤维化症和肾脏纤维化症等的各种纤维性疾病中，表达αSMA的肌成纤维细胞数量增加，并且在体内(in vivo)纤维化模型中，αSMA表达也增加。据报道，这些肌成纤维细胞主要来源于成纤维细胞(fibroblast)，除此之外，其也来源于内皮细胞(endothelial cell)、上皮细胞(epithelial cell)和干细胞(stem cell)等(The American Journal of Pathology,.2007.170(6)：1807-1816)。在肝纤维化的情况下，肝星状细胞(stellate cell)被激活，起到过度形成胶原蛋白等纤维组织的作用，并且在肝星状细胞被激活时，αSMA表达也增加，使得其被用作肝星状细胞的激活指标(Cells 2019，8(11)，1419)。

作为成纤维细胞分化(或肝星状细胞的激活)的诱导因子，最广为人知的因子为TGFβ1，此外，据报道，僵硬(stiff)环境中的机械应力(mechanical stress)是肌成纤维细胞的分化因素(The American Journal of Pathology,.2007.170(6)：1807-1816)。因此，在各种细胞中通过TGFβ1诱导αSMA表达的被用作体外(in vitro)纤维化模型，且减少诱导的αSMA表达的活性被判断为抗纤维化效能(Molecular Medicine 2021 27：22)。

为了证明针对肺纤维化症的有效性，迄今为止已经建立了各种动物模型，但最广泛认可和使用的模型是“吸入博莱霉素(Bleomycin，BL)诱导的肺纤维化症(Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis，BIPF)小鼠模型”。最初，博来霉素被用作抗癌剂或治疗疣，但通过建立在加州大学戴维斯分校兽医学院Giri教授的研究小组于1998年建立的三剂量气管吸入仓鼠模型(a three-dose bleomycin(BL)-hamster model)(Iyer 1998)、Oku等人于2008年建立的每天一次且持续5天给小鼠静脉注射博莱霉素的模型(Oku 2008，EuropeanJournal of Pharmacology 590；400-408)、以及最近Song等人(EXPERIMENTAL ANDTHERAPEUTIC MEDICINE 16：1800-1806，2018)的大鼠模型中经支气管途径施用博莱霉素一次后的次日开始立即每天经口服施用一次许可药物即吡非尼酮(pirfenidone)且持续施用14次或28次的模型，从而成功诱导了肺纤维化症，并研究了相应药物的效能和几种机制。结果，据报道，在14天和28天的组中，因博莱霉素而增加的骨膜蛋白(periostin)和TGFβ1水平减少(Song 2018)。

实际上，现时通过利用这种IPF小鼠模型而获得出售许可的IPF治疗剂只得两种，对于其中之一即吡非尼酮(pirfenidone)(PFD；商品名为Pirespa)，平安盐野义制药公司(Shionogi&Co.，Ltd.)在日本于2008年最先获得许可承认，随后欧盟于2011年、加拿大于2012年、美国于2014年分别获得许可承认。作为另一种治疗剂的尼达尼布(nintedanib)的商品名为Ofev或Vargatef，其为最近于2020年3月在美国获得许可的肺纤维化症治疗剂。根据开发吡非尼酮(PFD)的Oku等人(Oku 2008)，当对小鼠每天连续五次静脉施用(intravenous injection，IV)博莱霉素时，发现了炎症反应(inflammation)在施用开始后10天左右达到最高点后逐渐减弱，并且纤维化(fibrosis)在施用开始后约8至9天起逐渐进展。

更具体地，为了确定候选药物即吡非尼酮针对肺纤维化症的效能，该研究团队分别观察了在第一次施用博莱霉素的日子(第0天)后的次日(第1天)开始每天施用吡非尼酮3次持续10天或28天后的治疗效能。根据Oku等人的研究团队，在此时同时处理作为抗炎症皮质类固醇(corticosteroid)制剂的一种的泼尼松龙(prednisolone)的组中，炎症相关生物标志的水平减少，但并没看到作为抗纤维症效能尺度的TGFβ1水平减少。因此，由此推断，得出炎症在纤维化过程中的作用不仅不重要，而且在博来霉素施用后可以立即开始快速炎症反应，且通过初期施用药物可以在其后减缓或弱化缓慢进展的纤维化过程的结论。

一方面，在Oku等人的发表以后的两年后即2021年，du Bois等人所发表的论文中也得出了类似的结论(du Bois,R.M.Strategies for treating idiopathic pulmonaryfibrosis.Nature Rev.Drug Discov.2010，9，129-140)。

根据这些文献，本发明人通过利用如上所述的TGFβ1诱导的纤维性疾病细胞模型和博莱霉素诱导的肺纤维化症小鼠模型(BIPF)等，发现HAPLN1蛋白组合物即使在非常低的浓度下也在预防和治疗各种组织纤维化方面显示出优异的效能，从而完成本发明。

关于HAPLN1，例如，在美国公开专利US2013/0052198中公开了HAPLN1多肽作为由骨髓基质细胞(MSC，Marrow stromal cells)分泌的广泛个别因子之一，并提示在将其施用于患有炎症性疾病的个体时可以弱化该疾病的特征。然而，完全没有提及有关在各种组织中预防或治疗纤维化的作用。

如果可以直接预防或抑制体内细胞中异常且过度发生的纤维化，则对于纤维化本身作用为原因或促进已发病该纤维化作用的疾病进展的各种疾病，将是一种有效的对策，且总是存在有关此的需求。

发明内容

技术问题

本发明提供一种用于预防或治疗纤维性疾病的组合物，其包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1；HAPLN1)或编码其的基因作为有效成分，以及利用所述组合物的预防或治疗纤维性疾病的方法。

另外，通过提供包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1或编码其的基因作为有效成分的试剂组合物用于上述疾病的研究，以有助于确定该疾病的机制以及开发预防或治疗相关疾病的组合物。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供如下的发明方面。

[1]本发明的一方面涉及一种用于预防或治疗纤维性疾病的药物组合物，其包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1或编码其的基因作为有效成分。

[2]另外，本发明的一方面涉及一种组合物，其中，所述组合物的所述蛋白质具有相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的80％或更多的序列同一性。

[3]此外，本发明的一方面涉及一种组合物，其中，与所述基因有关的核酸包含在表达载体中。

[4]另外，本发明的一方面涉及一种组合物，其中，所述纤维性疾病的病灶选自由皮肤、肝、肠、心脏、肺和肾脏组成的组。

[5]此外，本发明的一方面涉及一种组合物，其中，所述纤维性疾病的病灶选自由皮肤成纤维细胞、肝星状细胞、结肠成纤维细胞、心脏微血管内皮细胞、肺成纤维细胞、肾脏肾小管细胞和肾脏近端小管上皮细胞组成的组。

[6]另外，本发明的一方面涉及一种组合物，其中，所述纤维性疾病为缺血性纤维化症。

[7]此外，本发明的一方面涉及一种组合物，其中，所述组合物的一次施用量为0.1ng/ml至500ng/ml。

[8]另外，本发明的一方面涉及一种组合物，其中，当体内施用所述组合物时，以0.001mg/kg至5mg/kg BK的rhHAPLN1蛋白质的用量施用。

[9]此外，本发明的一方面涉及一种组合物，其中，所述组合物作为主要或辅助有效成分包括在用于预防或抑制细胞纤维化症的组合物中。

[10]一方面，本发明的另一方面涉及一种通过在细胞中处理组合物的预防或抑制细胞纤维化的方法，其中，所述组合物包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1或编码其的基因作为有效成分。

[11]另外，本发明的额外方面涉及一种用于预防或抑制细胞纤维化的试剂盒，其包括根据权利要求1至9中任一项所述的组合物和用于处理根据权利要求10所述的方法的指南。

[12]此外，本发明的额外方面涉及一种用于与预防或抑制细胞纤维化相关的试验的试剂组合物，其包括根据项目[1]至项目[9]中任一项所述的组合物。

有益效果

如上所述，根据本发明的组合物和方法，通过预防和抑制细胞纤维化，从根本上抑制了因细胞纤维化进行干预而诱发的各种疾病的发生或进展，从而显着提高可以预防或治疗该疾病的可能性。换言之，可以预防或治疗由于老化和吸烟等环境因素导致组织再生和修复能力下降而发生在各组织中的纤维化症。

上述本发明的组合物具有较少的现有纤维性疾病治疗药物所带来的副作用，因此可以安全有效地应对随着全球高龄化趋势而每年增加的纤维性疾病。

另外，根据本发明，通过利用上述本发明的组合物，还可以提供预防或治疗由维化引起的疾病的方法。

此外，本发明的试剂组合物可用于与细胞纤维化相关的各种疾病的研究，从而有助于确定该疾病的机制以及开发预防或治疗该疾病的组合物。

附图简单说明

图1A为通过使用正常人真皮成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblast，NHDF)作为样品显示本发明的组合物对皮肤纤维化的抗纤维化作用的免疫印迹(Westernblot)的蛋白质条带照片。根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA和GAPDH蛋白的表达量通过免疫印迹条带的强度来显示。

图1B为通过将图1A的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA的相对水平的图表。

图2A为通过使用人肝星状细胞(Human Hepatic Stellate Cell，HHSC)作为样品以评估本发明的组合物对肝纤维化的抗纤维化作用的试验计划图。

图2B为根据图2A的实验计划显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA和GAPDH蛋白的表达量的免疫印迹条带照片。

图2C为通过将图2A的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA的相对水平的图表。

图3A为通过使用人结肠成纤维细胞株(Human Colon Fibroblast Cell Line，CCD-18Co)作为样品以评估本发明的组合物对肠纤维化的抗纤维化作用的试验计划图。

图3B为根据图3A的试验计划显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA和GAPDH蛋白的表达量的免疫印迹条带照片。

图3C为通过将图3A的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA的相对水平的图表。

图4A为通过使用人心脏微血管内皮细胞(Human Cardiac MicrovascularEndothelial Cell，HCMEC)作为样品以评估本发明的组合物对心脏纤维化的抗纤维化作用的试验计划图。

图4B为根据图4A的试验计划显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA和GAPDH蛋白的表达量的免疫印迹条带照片。

图4C为通过将图4B的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA的相对水平的图表。

图5A为通过使用正常人肺成纤维细胞(Normal Human Lung Fibroblast，NHLF)作为样品显示本发明的组合物对皮肤纤维化的抗纤维化作用的免疫印迹条带照片。根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA和GAPDH蛋白的表达量通过免疫印迹条带的强度来显示。

图5B为通过将图5A的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA的相对水平的图表。

图6A为通过使用人肾脏肾小管细胞(Human Kidney 2，HK-2)的上皮细胞株作为样品以评估本发明的组合物对肾脏纤维化的纤维化预防作用的试验计划图。

图6B为根据图6A的试验计划显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA和GAPDH蛋白的表达量的免疫印迹条带照片。

图6C为通过将图6B的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA的相对水平的图表。

图7A为通过使用人肾脏肾小管细胞的上皮细胞株作为样品以评估本发明的组合物对肾脏纤维化的抗纤维化作用的试验计划图。

图7B为根据图7A的试验计划显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA和GAPDH蛋白的表达量的免疫印迹条带照片。

图7C为通过将图7B的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA的相对水平的图表。

图8A为通过使用人肾脏肾小管细胞的上皮细胞株作为样品以评估rhHAPLN1针对于由TGFβ1诱导而引起的HK-2细胞纤维化形式变化的效能的试验计划图。

图8B为根据图8A的试验计划显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的细胞形状变化的显微镜照片。

图9A为通过使用肾脏近端小管上皮细胞(Renal Proximal Tubule EpithelialCells，RPTEC)作为样品显示本发明的组合物对由老化引起的纤维化的抗纤维化作用的免疫印迹条带照片。对于第11代培养细胞，根据本发明的组合物的各种浓度的αSMA和GAPDH蛋白的表达量通过免疫印迹条带的强度来显示。

图9B为通过将图9A中所示的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物的各种浓度的αSMA的相对水平的图表。

图10A为通过在培养第4代和第11代时使用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行染色来观察细胞核，并将αSMA抗体(abcam，ab7817)以1：1000在1XPBST(具有0.1％ TritonX-100的1X PBS，1％ BSA)来对胞内的αSMA进行染色来以荧光显示其表达程度的照片。

图10B为以荧光显示在培养作为对照组的第4代和其中诱导老化的第11代时根据本发明的组合物的各种浓度和吡非尼酮处理的细胞中αSMA相对水平的照片。

图11A为利用BioMAP纤维化面板(Fibrosis panel)确认rhHAPLN1对抗纤维化标志物的影响的试验，其通过将在作为肺纤维化症(lung fibrosis)疾病模型的SAEMyoF系统中，本发明的组合物(rhHAPLN1)按照浓度对αSMA和胶原蛋白(collagen)I的显着降低效果与载体(vehicle)对照组进行比较来显示相对倍数变化(fold change)的图表。

图11B为利用BioMAP纤维化面板确认rhHAPLN1对抗纤维化标志物的影响的试验，其通过将在作为肾脏纤维化症(kidney fibrosis)疾病模型的REMyoF系统中，本发明的组合物(rhHAPLN1)按照浓度对胶原蛋白I的显着降低效果与载体对照组进行比较来显示相对倍数变化的图表。

图11C利用BioMAP纤维化面板确认rhHAPLN1对抗纤维化标志物的影响的试验，其通过将在肌成纤维细胞(myofibroblast)中，本发明的组合物(rhHAPLN1)按照浓度对胶原蛋白IV的显着降低效果与载体对照组进行比较来显示相对倍数变化的图表。

图12A为说明通过利用小鼠博莱霉素诱导肺纤维化症(bleomycin-inducedpulmonary fibrosis，BIPF)模型以评估本发明的组合物的抗纤维化效能(预防纤维性疾病的能力)的试验概要的图。

图12B为在利用图12A的小鼠博莱霉素诱导肺纤维化症模型的试验中将小鼠分为四组(小鼠1至4)，在正常(Normal)组组处理PBS，在对照组(Control)中不进行任何处理，且对其分别处理0.0005％(w/w)的本发明的组合物(rhHAPLN1)和0.0015％(w/w)的本发明的组合物(rhHAPLN1)的组，且在每组取出4只小鼠的肺组织后，将左侧大叶水平切成两半，并将上部部分定在福尔马林中，并用苏毒素和伊红(H&E)进行染色而获得的照片。

图12C为通过将小鼠左侧最大肺叶的肺组织中部切开，每只小鼠制作3张组织载玻片，且每张载玻片上随机拍摄3个位置，然后将对总共9个部分进行染色的红色部分与未染色的白色部分区分，通过使用‘Image J’软件测量经染色的红色部分的面积，并对所获得的各数值取平均而获得每只小鼠的平均值，从而确定统计显着性的图表。

图12D和图12E分别为有关提供为可以用肉眼简单地测量肺纤维化症的严重程度的官方指南的Ashcroft评分的照片和说明(Ashcroft等人1988，J Clin Pathol 41：467-470)。

图12F为与根据图13A和图13B以shcroft评分显示肺纤维化症的严重程度的试验结果有关的图表。

图13A为说明通过利用小鼠博莱霉素诱导肺纤维化症模型以评估本发明的组合物的抗纤维化效能(治疗纤维性疾病的能力)的试验概要的图。

图13B为在利用图13A的小鼠博莱霉素诱导肺纤维化症模型的试验中将小鼠分为四组(正常组、PBS对照组、0.00075％(w/w)rhHAPLN1、0.0015％(w/w)rhHAPLN1、以及0.003％(w/w)rhHAPLN1)，每组设定为4只小鼠，并在试验后在每组取出4只小鼠的肺组织后，将左侧大叶水平切成两半，并将上部部分定在福尔马林中，并用苏毒素和伊红(H&E)进行染色而获得的照片。

图13和图13D为通过将小鼠左侧最大肺叶的肺组织中部切开，每只小鼠制作3张组织载玻片，且每张载玻片上随机拍摄3个位置，然后将对总共9个部分进行染色的红色部分与未染色的白色部分区分，通过使用‘Image J’软件测量经染色的红色部分的面积，并对所获得的各数值取平均而获得每只小鼠的平均值，从而确定统计显着性的图表。

图13E为与以Ashcroft评分显示与图13C的结果相关的肺纤维化症的严重程度的试验结果有关的图表。

图14A为通过使用缺血/再灌流(ischemia/reperfusion)作为肾脏纤维化诱发动物模型试验以评估本发明的组合物对肾脏纤维化的抗纤维化作用的试验计划图。

图14B为根据14A的试验计划显示根据本发明的组合物和吡非尼酮施用的αSMA蛋白的表达程度的免疫印迹的蛋白质条带照片(SV；空载体，SB；空-rhHAPLN1剂量B为空-rhHAPLN1-溶解溶液，且为用于确认在对空对照组(Sham control)处理rhHAPLN1时显示出什么样的影响的组，IRV；IR-载体，IRP；IR-吡非尼酮，IRA；IR-rhHAPLN1剂量A，IRB；IR-rhHAPLN1剂量B，IRC；IR-rhHAPLN1剂量C)。

图14C为通过将图14B的的免疫印迹条带的强度数值化来显示根据本发明的组合物和吡非尼酮的各种浓度的αSMA表达水平针对IRV的倍数(fold)变化的图表。

图14D为显示将在急性肾损伤诱导模型中根据吡非尼酮和本发明的组合物的各种浓度的胶原蛋白表达水平进行天狼星红和PAS染色而获得的照片。紫色显示胶原蛋白的表达。

图14E为显示为了将在急性肾损伤诱导模型中根据吡非尼酮和本发明的组合物的各种浓度的胶原蛋白表达程度进行定量而在组织染色中对肾脏外髓质(outer medulla)部位的两处进行随机成像后的仅胶原蛋白阳性部位的照片。

图14F为通过标记图14E中的胶原蛋白阳性部位且利用i-solution软件(IMT)将胶原蛋白的面积(％)数值化而显示的图表。

图14G为通过在性肾损伤诱导模型中根据吡非尼酮和本发明的组合物的各种浓度进行缺血/再通灌流后在第21天测量肌酸酐清除率(creatinine clearance)且显示其数值的图表。

最佳模式

首先，本说明书中所示的各种术语可以定义如下。

在本发明的说明书中，“rhHAPLN1”是重组人HAPLN1的缩写，表示重组人HAPLN1。

在本发明的说明书中，“成纤维细胞(Fibroblast)”是指通过制造胶原纤维等的结合组织而不是上皮性、血管、淋巴管、和炎症细胞来参与组织结构维持的细胞。

在本发明的说明书中，“肌成纤维细胞(Myofibroblast)”是指因物理伤口或炎症等而被激活来表达α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)，从而如平滑肌细胞般具有收缩功能的成纤维细胞。

在本发明的说明书中，“αSMA”或“α-SMA(alpha smooth muscle actin)”是在病理状态的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell)和基质成纤维细胞(Stromalfibroblastic cell)中表达的蛋白质，其为组织纤维化中出现的主要标志物。其在显示肾脏纤维化症迹象的肾脏中高表达，这种显示为高的表达量或活性是指与间质纤维化症(interstitial fibrosis)的程度密切相关的肌成纤维细胞(myofibroblast)的高活性。另外，由于患者中αSMA的表达与肾脏的肌酸酐清除率的减少密切相关，因此其可以作为能够确认体内的老废物即肌酸酐未被消除的标志物。

在本发明的说明书中，“转化生长因子β(TGFβ1或TGF-β1)”是指在与本发明有关的各种实施例中用于将成纤维细胞转变为肌成纤维细胞的细胞因子，且每个细胞的转换用量是不同。一般而言，细胞因子、趋化因子、生长因子和激素等的各种生理活性物质参与成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变。

在本发明的说明书中，“吡非尼酮(Pirfenidone)”是一种被承认为肺纤维化症治疗剂，且目前正在进行作为肾脏纤维化症的治疗剂的临床试验的抗纤维化药物。其在本发明实施例的试验中用作对照物质。有效用量可以因细胞而不同，但据相关文献报道，至少100μg/mL才显示效力。

在下文中，将详细地描述本发明。

本发明的一方面涉及一种抗纤维化组合物，其包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1；HAPLN1)或编码其的基因作为有效成分。其可以用作用于预防或治疗纤维性疾病的药物组合物。

另外，根据本发明一具体实施例，在所述本发明的组合物中，可以为表示为SEQ IDNO：1的重组人HAPLN1蛋白。有关于此，本发明的HAPLN1蛋白可以是具有相对于维持抗纤维化功能的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的80％，优选地85％，更优选地90％，再更优选地95％，最优选地100％的序列同一性的蛋白。

另外，根据本发明一具体实施例，与编码所述本发明的组合物中的HAPLN1蛋白的基因有关的核酸可以包含在表达载体中来包含在所述组合物中。

此外，在本发明中，本发明的组合物作用的所述细胞没有特别限制，但优选包括各种成纤维细胞、星状细胞、内皮细胞和上皮细胞等，更具体地包括皮肤成纤维细胞、肝星状细胞、人结肠细胞、微血管内皮细胞、肺成纤维细胞、肾脏肾小管细胞和近端小管上皮细胞等，且包括体内(in vivo)、体外(in vitro)、离体(ex vivo)和原位(in situ)等各种情况下的细胞。另外，适用器官只要是具有诱发纤维化的可能性的器官即可，没有特别限制，但优选地包括肺、肾脏、皮肤、肝、肠、和心脏等。

此外，根据本发明一具体实施例，所述本发明的组合物对细胞的一次施用量为0.1ng/ml至500ng/ml，优选地1ng/ml至300ng/ml，更优选地3.0ng/ml至50ng/ml，且再更优选地10ng/ml至13ng/ml。然而，根据应用的部位或根据情况，更具体地可以为3、5、11、30、50或100ng/ml。

或者，根据本发明一具体实施例，所述本发明的组合物对细胞的一次施用量为0.00001至0.1％(w/w)，优选地0.0001至0.05％(w/w)，更优选地0.0003至0.03％(w/w)，再更优选地0.0005至0.015％(w/w)。

一方面，在本发明一具体实施例中，所述本发明的组合物可以包括为用于预防或抑制细胞纤维化作用的组合物的主要或辅助有效成分。

另外，根据本发明的一方面，涉及一种通过在细胞中处理组合物的预防或抑制细胞纤维化的方法，其中，所述组合物包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1或编码其的基因作为有效成分。

此外，根据本发明的一方面，涉及一种用于预防或抑制细胞纤维化的试剂盒，其包括所述本发明的组合物和处理指南。

另外，根据本发明的一方面，涉及一种用于与预防或抑制细胞纤维化相关的试验的试剂组合物，其包括所述本发明的组合物。

此外，本发明涉及所述本发明的组合物在制造用于预防或治疗由细胞纤维化诱发的疾病的药物组合物中的用途。

在特定具体实施例中，所述药物组合物通常可以包括分子和药学上可接受的载体。在本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”包括可与药学施用相容的盐溶液、溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以包含在组合物中。换言之，本发明的药物组合物还可以包括选自由药学上可接受的载体、稀释剂、结合剂、崩解剂、滑泽剂及其任意组合组成的组中的药学添加剂。

所述药物组合物可以配制为与期望施用途径相容。优选地，本发明的组合物可以为选自由滴眼液、软膏、片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂、吸入剂、注射剂、贴剂和栓剂组成的组中的剂型。

施用途径的实例包括，例如，静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠施用。优选地为肠胃外施用用途。

用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下成分：诸如注射用水、盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂的灭菌稀释剂；诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯的抗菌剂；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二胺四乙酸的螯合剂；诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲液；以及诸如氯化钠或葡萄糖的张力调节剂。pH可以用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱调整。肠胃外制剂可放置在安瓿、一次性注射器或由璃或塑料制成的多次用量小瓶中。

适合注射用的所述药物组合物包括用于临时制备(extemporaneouspreparation)经灭菌的注射用溶液或分散液的灭菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液和灭菌粉末。适合静脉内施用的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且具有足以使注射容易的流动性。其在制造和保管条件下必须稳定，并且必须保存以防止诸如细菌和霉菌的微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用卵磷脂等涂层，在分散情况下维持所需的粒径以及使用表面活性剂来维持足够的流动性。可以通过例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、和硫柳汞等的各种抗菌和抗真菌剂来达成预防微生物作用。在许多情况下，优选地包括诸如糖的等渗剂、诸如甘露醇的多元醇、山梨醇、和氯化钠在组合物中。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达到可注射组合物的长期间吸收。

灭菌注射用溶液可通过根据需要将所需量的活性化合物与上述例举的成分中的一种或组合一起混入到适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备。一般而言，分散液通过将活性化合物统合到包括基本分散介质和上面列出的其他所需成分的无菌载体中来制备。在用于制造灭菌注射溶液的灭菌粉末的情况下，优选的制造方法为真空干燥和冻结干燥，其生成活性成分的粉末和来自先前灭菌过滤溶液的所需任意附加成分。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或食用载体。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊如明胶胶囊的形式使用。口腔用组合物液也可以通过使用用作口腔清洁剂的流体载体来制造。药学上合适的结合剂和/或辅助剂物质可以包括为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以任意含有以下成分或类似性质的化合物：粘着剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；诸如淀粉或乳糖的赋形剂、诸如海藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉的崩解剂；诸如硬脂酸镁或类固醇的润滑剂；诸如胶体二氧化硅的滑泽剂；诸如蔗糖或糖精的甜味剂；或诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙子香料的香料。

为了通过吸入的施用，化合物从含有合适的推进剂如二氧化碳的气体或喷雾器的压力容器或分配器中以气溶胶喷雾的形式递送。

全身施用还可以通过经粘膜或经皮方式实现。在经粘膜或经皮施用的情况下，使用适合于要穿透的屏障的渗透剂于剂型中。这种渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如用于经粘膜施用、洗剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻腔喷雾或栓剂来进行。为了经皮施用，活性化合物被配制成如本领域通常已知的软膏、膏药、凝胶或霜。

化合物还可以制造成栓剂(例如，与诸如可可脂和其他甘油酯的常规栓剂基质一起)或用于直肠递送的停留灌肠的形式。

从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的各种用量。这种化合物的施用量优选地在几乎或完全没有毒性的包括ED₅₀的循环浓度范围内。施用量可以根据所使用的施用形式和所使用的施用途径而在该范围内变化。

本发明的组合物的治疗有效量(即有效施用量)可以根据所选患者的状况而不同。例如，可以施用约1pg至1000mg范围的单一用量；在一些具体实施例中，可以施用10、30、100或1000pg，或10、30、100或1000ng，或10、30、100或1000μg，或10、30、100或1000mg。

另外，根据本发明一具体实施例，在将所述本发明的组合物直接体内施用于活体时，rhHAPLN1蛋白的用量为0.001至10mg/kg/BW，优选地0.004至5mg/kg/BW，更优选地0.1至1.0mg/kg/BW，再更优选地0.15至0.5mg/kg/BW。

或者，在一些实施例中，可以施用1ng/ml至100μg/ml，优选地3ng/ml至50μg/ml，更优选地5ng/ml至500ng/ml，特别优选地10ng/ml至200ng/ml的药物组合物。所述药物组合物可以每天一次或更多次至每周一次或更多次施用，且包括每隔一天一次。熟练的技术人员将认识到特定因素可能影响有效治疗个体所需的用量和时机，这包括疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、个体的总体健康和/或年龄以及任何其他现有疾病，但不限于此。此外，以本发明的分子的治疗有效量治疗个体可以包括单一治疗，或优选地包括一系列治疗。

根据患者的状况，本发明的组合物的施用量在5mg/kg/周至500mg/kg/周，例如5mg/kg/周、10mg/kg/周、15mg/kg/周、20mg/kg/周、25mg/kg/周、30mg/kg/周、35mg/kg/周、40mg/kg/周、45mg/kg/周、50mg/kg/周、55mg/kg/周、60mg/kg/周、65mg/kg/周、70mg/kg/周、75mg/kg/周、80mg/kg/周、85mg/kg/周、90mg/kg/周、95mg/kg/周、100mg/kg/周、150mg/kg/周、200mg/kg/周、250mg/kg/周、300mg/kg/周、350mg/kg/周、400mg/kg/周、450mg/kg/周和500mg/kg/周的范围内。在特定具体实施例中，根据本发明的双重作用性分子的施用量在10mg/kg/周至200mg/kg/周、20mg/kg/周至150mg/kg/周或25mg/kg/周至100mg/kg/周的范围内。在特定具体实施例中，本发明的组合物在2周至6个月的期间，例如，2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、26周、6个月、8个月、10个月或1年或更长的期间每周施用1x次。在特定具体实施例中，本发明的组合物每周施用2x次。在另一具体实施例中，本发明的组合物隔周施用。

本发明的组合物还可以配制为药物组合物，其包括药理学有效量的HAPLN1蛋白分子和药剂学上可接受的载体。药理学或治疗有效量是指有效产生期望的药理学、治疗或预防结果的含量。术语“药理学有效量”和“治疗有效量”或简称“有效量”是指有效产生期望的药理学、治疗或预防结果的双重作用性分子的量。例如，当与疾病或障碍相关的可测量参数减少20％或更多时，则给定的临床治疗被认为是有效的，用于治疗该疾病或障碍的药物的治疗有效量为减少该参数至少20％所需的量。

本发明的适当地配制的药物组合物可以通过本技术领域中公知的任意方式来施用，例如包括静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、直肠、阴道和局部(包括颊侧和舌下)施用的肠胃外途径。在一些实施例中，药物组合物通过静脉内或肠胃外注入或注射施用。

一般而言，分子的合适施用量单位为每天每kg的接受者体重0.001至0.25mg的范围、或每天每kg体重0.01至20微克的范围、或每天每kg体重0.01至10微克的范围、或每天每kg体重0.10至5微克的范围、或每天每kg体重0.1至2.5微克的范围。包括分子的药物组合物可以每天施用一次。然而，治疗剂还可以以包括在一天中以适当的间隔施用的2、3、4、5、6或更多个的下位用量的施用单位施用。施用单位也可以通过例如使用经过几天的期间内提供分子持续和一致释放的常规持续释放剂型来配制为经过几天内的单一用量。持续释放剂型是本技术领域中众所周知的。在一具体实施例中，施用量单位包括对应于一日施用量的倍数。

所述药物组合物可以与施用指南一起包括在试剂盒、容器、包装或分配器中。

在本说明书中使用的“治疗”或“治疗的”被定义为以治疗、治愈、缓和、减轻、改变、驱除、改善、改良或影响疾病或障碍、疾病或障碍的症状、或对疾病的起因的目的向患者作用或施用治疗剂(例如，本发明的分子)、或针对分离的组织或细胞株作用或施用治疗剂，其中，所述患者具有疾病或障碍、疾病或障碍的症状、或对疾病的起因。

另外，本发明的一方面涉及组合物用于预防或抑制细胞纤维化作用的用途，其中，所述组合物包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白作为有效成分。

具体实施方式

实施例

在下文中，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但以下实施例仅用于说明目的，并不限制本发明的范围。

[制造例1]

透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1；HAPLN1)的制造

通过将包括编码氨基酸SEQ ID NO：1的人HAPLN1蛋白的多核苷酸的载体插入CHO-K1细胞中来制作了生成重组人HAPLN1蛋白的CHO-K1细胞株。

所述氨基酸SEQ ID NO：1为如下：

MKSLLLLVLISICWADHLSDNYTLDHDRAIHIQAENGPHLLVEAEQAKVFSHRGGNVTLPCKFYRDPTAFGSGIHKIRIKWTKLTSDYLKEVDVFVSMGYHKKTYGGYQGRVFLKGGSDSDASLVITDLTLEDYGRYKCEVIEGLEDDTVVVALDLQGVVFPYFPRLGRYNLNFHEAQQACLDQDAVIASFDQLYDAWRGGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPREPCGGQNTVPGVRNYGFWDKDKSRYDVFCFTSNFNGRFYYLIHPTKLTYDEAVQACLNDGAQIAKVGQIFAAWKILGYDRCDAGWLADGSVRYPISRPRRRCSPTEAAVRFVGFPDKKHKLYGVYCFRAYN

选择具有优异的蛋白质生产量和质量的细胞株作为主细胞库(MCB，Master CellBank)。将所述MBC传代培养来以0.40±0.05×10⁶细胞/ml的浓度接种到Thermo公司的Hyperforma SUB 250L生物反应器中，并进行补料分批(Fed-Batch Culture)培养。作为基本培养基，使用22.36g的ActiPro^TM培养基+0.5846g的谷氨酰胺+10.00g的HT补充剂(ThermoFisher Scientific公司)+4.29g的10N NaOH+1.80g的NaHCO₃。设定了培养温度为36.5℃，溶解氧量(Dissolved oxygen，DO)为40.0％，且pH为7.00±0.20。作为pH调节溶液，使用1M的一水碳酸钠(Sodium Carbonate Monohydrate)。作为补料培养基(feeding medium，FM)，使用181.04g的海克隆(HyClone^TM)Cell Boost 7a+12.28g的10N NaOH的FM020a和94.60g的海克隆Cell Boost 7b+105.93g的10N NaOH的FM020b。

通过回收(收获和净化)、超滤/渗滤1(Ultrafiltration/Diafiltration 1，UF/DF1)、阴离子交换色谱法、溶剂/洗涤剂(S/D，Solvent/Detergent)病毒灭活化、阳离子交换色谱法、混合模式色谱法(Mixed-mode Chromatography，MMC)、疏水相互作用色谱法、超滤/渗滤2(UF/DF2)和中深度过滤(Intermediate Depth Filtration，Int.DF)等过程，从如上所述培养的细胞中分离和纯化重组人HAPLN1(rhHAPLN1)蛋白。在以下实施例中，使用如上所述的本发明的组合物。

[制造例2]

包括HAPLN1蛋白的本发明的组合物的制造

将在所述制造例1中纯化的HAPLN1蛋白稳定在20mM的乙酸缓冲液、8％(w/v)蔗糖、0.04％(w/v)PS80、pH 5.0中以制造包括HAPLN1蛋白本身作为主要有效成分的本发明的组合物。

[制造例3]

含有装有编码HAPLN1蛋白的基因的表达载体的本发明的组合物的制造

通过使用jetPRIME转染试剂盒(Transfection Reagent Kit)(PolyPlus公司的114-15产品)来制造含有装有编码HAPLN1蛋白的基因的表达载体的本发明的组合物。更具体地，通过使用OriGene公司的RC209274产品制造了设计为表达人HAPLN1的质粒载体(在下文中，称为“人HAPLN1 ORF克隆”)。其可以表达在宿主细胞核内输送其自身的基因。

作为参考，jetPRIME转染试剂盒由jetPRIME缓冲液和jetPRIME转染试剂构成，jetPRIME缓冲液用于稀释待输送至宿主细胞的质粒载体，且jetPRIME转染试剂以泡(脂质体)的形式捕获质粒载体来作用成渗透到宿主细胞中。

通过将所述人HAPLN1 ORF克隆稀释于jetPRIME缓冲液中来制造含有装有编码HAPLN1蛋白的基因的表达载体的本发明的组合物。

对于此，通过添加jetPRIME转染试剂并放置10分钟以泡(脂质体)的形式捕获质粒载体，然后滴到培养中的细胞上。在培养细胞48小时或更长时间后，通过实时qPCR确认人HAPLN1基因表达的增加，并通过免疫印迹(Western blot)确认人HAPLN1蛋白表达的增加。

[实施例1]

本发明的组合物对人皮肤成纤维细胞的抗纤维化效能的评估

通过使用正常人真皮成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblast，NHDF)作为样品，验证了本发明的组合物对皮肤纤维化的抗纤维化作用。

1.试验方法

(1)将正常人真皮成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblast，NHDF)接种(seeding)于6孔板中(1.0×10⁵细胞/孔)，并在FBM-2(成纤维细胞生长培养基-2，Fibroblast Growth Medium-2，CC-3131，Lonza)培养基中在37℃和5％CO₂的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)在更换为无血清培养基后，培养24小时。

(3)对于此，在通过处理TGFβ1(10ng/ml)来诱导纤维化的条件下，在板的每个孔中分别处理根据制造例2制造的本发明的组合物但其rhHAPLN1蛋白含量为0、3、10、30和100ng/ml，以及作为市售的抗纤维化剂的吡非尼酮(Selleckchem)100μg/mL和200μg/mL，然后培养24小时。

(4)然后，对各个样品用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline；PBS，pH7.2)洗涤2次，然后通过免疫印迹确认了作为肌成纤维细胞标志物的αSMA的表达程度。

2.结果

在图1A中，通过αSMA蛋白条带的强度和厚度显示正常人皮肤成纤维细胞纤维化的程度，因此从免疫印迹条带照片可以确认出，本发明的组合物表现出比吡非尼酮更优异的抗纤维化作用。

另外，在图1B中，在通过TGF1β(10ng/ml)诱导纤维化后，相比于处理不包括rhHAPLN1蛋白的组合物的情况，处理本发明的组合物的情况在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出αSMA的表达水平显着较低，因此显示出抗纤维化效能。特别地，在本发明的组合物中的rhHAPLN1蛋白含量为100ng/ml的样品中显示出最优异的抗纤维化效能，尽管其为吡非尼酮100μg/mL(100000ng/ml)的1000分之一的含量，其显示出25％更高的抗纤维化效能的效果。由于200μg/mL的吡非尼酮显示出比100μg/mL的更高的αSMA表达水平，因此可以推测在高浓度下，抗纤维化效能反而下降，且100μg/mL为最佳抗纤维化浓度。因此，可以得知，本发明的组合物具有比作为市售的抗纤维化剂的吡非尼酮更优异的抗纤维化效能。

[实施例2]

本发明的组合物对人肝星状细胞的抗纤维化效能的评估

通过使用人肝星状细胞(Human Hepatic Stellate Cell，HHSC)作为样品，验证了本发明的组合物对肝纤维化的抗纤维化作用。

1.试验方法

根据图2A的试验计划，将原代人肝星状细胞(Primary Human Hepatic StellateCell(HHSC；iXCells Biotechnologies，10HU-210))接种到6孔板中(1.5×10⁵细胞/孔)，并在星状细胞生长培养基(Stellate Cell Growth Medium)(iXCells Biotechnologies，MD-0014)中在37℃和5％CO₂的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)在更换为无血清DMEM培养基后，培养24小时。

(3)对于此，通过处理TGFβ1(2ng/ml)来诱导纤维化并培养24小时。

(4)然后，对板中的各孔分别处理rhHAPLN1蛋白含量为0、3、10、30和100ng/ml的本发明的组合物、以及100μg/mL和200μg/mL的吡非尼酮，然后培养24小时。

(5)之后，对各样品使用细胞裂解缓冲液(cell lysis buffer)进行处理，然后进行回收(harvest)。

(6)对于此，进行免疫印迹。在此，通过使用抗-αSMA Ab(Abcam，ab7817)和抗-GAPDH Ab(Santa Cruz，sc-32233)作为一抗，并且HRP偶联的抗小鼠IgG Ab(CST，#7076)作为二抗，确认αSMA和GAPDH的蛋白表达水平。

2.结果

在图2B中，通过αSMA蛋白条带的强度和厚度显示人肝星状细胞纤维化程度，因此从免疫印迹条带照片可以确认出，本发明的组合物在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出比吡非尼酮更优异的抗纤维化效能。

另外，在图2C中，在通过TGF1β(2ng/ml)诱导纤维化后，相比于处理不包括rhHAPLN1蛋白的组合物的情况，处理本发明的组合物的情况在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出作为肝星状细胞活性标志物的αSMA的表达水平显着较低，因此显示出抗纤维化效能。特别地，在本发明的组合物中的rhHAPLN1蛋白含量为3ng/ml的样品中显示出最优异的抗纤维化效能，尽管其为吡非尼酮100μg/mL(100000ng/ml)以及更高用量的200μg/mL吡非尼酮的200000分之三的分之一的含量，其显示出更高的抗纤维化效能的效果。

[实施例3]

本发明的组合物对人结肠成纤维细胞株的抗纤维化效能的评估

过使用人结肠成纤维细胞株(Human Colon Fibroblast Cell Line，CCD-18Co)作为样品，验证了本发明的组合物对肠纤维化的抗纤维化作用。

1.试验方法

(1)根据图3A的试验计划，将人结肠成纤维细胞株(CCD-18Co(human colonfibroblast cell line；ATCC，CRL-1459))接种到6孔板中(1.5×10⁵细胞/孔)，并在包括10％胎牛血清(FBS)的EMEM(Eagle最低基础培养基(Eagle's minimum essentialmedium)，ATCC)中在37℃和5％CO₂的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)在更换为无血清EMEM培养基后，培养24小时。

(3)对于此，通过处理TGFβ1(10ng/ml)来诱导纤维化并培养24小时。

(5)之后，对各样品使用细胞裂解缓冲液进行处理，然后进行回收。

2.结果

在图3B中，通过αSMA蛋白条带的强度和厚度来显示人结肠成纤维细胞纤维化程度，因此从免疫印迹条带照片可以确认出，本发明的组合物在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出比吡非尼酮更优异的抗纤维化效能。

另外，在图3C中，在通过TGF1β(10ng/ml)诱导纤维化后，相比于处理不包括rhHAPLN1蛋白的组合物的情况，处理本发明的组合物的情况在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出作为肌成纤维细胞(myofibroblast)标志物的αSMA的表达水平显着较低，因此显示出抗纤维化效能。作为参考，在肠纤维化(Intestinal fibrosis)中，肌成纤维细胞转变(transition)为肌成纤维细胞，并过度产生纤维组织。

特别地，在本发明的组合物中的rhHAPLN1蛋白含量为10ng/ml的样品中显示出最优异的抗纤维化效能，尽管其为吡非尼酮100μg/mL(100000ng/ml)的10000分之一的含量，但对于由TGFβ1诱导的αSMA的程度，rhHAPLN1的抑制被计算为71.6％((3.82-1.8)/(3.82-1)*100)，且吡非尼酮的抑制被计算为10.6％((3.82-3.52)/(3.82-1)*100)，在比较药物效能时，rhHAPLN1的抗纤维化效能高出约7倍，尽管其为吡非尼酮200μg/mL(200000ng/ml)的20000分之一的含量，其显示出抗纤维化效能远高于2倍。

由于200μg/mL的吡非尼酮显示出比100μg/mL的更高的αSMA表达水平，因此可以推测在高浓度下，抗纤维化效能反而下降，且100μg/mL的吡非尼酮为最佳抗纤维化浓度。因此，可以得知，本发明的组合物具有比作为市售的抗纤维化剂的吡非尼酮更优异的抗纤维化效能。

[实施例4]

本发明的组合物对人微血管内皮细胞的抗纤维化效能的评估

通过使用人心脏微血管内皮细胞(Human Cardiac Microvascular EndothelialCell，HCMEC)作为样品，验证了本发明的组合物对心脏纤维化的抗纤维化作用。

1.试验方法

(1)根据图4A的试验计划，将原代人心脏微血管内皮细胞(Primary HumanCardiac Microvascular Endothelial Cell)(HCMEC；ScienCell，#6000))接种到6孔板中(5.7×10⁴细胞/孔)，并在内皮细胞培养基(Endothelial cell medium)(ScienCell)上在37℃和5％CO₂的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)对于此，通过处理TGFβ1(5ng/ml)来诱导纤维化并培养3天。

(3)然后，对板中的各孔分别处理rhHAPLN1蛋白含量为0、3、10、30和100ng/ml的本发明的组合物、以及100μg/mL和200μg/mL的吡非尼酮，然后培养2天。

(4)之后，对各样品使用细胞裂解缓冲液进行处理，然后进行回收。

(5)对于此，进行免疫印迹。在此，通过使用抗-αSMA Ab(Abcam，ab7817)和抗-GAPDH Ab(Santa Cruz，sc-32233)作为一抗，并且HRP偶联的抗小鼠IgG Ab(CST，#7076)作为二抗，确认αSMA和GAPDH的蛋白表达水平。

2.结果

在图4B中，通过αSMA蛋白条带的强度和厚度来显示人心脏微血管内皮细胞纤维化程度，因此从免疫印迹条带照片可以确认出，本发明的组合物在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出比吡非尼酮更优异的抗纤维化效能。

另外，在图4中，在通过TGF1β(5ng/ml)诱导纤维化后，相比于处理不包括rhHAPLN1蛋白的组合物的情况，处理本发明的组合物的情况在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出作为肌成纤维细胞标志物的αSMA的表达水平显着较低，因此显示出抗纤维化效能。作为参考，在心脏纤维化(Cardiac fibrosis)中，内皮细胞转变为肌成纤维细胞，并过度产生纤维组织。

特别地，在本发明的组合物中的rhHAPLN1蛋白含量为3ng/ml的样品中显示出最优异的抗纤维化效能，尽管其为吡非尼酮100μg/mL(100000ng/ml)的100000分之三的含量，其显示出在吡非尼酮中不出现的抗纤维化效能，并且尽管其为吡非尼酮200μg/mL(200000ng/ml)的200000分之三的含量，其显示出在吡非尼酮中不出现的抗纤维化效能。

即使以任何浓度的吡非尼酮进行处理，αSMA的表达水平都高于用不含rhHAPLN1蛋白的组合物处理时的表达水平，因此，可以得知心脏微血管内皮细胞的抗纤维化作用更下降。因此，提出了本发明的组合物可以是至少对于心脏微血管内皮细胞而言几乎唯一的抗纤维化制剂。

[实施例5]

本发明的组合物对正常人肺成纤维细胞的抗纤维化效能的评估

通过使用正常人肺成纤维细胞(Normal Human Lung Fibroblast，NHLF)作为样品，验证了本发明的组合物对肺纤维化的抗纤维化作用。

1.试验方法

(1)将培养第9代的正常人肺成纤维细胞(NHLF)接种到6孔板中(1.5×10⁵细胞/孔)，并在FBM-2(Fibroblast Growth Medium-2，CC-3131，Lonza)培养基中在37℃和5％CO₂的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)在更换为无血清培养基后，培养24小时。

(3)对于此，在通过处理TGFβ1(10ng/ml)来诱导纤维化的条件下，在板的每个孔中分别处理rhHAPLN1蛋白含量为0、3.1、12.5、25、和100ng/ml的本发明的组合物、以及100μg/mL和200μg/mL的吡非尼酮(Selleckchem)，然后培养24小时。

2.结果

在图5A中，通过αSMA蛋白条带的强度和厚度显示正常人肺成纤维细胞纤维化程度，因此从免疫印迹条带照片可以确认出，本发明的组合物在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出比吡非尼酮更优异的抗纤维化效能。

另外，在图5B中，在通过TGF1β(10ng/ml)诱导纤维化后，相比于处理不包括rhHAPLN1蛋白的组合物的情况，处理本发明的组合物的情况在所有rhHAPLN1蛋白含量范围内都显示出作为肌成纤维细胞标志物的αSMA的表达水平显着较低，因此显示出抗纤维化效能。

特别地，在本发明的组合物中的rhHAPLN1蛋白含量为12.5ng/ml的样品中显示出最优异的抗纤维化效能，尽管其为吡非尼酮100μg/mL(100000ng/ml)的10000分之一的含量，但其抗纤维化效能高出约2倍，且同样对于吡非尼酮200μg/mL(200000ng/ml)也显示出其抗纤维化效能高出约2倍。

即使以任何浓度的吡非尼酮进行处理，αSMA的表达水平都与用不含rhHAPLN1蛋白的组合物处理时的表达水平几乎没有差异，因此可以至少得知其在肺成纤维细胞中没有抗纤维化作用。因此，提出了本发明的组合物可以是对于肺成纤维细胞而言几乎唯一的抗纤维化制剂。

[实施例6]

本发明的组合物对人肾脏肾小管细胞的纤维化预防效能的评估

通过使用人肾脏肾小管细胞(Human Kidney 2，HK-2)的上皮细胞株作为样品，验证了本发明的组合物对肾脏纤维化的纤维化预防作用。

1.试验方法

(1)根据图6A的试验计划，将人肾脏肾小管细胞(HK-2)接种到6孔板中(1.5×10⁵细胞/孔)，并在包括10％FBS的RPMI 1640培养基(11875-093，Gibco)中在37℃和5％CO₂的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)然后，使用PBS洗涤几次，并对板中的各孔分别同时处理TGFβ1(5ng/ml)、以及本发明的组合物(rhHAPLN1蛋白含量为0、5、10、20、和50ng/ml)和0.2mg/mL(200μg/mL)的吡非尼酮，然后培养24小时。

(3)之后，用冰冷(ice-cold)的PBS洗涤各样品几次，然后处理包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀法(RIPA，Radioimmunoprecipitation assay)裂解和提取缓冲液(Lysis and Extraction Buffer)(Thermo Scientific)，之后用刮刀刮擦准备后，将其转移到E-管中。

(4)离心(12000rpm，20分钟，4℃)来仅取上清液，从而实施二喹啉甲酸(BCA，Bicinchoninic Acid)测定法并获得蛋白质定量值。

(5)使用所获得定量值进行定量后，在100℃下烹调(cooking)3分钟，然后保管在-20℃的冰箱中。

(6)通过使用4％至15％的预制丙烯酰胺(precast acrylamide)PAGE凝胶，在每泳道上载10μg的蛋白质，并进行运行(80V-20分钟，120V-1小时30分钟)。

(7)将其改为100V-1小时30分钟，并用智能阻断器(smart blocker)阻断了约5分钟。

(8)将一抗在1％ BSA-TBST中稀释至1：1000来接种并在4℃下反应过夜(overnight)。

(9)在下一天，使用TBST洗涤3次，每次10分钟。

(10)将二抗在在1％ BSA-TBST(牛血清白蛋白-Tris-缓冲盐水和聚山梨酯20)中稀释至1：2000来接种并在室温(Room Temperature)下摇动(shaking)约1小时。

(11)再次使用TBST洗涤3次，每次10分钟，然后用Chemidoc进行检测。

2.结果

在图6B中，通过αSMA蛋白条带的强度和厚度来显示人肾脏肾小管细胞纤维化程度，因此从免疫印迹条带照片可以确认出，本发明的组合物在特定rhHAPLN1蛋白含量范围(rhHAPLN1蛋白含量为50ng/ml)内显示出比吡非尼酮更优异的纤维化预防作用。

另外，在图6C中，在通过TGF1β(5ng/ml)诱导纤维化后，相比于处理不包括rhHAPLN1蛋白的组合物的情况，处理rhHAPLN1蛋白含量为50ng/ml的本发明的组合物的情况中显示出优异的纤维化预防效能，尽管其为吡非尼酮200μg/mL(200000ng/ml)的4000分之一的含量，其显示出更高的纤维化预防效能的效果。

[实施例7]

本发明的组合物对人肾脏肾小管细胞的抗纤维化效能的评估

通过使用人肾脏肾小管细胞(Human Kidney 2，HK-2)的上皮细胞株作为样品，验证了本发明的组合物对肾脏纤维化的抗纤维化作用。

1.试验方法

(1)根据图7A的试验计划，将人肾脏肾小管细胞(HK-2)接种到60孔板中(1.5×10⁵细胞/孔)，并在包括10％FBS的RPMI 1640培养基(11875-093，Gibco)中在37℃和5％CO2的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)然后，使用PBS洗涤几次，并对板中的各孔处理TGFβ1(5ng/ml)，且培养24小时。

(3)接着，分别处理本发明的组合物(rhHAPLN1蛋白含量为0、5、10、20、和50ng/ml)和0.2mg/mL(200μg/mL)的吡非尼酮，然后培养48小时。

(4)之后，用冰冷的PBS洗涤各样品几次，然后处理包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀法(RIPA，Radioimmunoprecipitation assay)裂解和提取缓冲液(Lysis andExtraction Buffer)(Thermo Scientific)，之后用刮刀刮擦准备后，将其转移到E-管中。

(5)离心(12000rpm，20分钟，4℃)来仅取上清液，从而BCA测定法并获得蛋白质定量值。

(6)使用所获得定量值进行定量后，在100℃下烹调3分钟，然后保管在-20℃的冰箱中。

(7)通过使用8％的预制丙烯酰胺PAGE凝胶，在每泳道上载10μg的蛋白质，并进行运行(80V-20分钟，120V-1小时30分钟)。

(8)将其改为100V-1小时30分钟，并用智能阻断器阻断了约5分钟。

(9)将一抗在1％ BSA-TBST中稀释至1：1000来接种并在4℃下反应过夜。

(10)在下一天，使用TBST洗涤3次，每次10分钟。

(10)将二抗在在1％ BSA-TBST中稀释至1：2000来接种并在室温下摇动约1小时。

2.结果

在图7B中，通过αSMA蛋白条带的强度和厚度来显示人肾脏肾小管细胞纤维化程度，因此从免疫印迹条带照片可以确认出，本发明的组合物在特定rhHAPLN1蛋白含量范围(rhHAPLN1蛋白含量为10至50ng/ml)内显示出抗纤维化作用。

另外，在图7C中显示出，在通过TGF1β(10ng/ml)诱导纤维化后，相比于处理不包括rhHAPLN1蛋白的组合物的情况，处理rhHAPLN1蛋白含量为10至50ng/ml的本发明的组合物的情况中，特别是处理rhHAPLN1蛋白含量为50ng/ml的情况中，显示出优异的抗纤维化效能。值得注意的是，当处理50ng/ml的本发明组合物时，尽管其为吡非尼酮0.2mg/ml即200ng/ml的1/4小量，其显示出几乎与吡非尼酮相同的抗纤维化效能。

[实施例8]

根据本发明的组合物对人肾脏肾小管细胞的的抗纤维化效能的细胞形态学变化的观察

通过使用人肾脏肾小管细胞(Human Kidney 2，HK-2)的上皮细胞株作为样品，通过细胞的形态变化观察验证了本发明的组合物的抗纤维化作用。

1.试验方法

(1)根据图8A的试验计划，将人肾脏肾小管细胞(HK-2)接种到6孔板中(3.0×10⁵细胞/孔)，并在包括10％FBS的RPMI 1640培养基(11875-093，Gibco)中在37℃和5％CO2的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)然后，使用PBS洗涤几次，并对板中的各孔处理TGFβ1(10ng/ml)，且培养24小时。

(3)接着，分别处理本发明的组合物(rhHAPLN1蛋白含量为0、5、10、20、50、和100ng/ml)和0.2mg/mL(200μg/mL)的吡非尼酮，然后培养24小时。

(4)之后，对于装有各样品的孔使用1X PBS洗涤2次，然后处理4％多聚甲醛，并固定1小时。

(5)用1X PBS洗涤2次后，在显微镜下观察细胞的形状和形态。

2.结果

在图8B中，细胞的形态根据处理的物质而显示为不同。在作为未经任何处理的正常细胞的对照组(control)中，细胞的形态呈圆形，但确认了圆形细胞形状因处理10ng/mlTGFβ1而变成尖锐的纤维状。

然而，当对此添加具有各种rhHAPLN1蛋白含量的本发明的组合物时，可以看到，细胞的形状变为圆形的结果，类似于吡非尼酮的情况。

因此，可以得知，本发明的组合物明显地表现出针对细胞的优异的抗纤维化效能。

[实施例9]

本发明的组合物对肾脏近端小管上皮细胞的抗纤维化效能的评估1

通过使用肾脏近端小管上皮细胞(Renal Proximal Tubule Epithelial Cells，RPTEC)的原代上皮细胞(primary epithelial cell)作为样品，验证了本发明的组合物对因老化诱导引起的肾脏纤维化具有的抗纤维化作用。

1.试验方法

(1)将第3代培养和第10代培养的肾脏近端小管上皮细胞(RPTEC)接种到60Φ培养碟中(5.0×10⁵细胞)，并在完全肾上皮细胞培养基(Renal Epithelial Cell Medium)(ATCC PCS-400-030+ATCC PCS-400-040)中在37℃和5％CO₂的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)接着，分别处理本发明的组合物(rhHAPLN1蛋白含量为0、10、和100ng/ml)，然后额外地培养72小时。

(4)之后，用冰冷的PBS洗涤3次，然后处理包括蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的300μl的RIPA裂解和提取缓冲液，并用刮刀刮擦来回收细胞，然后将其转移到E-管中。

(6)通过使用4％至15％的预制丙烯酰胺PAGE凝胶，在每泳道上载20μg的蛋白质，并进行运行(80V-20分钟，120V-1小时30分钟)。

(7)对于此，进行免疫印迹。在此，通过使用抗-αSMA Ab(Abcam，ab7817)和抗-GAPDH Ab(Santa Cruz，sc-32233)作为一抗，并且HRP偶联的抗小鼠IgG Ab(CST，#7076)作为二抗。

2.结果

如图9A中所示，可以从免疫印迹条带照片中的蛋白条带的强度和厚度得知，随着细胞老化的进行，即随着传代培养数量从4增加到11而所增加的αSMA蛋白的表达量。

另外，在图9B中显示出，在老化细胞(P11)中，当用rhHAPLN1蛋白含量为100ng/ml的本发明的组合物处理时，与用不含rhHAPLN1蛋白的组合物处理时相比，αSMA蛋白的表达量减少约三分之一的程度。换言之，显示出优异的抗纤维化效能。

[实施例10]

本发明的组合物对肾脏近端小管上皮细胞的抗纤维化效能的评估2

1.试验方法

(1)将第3代培养和第10代培养的肾脏近端小管上皮细胞(RPTEC)接种到12孔板中(1.5×10⁵细胞)，并在完全肾上皮细胞培养基(Renal Epithelial Cell Medium)(ATCCPCS-400-030+ATCC PCS-400-040)中在37℃和5％CO2的条件下的培养箱中培养24小时。

(2)接着，分别处理本发明的组合物(rhHAPLN1蛋白含量为0、10、20、50、和100ng/ml)和0.2mg/mL(200μg/mL)的吡非尼酮，然后培养72小时。

(3)之后，每孔用PBS洗涤2次，然后用4％多聚甲醛处理并固定1小时。

(4)用1X PBS洗涤4次后，处理包括1％ BSA的1x PBST(1x PBS+0.1％ Triton X-100)并封闭2小时。

(5)将针对αSMA的一抗稀释且处理至1XPBSTdp 1：200，并在4℃下培养过夜。

(6)在下一天，使用1X PBST洗涤4次。

(7)将二抗(抗小鼠IgG Alexa Fluor^TM 488 1：500(Invitrogen，A28175))和DAPI1:2000(Invitrogen，D1306)进行处理后，在常温下培养1小时。

(8)然后，滴加50ul Vectashield(Vectorlabs，H-1000)，之后盖上盖玻片，并用荧光显微镜进行拍摄。

2.结果

如图10A所示，可以从传代培养11的右侧照片中明亮荧光区域的增加来确认，随着细胞老化的进行，即随着传代培养数量从4增加到11而所增加的αSMA蛋白的表达量，即纤维化已进行。

另外，在图10B中确认出，在老化细胞(11传代培养)中，与用不含rhHAPLN1蛋白的组合物处理的情况相比，在用的本发明的组合物处理时，随着rhHAPLN1蛋白含量的增加，特别是在rhHAPLN1蛋白含量为50和100ng/ml的情况下，显示较少的染色荧光部位，类似于处理吡非尼酮的情况。然而，由于吡非尼酮的含量为0.2mg/mL(200000ng/mL)，当考虑到本发明的组合物中的rhHAPLN1蛋白含量仅为吡非尼酮的4000分之一至2000分之一时，可以得知，与现有的抗纤维化制剂相比，本发明的组合物表现出优异的抗纤维化效能。

[实施例11]

利用各种抗纤维化标志物的本发明的组合物的抗纤维化效能的评估

通过利用BioMAP纤维化面板(由Eurofins discovery提供)检查各种纤维化标志物的表达程度，从而验证了本发明的组合物对肺纤维化和肾脏纤维化的抗纤维化作用。

BioMAP纤维化面板由三个型组成：SAEMyoF系统(共培养小气道上皮细胞和成体成纤维细胞)、REMyoF系统(共培养近端小管上皮细胞和成体成纤维细胞)、以及MyoF系统(分化的肺肌成纤维细胞)。在此，SAEMyoF系统代表包括如特发性肺纤维化症(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)的纤维性疾病(pulmonary fibrotic diseases)的间质性肺疾病(interstitial lung diseases，IDL)，且REMyoF系统代表与终末期肾衰竭(kidneyfibrosis)相关的肾脏纤维化症(kidney fibrosis)疾病。然而，进行了试验以确定MyoF系统仅对肌成纤维细胞的影响。

1.试验方法

(1)每个原代细胞均通过池化(pooling)来自多几个供体(donor)(n＝3-6)的细胞来使用，首先，将细胞在96孔板中培养直至细胞汇合，然后添加外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

(2)接着，按照浓度分别处理本发明的组合物(rhHAPLN1蛋白含量为0、3.7、11和33ng/ml)，并培养1小时。

(3)然后，用TNFα和TGFβ1进行处理，并培养48小时。

(4)对各种生物标志物的表达水平进行直接酶联免疫吸附试验(ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)。

2.结果

将每个定量值作为与载体对照组(control)相比的相对倍数变化数值(foldchange)进行比较。使用未配对的t检验(unpaired t-test)、显着差异相对载体对照组(significant differences vs vehicle control)、*p<0.05、**p<0.01、以及***p<0.001进行统计处理。

根据试验结果，在作为肺纤维化症疾病模型的SAEMyoF系统中确认了本发明的组合物(rhHAPLN1)对αSMA和胶原蛋白I的显着减少效果(图11A)。换言之，可以确认出，对于αSMA，与用不含rhHAPLN1蛋白的组合物处理的情况相比，用本发明的组合物处理时，αSMA的表达量与组合物中的rhHAPLN1的含量无关地始终降低至0.9倍或更少。另外，可以确认出，对于胶原蛋白I，与用不含rhHAPLN1蛋白的组合物处理的情况相比，用本发明的组合物处理时，胶原蛋白I的表达量与组合物中的rhHAPLN1的含量无关地始终优异地降低。特别地，当组合物中的rhHAPLN1蛋白含量为11ng/ml时，胶原蛋白I的表达量降低至0.8倍或更少。

另外，在作为肾脏纤维化症疾病模型的REMyoF系统中确认了本发明的组合物(rhHAPLN1)对胶原蛋白I的显著减少效果(图11B)。换言之，可以确认出，与用不含rhHAPLN1蛋白的组合物处理的情况相比，用本发明的组合物处理时，胶原蛋白I的表达量与组合物中的rhHAPLN1的含量无关地降低至0.9倍或更少。特别地，当组合物中的rhHAPLN1蛋白含量为11ng/ml时，胶原蛋白I的表达量降低至近0.7倍，这可以推测到该浓度是用于显示肾脏抗纤维化效能的最佳浓度。

在与肌成纤维细胞相关的MyoF系统中确认出本发明的组合物(rhHAPLN1)对胶原蛋白IV的显着减少效果(图11C)。换言之，可以确认出，与用不含rhHAPLN1蛋白的组合物处理的情况相比，用本发明的组合物处理时，胶原蛋白I的表达量与组合物中的rhHAPLN1的含量成比例地降低至0.8倍或更少。因此，当组合物中的rhHAPLN1蛋白含量为33ng/ml时，胶原蛋白IV的表达量降低至0.7倍。

[实施例12]

利用肺纤维化诱导动物模型的本发明的组合物的抗纤维化效能(预防纤维性疾病的能力)的评估

通过将本发明的组合物反复吸入施用于已诱导肺纤维化的动物，进行了检测预防博莱霉素诱导的肺纤维化症(BILP)的效果的试验。

1.试验动物的准备和饲养

使用C57BL/6N(KBSI，大田，韩国)小鼠8周龄的雌性作为试验动物，并设定正常对照组(正常，PBS)和两个用量的施用组(含有rhHAPLN1蛋白的本发明组合物)。每两天换一次水，并允许自由进食，每4只小鼠放入一个笼中，饲养室温度维持为21℃至24℃，且湿度为40％至60％，昼夜周期为各12小时。

2.肺组织的染色和显微镜观察

为了构建博莱霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化症(Pulmonary fibrosis，PF)模型，使用C57BL/6N小鼠8周龄的雌性，并分为4组(正常、对照组、0.0005％(w/w)rhHAPLN1、和0.0015％(w/w)rhHAPLN1)，设定每组4只小鼠，IPF疾病的诱发方法参照了Liu等人的论文(Methods in Molecular Biology 2017，DOI：10.1007/978-1-4939-7113-8_2)(参照图12A)。使用1ml注射器和口服施用针头(Oral Zonde Needle 0.9×50mm；20Guage)进行用于诱导特发性肺纤维化症(IPF)的博莱霉素(来自轮丝链霉菌的硫酸博莱霉素(Bleomycinsulfate from Streptomyces verticillus).B8416；Sigma-Aldrich Co.)的施用，在麻醉后，小心地以2U/kg的浓度经口气管内(Orally intratracheal)施用(instillation)25μl一次后，将10ml新鲜磷酸盐缓冲盐水(1X PBS,pH 7.4,Gibco Co.)滴加到雾化器(nebulizer)中以产生雾气(nebulization)来允许自由吸入。

从博莱霉素施用后第1天开始，通过使用上述雾化器以雾化的方式对每组每天施用1次1小时，对于对照组(Control)，施用由20mM Tris-HCl、0.5M NaCl、pH 8.0、50％甘油(glycerol)组成的50μl储备溶液和10ml PBS(1X，pH 7.4，GibcoCo.)溶液的混合液，对于有关本发明的组合物的两个组，施用将50μl rhHAPLN1储备溶液中的rhHAPLN1重量比浓度调整为0.0005％(w/w)即5000ng/mL和0.0015％(w/w)即15000ng/mL后，分别混合在10ml PBS(1X，pH 7.4，Gibco Co.)中而获得的混合液。每两天测量每只试验动物的体重，以确认体重没有变化，并使用质量剂量系统(Mass Dosing System)和气溶胶室(Aerosol Chamber)(Data Science International Co.)以产生雾气。

总试验期间为12天，各浓度重组HAPLN1蛋白实际施用每天1次1小时，在10天期间施用10次后，在第11天麻醉后进行解剖。

3.结果

甲.肺组织的照片比较

图12B为在取出肺组织后将左侧大叶水平切成两半，并将上部部分放入福尔马林中固定，并进行苏毒素和伊红(H&E)染色而获得的照片。当观察照片时可以得知，与对照组相比，当施用本发明的组合物时，特别是在rhHAPLN1重量比浓度为0.0015％(w/w)时，其形式显示为与正常组非常相似。

乙.以数值显示的本发明组合物的预防效能

然后，通过将小鼠左侧最大肺叶的肺组织中部切开，每只小鼠制作3张组织载玻片，且每张载玻片上随机拍摄3个位置，然后将对总共9个部分进行染色的红色部分与未染色的白色部分区分，通过使用Image J软件测量经染色的红色部分的面积，并对所获得的各数值取平均而获得每只小鼠的平均值。红色部分显示纤维化已进行的部分。

另外，对其余三只小鼠也重复同样的方法来获得平均值后，进行重新平均来获得最终的反映纤维化的面积的平均数值和偏差。不处理博莱霉素的正常组与处理博莱霉素的对照组之间的显着性P值为0.00038(***P<0.001)，且不处理本发明的组合物(rhHAPLN1)的组与0.0015％(w/w)rhHAPLN1处理组之间的显着性P值显示为0.00355(**P<0.01)，因此，确认了统计学显着性。

根据以图表显示这些平均值的图12C，可以得知，与对照组相比，在施用本发明的组合物时，特别是rhHAPLN1重量比浓度为0.0015％(w/w)时，红色部分的面积平均值已经减小到与正常组相当接近。换言之，已确认，本发明的组合物在体内表现出针对肺纤维化的预防效果。

丙.根据Ashcroft评分的本发明组合物的预防效能

图12D和图12E为说明作为可以用肉眼简单地测量肺纤维化症的严重程度的官方指南的Ashcroft评分的照片和说明(Ashcroft等人1988，J Clin Pathol 41：467-470)。

纤维化的等级可分为如下的Ashcroft评分(score)。

0分：在一些肺泡壁中观察到大部分薄小纤维，但没有看到明显的纤维性形态或负担(正常肺)。

1分：孤立的软纤维化改变(膈膜厚度小于或等于正常的3倍)，肺泡部分增大且稀疏，但不存在纤维肿块(团)。

2分：明确的纤维化改变(膈膜厚度大于正常的3倍)，肺泡部分增大且稀疏，但未观察到纤维肿块。

3分：在整个显微镜区域中主要确认了连续的纤维性隔膜(膈膜厚度大于正常的3倍)，肺泡部分增大且稀疏，但不存在纤维肿块。

4分：结构发生变化，单个纤维性肿块小于或等于显微镜区域的10％。

5分：结构发生变化，合并的纤维性肿块(大于显微镜区域的10％且小于或等于其50％)，肺结构严重受损，但仍然保存其形状。

6分：结构发生变化，大部分形状并不存在。连续的纤维性肿块(大于显微镜区域的50％)，肺结构大多不保存。

7分：肺泡结构不存在。肺泡几乎被纤维性团完全消灭，但仍然存在多达5个气泡。

8分：肺泡结构不存在。显微镜区域完全被纤维性肿块去除。

根据上述评估标准，三位观察者在不受其他人评估的条件下，各自对相同的数据进行个人判断和评分，然后综合各个结果来获得确定最终平均评分的结果，各个评估者的结果非常相似，双重代表观察者的结果如图12F所示。

总言之，正常组(Normal)的Ashcroft评分＝0，对照组(Control)的Ashcroft评分＝6.25，本发明的组合物1(rhHAPLN1 0.0005％)施用组的Ashcroft评分＝5.25，且本发明的组合物2(rhHAPLN1 0.0015％)施用组的Ashcroft评分＝0.5，正常组与对照组、对照组与本发明的组合物2施用组之间显示出统计学显着性。

[实施例13]

利用肺纤维化诱导动物模型的本发明的组合物的抗纤维化效能(治疗纤维性疾病的能力)的评估

通过将本发明的组合物反复吸入施用于已诱导肺纤维化的动物，进行了检测改善已发生的博莱霉素诱导的肺纤维化症(BILP)的效果的试验。在此，基本上与上述实施例12相似，但在博莱霉素治疗后经过7天，使博莱霉素诱导的肺纤维化症(BILP)充分发生，并对此提出本发明的组合物具有纤维性疾病的治疗能力的试验结果。

1.试验动物的准备和饲养

与上述实施例12的情况相同。

2.肺组织的染色和显微镜观察

为了构建博莱霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化症(Pulmonary fibrosis，PF)模型，使用C57BL/6N小鼠8周龄至10周龄的雌性，并分为4组(正常、PBS对照组、0.0005％(w/w)rhHAPLN1、和0.0015％(w/w)rhHAPLN1)，设定每组4只小鼠，IPF疾病的诱发方法参照了Liu等人的论文(Methods in Molecular Biology 2017，DOI：10.1007/978-1-4939-7113-8_2)(参照图13A)。使用1ml注射器和口服施用针头(Oral Zonde Needle 0.9×50mm；20Guage)进行用于诱导特发性肺纤维化症(IPF)的博莱霉素(来自轮丝链霉菌的硫酸博莱霉素.B8416；Sigma-Aldrich Co.)的施用，在麻醉后，向每只小鼠小心地以50U/kg的浓度经口气管内(Orally intratracheal)施用(instillation)20μl一次后，将10ml新鲜磷酸盐缓冲盐水(1X PBS,pH 7.4,Gibco Co.)滴加到雾化器中以产生雾气来允许自由吸入。

从博莱霉素施用后8天起，对照组(Control)为使用由20mM Tris-HCl、0.5M NaCl、pH 8.0、50％甘油组成的50μl储备溶液和10ml PBS(1X，pH 7.4，Gibco Co.)溶液的混合液。对于有关本发明的组合物的两个组，通过将rhHAPLN1储备溶液(20mM乙酸盐，pH 5.0，8.0M蔗糖，0.04％ PS80)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，并将50μl中rhHAPLN1重量比浓度调整为0.00075％(w/w)即7500ng/mL和0.0015％(w/w)即15000ng/mL。之后，分别混合在10ml PBS(1X，pH 7.4，Gibco Co.)，并通过使用上述雾化器以雾化的方式对每组每天施用1次1小时(10ml/时间/14次/1天)。每两天测量每只试验动物的体重，以确认体重没有变化，并使用质量剂量系统和气溶胶室(Data Science International Co.)以产生雾气。

总试验期间为23天，各浓度重组人HAPLN1蛋白实际每天施用10ml 1次1小时，在14天期间总施用14次，并在最终暴露后的第二天进行麻醉后进行解剖。

3.结果

甲.肺组织的照片比较

图13B为在取出肺组织后将左侧大叶水平切成两半，并将上部部分放入福尔马林中固定，并进行苏毒素和伊红(H&E)染色而获得的照片。当观察照片时可以得知，与对照组相比，当施用本发明的组合物时，特别是在rhHAPLN1重量比浓度为0.0015％(w/w)时，其形式还显示为与正常组非常相似。

乙.以数值显示的本发明组合物的治疗效能

根据以图表显示这些平均值的图13C，可以得知，与对照组相比，在施用本发明的组合物时，特别是rhHAPLN1重量比浓度为0.0015％(w/w)时，与未经任何处理的肺纤维化症的情况相比，红色部分的平均面积值减少了51％。换言之，已确认，本发明的组合物在体内表现出针对肺纤维化的优异治疗效果。这也在图13D中图表化。***p<0.001，通过学生t检验计算。

丙.根据Ashcroft评分的本发明组合物的治疗效能

根据如实施例12中所述的，评估标准，三位观察者在不受其他人评估的条件下，各自对相同的数据进行个人判断和评分，然后综合各个结果来获得确定最终平均评分的结果，各个评估者的结果非常相似，双重代表观察者的结果如图13E所示，在此也可以再次确认出，本发明的组合物在体内表现出针对肺纤维化的优异治疗效果。

[实施例14]

利用肾脏纤维化诱导动物模型的本发明的组合物的抗纤维化效能的评估

通过对诱发有急性肾脏纤维化的动物反复施用本发明的组合物来进行验证其治疗效果的试验。

急性肾脏损伤诱导模型的构建

根据图14A的试验计划，将8周龄的C57BL/6雄性小鼠在戊巴比妥(pentobarbital)(50mg/kg BW，i.p.)麻醉下切开侧腹以诱导缺血，在暴露肾脏后，通过使用非创伤性微动脉瘤夹(non-traumatic microaneurysm clamp；Roboz Surgical Instruments)封闭两侧肾蒂来阻断血流25分钟。接着，移除夹后缝合切口部位。对照手术(sham-operation)以与缺血/再灌流(ischemia/reperfusion)试验相同的方式进行，除了血流阻断之外。

缺血一天后，测量血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，并将该数值升至约98mg/dL(将来规定为100mg/dL)或更高的小鼠分入试验组并进行试验。对于试验组，在手术后第7天起，每天施用包括本发明组合物的各种药物，并在第14天取出肾脏来用于组织学和生化学分析。药物浓度示于表1，且试验组详情示于表2。

【表1】

【表2】

另外，在药物施用后第7天采集血液并测量BUN浓度，并在14天后采集血液和尿液，并测量血液和尿液中的肌酸酐(creatinine)浓度和血液中的BUN浓度。另外，计算肌酸酐清除率。

2.结果导出试验

A.本发明组合物对αSMA减少的效能评估

(1)试验方法

生化学分析(纤维化指标表达评估)：为了得知肾脏组织中的αSMA的表达量，施用针对其的抗体进行免疫印迹。

为了确认经对照手术(sham operation，Sham)和缺血/再灌流(Ischemia/Reperfusion，IR)的小鼠肾脏组织中的αSMA的表达，将每个试验组的样品加载到一块凝胶(gel)上来进行免疫印迹并测量每个条带的密度。使用丽春红(Ponceau)和GADPH作为等加载(equal loading)标志物(图14B)。在此，分别表示如下：SV；空-载体，SB；空-rhHAPLN1-溶解溶液，IRV；IR-载体，IRP；IR-吡非尼酮，IRA；IR-本发明的组合物(rhHAPLN1)A，IRB；IR-本发明的组合物(rhHAPLN1)B，IRC；IR-本发明的组合物(rhHAPLN1)C，更多详情如上表1和表2所示。更具体地，空-载体为其中其中仅将不含rhHAPLNB1的缓冲溶液稀释在PBS中并IP注射到空对照组中的组。空-rhHAPLN1-溶解溶液为其中稀释rhHAPLN1浓度B(0.02mg/kg)并进行IP注射以确认rhHAPLN1对正常条件的影响的组。IR-载体为I/R纤维化诱导模型中不含rhHAPLN1的缓冲液处理组。IR-吡非尼酮为在I/R纤维化诱导后经口服施用300mg/kg吡非尼酮的组。

另外，与αSMA表达相关的针对IRV表达量的倍数(fold)变化示于图表中(图14C)。

(2)结果

与对照手术(sham-operation，SV和SB)相比，在诱导缺血/再灌流时，作为肾脏中的纤维化指标的αSMA的表达显着地高。

然而，与对照药物施用组(IRV)相比，施用本发明的组合物(rhHAPLN1)的组(IRA和IRB)中的αSMA表达显示出与吡非尼酮相似的低水平模式。在此，由于IRC的浓度极低，因此被认为与IRV同等程度高。

B.本发明组合物对胶原蛋白减少的效能评估

(1)试验方法

作为纤维化组织学分析的一环，将由石蜡(Paraffin)固定的肾脏切成3μm后，并分别对这些载玻片切片进行天狼星红(Sirus red)和PAS染色，从而评估胶原蛋白表达和组织的纤维化病变。在此，分别表示如下：SV；空-载体，SB；空-rhHAPLN1-溶解溶液，IRV；IR-载体，IRP；IR-吡非尼酮，IRA；IR-本发明的组合物(rhHAPLN1)浓度0.1mg/kg，IRB；IR-本发明的组合物(rhHAPLN1)浓度0.02mg/kg，IRC；IR-本发明的组合物(rhHAPLN1)浓度0.004mg/kg。

(2)结果

如图14D所示，在暴露于缺血/再灌流的肾脏组(IRV)中显示出，肾脏间质(肾小管之间)中的胶原蛋白阳性部位(红色)明显多于对照手术组(SV和SB)。关于此，为了更客观地确认本发明与胶原蛋白减少相关的抗纤维化效能，通过3名研究人员对图14D的组织染色照片进行了暗盲测试。结果，所有3名研究人员都确认了，与IRV组相比，作为处理吡非尼酮的试验组的IRP、以及处理本发明的组合物的组(IRA和IRB)中的胶原蛋白的表达较弱。

另外，为了定量上述组织中胶原蛋白的表达，在图14D的组织染色照片中随机对肾脏外髓质(outer medulla)部位的两处进行随机成像后，标记胶原蛋白阳性部位。在此，红色是天狼星红阳性信号(图14E)。

基于此，使用i-Solution软件(IMT)对其进行数值化，并相似于图14D中在显微镜下观察到的，与IRV组相比，IRP、IRA和IRB组中的胶原蛋白阳性部位显得较弱(图14F)。这显示出本发明的组合物(rhHAPLN1)减少胶原蛋白的表达至与吡非尼酮同等的程度，并意味着在体内具有抗纤维化效能。

C.本发明组合物对肌酸酐清除率的效能评估

(1)试验方法

作为用于分析肾脏功能的试验，用于此的血液通过使用添加肝素的玻璃毛细管通过眼眶后静脉神经丛(retroorbital vein plexus)取得，尿液通过利用代谢笼而获得。使用Vitros250(Johnson&Johnson)测量血液尿素氮和肌酸酐(血浆肌酸酐，PCr)浓度。

肌酸酐清除率为利用从肾脏中清除的肌酸酐量来推定肾小球滤过率的方法，其计算为尿液肌酸酐浓度×尿量/血浆肌酸酐浓度，在本试验中，在缺血/再灌后第21天进行测量。*p<0.05.N＝4-6.*IR试验组仅使用与手术后第一天BUN浓度升至100mg/dL或更高的诱发有相似水平的损伤的动物。

(2)结果

如图14G中所示，显示出，与没有缺血/再灌流的对照组(SV和SB)相比，暴露于缺血/再灌流的肾脏组(IRV)中的肌酸酐清除率，即肾脏正常功能来从血液中清除的肌酸酐量显着减少。

然而，在处理本发明的组合物的组(IRA、IRB和IRC)中，肌酸酐清除率上升，特别是在IRA组(以0.1mg/kg/BW的rhHAPLN1施用的本发明的组合物)的情况，显示出肌酸酐清除率显着高于本发明组合物中不含rhHAPLN1蛋白且仅含有缓冲液(PBS)的rhHAPLN1缓冲液(IRV)组和吡非尼酮施用组(IRP)。特别地，IRA的CrCl在统计上显着高于IRV。这意味着本发明的组合物的施用实际上缓和由缺血/再灌流损伤诱发的肾脏功能的减少。

序列表自由文本

SEQ ID NO：1

Claims

1.一种用于预防或治疗纤维性疾病的药物组合物，其包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1；HAPLN1)或编码其的基因作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述蛋白质具有相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的80％或更多的序列同一性。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，与所述基因有关的核酸包含在表达载体中。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述纤维性疾病的病灶选自由皮肤、肝、肠、心脏、肺和肾脏组成的组。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述纤维性疾病的病灶选自由皮肤成纤维细胞、肝星状细胞、结肠成纤维细胞、心脏微血管内皮细胞、肺成纤维细胞、肾脏肾小管细胞和肾脏近端小管上皮细胞组成的组。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述纤维性疾病为缺血性纤维化症。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述组合物的一次施用量为0.1ng/ml至500ng/ml。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，当体内施用所述组合物时，以0.001mg/kg至5mg/kg BK的rhHAPLN1蛋白质的用量施用。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述组合物作为主要或辅助有效成分包括在用于预防或抑制细胞纤维化症的组合物中。

10.一种通过在细胞中处理组合物的预防或抑制细胞纤维化的方法，其中，所述组合物包括透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1；HAPLN1)或编码其的基因作为有效成分。

11.一种用于预防或抑制细胞纤维化的试剂盒，其包括根据权利要求1至9中任一项所述的组合物和用于处理根据权利要求10所述的方法的指南。

12.一种用于与预防或抑制细胞纤维化相关的试验的试剂组合物，其包括根据权利要求1至9中任一项所述的组合物。