CN117865333A - 基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，属于环境水处理技术领域，本发明利用共培养反硝化微生物和电活性微生物纯菌以葡萄糖和纤维素为碳源，在加或不加电子穿梭体条件下分别培养，并进行反硝化和碳源利用效率的增强机制探究，实现了电活性微生物与反硝化微生物可通过直接或间接种间电子传递及底物共代谢过程提升碳源利用率及尾水深度脱氮效能，并缓解氧化亚氮释放降低温室潜能。
Description
技术领域
本发明涉及环境水处理技术领域，尤其涉及基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法。
背景技术
目前，尾水在进入深度处理单元前仅为一级B标准，其中硝酸盐浓度多为10-20mg/L，COD浓度约为50-60 mg/L且碳源多为难被微生物利用的纤维素或腐殖质类，导致了水处理系统反硝化效能普遍处于较低水平。尽管通过外部碳源投加可以缓解该问题，但过度依赖昂贵的商用碳源极大污水处理厂运行的经济成本，也会造成温室大量排放，同时，生化系统厌氧区存在的异养菌会与反硝化菌竞争碳源，降低了碳源的脱氮利用效率。因此，解决污水处理系统进水碳源短缺及提升碳源利用效率是强化尾水深度脱氮的关键所在。
尾水处理系统微生物群落组成中除具备丰富的脱氮功能菌外，还具有大量的产电菌，如地杆菌属（Geobacter）、希瓦氏菌属（Shewanella）、红育菌属（Rhodoferax）等，其中典型的产电菌Geobacter可占到总群落丰度的13%-16%。另外，部分反硝化菌也可降解难利用有机质，如木质素、纤维素、半纤维素等，降解产生的小分子有机物是反硝化菌进行脱氮的优质碳源；同时，产电菌亦可降解有机物产生的电子还可通过直接（纳米导线）或间接（醌基结构）方式传递给反硝化菌用于硝酸盐氮的还原。因此，合理调控尾水处理系统产电菌活性，使其在碳源利用及电子传递两方面与反硝化菌进行协同互作，可达到提升碳源脱氮利用效率的目的，为强化尾水深度脱氮及减低氧化亚氮温室气体提供新的探究方向。
针对上述问题，本发明文件提出了基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法。
发明内容
本发明提供了基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，解决了上述提出的问题。
本发明提供了如下技术方案：
基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，包括以下步骤：
S1、菌株恢复与准备：
从实验室冷冻库中取出菌株，并准备高浓度硝酸盐培养基让菌株在其中富集，同时还准备二沉池污泥样品作为接种菌源；
S2、菌种富集：
S2.1、将最高稀释的反硝化微生物落转移到含有适量琼脂和维生素溶液以及合适的电子供体和受体的液体培养基中；
S2.2、使用10mM氢氧化钠调节培养基的pH值直至7.0；
S2.3、培养基在无氧条件下，使用N2/CO2吹托，在30°C下进行培养；
S3、菌落分离和纯化：
观察菌落开始出现后，在厌氧箱中，使用一次性消毒针将单个菌落挑选出来，转移到含有10mL固体培养基的划线板上，重复多次，进一步纯化和获得纯度较高和获得单一的反硝化菌落；
S4、将所述单一的反硝化菌落和电活性微生物纯菌接种至液体培养基中，其中，培养基模拟合成污水，且将高效电子传递介质蒽醌-2、6-二磺酸盐加入培养基以强化种间电子传递过程，同时浓度为500mg/L；
S5、以葡萄糖和纤维素为碳源，分别设置葡萄糖组和纤维素组两个处理组，在加或不加电子穿梭体的条件下，将反硝化微生物和电活性微生物纯菌分别接种并培养120小时，且分别分析两个处理组中反硝化微生物和电活性微生物纯菌的反硝化和碳源利用效率的增强机制，获得结果。
在一种可能的设计中，所述步骤S1中，菌种富集以二沉池污泥样品为接种菌源，其中反硝化微生物的相对丰度为18.6％。
在一种可能的设计中，所述步骤S3中，在厌氧箱中，使用一次性消毒针将单个菌落挑选出来，转移到含有10mL固体培养基的划线板上，重复的次数为5-6次。
在一种可能的设计中，所述培养基模拟合成污水的初始pH值需使用4M氢氧化钠和4M盐酸溶液进行滴定调节至7.0。
在一种可能的设计中，所述培养基模拟合成污水的成分具体包括：100L合成废水含有108.3mg硝酸钾、90mg丙二酸、1g氯化钠、0.5g氯化镁、0.3g氯化钾、0.015g氯化钙、0.2g磷酸氢二钾以及0.5%的微量元素，微量元素添加剂含有：1.5氯化亚铁、0.19氯化钴、0.1氯化锰、0.036钼酸钠、0.07氯化锌、0.006硼酸、0.024氯化镍和0.002氯化铜。
在一种可能的设计中，所述步骤S4中，在接种微生物之前，培养基应在121°C的温度和氦气吹脱10分钟的条件下进行处理，以确保无菌和无氧条件。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性的，并不能限制本发明。
本发明利用共培养反硝化微生物和电活性微生物纯菌以葡萄糖和纤维素为碳源，在加或不加电子穿梭体条件下分别培养，并进行反硝化和碳源利用效率的增强机制探究，实现了电活性微生物与反硝化微生物可通过直接或间接种间电子传递及底物共代谢过程提升碳源利用率及尾水深度脱氮效能，并缓解氧化亚氮释放降低温室潜能。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的AQDS共培养体系的ESR谱和电流曲线示意图；
图2为本发明实施例所提供的FISH后聚集体的扫描激光共聚焦显微示意图；
图3为本发明实施例所提供的G. sulfurreduens和Pseudomonas sp. StrainGWP-1的代谢模型示意图；
图4为本发明实施例所提供的G. sulfurreduens和Pseudomonas sp.Strain GWP-1在共培养体系中通过底物共代谢和种间电子转移驱动反硝化作用的共生示意图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图对本发明实施例进行描述。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例
本实施例的一种基于种间电子传递和底物共代谢过程强化纤维素，包括以下步骤：
S1、菌株恢复与准备：
从实验室冷冻库中取出菌株，并准备高浓度硝酸盐培养基让菌株在其中富集，同时还准备二沉池污泥样品作为接种菌源。具体的，本实施例采用Pseudomonassp.StrainGWP-1菌株，且二沉池污泥样品中，反硝化微生物的相对丰度（以nirS基因数目/16SrRNA基因数目表示）为18.6％。
S2、菌种富集：
S2.1、将最高稀释的反硝化微生物菌落转移到含有适量琼脂和维生素溶液以及合适的电子供体和受体的液体培养基中。
S2.2、使用10mM氢氧化钠调节培养基的pH值直至7.0。
S2.3、培养基在无氧条件下，使用N2/CO2吹托，在30°C下进行培养。
S3、菌落分离和纯化：
观察菌落开始出现后，在厌氧箱中，使用一次性消毒针将单个菌落挑选出来，转移到含有10mL固体培养基的划线板上，重复多次，进一步纯化和获得纯度较高和获得单一的反硝化菌落。具体的，本实施例中，其过程重复进行了6次，以进一步纯化和获得纯度较高和单一的Pseudomonassp.StrainGWP-1反硝化菌落。
S4、将所述单一的反硝化菌落和电活性微生物纯菌接种至液体培养基中，具体的，本实施例中是将纯Pseudomonassp.StrainGWP-1反硝化菌落和G.sulfurreducens电活性微生物纯菌接种到液体培养系统中，其中，培养基模拟合成污水，且将高效电子传递介质蒽醌-2、6-二磺酸盐加入培养基以强化种间电子传递过程，同时浓度为500mg/L。
具体的，培养基模拟合成污水的成分具体包括：100L合成废水含有108.3mg硝酸钾、90mg丙二酸、1g氯化钠、0.5g氯化镁、0.3g氯化钾、0.015g氯化钙、0.2g磷酸氢二钾以及0.5%的微量元素。微量元素添加剂含有：1.5氯化亚铁、0.19氯化钴、0.1氯化锰、0.036钼酸钠、0.07氯化锌、0.006硼酸、0.024氯化镍和0.002氯化铜。
S5、培养以葡萄糖和纤维素为碳源，分别设置葡萄糖G组和纤维素C组两个处理组，且为保证碳源充足，培养基中TOC浓度为300 mg/L， K15NO3中NO3--15N为15 mg15N/L。
具体的，根据是否存在AQDS，每组分为G0/C0（无AQDS）和G1/C1（有AQDS）2批，每批分为G*/C*-CK（无微生物）、G*/C*-G（仅G.sulfurreducens电活性微生物纯菌）、G*/C*-P（仅Pseudomonassp.StrainGWP-1反硝化菌落）、G*/C*-GP（G.sulfurreducens电活性微生物纯菌和Pseudomonassp.StrainGWP-1反硝化菌落共存）4组（*表示0/1，即是否存在AQDS）。所有实验组均为三平行处理，并且培养基置于250mL耐压无菌培养瓶中，含菌液的培养基OD值在0.7~0.72范围内。接种密封后，将烧瓶置于100转、30°C恒温空浴培养箱中培养，整个过程在厌氧手套箱中进行，然后密封。
蛋白质组学分析：培养结束后，G、C组菌悬液（P、GP、GPE）以8000g转速在4°C下离心10min，得到细菌沉淀；将5mm钢珠、LysisBuffer3、PMSF（终浓度为1mM）、EDTA（终浓度为2mM）加入细菌沉淀中；将混合物旋转并静置5分钟，然后加入最终浓度为10mM的DTT；用研磨机在50Hz下破碎2分钟；破碎后的菌液在25000g*4°C离心收集上清液，在10mMDTT溶液中还原，随后在56°C水浴1小时；拿出后冷却至室温后，加入最终浓度为55mM的IAM，并在暗室中等待45分钟；蛋白质含量用冷丙酮（4vol丙酮对1vol样品）沉淀，25000g*4°C离心收集蛋白沉淀，并于裂解缓冲液中超声重悬，25000g*4°C离心20min后取上清液，用50mMNH4HCO3按4倍体积稀释。
接下来，用胰蛋白酶在蛋白酶与蛋白质的比例约为1:40的条件下，在37°C下消化该溶液4小时；酶促肽用StrataX柱脱盐，真空干燥；将干燥后的多肽样品分为两部分，一部分采用数据依赖采集技术构建谱库；一部分在数据独立采集（DIA）模式下获得精确、高重现性的样本定量信息；每个样品使用nano-LC-MS/MS系统进行分析，进行GO、COG、Pathway功能注释分析和时间序列分析；基于定量结果，采用MSstats软件包寻找各组间差异蛋白，最后对差异蛋白进行功能富集分析、蛋白-蛋白相互作用（PPI）和亚细胞定位分析。
电子传递效率分析：本实施例通过电子呼吸方法将氯化四氮唑还原为甲臜来测量电子转移效率；从所有处理组的每个瓶子中收集5mL菌液，放置在50mL的离心管中；离心管中加入5mL0.5%氯化四氮唑和5mgNADH；在黑暗中放置30分钟（25°C）后，向离心管中注入1ml甲醛（HCHO）终止反应；在4500转/分钟离心10分钟，去除混合物上清液；然后在沉淀样品中加入5ml96%甲醇，离心管在200转/分钟振动提取甲醛30分钟，8000转/分钟离心5分钟后收集上清液，在490nm处测定产生的橙色上清液的吸光度；电子转移效率估计为：
；
式中：ABS490为上清液在490nm处的吸光度；15.9为四氮唑-甲马甲的吸光度；V0和V（ml）分别为初始混合物和甲醇的体积；T（min）为孵育时间；32/2为氯化四氮唑-甲臜转化为O的因子；Vm（item）为菌液体积。
电子转换效率量化计算分析：记录培养瓶上部空间容积，收集15NO、15N2O、15N2和CO2气体进行浓度检测，并计算各组分的产率；采用同位素比质谱仪检测各组分中同位素标记元素的比例，计算各组分中同位素标记气体组分的含量；最后，根据物质平衡和电子守恒定律，计算电活性微生物驱动脱氮的电子转换效率，结果如图1、图2、图3和图4所示：
图1中：[a]AQDS共培养体系的ESR谱；[b-e]水溶液中AQDS在−1.0V（[b]0小时，[c]120小时）和+1.0V（[d]0小时，[e]120小时）时的电流曲线（相对于Ag/AgCl）；箭头表示向共培养菌株溶液中添加AQDS。
图2中：FISH后聚集体的扫描激光共聚焦显微镜图像，用红色探针（Cy3）靶向G.sulfurreducens，用靛蓝探针（Cy5）靶向菌株GWP-1细胞，[a-c]G.sulfurreducens与StrainGWP-1在葡萄糖[b]和纤维素[c]中共培养120小时后形成的聚集体的SEM图像，在葡萄糖组和纤维素组中，两株菌株之间的丝状结构都很明显。
图3中：对GWP-1菌株进行HGP与HP、HGPE与HGP的相对丰度比较，对G.sulfurreduens菌株进行HGPE与HGP、HGP与SGP的相对丰度比较。
图4中：[b]G.sulfurreduens和GWP-1在葡萄糖和纤维素共培养体系中存在/不存在AQDS时的电子转移效率（n=3）；[c]在存在/不存在AQDS的情况下，对葡萄糖和纤维素共培养系统中用于反硝化需求的电子数量、碳消耗、AQDS储存和种间转移以及不同碳源组中转移电子x的值进行了量化（n=3）。
本发明利用共培养（Pseudomonassp.StrainGWP-1）反硝化菌落和（G.sulfurreducens）电活性微生物纯菌以葡萄糖和纤维素为碳源，在加或不加电子穿梭体（AQDS）条件下分别培养120小时，探究其反硝化和碳源利用效率的增强机制及有效方法，由此可得：
1、葡萄糖体系中Pseudomonassp.StrainGWP-1反硝化菌落可同时获得来自G.sulfurreducens电活性微生物纯菌（直接种间电子转移，d-IET）和AQDS（间接种间电子转移，i-IET）两方面的电子，在充足的电子刺激下，反硝化关键蛋白酶活性显著上调，反硝化效率明显提高。
2、在纤维素体系中，Pseudomonassp.StrainGWP-1反硝化菌落与G.sulfurreducens电活性微生物纯菌可通过底物共代谢过程，提升G.sulfurreducens糖酵解、三羧酸循环和电子转移过程的关键蛋白酶活性，加速种间电子传递过程，提升了反硝化效能，降低了氧化亚氮释放。
3、利用同位素示踪技术，对共培养体系中两菌间电子传递量进行量化发现纤维素碳源组中G.sulfurreducens电活性微生物纯菌向Pseudomonassp.StrainGWP-1反硝化菌落传递电子量高于葡萄糖碳源近1倍，在相同碳源组中，AQDS的存在高出无AQDS大约2-3倍。
最终可得，本发明实现了电活性微生物与反硝化微生物可通过直接/间接种间电子传递及底物共代谢过程提升碳源利用率（3倍-5倍）及尾水深度脱氮效能（25%-40%），并缓解氧化亚氮释放降低温室潜能（20%-30%）。
以上，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内；在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌株恢复与准备：
从实验室冷冻库中取出菌株，并准备高浓度硝酸盐培养基让菌株在其中富集，同时还准备二沉池污泥样品作为接种菌源；
S2、菌种富集：
S2.1、将最高稀释的反硝化微生物菌落转移到含有适量琼脂和维生素溶液以及电子供体和受体的液体培养基中；
S2.2、使用10mM氢氧化钠调节培养基的pH值直至7.0；
S2.3、培养基在无氧条件下，使用N2/CO2吹托，在30°C下进行培养；
S3、菌落分离和纯化：
观察菌落开始出现后，在厌氧箱中，使用一次性消毒针将单个菌落挑选出来，转移到含有10mL固体培养基的划线板上，重复多次，纯化和获得单一的反硝化菌落；
S4、将所述单一的反硝化菌落和电活性微生物纯菌接种至液体培养基中，其中，培养基模拟合成污水，且将高效电子传递介质蒽醌-2、6-二磺酸盐加入培养基以强化种间电子传递过程，同时浓度为500mg/L；
S5、以葡萄糖和纤维素为碳源，分别设置葡萄糖组和纤维素组两个处理组，在加或不加电子穿梭体的条件下，将反硝化微生物和电活性微生物纯菌分别接种并培养120小时，且分别分析两个处理组中反硝化微生物和电活性微生物纯菌的反硝化和碳源利用效率的增强机制，获得结果。
2.根据权利要求1所述的基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，其特征在于，所述步骤S1中，菌种富集以二沉池污泥样品为接种菌源，其中反硝化微生物的相对丰度为18.6％。
3.根据权利要求1所述的基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，其特征在于，所述步骤S3中，在厌氧箱中，使用一次性消毒针将单个菌落挑选出来，转移到含有10mL固体培养基的划线板上，重复的次数为5-6次。
4.根据权利要求1所述的基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，其特征在于，所述培养基模拟合成污水的初始pH值需使用4M氢氧化钠和4M盐酸溶液进行滴定调节至7.0。
5.根据权利要求1所述的基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，其特征在于，所述培养基模拟合成污水的成分具体包括：100L合成废水含有108.3mg硝酸钾、90mg丙二酸、1g氯化钠、0.5g氯化镁、0.3g氯化钾、0.015g氯化钙、0.2g磷酸氢二钾以及0.5%的微量元素，微量元素添加剂含有：1.5氯化亚铁、0.19氯化钴、0.1氯化锰、0.036钼酸钠、0.07氯化锌、0.006硼酸、0.024氯化镍和0.002氯化铜。
6.根据权利要求1所述的基于强化种间互营过程提升纤维素驱动反硝化效能的方法，其特征在于，所述步骤S4中，在接种微生物之前，培养基应在121°C的温度和氦气吹脱10分钟的条件下进行处理，以确保无菌和无氧条件。
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