CN117867161A - 一种与控制枸杞自交亲和性s位点相关的分子标记及其获得方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种与控制枸杞自交亲和性S位点相关的分子标记及其获得方法和应用，属于分子标记技术领域。本发明的分子标记包括Lba02g00861、Lba02g00868、Lba02g01091、Lba02g01064、Lba02g01100、Lba02g01102、Lba02g01105。本发明基于自交亲和与不亲和杂交F1群体的BSA混池分析，得到在枸杞雌、雄蕊中特异表达的分子标记，该方法减少了测序工作量和测序的成本，提高连锁标记的筛选效率，相比于QTL定位更加经济和快速。得到的分子标记能够用于在植株苗期对其基因型进行筛选，加快育种的进程，有利于枸杞种质资源的精准育种。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种与控制枸杞自交亲和性S位点相关的分子标记及其获得方法和应用。
背景技术
宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)是茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)多年生落叶灌木。枸杞子即枸杞的果实，味甘性平，具有滋肾润肺、养肝补血、强肾养阳等功效，是干旱半干旱地区重要的经济林作物，对于促进经济发展，保障生态安全有重要意义。近年来，枸杞产业发展迅速，新培育成不少高产优良品种。然而有些品种虽然混合种植时性状表现优良，但单一品种大面积种植时，存在落花落果严重、果粒大小不一、结实率低甚至绝收等问题。研究者对不同品种的宁夏枸杞的繁育系统和自交亲和性做了调查研究，结果表明，除‘宁杞1号’‘宁杞7号’自交亲和性较高以外，其他品种多为自交不亲和品种，自交亲和性很低。一般来说，自交不亲和过程中花粉和花柱的识别是由同处于S位点的2个S基因(花粉S基因和花柱S基因)来决定的，当花粉与花柱具有相同的S单倍型时，花粉管的生长被抑制。
植物的自交不亲和性(Self-Incompatibility，SI)是一种重要的自我/异种识别系统，它使植株能够识别自己和其他植株的花粉，进而抑制自身花粉或同一品系内的异株花粉在自身柱头上的发芽或生长。这种机制广泛存在于显花植物中，可以有效防止近亲繁殖，促进异交，使后代具有更强的生存能力和适应力。关于自交不亲和性的研究可以追溯到19世纪70年代，当时达尔文首次描述了这一现象。20世纪初，人们开始通过野外调查和杂交实验对自交不亲和现象进行研究，后来的研究也逐渐增加。目前，对自交不亲和的分子和生化机制的研究主要集中于茄科、蔷薇科、玄参科、罂粟科和十字花科等5个科的植物中。
其他茄科植物如番茄马铃薯等花粉和花柱之间的特定识别是基于S-核酸酶(S-RNase)作为决定因素。S-RNase是一类分泌型糖蛋白，在花柱中特异表达，主要分布在花柱引导组织的细胞内或细胞间隙中，可以抑制花粉管的生长，从而发挥防止自交的作用。而花粉S-决定因子，编码一类具有F-box结构域的蛋白，称为SLF(S-locusF-box)蛋白，SLF在花粉和花柱的识别中起到关键作用，是E3范素连接酶复合体SCF(Skp1-Cullin1-F-box)底物识别亚基。近年来，越来越多的证据表明自交不亲和反应不是仅仅受S因子的调控，还涉及到很多其他位点的复杂反应。这些非S因子主要为蛋白质，在自交不亲和反应的不同阶段发挥关键作用。已经发现参与自交不亲和反应的非S因子包括钙结合蛋白(CaBP)，泛素结合蛋白，SKP1样蛋白，S-核糖核酸酶结合蛋白(SBP1)，S-位点F-box相互作用蛋白和肌动蛋白解聚因子(ADF)等。
QTL定位是进行功能位点和功能基因挖掘的有效途径，它基于高通量重测序技术进行遗传分析，现今已经在多种植物中得到广泛应用。科学家使用QTL定位分析已经在番茄、向日葵、黑麦草以及白菜型油菜和其他作物中植物中成功的鉴定到控制自交不亲和的位点。
目前，枸杞中的QTL定位分析多用于果实产量和品质相关性的定位。BSA(BulkedSegregantAnalysis)利用极端表型个体集合构建混池，可以显著减少测序工作量和测序的成本，提高连锁标记的筛选效率，相比于QTL定位更加经济和快速。在枸杞中，还没有相关的报道涉及到BSA分析的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与控制枸杞自交亲和性S位点相关的分子标记及其获得方法和应用。本发明基于自交亲和与不亲和杂交F1群体的BSA混池分析，得到在枸杞雌、雄蕊中特异表达的分子标记，该方法减少了测序工作量和测序的成本，提高连锁标记的筛选效率，相比于QTL定位更加经济和快速。得到的分子标记能够用于在植株苗期对其基因型进行筛选，加快育种的进程，有利于枸杞种质资源的精准育种。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种与控制枸杞自交亲和性S位点相关的分子标记，所述分子标记包括Lba02g00861、Lba02g00868、Lba02g01091、Lba02g01064、Lba02g01100、Lba02g01102、Lba02g01105；
所述Lba02g00861的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Lba02g00868的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Lba02g01091的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Lba02g01064的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述Lba02g01100的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述Lba02g01102的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述Lba02g01105的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，所述Lba02g00868、Lba02g01102在枸杞雌蕊中特异表达；所述Lba02g00861、Lba02g01064、Lba02g01091、Lba02g01100、Lba02g01105在枸杞雄蕊中特异表达。
本发明还提供了一种上述分子标记的获得方法，包括如下步骤：
(1)将自交亲和亲本和自交不亲和亲本杂交，得到F1代，对F1代进行自交亲和相关表型分析；
(2)根据自交亲和相关表型分析结果，将F1代DNA分为自交亲和混池和自交不亲和混池，并进行ED关联分析和SNP-Index关联分析，得到候选关联区间；
(3)统计候选关联区间内基因在枸杞不同器官中的表达差异情况，得到在枸杞雌、雄蕊中特异表达的基因，所述基因为所述分子标记。
优选的，所述自交亲和相关表型分析包括坐果率、平均单果重、自交亲和指数、相对自交亲和指数。
优选的，所述自交亲和混池中包含相对自交亲和指数排名前30位的F1代；所述自交不亲和混池包含相对自交亲和指数排名后30位的F1代。
优选的，所述器官包括雌蕊、雄蕊、茎尖、老叶、新叶、青果、成熟果。
本发明还提供了一种上述分子标记在枸杞自交亲和性检测中的应用。
本发明提供了一种与控制枸杞自交亲和性S位点相关的分子标记及其获得方法和应用。本发明基于自交亲和与不亲和杂交F1群体的集群分离分析法(BSA)混池分析，获得32.2Mb的候选S位点区间，区间内共108个基因。进一步分析定位区间内基因在不同器官中的表达差异情况，得到在枸杞雌、雄蕊中特异表达的分子标记Lba02g00861、Lba02g00868、Lba02g01091、Lba02g01064、Lba02g01100、Lba02g01102、Lba02g01105。分析表明，定位区间内，雌蕊特异表达的Lba02g01102(注释为S-RNase基因)为雌蕊S决定因子，雄蕊特异表达的Lba02g00861、Lba02g01105、Lba02g01091、Lba02g01100(均注释为F-box基因)为雄蕊S决定因子。除此之外，雌蕊特异表达的Lba02g00868(注释为RLK，受体激酶家族)和雄蕊特异表达的Lba02g01064(注释为L-抗坏血酸氧化酶)也和枸杞的自交亲和性控制相关。
本发明利用极端表型个体集合构建混池，显著减少了测序工作量和测序的成本，提高连锁标记的筛选效率，相比于QTL定位更加经济和快速。本发明的分子标记能够用于在植株苗期对其基因型进行筛选，加快育种的进程，有利于枸杞种质资源的精准育种。
附图说明
图1为2021年和2022年采集F1群体的自交亲和表型性状的频率分布图。
图2为ED关联值在染色体上的分布图。
图3为SNP-index关联值在染色体上的分布图。
图4为候选关联区间内的基因在不同器官中的差异表达图谱。
图5为定位区间内基因在自交亲和品系和自交不亲和品系自交和杂交后不同时间花柱的差异表达分析结果图。
图6为亲本和F1子代群体S-RNase基因型鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、试验材料：
本实施例选用宁夏枸杞两个优良品系‘宁杞8号’(自交不亲和)和‘宁杞1号’(自交亲和)作为亲本，正反交后获得F1杂交群体。2016年进行正反交杂交授粉，2017年春季完成温室育苗，同年5月将苗木定植于银川市西夏区宁夏农林科学院芦花台枸杞种质资源圃(38°380′N，106°9′E)，按常规栽培模式进行管理。
二、试验过程：
1、自交亲和表型分析
1.1授粉
在2021年和2022年6月初枸杞盛花期进行授粉试验。首先，分别收取亲本和F1群体单株当天将要开放但花冠未打开的花10朵，置于培养皿中，室温阴凉处散粉、待用；其次，两天后，对F1群体各单株进行套袋处理，选择当天将要开放但花冠未打开的花朵，每株选25朵花，用各自采集的花粉进行授粉处理，授粉完成之后用3cm×5cm牛皮纸袋进行单花套袋。
1.2胚珠数
亲本和F1群体每单株采集五朵完整且开放完全的花，体视镜下使用解剖针对所采集花的子房进行解剖，记录得到每单株的五朵花分别含胚珠数的数目，求平均值。
1.3自交亲和表型指标计算
授粉当年七月初，进行果实收获和数据统计工作。分别采集每单株同株异花授粉纸袋。记录每单株植株收集的纸袋数(一般为25个，个别由于刮风下雨等有缺失)，统计单株纸袋内果实数目，称取单株果实重量；收集果实中的种子，统计由每株植株回收果实中得到的种子总数。
按照以下公式分别计算坐果率、平均单果重、自交亲和指数、相对自交亲和指数，作为评价自交亲和性的依据：
坐果率(FR)＝果实数/收获纸袋数；
平均单果重量(AFW)＝总重量/套袋花蕾数；
自交亲和指数(CI)＝总种子数/收获纸袋数；
相对亲和指数(CCI)＝总种子数/收获纸袋数/胚珠数
1.4结果
2021年和2022年采集F1群体的自交亲和表型性状的频率分布统计结果如图1所示，其中，FR为坐果率，AFW为平均单果重，CI为自交亲和指数，CCI为相对自交亲和指数。
图1显示，相关指标的频率分布不呈正态分布，可能是正态分布和指数分布的结合。表明自交亲和相关性状可能受一个关键位点和一系列其他位点的共同调控。
2021年和2022年采集F1群体的自交亲和表型性状的相关性分析结果如表1所示。
表1F1群体同株异花授粉自交亲和相关表型性状相关性分析
注：**：p＜0.01
表1显示，这些自交亲和性状在枸杞中可能是共同受到一个或多个基因的调控。
2、候选关联区间定位(基因组DNA提取，测序和BSA混池定位)
取亲本和F1群体单株幼嫩叶片，采用DNA提取试剂盒(天根生化，北京，中国)提取DNA，琼脂糖凝胶电泳和Qubit2.0进行DNA检测和定量。采用GenoBaits DNA-seqLibraryPrep试剂盒对质检合格的DNA构建重测序文库，文库质量检测合格后，利用华大MGI-2000/MGI-T7测序平台进行测序，测序模式为PE150模式。
根据相对自交亲和指数，从F1群体中选取自交亲和性最高的30单株和最低的30单株构建子代混池，使用bcftools分别将两个混池对应的子代个体基因型提取出来；合并两亲本、两混池的位点信息，整合为vcf格式的变异文件进行进一步分析。
2.1ED关联分析
欧式距离(EuclideanDistance，ED)算法，是利用测序数据寻找混池间存在显著差异标记，并以此评估与性状关联区域的方法。理论上，BSA项目构建的两个混池间除了目标性状相关位点存在差异，其他位点均趋向于一致，因此非目标位点的ED值应趋向于0。ED方法的计算公式如下所示，ED值越大表明该标记在两混池间的差异越大。
其中，Amut为A碱基在突变混池中的频率，Awt为A碱基在野生型混池中的频率；Cmut为C碱基在突变混池中的频率，Cwt为C碱基在野生型混池中的频率；Gmut为G碱基在突变混池中的频率，Gwt为G碱基在野生型混池中的频率；Tmut为T碱基在突变混池中的频率，Twt为T碱基在野生型混池中的频率。
2.2SNP-index关联分析
利用两亲本的SNP数据，分别计算两混池的SNP-index，并通过ΔSNP-index观测可能与性状分离相关的位点。SNP-index计算方法如下：
SNP-index(Mut)＝ρx/(ρX+ρx)
SNP-index(WT)＝ρx/(ρX+ρx)
ΔSNP-index＝SNP-index(Mut)-SNP-index(WT)
其中，Mut和WT分别为子代的突变池与野生池，ρX和ρx分别为野生型亲本的等位基因，以及突变型亲本的等位基因在各自池中出现的read数目。
通过ΔSNP-index可以观察每个位点在突变池与野生池之间的差异。为了消除假阳性的位点，利用标记在基因组上的位置，可对同一条染色体上标记的ΔSNP_index值进行拟合，并根据关联阈值，选择阈值以上的区域作为与性状相关的区域。关联阈值是通过一个计算机模拟抽样实验得到的，计算每一个标记与目标性状关联的概率。
2.3结果
2.3.1ED关联分析结果
根据F1群体自交亲和性的分析结果，选取自交亲和的30株和自交不亲和的30株，建立分别组成子代自交亲和混池和自交不亲和混池。基于2个混池的基因型，共获得25,138,462个高质量SNP，统计各碱基在不同混池中的等位基因频率，计算每个位点的原始ED值。为了消除背景随机波动对定位的影响，对ED值取四次方操作，然后使用基于染色体位置的滑窗方法对ED值进行拟合，取窗口内所有SNP的关联值的中位数作为该窗口的关联值，其中窗口大小为1Mb，步长大小为200kb。最终得到的关联值分布如图2所示。
取所有位点拟合值从大到小排序，取中位数+3SD作为分析的关联阈值(0.27)，根据关联阈值判定，定位到17个区域，如表2所示，均位于2号染色体。
表2ED关联区域信息统计表
2.3.2SNP-index关联分析结果
使用双亲的基因型和两个子代混池基因型数据，过滤掉亲本和混池之间无多态性的位点，共获得1,874,441个高质量SNP，用于SNP-Index关联分析。计算△SNP-index，并采用滑窗方法对△SNP-index进行拟合，其中窗口大小为2Mb，步长100kb，取窗口内所有位点的△SNP-index的中值作为该位点拟合后的关联值。最终拟合的△SNP-index的分布如图3所示。按照拟合后的△SNP-index计算机模拟实验，取置信度99％的阈值，得到10个关联区域，如表3所示，也均位于2号染色体。
表3SNP-index关联区域信息统计表
| 染色体编号 | 关联区域起始位置 | 关联区域终止位置 | 关联区域大小/Mb |
| Chr02 | 11100000 | 11300000 | 0.2 |
| Chr02 | 12700000 | 13400000 | 0.7 |
| Chr02 | 13800000 | 19100000 | 5.3 |
| Chr02 | 21000000 | 52300000 | 31.3 |
| Chr02 | 52800000 | 57400000 | 4.6 |
| Chr02 | 59000000 | 83900000 | 24.9 |
| Chr02 | 84300000 | 85300000 | 1 |
| Chr02 | 87600000 | 92900000 | 5.3 |
| Chr02 | 115500000 | 115800000 | 0.3 |
| Chr02 | 120700000 | 121700000 | 1 |
2.3.3候选关联区间的确定
取ED关联分析和SNP-index关联分析两种算法的交集，如表4所示，共获得11个候选关联区间，均位于2号染色体。
显著关联区间分别为Chr02：24.7-24.9Mb、Chr02：30.8-34Mb、Chr02：30.8-34Mb、Chr02：34.7-35.4Mb、Chr02：35.8-36.9Mb、Chr02：37.1-38.3Mb、Chr02：40.2-45.3Mb、Chr02：47.6-49.2Mb、Chr02：56.7-57.2Mb、Chr02：59.6-63.1Mb、Chr02：70.5-81.1Mb、Chr02：88.8-92.3Mb，总长度32.2M，这些显著关联区覆盖的染色体长度为0.2-10.6Mb，总长度32.2Mb，共包含108个基因。对得到的候选区间的变异位点进行基因注释，并进行Swissprot功能注释。
表4ED和SNP-index两种算法交集区域
| 染色体编号 | 关联区域起始位置 | 关联区域终止位置 | 关联区域大小/Mb |
| Chr02 | 24700000 | 24900000 | 0.2 |
| Chr02 | 30800000 | 34000000 | 3.2 |
| Chr02 | 34700000 | 35400000 | 0.7 |
| Chr02 | 35800000 | 36900000 | 1.1 |
| Chr02 | 37100000 | 38300000 | 1.2 |
| Chr02 | 40200000 | 45300000 | 5.1 |
| Chr02 | 47600000 | 49200000 | 2.6 |
| Chr02 | 56700000 | 57200000 | 0.5 |
| Chr02 | 59600000 | 63100000 | 3.5 |
| Chr02 | 70500000 | 81100000 | 10.6 |
| Chr02 | 88800000 | 92300000 | 3.5 |
3、基因差异表达分析
提取枸杞不同器官的转录组数据，获得定位区间内各个基因在雌蕊、雄蕊、茎尖、老叶、新叶、青果、成熟果中的的表达量(FPKM值)，去除各个时期表达量均为0的基因，剩余的基因根据FPKM值使用Tbtools软件绘制基因表达热图。如图4所示，其中，CR为雌蕊；XR为雄蕊；S为茎尖；OL为老叶；NL为新叶；GF为青果；RF为成熟果。
图4显示，108个基因中，有Lba02g00770、Lba02g00815、Lba02g00817等51个基因各个时期FPKM值均为0或者很接近于0，其余的57个基因显示了不同的差异表达模式。Lba02g01064、Lba02g00814、Lba02g00861、Lba02g00862、Lba02g01091、Lba02g01093、Lba02g01096、Lba02g01105、Lba02g01110、Lba02g1136等10个基因仅在雄蕊中表达，或者在雄蕊中表达量远高于其他部位；Lba02g01102、Lba02g00852、Lba02g00877等6个基因仅在雌蕊中表达，或者在雌蕊中表达量远高于其他部位；Lba02g00892、Lba02g00847、Lba02g00868等11个基因在雄蕊中表达量明显低于其他部位；Lba02g00923在雌蕊和雄蕊中表达量均低于其他部位；Lba02g00884在果实中含量低于其他部位；还有以下基因在各个器官中表达比较均衡，未产生明显差异，比如Lba02g00844、Lba02g00845、Lba02g00855等11个基因。
为了探寻枸杞的雌、雄蕊S决定因子，我们特别关注了在雌、雄蕊中特异表达的基因。仅在雌蕊中表达并且在雌蕊中表达量超高的Lba02g01102(雌蕊中FPKM值为19116)，经注释后显示为S-RNase基因，和其他茄科植物雌蕊决定因子一致，为枸杞的雌蕊S决定因子；仅在雄蕊中表达的基因中，Lba02g00861、Lba02g01105、Lba02g01091、Lba02g01100四个基因均注释为F-box基因，共同作为枸杞的雄蕊S决定因子SLF基因起协同调控作用。值得注意的是，Lba02g01064在雄蕊中表达量很高，FPKM值达到7726.7，该基因被注释为L-抗坏血酸氧化酶，该基因在植物中广泛存在，在细胞壁合成、植物细胞死亡、抗氧化防御和信号传递等方面发挥着重要的作用。
4、花柱中特异表达的基因在自交和异交授粉后的差异表达分析
为了进一步探索自交和杂交授粉后亲和与不亲和品系基因的差异表达情况，首先筛选花柱中有表达的基因，采用自交亲和与不亲和枸杞品系分别在自交和杂交授粉后0h以及短期(0.5h)、中期(8h)、长期(24h)花柱转录组数据，使用Tbtools绘制所关注区间内在花柱中有表达的基因的差异表达热图，如图5所示。其中，A为自交亲和品系花柱未授粉；B为自交不亲和品系花柱未授粉；AcE为自交亲和品系杂交0.5h花柱；AcM为自交亲和品系杂交8h花柱；AcL为自交亲和品系杂交48h花柱；AsE为自交亲和品系自交0.5h花柱；AsM为自交亲和品系自交8h花柱；AsL为自交亲和品系自交48h花柱；BcE为自交不亲和品系杂交0.5h花柱；BcM为自交不亲和品系杂交8h花柱；BcL为自交不亲和品系杂交48h花柱；BsE为自交不亲和品系自交0.5h花柱；BsM为自交不亲和品系自交8h花柱；BsL为自交不亲和品系自交48h花柱。
图5显示，多数基因变化比较平稳，少数基因产生较大的变化。比如在亲和与不亲和品系中Lba02g00854、Lba02g00884，自交和杂交后表达均显著上升；Lba02g00854注释为transmembraneepididymalprotein1-like基因，编码一个跨膜蛋白，属于EFCAB家族，这个家族的蛋白质通常具有钙离子结合和信号转导的功能；Lba02g00884注释为Zinc fingerA20 and AN1domain-containing stress-associated protein 8-like基因，编码一个蛋白质，属于A20/AN1家族，这个家族的蛋白质通常参与了多种生物学过程，如逆境响应、激素信号转导、细胞周期调控等等。在自交和杂交之后，Lba02g00892和Lba02g01102基因表达量均大幅降低；Lba02g00892注释为MLP-like protein 34-like基因，编码一个蛋白质，属于MLP家族，这个家族的蛋白质通常参与了多种生物学过程，如细胞的信号转导、细胞骨架的重塑、细胞凋亡、基因转录的调控等等；Lba02g01102为S-RNase基因。而Lba02g00868在自交亲和品系自交和杂交授粉后48h时间内表现出先升后降趋势，而在自交不亲和品系中却表现出升高趋势，该基因注释为G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase RLK1基因，编码一个受体蛋白质，属于植物中的RLK(受体激酶)家族，该基因编码蛋白参与花粉管的生长和吸引、花粉和雌蕊之间的识别，以及植物对外界环境的适应反应等。Lba02g01069在自交亲和品系杂交授粉后表现出上升趋势，而在亲和品系自交授粉与自交不亲和品系中则表现出上升趋势，该基因没有注释成功。
5、子代S-RNase基因分析
分别取亲本和混池子代的幼嫩叶片，使用DNA提取试剂盒(天根生化，北京，中国)提取DNA，电泳检测提取DNA的量和质量。接着，使用基因特异的引物(如表5所示)，对亲本和极端表型子代S-RNase基因型进行鉴定。鉴定采用PCR的方法，PCR采用10ng DNA作为模板，1×PCR缓冲液，0.25mmol/L dNTPs，0.25μmol/L正向和反向引物，0.5U的TaqDNA聚合酶(Qiagen，Valencia，CA，USA)，用ddH2O补足至20μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，28个循环，72℃延伸10min。PCR结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，有条带即为含有该基因型，无条带则表明不含该基因型。
表5用于S-RNase基因型鉴定的引物序列及产物长度信息
在其他茄科植物中，S-RNase均作为雌蕊S决定因子决定自交不亲和过程中的雌、雄蕊识别，在本发明中，枸杞的S-RNase基因也在通过BSA所获得的定位区间以内，且S-RNase基因也显示了花柱特异性表达，及授粉后不同时间的差异表达。根据亲本中S-RNase基因序列，设计基因特异性引物，在子代中进行扩增，以鉴定子代的S-RNase基因型。如图6所示。
图6显示，亲本和所检测的子代均含两个不同的S-RNase，且自交亲和子代混池中均含S8-RNase基因，自交亲和性和S基因型之间显示了显著的相关性，这在一定程度上暗示了S8-RNase基因的功能。
结论：
本发明基于自交亲和与不亲和杂交F1群体的BSA混池分析，获得32.2Mb的候选S位点关联区间，区间内共108个基因。通过进一步分析发现，定位区间内，Lba02g00861、Lba02g00868、Lba02g01091、Lba02g01064、Lba02g01100、Lba02g01102、Lba02g01105在枸杞雌雄蕊中特异表达，其中，雌蕊特异表达的Lba02g01102(注释为S-RNase基因)、Lba02g00868(注释为RLK，受体激酶家族)为雌蕊S决定因子，雄蕊特异表达的Lba02g00861、Lba02g01105、Lba02g01091、Lba02g01100(均注释为F-box基因)，以及Lba02g01064(注释为L-抗坏血酸氧化酶)为雄蕊S决定因子。
Lba02g00861的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGTCACCGTTAATGCGGGCTGCTTATGATGACACCGTGCCTAGATGGTCGGACATGTCACCGCTAATGCGGGCTGCTTATGATTCCACCGTGCCTAGAGGGCCGGACATGACACCACTAGTTGGCGGCACGCTAGCATTGGAAGGAAAAGAGGAAGTTGAGTTCATTGAGGGTGATGATTTGGACTCCATTTGCTCAGGCTTGACGAGGATTGGTCAGTTTGACAAGCACTTGGTGACAGGACAAAAATGTGAAGATTTTAGtGATGGTGATGGTTACCTGAAATCCATTTACCCAGATCTAGATTTGCCATATATAAAAAGTTGTATTAGTATTTCAAGTGATAAACTCATCGGTCCAATCCATGGTTTGATTGCTCTGATGGATCCAATTACCACCATCTTGTTCAATCCATGTACTAGAAATTATAGACTGCTCTCGTCCAGCCCTTTTGAAGTTCCGAAGGGTTTCTCTATATCCATTGAAAGTGGCGGGTTTGGTTTTGATTCTGTAGTTAACGATTTCAAAATTTTTAGAATTGTTCAAATTTACACAGAAGATCGATACGGATACGATGAAGAGGTAGAGAAAAAGGTTGAGGTTTATGAATTGGGTATTGATATTTGGAGAGAATTAGATCATGTTGATCCACAATTGCCCGGGTTATTTTGGCTGACTTCTTCGATATTTTTTAGGGGAGTCTACCATTGGATTACAACTTCAGAAGAACTCGAACCGATAATTCTTTGTTTTGATATGAGCACCGAAATTTTTCGCAATATGAAACCCCCTGATACTCGTGAATTTTCAAATGGAACACTTCATAGCCTCGTCCTCTTGACTGGTTCTCTAAGCTTGATTTGTTACCCCTGTTTGGGGCCCATGATTGATCCAGCAAAAGATCTGATAGAAATTTGGGTAATGAAAGATTATAATGTTTATGAGTCTTGGATTAATAAATACACAGTTAGAGGTCTTCCTACTGAATCCCCATTAGCAGTATGGAAAGATTATTTATTGTTTTTTCAAAGCAAAAGTGGATATTTGATGTCGTATGATCTTAATTCCGATGAAATCAACGAATTGACATTTCACGGTTGTCTGGAAAGTATGCGAATTATAATTTACAACGAAAGCTTGACTCCAATTCCAAGAGGAAGCCAAAGTAACTCACAAGTTCAAAACTTTTAG
Lba02g00868的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
ATGGCTTGCTCCACAACATATCCTATGCTTTTTGTTCTTCTCATCTTTCCCCTGCATATTTTAGCACATACTAAGTTTACTATACCATTGGGCAGCTCTCTCACAGCAAATCAAGAAACCACCCGTTGGCTTTCTCACTCTAGAGATTTCGCATTCGGATTCAAGCAAATTCAACCTCAAAACCAGTTCTTGCTTTGCATATACTATGCCAAGATAAAAGACACCACCATAATTTGGTATGCAAATGATGGTTATCCAGTTCCGCGAGGCTCTATCGTGGAATTAAATCCACAAAATGGACTAATTCTCGGCGATCCTCAGGGGAAAATGATTTGGAGCACTAGTCCGATTATAGCTTGTAATGTTGCTTATGTTGTCATGAATAATACAGGAAACTTTGTTCTTGTTGGAAGTGATTCTTCAGTTTTATGGGAAAGTTTTCGATATCCAACTGATACCCTTCTGCCTACTCAAATACTAGAGATTGACGACAAGCTGGTTTCTCGAAAATCGGAGTCTTTGTCTGTTCCAGGTAGATTTTATCTTCGTATGTTGAGTAATGGGAATTTGGTGCTTGTTACTCAATCCAGGCCAACAAATTTCGATTATGATGCTGAGTATTACAACAGTCATACTTCTGATCCTGGAGACGAAGCCAATTCTGTTTATCGATTGATATTTGATGAGTTAGGTTCAGTTTACATATTAAAAAGAAATAATCAAAAACTTTTGTTGACACCTCCCAATGTCCCTTCAATTTCAGAAAATTATCACAGGCTAAGTCTTGATTTTGATGGTGTTTTAACTCATTACTATCATCCCAAGAGTACTACCTCTACGGGGAACGAAAGGTGGAGTACTCTTTGGTCTTTGCCTGATAACATATGTCTAGCAATTCTTGGAGAAACTGGAAGTGGAGTTTGTGGGTACAACAATGTGTGCCATCTAGGCGAAAATCAAAGACCATATTGTGTGTGTCCAAAAGGGTATTCGTTGACCGATCCCAACAATAATTACGGGAACTGTAAACCAAAATTTATTCCAAGTTGTGATGAATTTGGAAAGGGCAATCCTGAAGATTTGTATGATTTTGATGTGGTGACGGACGTTGATTGGCCATTATCAGATTTCGAGAGGATTTATCCTTCAGCTGAAGAAGAATGCAGGAAGGCGTGTTTAGAAGATTGTTTTTGGGCAGTTGCTATTTATAGAAGCAATAGTTGCTGGAAGAAGAAACTGCCATTGTCAAATGGGAGAGTAGATGCCACTTTGAATGTAAAAGCTTTCCTTAAAATAAGGAAAGTTTCAACATAA
Lba02g01091的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ATGCAACCAGGTGAAAAACTTGTTAAGAATTTTGTGATGCAATGTAAAGTACTTTTGGAAGAATCCAAGATGACGGATGGAACAATGAAAAAATTGCCGGAAGATGTGGTGTTTTATATATTCTTCAGGTTTCCGGTGAAATCAATTTCCCGATTCAAATGTGTTACTAAAAGTTGGTACACGCTCATACAATCATTCAATTTCATCAATCTACATCTCAACCGCACCACTACCACCAAAGATGAATTCATTCTTATCAAAAGATCCTTTAAAGAAACCAAAGGATTTAAAACTGTTTTGTCTTTTCTCCTCAGTGCTGATGGCGAAGATGATCTTGATCCTATTTCCAGGGATATAGCTGTGCCATATCTGTGCACCAGTTATGGTAGTATCTGTCATCAGCTCAATGGTCCTTGTCATGGTTTGATTTTTTTAACTGACTTCACCAACATTGTAATATTAAACCCAGCTACTAGAAATTATAGGCTGCTCCCACCCAGCCATATTGGTTGCCCACGTGGTTTCTATCGTTCTATTGGCGGTGTTGGATTTGGCTATGACTCAATTCAAAAGAAATACAAGGTAGTTACAATTTCAGAAGTTTTCGGGGAACCTCCATTCAATGATCCTAGTGTGGTAGAGTGGAAAGGTGAGGTTTATGACTCGAGCATTGATTCTTGGAGAGAACATCAAGAGTTGCCCTGGCGTTATAATTTCCCTTATTCTGAAATATTTTATAAGGGAGCCTTTCATTGGTATGCCCACAGAAAAATTGTGATAATTCTTTGTTTTGATATAAGTACTGAAATTTTTCGCACCATGCAAGTGCCTGAAACTTGTGCAGAATATGATGAAAAATGTCATAGCCTTGTAGTCTTAGATGAGTCTCTAACATTTATTTGTTACCCTGACCCAGGGAGGGAAAGTAGTCCAATACAAGAAACAACTAAAATTTGGATAATGGAGGAGTACAGTGTAAATGAGTCTTGGATTAAGAAATATACAATTAGATCTCCTCCTATTGAGTCCCCCTTGGTAGTTTGGAAAGATCGTCTAATGCTTCTTCGAGACAAAAGTGGACTTCTGATTTCATATCTAGAATCTAATAAAATCAAGGAATTCAAGTTAGATGGTTATCCTGGAAGTTTGAGAATAATAATTTACAAGGAAAACTTGATTCCAATTCCTACGGGTAGTACCCAAGTTCAAAGTTTTAGGGAAGGTAAAACTCCTTAA
Lba02g01064的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
ATGGGAAGTGGTAAAGTGACAGTCGTGGCTTTGCTACTTTGCCTCTCTCTAGGGGTGATAGCTGAGGACCCTTACCTCTACTTTAACTGGGAAGTCACCTATGGCACTGTCGATCCATTGGGCGTGCCTCAACAAGGTATTCTCATCAACGGGCAGTTCCCAGGGCCTAGAATTAACTGTACCTCTAACAACAACATTGTTGTCAATGTCTTCAATAAATTGGACGAGCCATTCCTCTTAACTTGGAATGGTGTCCAACATAGGAAGAACTCATGGCAAGATGGTACCCCAGGAACCATGTGCCCAATCATGCCTGGTCAAAATTTCACCTACCGCTTCCAGGTCAAGGACCAGATTGGTAGCTACTACTACTTCCCAACCACAGCCTTGCACCGGGCAGCCGGTGGCTATGGCCCCATCAACGTCCACAGTCGTGCTCTCATCCCAGTTCCGTTTCACAATCCTGCTGATGAGTACAACGTATTCGTGGGCGATTGGTACAACAAGGGCCACAAGACCTTGAAAAAGATCTTGGACGGTGGACGCACCATTGGCAGGCCCGATGGCATTATCATAAATGGTAAGTCTGCTAAGGTTGGCGAGGCAAAAGAGCCACTCTTTACCATGGAGGCTGGCAAGACTTATAGGTACAGGTTCTGCAACCTTGGCATGAGGTCCTCAGTCAACGTGAGGTTCCAAGGTCACCCAATGAAATTAGTGGAGCTAGAGGGATCCCACACCGTACAAAACGTCTACGATTCCTTGGACATCCACGTTGGTCAGTGCCTCTCAGTATTGGTCACTGCCAATCAGGAGCCCAAGGACTATTACTTAGTTGCTTCAAGCAGGTTCTTGAAGCAAGAACTCTCCTCTGTGGCCATCATTCGTTATGTCAATGGCAAGGGTCCAGCATCCTCTGAGCTCCCAGCATCCCCACCAGACAACACTGAAGGCATTGCCTGGTCCATGAACCAGTTCCGCTCCTTCAGATGGAACCTCACCGCTAGTGCTGCCAGACCCAACCCTCAAGGTTCCTACCATTATGGACAGATCAACATCACCCGCACCATCAAGATCGTCAACTCCAAGGGCCAAGTAGGTGGTAAGCTTAGATATGGTTTGAACGGTATCTCTCACACCGATAGCGAGACTCCATTGAAGCTTGTAGAGTACTTTGGAGCTGCCGATAAGGCCTTCAAGTATGATCTCATGGCTGATGAAGCCCCCGCTGACCCAAGCAAGCTCACTATTGCCGCAAATGTGAAAAACGCCACCTACCGTAACTTTGTGGAAATCATCTTCGAGAACCACGAGAAGACCATCCGCACCTATCACCTGGACGGATATTCCTTCTTCGCCGTGGCTGTTGAGCCCGGGAAGTGGACCCCAGAGAAGAGGAAGAACTACAATTTAGTGGATGCCACAAGCAGGAACAACATCCAGGTGTATCCAAACTCATGGGCAGCAATAATGTTGACCTTTGACAATGCAGGAATGTGGAACTTGAGGTCAGATATGTGGGAGAAGACATACTTGGGAGAGCAAATGTACTTCAGCGTTCTCTCCCCAAGCCGATCATTGAGAGATGAGTACAACCTCCCAGACAACCATCCTCTCTGCGGTGTTGTCAAGGGCATGCCCCTCCCAACTCCATACAAGGCTTAA
Lba02g01100的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
ATGGATGGAATTACGAAACAATTGCACAAAGATGTCTTAATTTATATTGTTTTAAGGTTTCCCCTGAGATCTCTCATGCGATTCAAGTGCATCTCTAGAACTTGGTATATTTTCTTACAATTCCCTACTTTCATCAATCTTCATCTAAATCGCAGTACAACATCTAGAAATGAATATATTCTCCTCAAATATTCCATCAAATCAGAAGTGGACCAATATAAAAATGTATTGTCTTTTCTTTCCAGTAATGACTATGATGACCTAAATCCTGTTTCTCCAGATATAGATCTACCATATTTAACCTCTTATCGCAGTCTTTCTCATCAACTTATAGGTCCTTGTCGTGGTTTGATTGCTTTAACGGATCTTGAAGATATTGTTTTGTCGAATCCATCTACTAGAAAATACAGGCTTCTCCCACATCCAAGATGCACGATTGATCCGGGACAAGAGTTGACGGAGATTTGGATAATGAAGGAGTACGGTATAAATGAAACCTGGATTCAGAAATATACAATTAAACCTCTTCCCATTGAATCTTCATTAGCAATCTGGAACGATCATTTGTTGCTTCTTCAAAGAATAAGTGGAAATTTTAGTTCATATGATCTTATTTCTGATGAAGTCAAGGTATTCAATTTCCGAGGTTGTCCTAGTACTATGAGACTTCTAGTTTTTAAGGAAAGCTTGACTACAATTCCAAGAGAAAGTAAGCATGGTACAAAAATTCGAACTTTTTGALba02g01102的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
ATGTCTAAACCACAGCACACATCAGTTCTCTTCATGTTGCTTTTTGCTATTTCCTCTACTTATGGGAATTTCGAGTTATTGGAGCTCGTTTTGACGTGGCCACCAACTTTTTGCTACATGAACGATTGCAACAGATGGCCAATTCCAAACAATTTTACAATTCATGGGCTTTGGCCGGATAACAAATCCGTTATGCTGAATAACTGCGTGGGCTACCCAAAAGTGGGTTATAATATCATCATGGATGTCAGAAAACTAAGTGAGCTGGACAAACGCTGGCCTCAACTGAAATACGACTACCAAACTGGTATAGACGAACAATATCTCTGGAAAAAGGAATTCCTAAAACATGGAAGCTGTGGTATAAAGCGGTACCCACAACCTGCATATTTTGATTTAGCCATGAATTTAAAAGACAAGTTTGATCTCTTGAGTACTCTCAGAAATCATGGGATTACTCCTGGTTCAACTTATCAGCTTGATGATATCGAAAAGGCCATAAAGACAGTTTCTATAAAGGTTCCTAGCCTCAAGTGCATTGAAAAATATCCTGGAGATGTGGAACTCAGTGAGATTGGTATATGTTTGGACCCAGAAGCAGAATATATGGTTCCCTGTCCTCGAACTGGGTCATGCCATAACAAGAGAACTAAGATAATTAAGTTCCGATGA
Lba02g01105的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示:
ATGACAGATGGAATCATGAAGAAATATTCTGGAGATGTGGTCATTCATATACTTTTGAGGCTTCCGGTGAAATTTCTCTTGCGATTCAAATGTGTCTCCAAAACTTTTTTCACTCTCATACAATCTTCAACTTTCATCAATCTTCATCTCAACCACACAACAACTTCGACAAATGATAACATTCTCTTGAAGCGCTCCTTTAAAGAAGATATTGAAATATATAAAHCTATATTTTCTTTTCTTTCTAGTGATTGTGAAGATTACATGAAATTCTTTTATCCAGATCTAGTTGTGCCATATATGACAAATCGTTTGAGTATTACCAGTGATAAACTTATCGGTCCTAGCCATGGTTTGATTGCTCTGATGGATCCAATTACCACCATCTTGTTCAATCCATCTACTAGAAATTATAGACTGCTGCCGTCGAGCCCTTTTGATGTTCCAAAGGGATTTTATCGATCCATTGAAAGTGGCGGGTTTGGTTTAGACTCTGTAGTTAATGATTTCAAAGTTTTTAGAATTTCTCAAGTTTACACGGAAGATCATTTCGGGTACCCTGAAAAGGGAGAGAAAAAGGTCGAGGTTTATGAATTGGGTATTGATATTTGGAGAGAATTGGATCATGTTGATCAACAGTTGCCCAAGTTATTCTGGTTGACTTCTTCGATATTTTATAAGGAAGCTTACCATTGGATTACATCTTCAAGAGAATTTAAATCAATAATTCTTTGTTTTGATATGAGCACCGAAATATTTCGCAATATGGAACCCCCTAATACTTGTGAATTTTCAAGTGGAACACTTCATAGCCTCCTCATCTTGACTGAGTCTCTATGCTTGACTTGTTACCCCTGTCTAGGGCCCATGATTGATCCAGCAAACATTTTGATGGAAATTTGGATAATGAAAGATTATAATGTTTATGAATCTTGGATTAAGAAATACACAATTAGAGGTCTTCCTACTGAATCTCCGTTAGCAATATGGAAGGACTGTTTATTGTTTTTCCAAAGCAAAAGTGGATATTTGATGTTGTATGATCTTAACTCCGATGAAATCAAGGAATTGAATTTTCATGGTTGTCTGAAAAGTATGCGAGTTATAATTTACAAAGGAAGCATGACTCCGATTCCAAAAGGAGGCCAAAGTAGTACACAAGTTCAAAACTTTTAG
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种与控制枸杞自交亲和性S位点相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括Lba02g00861、Lba02g00868、Lba02g01091、Lba02g01064、Lba02g01100、Lba02g01102、Lba02g01105；
所述Lba02g00861的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Lba02g00868的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Lba02g01091的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Lba02g01064的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述Lba02g01100的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述Lba02g01102的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述Lba02g01105的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述Lba02g00868、Lba02g01102在枸杞雌蕊中特异表达；所述Lba02g00861、Lba02g01064、Lba02g01091、Lba02g01100、Lba02g01105在枸杞雄蕊中特异表达。
3.一种权利要求1或2所述分子标记的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将自交亲和亲本和自交不亲和亲本杂交，得到F1代，对F1代进行自交亲和相关表型分析；
(2)根据自交亲和相关表型分析结果，将F1代DNA分为自交亲和混池和自交不亲和混池，并进行ED关联分析和SNP-Index关联分析，得到候选关联区间；
(3)统计候选关联区间内基因在枸杞不同器官中的表达差异情况，得到在枸杞雌、雄蕊中特异表达的基因，所述基因为所述分子标记。
4.根据权利要求3所述的获得方法，其特征在于，所述自交亲和相关表型分析包括坐果率、平均单果重、自交亲和指数、相对自交亲和指数。
5.根据权利要求4所述的获得方法，其特征在于，所述自交亲和混池中包含相对自交亲和指数排名前30位的F1代；所述自交不亲和混池包含相对自交亲和指数排名后30位的F1代。
6.根据权利要求5所述的获得方法，其特征在于，所述器官包括雌蕊、雄蕊、茎尖、老叶、新叶、青果、成熟果。
7.一种权利要求1或2所述的分子标记或权利要求3～6任一项所述获得方法获得的分子标记在枸杞自交亲和性检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410068137.4A CN117867161A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 一种与控制枸杞自交亲和性s位点相关的分子标记及其获得方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410068137.4A CN117867161A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 一种与控制枸杞自交亲和性s位点相关的分子标记及其获得方法和应用 |
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| CN117867161A true CN117867161A (zh) | 2024-04-12 |
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|---|---|---|---|
| CN202410068137.4A Pending CN117867161A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 一种与控制枸杞自交亲和性s位点相关的分子标记及其获得方法和应用 |
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-
2024
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