CN117866108A - 用于小分子化合物、靶蛋白检测的多功能蛋白分子开关 - Google Patents

用于小分子化合物、靶蛋白检测的多功能蛋白分子开关 Download PDF

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李海英
胡接力
聂神有
张佳唯
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Abstract

本发明公开了用于小分子化合物、靶向蛋白检测的多功能蛋白分子开关，所述分子开关为融合蛋白，选自NanoSwitch‑Lys、NanoSwitch‑Lys‑11、NanoSwitch‑Lys‑I、NanoSwitch‑Lys‑Q中的任一个；NanoSwitch‑Lys包括依次连接的SmBiT、第一接头、6×赖氨酸短肽、第二接头、LgBiT、第三接头、6×赖氨酸短肽、第四接头、6×His标签。本发明的蛋白分子开关平台可在不更改基础蛋白分子开关模块的前提下，仅需简单的小分子化合物修饰与标记反应，避免检测大分子蛋白时须构建获得特异性结合肽的问题，可广泛应用于不同小分子化合物及其靶蛋白检测。

Description

用于小分子化合物、靶蛋白检测的多功能蛋白分子开关
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于小分子化合物、靶蛋白检测的多功能蛋白分子开关。
背景技术
蛋白分子开关是一种基于变构调节酶为设计基础的可用于检测各种目标生物分子的以荧光信号输出的生物传感器。其原理是利用经过特别设计的蛋白分子，在结合目标分子前后的不同构象和功能状态，来“感知”和反映目标分子的存在，从而达到检测目的。蛋白分子开关在疾病诊断、生物医学基础研究方面有广泛用途。2020年度科学突破奖得主David Baker等设计构建了一种人工合成的蛋白分子开关LOCKR(Nature,2019)，将该系统用于新冠病毒抗体及抗原检测(Nature,2020)。
变构调节酶常被用来作为分子开关的设计基础，用于检测各种蛋白分子，包括针对病毒产生的抗体等。这里的变构调节酶，是指那些酶活性会因为某些构象变化而发生改变的酶。当目标分子尚未结合到酶分子时，酶分子处于活性较低(或较高)的状态，当目标分子结合到酶分子以后，改变了酶分子的空间结构，从而使酶活性发生变化(变高或者变低)。此时，酶活性的变化即可反映目标分子的存在及其数量。利用变构调节酶检测目标分子的好处，是目标分子的结合与信号输出发生在同一个分子上，二者的紧密偶联有助于保证检测的高度特异性，因而可以去除反复洗涤和更换缓冲液等诸多步骤，极大简化检测流程。利用相似的原理，荧光蛋白也常用于分子开关设计，只不过此时的输出信号为荧光而非酶活性。
Nanoluc荧光素酶是从一种深海虾类动物中分离到的荧光素酶，经过改造和优化后，具有迄今最强的发光活性(96孔板测量值可达108)，同时发光持续时间长，分子量小，这些特点十分有利于其在生物医学中的应用。此外，Dixon等2015年的研究发现，Nanoluc羧基末端长度为11个氨基酸(AA)的片段，可以与氨基末端的大片段(商品名LgBiT)分离开来。他们将这11AA片段进一步改造和进化，得到两个新的多肽，商品名称分别为SmBiT和HiBiT(Promega)。HiBiT与LgBiT之间具有高亲和力(Kd＝0.7nM)，而SmBiT与LgBiT之间的亲和力很低(Kd＝190μM)，当HiBiT或SmBiT与LgBiT分离时，各部分均没有酶活性，而当HiBiT或SmBiT与LgBiT靠近时，则恢复Nanoluc活性。
重庆医科大学也设计构建了一种基于Nanoluc的新型蛋白分子开关NanoSwitch，将该系统用于HIV抗体和新冠抗体检测(JieLi等，2022，Protein sensors combining bothon-and-off model for antibody homogeneous assay，Biosensors and Bioelectronics209(2022)114226)。
但是，现有蛋白分子开关难以用于抗体以外的生物大分子蛋白检测。
蛋白分子开关应用较好的方面主要是检测小分子，比如利用荧光蛋白、钙调蛋白(CaM)以及钙调蛋白结合肽(CaM-BP)构建的分子开关来检测钙离子。同时，由于抗原抗体结合的特异性，利用特异性抗原表位肽构建的分子开关可用于检测相应抗体类生物大分子蛋白，如前述David Baker等设计构建的人工分子开关(LOCKR)主要用于检测新冠病毒S蛋白、新冠病毒抗体及乙肝病毒抗体。而本课题组前期基于NanoLuc荧光素酶构建并优化的NanoSwitch也是用于检测新冠病毒、HIV和HCV的大分子抗体。对于抗体以外的生物大分子蛋白，由于较难获得与之结合的多肽，因此难以构建相应蛋白分子开关，使得现有的分子开关难以用于抗体以外的生物大分子蛋白检测。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种用于小分子化合物、靶蛋白检测的多功能蛋白分子开关及其制备方法和应用。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
本发明的第一方面提供了一种用于小分子化合物、靶向蛋白检测的多功能蛋白分子开关，所述分子开关为融合蛋白，所述融合蛋白选自NanoSwitch-Lys、NanoSwitch-Lys-11、NanoSwitch-Lys-I、NanoSwitch-Lys-Q中的任一个；
所述NanoSwitch-Lys包括依次连接的SmBiT、第一接头、6×赖氨酸短肽、第二接头、LgBiT、第三接头、6×赖氨酸短肽、第四接头、6×His标签；其中，所述第一接头、第二接头、第三接头、第四接头均为甘氨酸-丝氨酸接头；
所述NanoSwitch-Lys-11是在NanoSwitch-Lys的基础上将位于LgBiT氨基酸序列上第54、79、90、124、137位的共计5个赖氨酸均突变为精氨酸得到的突变体；
所述NanoSwitch-Lys-I是在NanoSwitch-Lys-11的基础上将位于LgBiT氨基酸序列上第125位的赖氨酸突变为异亮氨酸；
所述NanoSwitch-Lys-Q是在NanoSwitch-Lys-11的基础上将位于LgBiT氨基酸序列上第125位的赖氨酸突变为谷氨酰胺。
优选地，所述第一接头为GS，所述第二接头为GGGGSGGGGS，所述第三接头为GS，所述第四接头为SG；
所述融合蛋白NanoSwitch-Lys的氨基酸序列如SEQ ID NO.63所示。
优选地，所述蛋白分子开关是生物素标记的融合蛋白；
优选采用Sμlfo-NHS-LC-Biotin对所述融合蛋白进行生物素标记。
本发明的第二方面提供了一种分离的编码核酸，所述编码核酸编码上述的蛋白分子开关；
优选NanoSwitch-Lys、NanoSwitch-Lys-11、NanoSwitch-Lys-I、NanoSwitch-Lys-Q的编码序列依次如SEQ ID NO.60、64、65、66所示。
本发明的第三方面提供了表达上述蛋白分子开关或上述编码核酸的表达载体。
本发明的第四方面提供了含有或表达上述蛋白分子开关、上述编码核酸、上述表达载体中的一种或多种的宿主细胞。
本发明的第五方面提供了一种上述蛋白分子开关的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)构建权利要求1或2所述蛋白分子开关的核酸序列；
2)构建包含步骤1)的核酸序列的原核表达载体；
3)将步骤2)的原核表达载体用于转染或转化宿主细胞，并使所述核酸序列在宿主细胞中表达，产生融合蛋白；
4)将步骤3)中表达的融合蛋白进行纯化。
本发明的第六方面提供了上述蛋白分子开关在检测小分子化合物和/或其靶向蛋白中的应用。
优选地，所述应用为将小分子化合物偶联到所述蛋白分子开关的赖氨酸残基伯胺上得到标记后的分子开关，然后将标记后的分子开关用于检测所述小分子化合物和/或其靶向蛋白，包括如下应用(1)或(2)：
(1)竞争抑制法检测小分子化合物:待检样本中的小分子化合物和分子开关上标记的化合物竞争结合相应靶向蛋白，当待检体系中无特定小分子化合物存在时，加入的相应靶向蛋白结合到标记于分子开关上的特定小分子化合物时，引起空间位阻和变构效应，导致SmBiT与LgBiT的结合障碍，此时分子开关将处于部分失活状态，加入底物后，光信号降低；当有特定小分子化合物存在时，小分子化合物与相应靶向蛋白结合，SmBiT将能结合到LgBiT的相应位置，分子开关处于全活性状态，信号强度与小分子化合物的量呈正相关；
(2)检测相应靶向蛋白：当无相应靶向蛋白存在时，SmBiT将能结合到LgBiT的相应位置，分子开关处于全活性状态；当有相应靶向蛋白存在，并结合到标记于分子开关上的特定小分子化合物时，引起空间位阻和变构效应，导致SmBiT与LgBiT的结合障碍，此时分子开关将处于部分失活状态，加入底物后，光信号降低，信号变化用来反映相应靶向蛋白的量。
优选地，上述应用技术方案中，所述小分子化合物选自生物素、NVR3-778、PSMA-617、GW572016、AP-26113；所述生物素通过N-羟基硫代琥珀酰亚胺基团修饰化合物，然后将其连接到分子开关的赖氨酸残基伯胺上；
生物素的靶向蛋白为亲和素，
NVR3-778的靶向蛋白为HBc蛋白；
PSMA-61的靶向蛋白为前列腺特异性膜抗原(PSMA)；
GW572016(二对甲苯磺酸拉帕替尼)的靶向蛋白为EGFR((表皮生长因子受体))；
AP-26113(布格替尼，Brigatinib)的靶向蛋白为间变性淋巴瘤激酶(ALK)。
其中，NVR 3-778是一种首创的(first-in-class)、口服有效的HBV CAM(衣壳组装调制剂),属于SBA类,具有抗HBV活性。
NVR3-778、PSMA-617、GW572016、AP-26113也可以通过N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS-)基团修饰，然后然后将其连接到分子开关的赖氨酸残基伯胺上。
本发明的有益效果是：
本发明以课题组前期构建的NanoSwitch为基础，采用新颖的设计思路，构建了基于Nanoluc的NanoSwitch-Lys蛋白分子开关。为了筛选合适的NanoSwitch突变体，我们对其中的6个赖氨酸残基进行了依次突变和组合突变，最终发现一种特定的突变组合(NanoSwitch-Lys-11、NanoSwitch-Lys-I、NanoSwitch-Lys-Q)既能保持NanoSwitch的活性，也能保持其稳定性。以此突变体为基础，我们将生物素偶联到其上，得到NanoSwitch-biotin，并将其用于检测亲和素。检测结果显示，该分子开关具有信噪比高，检测动态范围宽的特点，可以用于特异性检测亲和素和竞争抑制性检测生物素的滴度。本法最低可检测到pg/ml级别样本，特异性检测45min内即可完成检测，竞争抑制检测亦可在1h内完成检测；无需任何洗涤步骤，仅需加样-孵育-检测三步；阳性样本检测信噪比可超过36倍，不同浓度梯度蛋白分子开关可检测生物素和亲和素的不同线性范围。该蛋白分子开关平台可在不更改基础蛋白分子开关模块的前提下，仅需简单的小分子化合物修饰与标记反应，避免检测大分子蛋白时须构建获得特异性结合肽的问题，可广泛应用于不同小分子化合物及其靶蛋白检测。
附图说明
图1显示了用于小分子化合物及其相应靶蛋白分子检测的NanoSwitch分子开关原理。
图2是Sulfo-NHS-LMWC标记蛋白分子中赖氨酸残基(-NH2)示意图。
图3是NanoSwitch-Lys中LgBiT上赖氨酸(Lys，K)突变流程示意图：A.NanoSwitch-Lys中LgBiT上赖氨酸突变为精氨酸(Arg，R)；B.11号突变体NanoSwitch-Lys-11中LgBiT上第125位赖氨酸突变为K和R之外的其他18种氨基酸。
图4显示了LgBiT上赖氨酸突变为其他氨基酸的突变体酶活性影响与信噪比检测结果：A.赖氨酸突变为精氨酸的单点突变体酶活性检测；B.赖氨酸突变为精氨酸的多点合并突变体酶活性检测；C.第125位赖氨酸突变为精氨酸外的其他18种氨基酸的突变体酶活性检测；D.突变前体与筛选突变体生物素化后检测亲和素的平均信号最高信噪比。
图5显示了生物素化NanoSwitch检测Avidin和Biotin结果：A.Bio-NanoSwitch-Lys检测Avidin；B.Bio-NanoSwitch-Lys-11特异性检测Avidin；C.Bio-NanoSwitch-Lys-11竞争抑制检测Biotin；D.Bio-NanoSwitch-Lys-I特异性检测Avidin；E.Bio-NanoSwitch-Lys-Q特异性检测Avidin。
图6是纯化与生物素化NanoSwitch蛋白的考马斯亮蓝染色结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
一、主要试剂来源：
IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside)、硫酸卡那霉素、咪唑、DMSO(二甲基亚砜)：购自Bio Basic Inc.(BBI)公司(英国)；
ATP、DTT、T7 Ligase连接酶、T4多聚核苷酸激酶、10×T4 DNA Ligase buffer(withATP)：购自New England Biolabs(NEB)公司(美国)；
限制性内切酶BsaⅠ、10×buffer Tango、EZ-Link Sμlfo-NHS-LC-BiotinylationKit(生物素化试剂盒)：购自Thermo Fisher Scientific公司(美国)；
胶回收试剂盒：Magen(美基)生物公司(中国)；
PrimeSTAR Premix,2×：TAKARA公司(日本)；
质粒小抽提取试剂盒：OMEGA公司(美国)；
琼脂糖、酵母提取物、蛋白胨、琼脂：晶钻生医股份有限公司(Diamond)；
D-Biotin(D-生物素)：Sigma-Aldrich公司(美国)；
μltra-15 3K离心过滤器、/>μltra-4 3K离心过滤器：MerckMillipore(德国)；
BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)、Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)：碧云天公司(中国)；
Nano-HiBiT Lytic Detection System：Promega公司(美国)；
大肠杆菌(DH5α)、大肠杆菌Rosetta(BL21)：重庆医科大学感染实验室保存；
原核表达质粒Pet28a(+)/NanoSwitch-HCV：重庆医科大学胡接力课题组保存。
二、本发明实施例中所用溶液配制方法：
LB液体培养基：胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 2g，溶于ddH2O,定容至200ml，高温高压灭菌20min。
LB固体培养基：胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 2g，琼脂3g，溶于ddH2O,定容至200ml，高温高压灭菌20min。
硫酸卡那霉素溶液(50mg/ml)：0.5g硫酸卡那霉素固体溶于10ml ddH2O，0.45μM滤膜过滤除菌。
2X PBS(PH＝7.4):NaCl 16g、KCl 0.4g、Na2HPO43.56g、KH2PO40.48g,溶于ddH2O，加浓盐酸调至PH＝7.4，定容至1L，高温高压灭菌。
1.5XPBS(PH＝7.4):NaCl 12g、KCl 0.3g、Na2HPO42.67g、KH2PO40.36g,溶于ddH2O，加浓盐酸调至PH＝7.4，定容至1L，高温高压灭菌。
1X PBS(PH＝7.4):NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.78g、KH2PO40.24g,溶于ddH2O，加浓盐酸调至PH＝7.4，加入1％海藻糖(m/Vol)定容至1L，高温高压灭菌。
20mM磷酸盐(PH＝7.5)：Na2HPO42.39g、NaH2PO40.38g，溶于1L ddH2O。
Binding Buffer(PH＝7.5)：取20mM磷酸盐1L，加入29.25g NaCl，NaCl终浓度0.5M，高温高压灭菌。
Wash Buffer(PH＝7.5)：取400mL Binding Buffer加入1.02g咪唑，咪唑终浓度30mM,加入氢氧化钠调PH＝7.5，定容至500mL,高温高压灭菌。
Elution Buffer(PH＝7.5)：取200mL Binding Buffer加入5.1g咪唑，咪唑终浓度250mM,加入氢氧化钠调PH＝7.5，定容至300mL,高温高压灭菌。
三、本发明实施例中所用扩增引物
本发明实施例中所用扩增引物序列如下表1所示：
表1.本发明实施例中所用引物序列
针对蛋白分子开关难以应用于抗体以外的大分子蛋白检测的问题，我们提出利用靶蛋白分子能与特定小分子化合物相结合的特点，构建一类基于Nanoluc的新型分子开关。这类分子开关的工作原理如图1所示：将6个赖氨酸替换NanoSwitch中的多肽插入到SmBiT和LgBiT之间，同时将另一拷贝的多肽插入到LgBiT的羧基末端(图1)，然后将N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS-)基团修饰的小分子化合物(Sulfo-NHS-LMWC)结合到赖氨酸残基伯胺(-NH2)上(图2)。当无相应靶蛋白存在时，SmBiT与LgBiT可以结合，从而具有酶活性；当相应靶蛋白结合到小分子化合物上以后，由于空间位阻导致开关分子结构改变，使得SmBiT不能很好地与LgBiT结合，从而导致酶活性下降，因而可以反映体系中相应靶蛋白的量。或者，也可以用竞争法来检测体系中特定小分子化合物的浓度。构建上述分子开关要解决的一个问题，是将特定小分子化合物偶联到NanoSwitch。将化合物偶联到蛋白质上，常用的方法是利用N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS-)基团修饰化合物(Sulfo-NHS-LMWC)，然后将其连接到蛋白质的赖氨酸残基伯胺(-NH2)上。虽然我们在NanoSwich的LgBiT序列的C端，以及LgBiT序列和SmBiT序列之间插入富含赖氨酸残基的多肽可供化合物连接，然而，NanoSwitch蛋白的其他位置还存在6个赖氨酸残基，这些赖氨酸残基也具有与Sulfo-NHS-基团反应的潜力，因此需要将这些赖氨酸突变为其他氨基酸。
实施例1
为了检测小分子化合物和其靶向蛋白质，我们设计构建了一种富含赖氨酸残基的NanoSwitch平台——NanoSwitch-Lys。其设计思路和工作原理(图1)如下：(1)将两段6X赖氨酸短肽插入LgBiT和SmBiT之间以及LgBiT的C端；(2)将NHS修饰的小分子化合物标记于赖氨酸残基伯胺上；(3)检测相应靶向蛋白：①当无相应靶向蛋白存在时，SmBiT将能结合到LgBiT的相应位置，NanoSwitch-Lys处于全活性状态；②当有相应靶向蛋白存在，并结合到标记于NanoSwitch-Lys上的特定小分子化合物时，引起空间位阻和变构效应，导致SmBiT与LgBiT的结合障碍，此时NanoSwitch-Lys将处于部分失活状态，表现为加入底物后，光信号降低，因而这种信号变化就可以用来反映相应靶向蛋白的量；(4)竞争抑制法检测小分子化合物:①待检样本中的小分子化合物和NanoSwitch-Lys上标记的化合物竞争结合相应靶蛋白，当待检体系中无特定小分子化合物存在时，加入的相应靶向蛋白结合到标记于NanoSwitch-Lys上的特定小分子化合物时，引起空间位阻和变构效应，导致SmBiT与LgBiT的结合障碍，此时NanoSwitch-Lys将处于部分失活状态，表现为加入底物后，光信号降低；②当有特定小分子化合物存在时，小分子化合物与相应靶蛋白结合，SmBiT将能结合到LgBiT的相应位置，NanoSwitch-Lys处于全活性状态，信号强度与小分子化合物的量呈正相关；(5)将LgBiT中的6个赖氨酸替换为其他氨基酸，筛选出活性和信噪比更高的突变体，优化NanoSwitch-Lys蛋白分子开关。
具体研究过程如下：
1.NanoSwitch-Lys质粒构建、原核表达纯化、生物素标记与检测
1.1NanoSwitch-Lys质粒构建
质粒NanoSwitch-Lys的构建分两步进行，首先构建一个过渡质粒Km,构建过程如下：以质粒NanoSwitch-HCV(Jie Li等，2022，Protein sensors combining both on-and-off model for antibody homogeneous assay，Biosensors and Bioelectronics 209(2022)114226)为模板，引物F_G4S+R_Sm扩增后胶回收得到frag1，PCR反应体系为：无菌无酶水8.8μl、
上游引物F(10μM)0.4μl、下游引物R(10μM)0.4μl、模板(10ng/μl)0.4μl、2×PrimeSTAR(Max)10μl，总体积20μl。反应条件：95℃3min；95℃15s，65℃15s，72℃1min(15s/kb)，10个循环，每个循环减1℃；95℃15s，55℃15s，72℃1min(15s/kb)，25个循环；72℃3min。
将寡核苷酸F K_Sm_oli和R K_Sm_oli退火并做5’磷酸化，取反应产物1μl，用ddH2O 199μl稀释，然后取稀释后的产物(命名为frag2)，反应体系如下：上游引物F(100μM)1μl、下游引物R(100μM)1μl、10×T4连接酶buffer(withATP)1μl、T4 PNK 0.5μl、无菌无酶水6.5μl，总体积10μl。反应条件：37℃30min，95℃5min，95℃15s，然后进入15s/循环的降温循环，每个循环减1℃，70个循环。
将frag1与frag2做Golden gate连接，反应体系：DTT(10mM)1μl、ATP 1μl、10×Tango Buffer 1μl、T7 ligase 0.25μl、BsaⅠ酶0.75μl、磷酸化退火片段frag2 1μl、胶回收扩增片段frag1 20 ng/kb，总体积10μl(无酶水补足)。反应条件：37℃5min，20℃5min，25个循环；80℃20min。
Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定正确的克隆提小抽，得到的质粒命名为Km。
接下来以质粒Km为模板，用引物F_slH+R_Lg作PCR扩增，将胶回收扩增片段命名为frag3；将寡核苷酸F K_Lg_oli和R K_Lg_oli退火并做5’磷酸化，取反应产物1μl，用ddH2O199μl稀释，然后取稀释后的产物(命名为frag4)；将以上得到的2个片段frag3、frag4做Golden gate连接反应；Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒Kmc(表达分子开关NanoSwitch-Lys)。NanoSwitch-Lys的编码序列如下(SEQ ID NO.60)：
注：序列起始3个和末端3个碱基分别为起始密码子和终止密码子，单下划线未加粗部分为SmBiT，小写部分为接头序列，单下划线加粗部分为LgBiT，双下划线未加粗部分为6×His标签。接头序列是由氨基酸G和S组成的多肽，有很多种排列组合形式，可以常规替换。其中无下划线的序列“AAAAAAAAAAAAAAAAAA”是6×赖氨酸短肽的编码序列。
SmBiT的氨基酸序列是(SEQ ID NO.61)：VTGYRLFEEIL。
LgBiT的氨基酸序列是(SEQ ID NO.62)：
VFTLEDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIQRIVRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKVILPYGTLVIDGVTPNMLNYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINS。
NanoSwitch-Lys的氨基酸序列是(SEQ ID NO.63)：
MVTGYRLFEEILGSKKKKKKGGGGSGGGGSVFTLEDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIQRIVRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKVILPYGTLVIDGVTPNMLNYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINSGSKKKKKKSGHHHHHH。
1.2NanoSwitch-Lys原核表达与纯化
1.2.1原核表达蛋白
将表达NanoSwitch-Lys的质粒化转至BL21感受态中，涂布至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃培养16h。取单菌落至3ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，16h。取2ml菌液接种到200ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，培养至OD＝0.6(约2.5h)。加入IPTG至终浓度为1mM，18℃，180rpm，16h。
1.2.2纯化蛋白
将菌液转移至离心管，4℃，4000rpm离心15min。弃上清，加入50ml BindingBuffer重悬，4℃，4000rpm，15min。弃上清，加入80ml Binding Buffer重悬，超声破菌。取破菌液4℃，12000g，20min，收集上清。用Elution Buffer清洗镍柱2次，Binding Buffer清洗2次，取破菌上清过柱，6s-7s/滴。Wash Buffer清洗柱子3次，加入20ml Elution Buffer以7s-8s/滴洗脱目的蛋白。
1.2.3浓缩蛋白
取3KD 15ml超滤管，加入洗脱蛋白，4℃，4000g离心(定角式转子)至剩余2ml液体。加入10ml 2X PBS溶液，4℃，4000g离心至剩余2ml液体。加入10ml 1.5X PBS溶液，4℃，4000g离心至剩余2ml液体。加入10ml 1X PBS(1％海藻糖)溶液，4℃，4000g离心至剩余2ml。吸出超滤管中的浓缩纯化蛋白，Bradford法测浓度，保存于-20℃。
1.3生物素标记NanoSwitch-Lys
1.3.1生物素标记
将Sμlfo-NHS-LC-Biotin(磺基琥珀酰亚胺-6-(生物素)己酸)以10mM的终浓度稀释于无菌无酶水中。取1ml浓缩纯化蛋白NanoSwitch-Lys于1.5ml EP管，加入20倍于NanoSwitch-Lys物质的量的10mM Sμlfo-NHS-LC-Biotin溶液，混匀，4℃，100r摇床，反应2h。取3KD 4ml超滤管，加入标记蛋白混合液，4℃，4000g离心至剩余1ml液体。重复标记3次。取5ml 7KZeba脱盐离心柱放入15ml收集管，从柱顶加入2.5ml无钾PBS，4℃，1000g，2min。重复平衡3次。脱盐柱放入新的15ml收集管，将第3次标记生物素的蛋白混合液加入柱子中心，4℃，1000g，2min。吸出收集管中的生物素化蛋白，记为Bio-NanoSwitch-Lys，Bradford法测浓度，保存于-20℃。
1.3.2生物素标记率检测(HABA法)
根据生物素化试剂盒说明书，以Avidin(亲和素)：10mM HABA(4'-羟基偶氮苯-2-羧酸)：无钾PBS＝1mg：60μl：1.94ml的比例配制适量的HABA/Avidin(H/a)混合液。加入H/a混合液180μl/孔于透明96孔板，酶标仪测A500H/a吸光度。H/a混合液孔中加入20μl待测生物素化蛋白，轻柔振荡混匀并恒定3-5min，酶标仪测定A500H/a/b吸光度。在
https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-labeling-crosslinking/biotinylation/biotin-quantitation-kits/haba-calcμlator.html计算蛋白质的生物素标记率。
1.4生物素化蛋白检测亲和素
取1μl稀释50倍的Bio-NanoSwitch-Lys，将Avidin以无钾PBS溶解，按一定的分子数量比(标记生物素：亲和素)梯度加入相应量的Avidin，无钾PBS补齐总反应体系，37℃孵育1小时后，检测Nanoluc活性。结果显示，与质控组相比，加入Avidin使信号平均降低最高3.5倍(图4D)，随着Avidin的量逐渐增加，Nanoluc活性逐渐降低，提示Bio-NanoSwitch-Lys的信号变化与Avidin的量具有相关性，且当Avidin浓度为19.15ng/ml-7.66μg/ml时，信号与Avidin浓度之间具有较好的线性关系(图5A)。
2.NanoSwitch-Lys的改进
2.1NanoSwitch-Lys单点突变改进
前述测试表明，Bio-NanoSwitch-Lys能反映Avidin的存在，但其信噪比不够高。为了改进该系统，我们将位于LgBiT氨基酸序列上第54、79、90、124、125、137位的共计6个赖氨酸分别突变为精氨酸(图3A)，
2.1.1构建单点突变质粒NanoSwitch-Lys-1(54)，NanoSwitch-Lys-2(79)，NanoSwitch-Lys-3(90)，NanoSwitch-Lys-4(124)，NanoSwitch-Lys-5(125)，NanoSwitch-Lys-6(137)
以质粒NanoSwitch-Lys为模板，分别用引物F_54+R_54，F_79+R_79，F_90+R_90，F_124+R_124，F_125+R_125，F_137+R_137做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag5、frag6、frag7、frag8、frag9、frag10。
将以上得到的5个片段frag5、frag6、frag7、frag8、frag9、frag10分别做Goldengate连接反应。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒NanoSwitch-Lys-1(54)，NanoSwitch-Lys-2(79)，NanoSwitch-Lys-3(90)，NanoSwitch-Lys-4(124)，NanoSwitch-Lys-5(125)，NanoSwitch-Lys-6(137)。
2.1.2突变质粒原核表达与检测
将表达NanoSwitch-Lys-n(n为1(54)、2(79)、3(90)、4(124)、5(125)、6(137)中的一个)的质粒化转至BL21感受态中，涂布至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃培养16h。取单菌落至2ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，3h。加入IPTG至终浓度分别为1mM、0.6mM、0.3mM，37℃，220rpm，3h。取1ml菌液于1.5ml EP管，4℃，12000g离心15min。取其上清液10μl，加入1μlNano底物，室温平衡反应10min后，检测Nanoluc活性。结果显示(图4A)，与质控组(未突变组)相比，不同单点突变体活性平均信号最高降低1.84倍，最高升高1.67倍。提示点突变对酶活性有改善效果。
2.2NanoSwitch-Lys多点合并突变改进
为了尽量减少LgBiT上赖氨酸残基对标记与检测的影响，进一步改进分子开关，在单点突变的基础上合并多点突变，筛选酶活性升高或不受影响的多点合并突变体。
2.2.1构建多点合并突变质粒NanoSwitch-Lys-①，NanoSwitch-Lys-②，NanoSwitch-Lys③，NanoSwitch-Lys-④，NanoSwitch-Lys-⑤，NanoSwitch-Lys-⑥，NanoSwitch-Lys-⑦，NanoSwitch-Lys-⑧，NanoSwitch-Lys-⑨，NanoSwitch-Lys-⑩，NanoSwitch-Lys-11
以质粒NanoSwitch-Lys-3(90)为模板，分别用引物F_54+R_54，F_79+R_79做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag11、frag12。
以质粒NanoSwitch-Lys-4(124)为模板，用引物F_137+R_137做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag13。
将以上得到的3个片段frag11、frag12、frag13分别做Golden gate连接反应。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒NanoSwitch-Lys-①，NanoSwitch-Lys-②，NanoSwitch-Lys-⑩。
以质粒NanoSwitch-Lys-①为模板，用引物F_79+R_79做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag14。
以质粒NanoSwitch-Lys-⑩为模板，用引物F_125+R_125.4做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag15。
将以上得到的2个片段frag14、frag15分别做Golden gate连接反应。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒NanoSwitch-Lys-③，NanoSwitch-Lys-⑨。
以质粒NanoSwitch-Lys-③为模板，用引物F_124+R_124做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag16。
以质粒NanoSwitch-Lys-⑨为模板，用引物F_90+R_90做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag17。
将以上得到的2个片段frag16、frag17分别做Golden gate连接反应。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒NanoSwitch-Lys-④，NanoSwitch-Lys-⑧。
以质粒NanoSwitch-Lys-④为模板，分别用引物F_125+R_125.4，F_137+R_137做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag18、frag19。
以质粒NanoSwitch-Lys-⑧为模板，用引物F_79+R_79做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag20。
将以上得到的2个片段frag18、frag19、frag20分别做Golden gate连接反应。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒NanoSwitch-Lys-⑤，NanoSwitch-Lys-11，NanoSwitch-Lys-⑦。
以质粒NanoSwitch-Lys-③为模板，用引物F_2767+R_90做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag21。
以质粒NanoSwitch-Lys-⑨为模板，用引物F_90+R_2767做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag22。
将以上得到的2个片段frag21+frag22做Golden gate连接反应。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒NanoSwitch-Lys-⑥。
综上，NanoSwitch-Lys-①是在NanoSwitch-Lys-3(90)的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第54位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第54、90位的共计2个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-②是在NanoSwitch-Lys-3(90)的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第79位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第79、90位的共计2个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-③是在NanoSwitch-Lys-①的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第79位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第54、79、90位的共计3个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-④是在NanoSwitch-Lys-③的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第124位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第54、79、90、124位的共计4个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-⑤是在NanoSwitch-Lys-④的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第125位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第54、79、90、124、125位的共计5个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-⑥是在NanoSwitch-Lys-③和NanoSwitch-Lys-⑨的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上的全部6个赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第54、79、90、124、125、137位的共计6个赖氨酸全部合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-⑦是在NanoSwitch-Lys-⑧的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第79位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第79、90、124、125、137位的共计5个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-⑧是在NanoSwitch-Lys-⑨的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第90位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第90、124、125、137位的共计4个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-⑨是在NanoSwitch-Lys-⑩的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第125位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第124、125、137位的共计3个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-⑩是在NanoSwitch-Lys-4(124)的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第137位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第124、137位的共计2个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体；
NanoSwitch-Lys-11是在NanoSwitch-Lys-④的基础上，将位于LgBiT氨基酸序列上第137位赖氨酸突变为精氨酸，最终即为第54、79、90、124、137位的共计5个赖氨酸合并突变为精氨酸的突变体。
2.2.2突变质粒原核表达与检测筛选
将表达NanoSwitch-Lys-n(n为①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、11中的一个)的质粒化转至BL21感受态中，涂布至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃培养16h。取单菌落至2ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，3h。加入IPTG至终浓度分别为1mM、0.6mM、0.3mM，37℃，220rpm，3h。取1ml菌液于1.5ml EP管，4℃，12000g离心15min。取其上清液10μl，加入1μlNano底物，室温平衡反应10min后，检测Nanoluc活性。结果显示(图4B)，与质控组(未突变组)相比，含第5位突变点的多点合并突变体活性平均信号最少降低4.88倍；其中，6个点全部突变的合并突变体活性平均信号降低幅度最大，达37.68倍。而6个位点中仅第5位不进行突变的11号突变体(即：NanoSwitch-Lys-11)活性平均信号与未突变体Kmc(即：NanoSwitch-Lys)相当。提示11号突变体在不影响酶活性的前提下，最大限度的减少了LgBiT中赖氨酸残基对小分子化合物标记与靶蛋白检测的影响。
2.3生物素化NanoSwitch-Lys-11检测
将筛选出的11号多点合并突变体NanoSwitch-Lys-11(编码序列如SEQ ID NO.64所示)转化BL21，以1mM终浓度IPTG诱导表达蛋白并纯化、浓缩以及生物素标记蛋白，检测Bio-NanoSwitch-Lys-11浓度与生物素标记率后，进行亲和素检测和生物素竞争抑制检测：
2.3.1Bio-NanoSwitch-Lys-11检测Avidin
分别取10μl稀释1000倍和10000倍的Bio-NanoSwitch-Lys-11，将Avidin以无钾PBS溶解，按一定的分子数量比(标记生物素：亲和素)梯度加入相应量的Avidin，无钾PBS补齐总反应体系，37℃孵育1小时后，检测Nanoluc活性。结果显示，质控组(未加亲和素)与对照组(分别加入最高分子数量梯度比的HBc蛋白：15.75μg/ml和1.58μg/ml)无明显差异；与质控组相比，加入Avidin的实验组信号平均降低最高26.6倍(图4D)，随着Avidin的量逐渐增加，Nanoluc活性逐渐降低。提示HBc蛋白不影响Bio-NanoSwitch-Lys-11的活性，Bio-NanoSwitch-Lys-11的信号变化与Avidin的量具有相关性，且当Avidin浓度分别为24.92-797.3ng/ml和2.49-398.65ng/ml时，稀释1000倍和10000倍的Bio-NanoSwitch-Lys-11信号与Avidin浓度之间具有较好的线性关系，不同浓度的Bio-NanoSwitch-Lys-11可以检测不同线性范围的Avidin(图5B)。
2.3.2Bio-NanoSwitch-Lys-11竞争抑制法检测Biotin
将Avidin以无钾PBS溶解，按标记生物素：亲和素＝1:1的分子数量比加入相应量的Avidin；将Biotin以DMSO溶解为1mM，再用无钾PBS进行倍比稀释，按一定分子数量比(Biotin：Avdin)梯度加入Biotin；无钾PBS补齐总反应体系；Avidin+Biotin体系(A+B)于37℃孵育30min后，加入10μl稀释1000倍的Bio-NanoSwitch-Lys-11；Avidin+Biotin+Bio-NanoSwitch-Lys-11体系(A+B+B-Pro)37℃孵育30min后，检测Nanoluc活性。结果显示(图5C)，与质控组(B-Pro组，未加Avidin和Biotin)相比，对照组(A+B-Pro组，未加Biotin)平均信号最高降低4.73倍；与对照组相比，实验组(A+B+B-Pro)平均信号最高增加4.65倍，随着Biotin的量逐渐增加，Nanoluc活性逐渐升高，提示Bio-NanoSwitch-Lys-11的信号变化与竞争结合Avidin的Biotin的量具有相关性，且当Biotin浓度为13pg/ml-6.39ng/ml时，稀释1000倍的Bio-NanoSwitch-Lys-11信号与Biotin浓度之间具有线性关系，不同浓度的Bio-NanoSwitch-Lys-11可以竞争抑制性检测不同线性范围的Biotin。
3.NanoSwitch-Lys-11的进一步优化
前述测试表明，Bio-NanoSwitch-Lys-11能反映Avidin的存在，且其信噪比(26.6倍)较突变前体Bio-NanoSwitch-Lys(3.5倍)有了显著改进(图4D)。为了进一步优化该系统，我们将位于11号突变体中LgBiT氨基酸序列上残留的最后一个赖氨酸(即第125位氨基酸)突变为除赖氨酸和精氨酸以外的其他18个氨基酸(图3B)，筛选酶活性升高或不受影响的突变体。这些表达质粒构建过程如下：
3.1构建突变质粒NanoSwitch-Lys-A，NanoSwitch-Lys-C，NanoSwitch-Lys-D，NanoSwitch-Lys-E，NanoSwitch-Lys-F，NanoSwitch-Lys-G，NanoSwitch-Lys-H，NanoSwitch-Lys-I，NanoSwitch-Lys-L，NanoSwitch-Lys-M，NanoSwitch-Lys-N，NanoSwitch-Lys-P，NanoSwitch-Lys-Q，NanoSwitch-Lys-S，NanoSwitch-Lys-T，NanoSwitch-Lys-V，NanoSwitch-Lys-W，NanoSwitch-Lys-Y
以质粒NanoSwitch-Lys-11为模板，分别用引物F_A+R_A，F_C+R_C，F_D+R_D，F_E+R_E，F_F+R_F，F_G+R_G，F_H+R_H，F_I+R_I，F_L+R_L，F_M+R_M，F_N+R_N，F_P+R_P，F_Q+R_Q，F_S+R_S，F_T+R_T，F_V+R_V，F_W+R_W，F_Y+R_Y做PCR扩增，胶回收扩增片段分别命名为frag23、frag24、frag25、frag26、frag27、frag28、frag29、frag30、frag31、frag32、frag33、frag34、frag35、frag36、frag37、frag38、frag39、frag40。
将以上得到的18个片段frag23、frag24、frag25、frag26、frag27、frag28、frag29、frag30、frag31、frag32、frag33、frag34、frag35、frag36、frag37、frag38、frag39、frag40分别做Golden gate连接反应。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒NanoSwitch-Lys-A，NanoSwitch-Lys-C，NanoSwitch-Lys-D，NanoSwitch-Lys-E，NanoSwitch-Lys-F，NanoSwitch-Lys-G，NanoSwitch-Lys-H，NanoSwitch-Lys-I，NanoSwitch-Lys-L，NanoSwitch-Lys-M，NanoSwitch-Lys-N，NanoSwitch-Lys-P，NanoSwitch-Lys-Q，NanoSwitch-Lys-S，NanoSwitch-Lys-T，NanoSwitch-Lys-V，NanoSwitch-Lys-W，NanoSwitch-Lys-Y。
3.2突变质粒原核表达与检测
将表达NanoSwitch-Lys-X(X为A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y中的一个)的质粒化转至BL21感受态中，涂布至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃培养16h。取单菌落至2ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，3h。加入IPTG至终浓度分别为1mM、0.6mM、0.3mM，37℃，220rpm，3h。取1ml菌液于1.5ml EP管，4℃，12000g离心15min。取其上清液10μl，加入1μlNano底物，室温平衡反应10min后，检测Nanoluc活性。结果显示(图4C)，与质控组(未突变组Kmc)相比，脯氨酸(P)突变体信号活性平均降低6458.6倍，几乎呈失活状态；突变为天冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)的突变体酶活性严重降低，活性信号平均降低31.5-194.5倍；突变为丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)的突变体活性信号平均降低1.9-6.6倍；突变为半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)的突变体活性信号平均降低1.15-1.48倍；苏氨酸(T)突变体活性信号升高1.18倍，与质控组无明显差异。提示上述18个突变体中，NanoSwitch-Lys-C、NanoSwitch-Lys-I、NanoSwitch-Lys-Q、NanoSwitch-Lys-S和NanoSwitch-Lys-T共5个优化突变体在不影响酶活性的前提下，避免了LgBiT中赖氨酸残基对小分子化合物标记与靶蛋白检测的影响。
3.3生物素化NanoSwitch-Lys-I、NanoSwitch-Lys-Q特异性检测Avidin
将筛选出的5个优化突变体中较稳定的NanoSwitch-Lys-I(编码序列如SEQ IDNO.65所示)和NanoSwitch-Lys-Q(编码序列如SEQ ID NO.66所示)分别化转BL21，以1mM终浓度IPTG诱导表达蛋白并纯化、浓缩以及生物素标记蛋白，检测Bio-NanoSwitch-Lys-I和NanoSwitch-Lys-Q的浓度与生物素标记率后，将纯化的蛋白和3次生物素化蛋白进行考马斯亮蓝染色，结果显示(图6)，表达出15-25KDa的蛋白，符合NanoSwitch-Lys-I和NanoSwitch-Lys-Q的大小，生物素化后的蛋白分子大于未生物素化蛋白，符合生物素标记后蛋白大小。再进行亲和素检测：
3.3.1生物素化NanoSwitch-Lys-I特异性检测Avidin
分别取10μl稀释1000倍和10000倍的Bio-NanoSwitch-Lys-I，将Avidin以无钾PBS溶解，按一定的分子数量比(标记生物素：亲和素)梯度加入相应量的Avidin，无钾PBS补齐总反应体系，37℃孵育1小时后，检测Nanoluc活性。结果显示，质控组(未加亲和素)与对照组(分别加入最高分子数量梯度比的HBc蛋白：14.14μg/ml和1.41μg/ml)无明显差异；与质控组相比，加入Avidin的实验组信号平均降低最高27.3倍(图4D)，随着Avidin的量逐渐增加，Nanoluc活性逐渐降低。提示HBc蛋白不影响Bio-NanoSwitch-Lys-I的活性，Bio-NanoSwitch-Lys-I的信号变化与Avidin的量具有相关性，且当Avidin浓度分别为15.2ng/ml-2.44μg/ml和1.5-243.7ng/ml时，稀释1000倍和10000倍的Bio-NanoSwitch-Lys-I信号与Avidin浓度之间具有较好的线性关系，不同浓度的Bio-NanoSwitch-Lys-I可以检测不同线性范围的Avidin(图5D)。
3.3.2生物素化NanoSwitch-Lys-Q特异性检测Avidin
分别取10μl稀释1000倍和10000倍的Bio-NanoSwitch-Lys-Q，将Avidin以无钾PBS溶解，按一定的分子数量比(标记生物素：亲和素)梯度加入相应量的Avidin，无钾PBS补齐总反应体系，37℃孵育1小时后，检测Nanoluc活性。结果显示，质控组(未加亲和素)与对照组(分别加入最高分子数量梯度比的HBc蛋白：20.7μg/ml和2.07μg/ml)无明显差异；与质控组相比，加入Avidin的实验组信号平均降低最高36倍(图4D)，随着Avidin的量逐渐增加，Nanoluc活性逐渐降低。提示HBc蛋白不影响Bio-NanoSwitch-Lys-Q的活性，Bio-NanoSwitch-Lys-Q的信号变化与Avidin的量具有相关性，且当Avidin浓度分别为19ng/ml-3.04μg/ml和1.9-303.9ng/ml时，稀释1000倍和10000倍的Bio-NanoSwitch-Lys-Q信号与Avidin浓度之间具有较好的线性关系，不同浓度的Bio-NanoSwitch-Lys-Q可以检测不同线性范围的Avidin(图5E)。

Claims (10)

1.用于小分子化合物、靶向蛋白检测的多功能蛋白分子开关，其特征在于：所述分子开关为融合蛋白，所述融合蛋白选自NanoSwitch-Lys、NanoSwitch-Lys-11、NanoSwitch-Lys-I、NanoSwitch-Lys-Q中的任一个；
所述NanoSwitch-Lys包括依次连接的SmBiT、第一接头、6×赖氨酸短肽、第二接头、LgBiT、第三接头、6×赖氨酸短肽、第四接头、6×His标签；其中，所述第一接头、第二接头、第三接头、第四接头均为甘氨酸-丝氨酸接头；
所述NanoSwitch-Lys-11是在NanoSwitch-Lys的基础上将位于LgBiT氨基酸序列上第54、79、90、124、137位的共计5个赖氨酸均突变为精氨酸得到的突变体；
所述NanoSwitch-Lys-I是在NanoSwitch-Lys-11的基础上将位于LgBiT氨基酸序列上第125位的赖氨酸突变为异亮氨酸；
所述NanoSwitch-Lys-Q是在NanoSwitch-Lys-11的基础上将位于LgBiT氨基酸序列上第125位的赖氨酸突变为谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的用于小分子化合物、靶向蛋白检测的多功能蛋白分子开关，其特征在于：
所述第一接头为GS，所述第二接头为GGGGSGGGGS，所述第三接头为GS，所述第四接头为SG；所述融合蛋白NanoSwitch-Lys的氨基酸序列如SEQ ID NO.63所示。
3.根据权利要求1所述的用于小分子化合物、靶向蛋白检测的多功能蛋白分子开关，其特征在于：
所述蛋白分子开关是生物素标记的融合蛋白；
优选采用Sμlfo-NHS-LC-Biotin对所述融合蛋白进行生物素标记。
4.一种分离的编码核酸，所述编码核酸编码权利要求1或2所述的蛋白分子开关；
优选NanoSwitch-Lys、NanoSwitch-Lys-11、NanoSwitch-Lys-I、NanoSwitch-Lys-Q的编码序列依次如SEQ ID NO.60、64、65、66所示。
5.表达权利要求1或2所述蛋白分子开关或包含权利要求4所述编码核酸的表达载体。
6.含有或表达权利要求1或2所述蛋白分子开关、权利要求4所述编码核酸、权利要求5所述表达载体中的一种或多种的宿主细胞。
7.一种权利要求1或2所述蛋白分子开关的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)构建权利要求1或2所述蛋白分子开关的核酸序列；
2)构建包含步骤1)的核酸序列的原核表达载体；
3)将步骤2)的原核表达载体用于转染或转化宿主细胞，并使所述核酸序列在宿主细胞中表达，产生融合蛋白；
4)将步骤3)中表达的融合蛋白进行纯化。
8.权利要求1或2所述蛋白分子开关在检测小分子化合物和/或其靶向蛋白中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用为将小分子化合物偶联到所述蛋白分子开关的赖氨酸残基伯胺上得到标记后的分子开关，然后将标记后的分子开关用于检测所述小分子化合物和/或其靶向蛋白，包括如下应用(1)或(2)：
(1)竞争抑制法检测小分子化合物:待检样本中的小分子化合物和分子开关上标记的化合物竞争结合相应靶向蛋白，当待检体系中无特定小分子化合物存在时，加入的相应靶向蛋白结合到标记于分子开关上的特定小分子化合物时，引起空间位阻和变构效应，导致SmBiT与LgBiT的结合障碍，此时分子开关将处于部分失活状态，加入底物后，光信号降低；当有特定小分子化合物存在时，小分子化合物与相应靶向蛋白结合，SmBiT将能结合到LgBiT的相应位置，分子开关处于全活性状态，信号强度与小分子化合物的量呈正相关；
(2)检测相应靶向蛋白：当无相应靶向蛋白存在时，SmBiT将能结合到LgBiT的相应位置，分子开关处于全活性状态；当有相应靶向蛋白存在，并结合到标记于分子开关上的特定小分子化合物时，引起空间位阻和变构效应，导致SmBiT与LgBiT的结合障碍，此时分子开关将处于部分失活状态，加入底物后，光信号降低，信号变化用来反映相应靶向蛋白的量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述小分子化合物选自生物素、NVR3-778、PSMA-617、GW572016、AP-26113；所述生物素通过N-羟基硫代琥珀酰亚胺基团修饰化合物，然后将其连接到分子开关的赖氨酸残基伯胺上；
生物素的靶向蛋白为亲和素，
NVR3-778的靶向蛋白为HBc蛋白；
PSMA-61的靶向蛋白为前列腺特异性膜抗原PSMA；
GW572016的靶向蛋白为EGFR；
AP-26113的靶向蛋白为间变性淋巴瘤激酶ALK。
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