CN117866894A - 一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法，包括如下步骤：(1)将c‑Myc导入成纤维细胞；(2)iPSC培养基中培养7天，收集新生的悬浮细胞，即得P0MCC；(3)将P0MCC或者是经过扩增培养的MCC在巨噬细胞分化培养基中培养7天，获得巨噬细胞。本发明建立了一种全新的产生巨噬细胞的方法，本发明方法时间短效率高，且转化来的巨噬细胞吞噬功能强，具有抗炎(M1型)偏向性，更有利于用于免疫治疗用。

Description

一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及细胞诱导技术领域，更具体地，本发明涉及一种成纤维细胞(MEF细胞)转分化为巨噬细胞的方法。

背景技术

以免疫细胞为基础的治疗方法在治疗具有化学和放射抗性的恶性肿瘤方面显示出潜在的希望。虽然CAR-T细胞治疗已证实对血液系统恶性肿瘤有效，但CAR-T细胞对实体瘤的疗效有限。巨噬细胞在先天免疫系统中起着重要作用。其具有能够吞噬细胞，分泌促炎因子和肿瘤浸润的功能。在基于CAR的细胞治疗中，巨噬细胞作为抗原呈递细胞具有巨大的治疗潜力。然而，巨噬细胞的收集和体外培养是具有挑战性的。

诱导多能干细胞(iPSC-Mac)向巨噬细胞分化的技术建立为临床中应用基于自体免疫细胞的疗法打开了大门。然而，相关技术中报道指出iPSC-Mac的功能是有限的。且iPS巨噬细胞分化耗时长，获得细胞量少，还需要支持细胞的刺激以及单核细胞的分选过程。

谱系转换的方法已经成为iPSC-Mac技术的补充方法。但相关技术中报道的转分化在一定程度上存在着需要多个基因诱导，其分化的巨噬细胞功能不全，或者没有M1的活性偏向的问题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一，为此，本发明实施例提供了一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法。

本发明实施例采用如下技术方案：

本发明实施例提供了一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法，包括：

(1)将c-Myc导入成纤维细胞；

(2)iPSC培养基中培养7天，收集新生的悬浮细胞，即得P0 MCC；

(3)将P0 MCC或者是经过扩增培养的MCC在巨噬细胞分化培养基中培养7天，获得巨噬细胞。

本发明方法简单，仅转一个c-Myc基因，而后用iPSC培养基培养，就可以获得具有植入能力的CD45+血细胞中间体(MCC)。MCC在悬浮培养中保持稳定，可以持续培养3个月以上，并在巨噬细胞分化培养基中培养产生功能性和高纯度诱导的巨噬细胞(iMac)。本发明建立了一种全新的产生巨噬细胞的方法，本发明方法时间短效率高，且转化来的巨噬细胞吞噬功能强，具有抗炎(M1型)偏向性，更有利于免疫治疗应用。

在一些实施例中，将c-Myc导入成纤维细胞的方法，包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质体转染等等，且所述的方法均按照本领域常规的方法进行。

例如，在一些实施例中，将c-Myc导入成纤维细胞的方法采用病毒感染的方式，将含有c-Myc的病毒载体与相应的包装载体转染至包装细胞系，待病毒产生后，收集相应的c-Myc病毒，成纤维细胞再转染c-Myc病毒，其中所述的病毒载体选自慢病毒载体，逆转录病毒载体、腺病毒载体等，例如可以采用逆转录病毒质粒PMX-c-Myc，用PlatE细胞包装病毒；或者含有c-Myc的慢病毒载体，用293T细胞包装病毒，进一步地，还可以通过DOX(多西环素)诱导过表达c-Myc，在一个具体的实例中，多西环素的用量为2μg/ml。

在一些实施例中，所述成纤维细胞为P2代(第二代)成纤维细胞。

在一些实施例中，所述成纤维细胞小鼠胚胎成纤维细胞。

在一些实施例中，所述iPSC培养基为：DMEM+15％FBS(胎牛血清)+1000U/ml LIF(白血病抑制因子)+1％NEAA(非必需氨基酸)+1％谷氨酰胺+1％β-ME(β-巯基乙醇)。

在一些实施例中，步骤(2)、步骤(3)中iPSC培养基每2天更换一次。

在一些实施例中，所述巨噬细胞分化培养基为RPMI1640+20％FBS(胎牛血清)+1％PS(青霉素-链霉素)+100ng/ml M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)。

在一些实施例中，巨噬细胞分化培养基每2天更换一次。

在一些实施例中，所述成纤维细胞为P2代成纤维细胞。

在一些实施例中，所述成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。

在一些实施例中，步骤(2)中获得的P0 MCC可以在iPSC培养基中持续传代培养3个月以上。

本发明实施例方法获得的巨噬细胞具有成熟外周血巨噬细胞的功能，吞噬功能强，极化具有抗炎偏向性，且纯度达到90％以上。

本发明实施例还提供了含c-Myc的生物材料在制备促进成纤维细胞转分化为巨噬细胞的试剂中的用途。

在本发明的实施例中，c-Myc通过调控MafB基因表达诱导成纤维细胞转分化为造血中间体细胞进而分化为巨噬细胞。

在一些实施例中，所述c-Myc为cDNA或mRNA形式。

在一些实施例中，所述含c-Myc的生物材料为含c-Myc的重组质粒、或含c-Myc的重组载体。

本发明实施例还提供了一种将成纤维细胞转分化为巨噬细胞的试剂盒，包括：

(a)含c-Myc的重组质粒或者是含c-Myc的重组载体；

(b)iPSC培养基：DMEM+15％FBS+1000U/ml LIF+1％NEAA+1％谷氨酰胺+1％β-巯基乙醇；

(c)巨噬细胞分化培养基：RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSF。

本发明实施例还提供了上述试剂盒的应用，所述应用是以成纤维细胞为初始细胞制备巨噬细胞。

本发明实施例还提供了由上述方法制备的MCC在制备治疗肿瘤的产品中的应用，由c-Myc诱导转分化而来，具有造血干细胞以及分化各阶段的造血干祖细胞以及分化的各种血细胞的混合体。

本发明的优点和有益效果为：

(1)本发明建立了一种全新的产生巨噬细胞的方法，本发明方法时间短、效率高，且转化来的巨噬细胞吞噬功能强，具有抗炎(M1)偏向性。更有利于免疫治疗。

(2)本发明方法缩短了巨噬细胞分化时间，与需要小分子抑制剂和多种生长因子的iPSC-Mac技术相比，本发明方法更加简单，只需要iPSC培养基。且iPSC-Mac技术通常花费20-30天，但本发明iMac可以在两周内生成。最早1周就可以产生MCC和部分单核巨噬细胞，之后用巨噬细胞培养7天，会得到90％以上纯度的巨噬细胞。MCC可以持续培养3个月，在这期间任何时间都可以改为巨噬细胞分化培养基培养得到纯化的巨噬细胞。

(3)本发明方法，促进了巨噬细胞的产量，且不需要滋养层细胞，也不需要单核细胞分选，巨噬细胞的纯度在90％以上。

(4)本发明c-Myc转分化来的巨噬细胞体外免疫吞噬能力和和外周血巨噬细胞相当。并且偏极化为M1。

附图说明

图1是c-Myc诱导MEF转分化为MCC进而可以分化为巨噬细胞的相关图。

A：利用C-Myc将成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方案示意图以及成纤维细胞(MEF/c-Myc)，P0骨髓细胞复合物(MCC)，P1 MCC和诱导巨噬细胞(iMac)的代表性明场图像。MEF来源于CD45.1的B6小鼠胚胎。

B：流式细胞术分析MEF和P1 MCC中CD45+细胞的百分比。

C：不同iPSC因子对MEF对诱导后产生的CD45+细胞比例的影响。

D：不同培养基对MEF诱导CD45+细胞比例的影响。MEF-M:MEF培养基；EC-M，红细胞扩增培养基；GC-M:粒细胞培养基；iPSC-M，iPSC培养基。

E：利用CD11b和F4/80的抗体对MCC和iMac的流式细胞术分析。

F：MCC和iMac中CD11b+F4/80+巨噬细胞的占比。

G：流式细胞术分析MCC中LKS(lin-c-kit+sca-1⁺)和MP(lin-c-kit+sca-1^-)细胞百分比。

H：MCC中LKS，B220⁺，CD3⁺和CD11b⁺细胞的百分比。

I：MCC中B220⁺，CD3⁺和CD11b⁺细胞的Wright-Giemsa染色的代表性图像。

J：骨髓和MCC CFU-G、CFU-M、CFU-GM、CFU-GEMM和CFU-E形成的比较。在MCC和小鼠骨髓来源的祖细胞中进行CFU造血集落形成。CFU：群体形成单位。CFU-G：CFU-粒细胞。CFU-GM：CFU-粒细胞巨噬细胞。CFU-M：CFU-巨噬细胞。CFU-GEMM，CFU-混合细胞。CFU-E：CFU-红细胞。

K：体外分化克隆的代表性图像显示CFU-GMM，CFU-GM，CFU-E和CFU-G/CFU-M的形成。

L：评价MCC体内植入能力的检测示意图。用8Gy照射预处理具有B6(CD45.2)小鼠，然后将GFP标记的MCC移植到小鼠中。三个月后，进行了第二次移植，以进一步研究MCC的潜力和安全性。N＝5。

M：首次移植GFP标记的MCC后不同时间点受体动物外周血(PB)重建的定量。

N：在第一次移植后3个月定量测定受体小鼠不同组织中的重建。

O：第一次和第二次移植后1个月PB重建的比较。

P：第二移植受体小鼠骨髓中MCC的谱系重建。

数据是三个独立实验的代表，具有相似的结果。所有数据代表平均值±SEM。通过双尾t检验或单因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图2是MCC在iPSC培养基培养3个月的增殖曲线。

图3是c-Myc上调MafB并促进成纤维细胞向巨噬细胞的转化

A.来自MCC总细胞的t-SNE图，每个细胞按细胞簇和细胞类型进行颜色编码。

B.六个中间体簇的细胞比例和炎性细胞因子途径激活率。

C伪时间分析显示了两个发展方向。

D.炎症细胞因子途径基因在MCC不同细胞亚群中表达热图。

E由SCENIC衍生的TF调节网络图，调节子为x轴，它们的标准化特异性评分为y轴。F.MafB和c-Maf基因表达水平的t-SNE图。

G.使用IGV(Integrative Genomics Viewer)软件分析MEF细胞数据库(GSE90893)和巨噬细胞数据库(GSE84520)中MafB基因上c-Myc的ChIP-Seq峰。

H.ChIP-qPCR检测C-Myc在MEF和MCC细胞中MafB启动子结合的量。

I.荧光素基因报告酶实验检测C-Myc过表达激活野生型MafB的表达。利用c-Myc在MafB启动子上结合位点突变：Site 1突变(Mut1)，Site 2突变(Mut2)对启动子激活的作用。J.MafB启动子的WT的以及与c-Myc结合位点的两个突变基序。

K.蛋白杂交检测c-Myc诱导MEF转化为MCC过程中诱导敲降MafB后MafB的敲降效果。

L.流式细胞检测在培养第12天用或不用Dox处理的MCC中CD45⁺/B220⁺，CD45⁺/CD3⁺，CD45⁺/CD11b⁺细胞的比例。

M.L中三系细胞定量图。***P<0.001。

图4是MCC向巨噬细胞分化后偏向促炎表型

A:T-SNE图显示MCC中巨噬细胞子集的四个子簇(C0-C4)。

B四个亚群的相对百分比和NF-κB途径的激活率。

C.在MCC中不同巨噬细胞簇中NF-κB途径基因的热图。

D.在MCC中不同巨噬细胞簇中促炎症基因热图和促炎症评分。

E.在MCC中不同巨噬细胞簇中抗炎基因热图和不同组别的抗炎评分。

F.QRT-PCR检测MEF和iMac.中Cxcl10、Fpr2、Lrf1 mRNA表达。

G.蛋白杂交检测有或没有LPS处理的MEF和iMac中磷酸化IKKα/β(p-IKKα/β)，IKKα和IKKβ的蛋白表达情况。

H.巨噬细胞吞噬肿瘤细胞免疫荧光的代表性图像。MEF(用红色荧光-DID抗体标记)或iMac(红色荧光-CD68标记)，肿瘤细胞用绿色荧光标记Reh和Raji。共染的是吞噬肿瘤细胞的免疫细胞。

I.流式细胞检测MEF或iMac对Reh和Raji的吞噬作用。

J.I中流式细胞的定量。**P<0.01，***P<0.001。

图5是MEF转分化来的巨噬细胞具有体内外的免疫吞噬作用的相关图。

A：iMac在Reh细胞移植异种白血病小鼠模型体内疗效的治疗方案。用2Gy照射预处理SCID小鼠，然后用2×10⁵Reh-GFP细胞尾静脉注射造模，治疗用尾静脉注射MCC(PBS作为对照)。

B-C：iMac处理后第28天小鼠骨髓(B)和脾脏(C)中白血病细胞百分比。

D：流式检测骨髓(BM)和脾脏中CD11b⁺细胞的百分比。小鼠每组N＝5。用于评估iMac在4T1乳腺癌异种移植物中的体内疗效。

E：实体瘤小鼠模型治疗方案：BALB/c小鼠通过尾静脉注射2×10⁵荧光素酶标记的4T1细胞，并在第5天用1×10⁶MCC或PBS处理小鼠。观测治疗效果N＝5。

F：第16天4T1肿瘤动物生物发光(BLI)的代表性小鼠整体成像图像。

G：Kaplan-Meier生存曲线中BLI活性的定量统计图。

H：小鼠的生存曲线(P＝0.0178)。中位生存期:对照(17.5天)和iMac(19.0天)。

I：有或没有iMac治疗的肺明场(上图)和H&E染色切片(下图)的代表性图像。比例尺100微米

J-L：肺切片中Ki-67和CD68的代表性IHC染色中肺转移(J)和肺(K)和脾(L)重量的定量。

M-O：Ki67(N)和CD68(O)阳性细胞的定量分析以及代表性免疫组化图片(M)。

P：c-Myc诱导成纤维细胞向巨噬细胞转化的模示图。

以上所有统计数据代表平均值±SEM。通过双尾t检验或单因素方差分析，*P<0.05，**P

<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本文中，词语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。

以下为术语说明，且除非另外定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域的熟练技术人员通常理解的含义。且除非另外指明，本发明的实践使用的分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域的技术范围。

术语“转分化”(有时也称为“谱系重编程”)是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为其他类型细胞的现象，且这一转变不经过多能干细胞的中间过程。在本发明中，“转分化”指将成纤维细胞转变为MCC以及巨噬细胞的过程。在本发明的一个实例中，所述成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。

术语“转染”是指在将分子诸如核酸(质粒)引入宿主细胞中。当外源核酸已被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。“转染”细胞可繁殖并且引入的核酸被转录和/或蛋白被表达。

本发明实施例采用逆转录病毒质粒PMX-c-Myc，用PlatE细胞包病毒。或者慢病毒载体过表达c-Myc或者DOX诱导的过表达c-Myc，利用293T细胞包病毒。P2代MEF细胞转染c-Myc病毒24小时，换成小鼠iPSC培养基培养7天，可产生悬浮细胞MCC。流式鉴定其中有1％左右的KLS细胞，c-Kit，Scar-1单阳或者与CD11b+共阳的各级造血干祖细胞，以及分化的三系细胞都存在的血细胞混合体，体外CFC分化各种克隆类型都存在，小鼠一次和二次移植均有植入，其在外周血，骨髓，脾脏，肝脏，淋巴中都有分布。可以继续iPSC培养基传代培养(3个月以上)(见图2)，细胞呈现为CD45阳性，三系细胞都有一定比例，也可以随时换成巨噬细胞分化培养基后，7天后巨噬细胞能达到90％。体外对肿瘤细胞具有吞噬能力，并且偏向M1极化，体内具有延长白血病和实体瘤荷瘤小鼠的存活期，对肿瘤细胞具有吞噬作用。iMac移植可以显著抑制肿瘤移植动物模型中白血病和乳腺癌进展。

以下为本发明具体实施例，需要进一步说明的是，下述对比例的方案并非现有技术，仅是为了与实施例的方案进行对比而设置，不作为对本发明的限制。

本发明实施例以及对比例中，

MEF-M(MEF培养基)：DMEM+10％FBS+1％PS。

EC-M(红细胞扩增培养基)：IMDM(50％)+Ham’s F12(50％)+ITS-X(100×)+化学定义的脂质浓缩物(CD)(100×)+L-谷氨酰胺(100×)+抗坏血酸(0.05mg/ml)+BSA(5mg/ml)+1-硫代甘油(200μM)+SCF(100ng/ml)+IL-3(10ng/ml)+促红细胞生成素(2U/ml)+IGF-1(40ng/ml)+地塞米松(1μM)+全息转铁蛋白(100μg/ml)。

GC-M(粒细胞培养基)：IMDM(50％)+Ham’s F12(50％)+ITS-X(100×)+化学定义的脂质浓缩物(简称CD)(100×)+L-谷氨酰胺(100×)+抗坏血酸(0.05mg/ml)+BSA(5mg/ml),1-硫代甘油(200μM)+血小板生成素(100ng/ml)+SCF(100ng/ml)+Flt3配体(100ng/ml)+粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(100ng/ml)+IL-3(10ng/ml)。

iPSC-M(iPSC培养基)：Knock-Out DMEM+FBS(15％)+LIF(1,000U/ml)+1％非必须氨基酸+1％谷氨酰胺+1％β-巯基乙醇。

巨噬细胞分化培养基：RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSFMethocultH4434经典培养基：干细胞技术公司的试剂，货号是Cat#04434。

MEF细胞的建立：

取13.5天孕鼠，CO₂处死，无菌取胎儿，去头和内脏，剪碎，胰酶消化为单细胞，接种到培养皿中，用DMEM+10％FBS(100X的双抗)放入温度为37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中培养。当细胞达到70％-80％密度时胰酶消化传代。P0-P2代冻存母细胞。

病毒产生：

小鼠Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的cDNA的逆转录病毒载体pMXs购自Addgene公司，用pMXs-c-myc(Addgene#13375)、pMXs-oct4(Addgene#13366)、pMXs-klf4(Addgene#

13370)、pMXs-sox2(Addgene#13367)，转染到病毒包装细胞(PlatE，细胞已经表达逆转录病毒的包装质粒)，转染后48，72小时收集病毒。

或者用脂质体转染试剂将载有c-Myc的cDNA的慢病毒载体与包装质粒pMD2.G(Addgene#12259)和psPAX2(Addgene#12260)共转到HEK 293T细胞，进行病毒包装，收集48，72小时病毒。

实施例1：

产生CD45⁺血细胞中间体(MCC)：

P2代MEF解冻后至6孔板，贴壁后加入含c-Myc病毒进行转染，在补充有8μg/ml聚乙烯的培养基(MEF培养液：DMEM+10％FBS)中温育，24小时后，换为iPSC培养基培养。培养基每2天更换一次，7天开始收集新生的悬浮细胞(MCC)。

P0 MCC可以在iPSC培养基中继续培养3天，获得P1 MCC，MCC可以在iPSC培养基持续传代培养3个月以上。

巨噬细胞分化：

用RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSF培养液培养MCC。直到7天后90％细胞为巨噬细胞(CD11b⁺/F4/80⁺)。

转分化的MCC具有体外克隆形成能力：

MCC细胞通过100μM细胞过滤器后使用Methocult H4434经典培养基(StemCellTechnologies)进行CFC培养，使用3000个单个MCC一个空(6-孔板)进行测定。每个样本有三个重复。

转分化的MCC具有体内植入能力：

将1X 10⁶个MCC细胞经尾静脉注入2Gy辐照后的NOD/SCID小鼠内。第一次移植三个月后，采集小鼠外周血、分离不同器官的细胞并用流式细胞术进行分析。第二次移植采用1X10⁷细胞经尾静脉注入2Gy辐照后的NOD/SCID小鼠体内。一个月后，采集小鼠外周血进行流式细胞仪分析，并检测第二次移植小鼠骨髓的谱系重建情况。

巨噬细胞体外具有吞噬肿瘤细胞作用：

用PBS洗涤Raji和Reh细胞系，重悬于1ml CFSE染色溶液中，并在37℃下温育20分钟。为了去除残留在溶液中的游离染料，将5ml完全培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)加入到细胞中并温育5分钟。细胞被分离并重新悬浮于完全培养基中。用DiD染料对MEF进行预染色，然后将HLC和MEF以1:4的比例与肿瘤细胞在37℃共孵育2小时。流式细胞术采集MCC组细胞并用CD11b抗体染色，吞噬百分比为CD11b⁺群体中CFSE阳性细胞的比例。MEF组收获细胞，吞噬百分比为Did⁺细胞中CFSE阳性细胞的比例。

分化来的巨噬细胞具有体内肿瘤杀伤作用：

辐照NOD-SCID小鼠后尾静脉REH细胞造白血病模型：2Gy辐照NOD-SCID小鼠，24小时后尾静脉注射2×10⁵的Reh-GFP细胞构建白血病模型，3天后尾静脉注射不同剂量的分化来的MCC，28天后检测小鼠骨髓，脾脏中肿瘤细胞以及巨噬细胞的比例。

实体瘤模型采用4T1细胞尾静脉注射造模，BALB/c小鼠通过尾静脉注射2×10⁵荧光素酶标记的4T1细胞，并在第5天用1×10⁶MCC或PBS处理小鼠。用小鼠整体成像技术检测小鼠中肿瘤细胞的量，以及小鼠的生存曲线，免疫组化分析肺内的肿瘤细胞的量。

对比例1：

与实施例1不同的是，转染含klf4病毒。

对比例2：

与实施例1不同的是，转染含Sox2病毒。

对比例3：

与实施例1不同的是，转染含Oct4病毒。

对比例4：

与实施例1不同的是，用MEF-M(MEF培养基)替换iPSC培养基。

对比例5：

与实施例1不同的是，用EC-M(红细胞扩增培养基)替换iPSC培养基。

对比例6：

与实施例1不同的是，用GC-M(粒细胞培养基)替换iPSC培养基。

本申请研究了iPSC因子的过表达是否可以直接将MEF重编程为巨噬细胞。见图1，利用C-Myc将成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方案如图1中A所示。本发明将MEF细胞过表达c-Myc、Klf4、Sox2或Oct4等因子，并在iPSC培养基中培养，发现利用c-Myc单因子过表达，可以诱导MEF在7天内产生悬浮细胞。由于这些细胞通过流式细胞术鉴定为CD45+，并且有造血干细胞以及分化的干祖细胞和3系分化细胞，因此将其命名为髓细胞复合体(MCC)(图1中B)。与c-Myc相比，单独Oct4、Sox2或Klf4的过表达几乎没有诱导CD45+细胞产生(图1中C)。与MEF培养基(MEF-M)、红细胞扩增培养基(EC-M)和粒细胞培养基(GC-M)相比，iPSC培养基最有效地诱导成纤维细胞转化为CD45+细胞(图1中D)。收集P0-MCC细胞，传代再培养3天，得到子代1(P1)细胞，然后将P1-MCC细胞在巨噬细胞分化培养基中培养7天以促进MCC分化为高纯巨噬细胞(图1中A)。与MCC细胞相比，约92％的诱导巨噬细胞(iMac)呈现巨噬细胞标志物CD11b和F4/80均呈双阳性(图1中E和F)。以上数据表明，只有c-Myc的过表达才能诱导成纤维细胞转化为高纯度巨噬细胞。

本申请通过流式细胞术分析了MCC细胞的成分，发现其中有1％左右的KLS的造血干细胞，其富含造血祖细胞样细胞(HPCs)；30％骨髓祖细胞(Lin-c-kit⁺Sca-1^-)细胞(图1中G)。MCC细胞染色也表明存在不同的造血细胞类型，例如B细胞(B220⁺)，T细胞(CD3⁺)和骨髓细胞(CD11b⁺)的三系分化的谱系图1中H，I)。说明CD45⁺MCC可能具有多种血细胞类型的功能性造血潜能。我们进一步进行了克隆形成测定，显示与小鼠骨髓(BM)衍生的祖细胞类似(图1中J，K)，CD45⁺MCC细胞可以产生所有类型的细胞群落，包括CFU-粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)，CFU-粒细胞(CFU-G)和CFU-巨噬细胞(CFU-M)等，表明MCC具有多谱系的发育潜力。其中CFU-GM和CFU-M的数量显著高于BM来源的(图1中J)。说明其粒单核细胞分化能力强。

为了进一步评估MCC细胞的能力，本申请将MCC混合细胞经尾静脉注入经辐照后的NOD/SCID小鼠内(图1中L)，发现第一次移植每月检测，可见有植入的MCC细胞，1-3月骨髓植入率从2％-5％，从移植后3个月到5个月维持在5％左右(图1中M)，在骨髓，脾脏，肝脏以及淋巴等不同脏器的植入率相近，在2％左右(图1中N)。比较第一次和第二次移植后1个月的外周血重建率，第二次移植略有下降(图1中O)，分析第二次移植后骨髓的三系重建率，CD11b⁺的粒单核细胞最多，在50％左右(图1中P)。

体外MCC可以在iPSC培养基中连续培养3个月(图2)。

为了研究c-Myc诱导成纤维细胞向巨噬细胞转化的机制，我们对MCC细胞进行了单细胞RNA测序。共检测到4591个MCC细胞。总细胞群的t-SNE分析鉴定出了6个亚群(C0-C5，图3中A)，包括原始红细胞(C0)，巨噬细胞(C1)，白细胞(C2)，单核干祖细胞(C3)，谱系定向祖细胞(C4)和MEF(C5)。除了原始红细胞和白细胞亚群，巨噬细胞(C1)占很大比例(图3中B)。与MEF不同，巨噬细胞亚群的“炎性细胞因子途径”的基因显著上调富集(图3中B、D)。我们对六个亚群进行了轨迹分析，发现巨噬细胞和单核干祖细胞亚群聚集在一个方向分支中，而原始红细胞和白细胞聚集在另一个方向分支中(图3中C)。通过基因表达调控评估，发现MafB在转化中起重要作用(图3中E)。巨噬细胞表达高水平的MafB，而原始红细胞和单核干祖细胞表达c-Maf(图3中F)。我们下载了MEF(GSE90893)和巨噬细胞(GSE84520)中c-Myc的ChIP-Seq数据，发现c-Myc存在于巨噬细胞中的MafB启动子中，但不存在于MEF中(图3中G)。我们进行了ChIP-qPCR分析，并在MCC细胞中验证了这一点(图3中H)。我们进一步分析了MafB启动子的荧光素酶活性。在突变c-Myc的结合位点后，MafB启动子的萤光素酶活性被抑制(图3中I，图3中J)。这些数据表明，c-Myc可能上调MafB在成纤维细胞转化为巨噬细胞。

为了评估MafB在c-Myc重编程成纤维细胞进入巨噬细胞中的功能，用诱导型shRNA(tetO-shMafB)在MEF/c-Myc中敲低MafB。MafB在MCC中的表达随着诱导天数的增加而增加(图3中K)，并且与对照相比，敲低MafB后CD45⁺CD11b⁺细胞的比例降低，而不是CD45⁺CD3⁺和CD45⁺CD11b⁺细胞(图3中L、M)。这些结果表明c-Myc在成纤维细胞向巨噬细胞的转化中上调MafB。

我们根据基因特征(图4中A)将MCC中的巨噬细胞进一步分层为四个亚群(C0-C3)，而C0和C1亚群占绝大多数(图4中B)。NF-κB通路被激活，在C1亚群中NF-κB通路相关基因的表达上调(图4中B、C)。我们分析了4个簇中的单细胞数据，发现M1巨噬细胞相关基因在C1亚群中高度表达，这与促炎症状态更为相似(图4中D)。C3亚群表达Tgfb1，Vegfb和Arg1，接近抗炎状态(图4中E)。

通过qRT-PCR分析验证了iMac中Cxcl10，Fpr2和Lrf1的高表达水平(图4中F)。进而我们研究了iMac是否在体外功能，我们用LPS处理MEF和iMac，与MEF相比，iMac中IKKα/β(p-IKKα/β)的磷酸化显着增加(图4中G)，表明iMac中NF-κB信号传导的激活。我们进一步通过流式细胞术检测了iMac的吞噬功能，并验证了iMac能够吞噬荧光珠和肿瘤细胞(图4中H、I、J)。这些结果表明，iMac是一个具有促炎症表型的功能巨噬细胞。

为了评估iMac在肿瘤治疗中的作用，本发明实施例验证了iMac在Reh细胞移植白血病小鼠模型的体内疗效，利用尾静脉注射的方法进行Reh白血病模型建立，之后通过尾静脉注射MCC检测其治疗效果(图5中A)，骨髓细胞流式结果发现随着注射MCC细胞增多，白血病细胞有所下降(图5中B)，在脾脏中发现利用不同数量MCC治疗后，白血病细胞含量变化不大，但显著低于不治疗组(图5中C)。在骨髓和脾脏中不同剂量MCC治疗后，CD11b细胞含量有一定差异，在脾脏中含量稍高于骨髓中含量(图5中D)。

为了进一步证明iMac的抗肿瘤疗效，本发明实施例建立了4T1乳腺癌转移模型(图5中E)，用于评估iMac在4T1乳腺癌异种移植物中的体内疗效，在4T1肿瘤模型中发现MCC治疗后，总体的肿瘤细胞含量显著下降(图5中F、G)，小鼠的存活时间延长(图5中H)，转移到肺脏的肿瘤细胞显著减少(图5中I)：肺结节数，肺重量在MCC治疗后显著减少，脾脏肿瘤显著增加(图5中I、J-L)。肿瘤组织的ki67阳性率治疗后显著下降，CD68⁺巨噬细胞含量升高(图5中M-O)。说明MEF诱导的iMac细胞具有体内吞噬肿瘤细胞的能力。

在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将c-Myc导入成纤维细胞；

(2)iPSC培养基中培养7天，收集新生的悬浮细胞，即得P0 MCC；

(3)将P0 MCC或者是经过扩增培养的MCC在巨噬细胞分化培养基中培养7天，获得巨噬细胞。

2.根据权利要求1所述一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，

所述iPSC培养基为：DMEM+15％FBS+1000U/ml LIF+1％NEAA+1％谷氨酰胺+1％β-巯基乙醇。

和/或，所述巨噬细胞分化培养基为RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSF；

进一步地，步骤(2)、步骤(3)中iPSC培养基每2天更换一次；

巨噬细胞分化培养基每2天更换一次。

3.根据权利要求1所述一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，

所述成纤维细胞为P2代成纤维细胞；

进一步地，所述成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。

4.根据权利要求1所述一种成纤维细胞转分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，所述巨噬细胞具有成熟外周血巨噬细胞的功能，吞噬功能强，极化具有抗炎偏向性，且纯度达到90％以上。

5.含c-Myc的生物材料在制备促进成纤维细胞转分化为巨噬细胞的试剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述c-Myc通过调控MafB基因表达诱导成纤维细胞转分化为造血中间体细胞进而分化为巨噬细胞。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，

所述c-Myc为cDNA或mRNA形式；

和/或，所述含c-Myc的生物材料为含c-Myc的重组质粒、或含c-Myc的重组载体。

8.一种将成纤维细胞转分化为巨噬细胞的试剂盒，其特征在于，包括：

(a)含c-Myc的重组质粒或者是含c-Myc的重组载体；

(b)iPSC培养基：DMEM+15％FBS+1000U/ml LIF+1％NEAA+1％谷氨酰胺+1％β-巯基乙醇；

(c)巨噬细胞分化培养基：RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSF。

9.权利要求8所述试剂盒的应用，其特征在于，所述应用是以成纤维细胞为初始细胞制备巨噬细胞。

10.MCC在制备治疗肿瘤的产品中的应用，其特征在于，所述MCC为权利要求1-4中任一项方法制备得到的MCC，所述MCC具有造血干细胞以及分化各阶段的造血干祖细胞以及分化的各种血细胞的混合体。