CN117860907A - 一种穿膜肽在制备递送rna药物的递送载体中的应用和具有透膜能力的rna药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种穿膜肽在制备递送RNA药物的递送载体中的应用和具有透膜能力的RNA药物，属于纳米生物技术领域。本发明针对RNA分子药物带负电荷，不易穿过细胞膜，且易被核酸酶降解的问题，提供了一种具有透膜能力的RNA药物，将穿膜肽融合表达在非病毒蛋白笼表面作为递送载体，来封装和递送外源性RNA分子或药物，形成一种新型的RNA药物，可有效提高了RNA稳定性，同时大大提升了蛋白笼的细胞内递送和内体逃逸，对于在细胞靶部位有效释放RNA药物至关重要。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种穿膜肽在制备递送RNA药物的递送载体中的应用和具有透膜能力的RNA药物。
背景技术
RNA药物通过识别与其互补的序列来靶向相应的基因转录和翻译过程，从而抑制特定蛋白的表达，最终起到治疗疾病的作用。相比传统小分子和抗体药物，RNA药物直接在基因水平发挥调控作用，对致病基因清晰而相关蛋白质难以成药的靶点具有独特优势，在肿瘤、免疫疾病和罕见遗传病等领域有极大的应用潜力。RNA药物分子量大，并且带有负电荷，不易透过生物膜到达作用部位，此外，血液和组织中存在着许多的RNA内切酶，容易将治疗性的RNA降解。因此，亟需开发高效、低成本的RNA递送系统用于RNA药物递送。
蛋白笼是大、空心且定义明确的大分子结构，由一个或多个蛋白质亚基的多个拷贝构建而成。它们的胶囊状结构与通过遗传和化学手段精确修改其外表面和空腔的可能性相结合，产生了一系列纳米技术和生物医学应用。已被探索用于输送药物或造影剂的非病毒蛋白笼包括病毒样颗粒、铁蛋白和热休克蛋白等。这些蛋白笼几乎均可在原核系统中快速、简单生产，生产成本更低。因此，非病毒蛋白笼是RNA药物封装和递送的具有潜在应用价值的工具。目前，已有研究通过蛋白笼包括外源性RNA分子或药物，例如siRNA，并取得了良好的治疗效果。尽管蛋白笼用于RNA药物递送有众多优势，但开发具备增强细胞内递送和内体逃逸的蛋白笼对于进一步提升药物递送效率具有一定的挑战性。
因此，建立一种穿膜肽增强非病毒蛋白笼细胞内递送外源性RNA分子或药物的方法显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种穿膜肽在制备递送RNA药物的递送载体中的应用，将穿膜肽融合表达在非病毒蛋白笼表明，能有效增强RNA分子或药物的细胞内递送并实现内体逃逸。
本发明的目的还在于提供一种具有透膜能力的RNA药物，将表面表达有穿膜肽的非病毒蛋白笼作为递送载体封装RNA分子或药物，不能能有效防止降解还能精准递送到病变的细胞中，有利于发挥更好的治疗效果。
本发明提供了一种穿膜肽在制备递送RNA药物的递送载体中的应用。
优选的，所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1。
优选的，所述递送载体的骨架蛋白包括非病毒蛋白笼；
所述非病毒蛋白笼包括以下任意一种蛋白：来自强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)的24聚体铁蛋白、来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的60聚体封装蛋白、来自Aquifex aeolicus的60聚体蛋白笼、来自Pyrococcus furiosus的180聚体封装蛋白和来自Quasibacillus thermotolerans的420聚体封装蛋白。
本发明提供了一种递送RNA药物的递送载体，所述递送载体是表面修饰有穿膜肽、中空的非病毒蛋白笼。
优选的，所述递送载体是穿膜肽-非病毒蛋白笼融合蛋白重组表达后经自组装形成；
所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述非病毒蛋白笼包括以下任意一种蛋白：来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白、来自Thermotoga maritima的60聚体封装蛋白、来自Aquifex aeolicus的60聚体蛋白笼、来自Pyrococcus furiosus的180聚体封装蛋白和来自Quasibacillusthermotolerans的420聚体封装蛋白。
优选的，所述穿膜肽-非病毒蛋白笼融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供了一种具有透膜能力的RNA药物，包括所述递送载体和封装在所述递送载体内部的外源性RNA。
优选的，每摩尔递送载体封装所述外源性RNA的拷贝数为100～200Kg。
优选的，所述外源性RNA包括siRNA。
本发明提供了一种穿膜肽在制备递送RNA药物的递送载体中的应用。本发明通过基因融合方法将穿膜肽表达在非病毒蛋白笼表面，形成递送载体，有利于增强封装在递送载体内部的RNA药物递送至细胞中并防止RNA的降解，有效实现体内逃逸。实验表明，递送载体表面添加穿膜肽，不仅不影响递送载体的稳定性和耐酶性，而且增强递送载体细胞内递送外源性RNA分子或药物的能力，有利于极大提高RNA药物的药效。
本发明提供了一种具有透膜能力的RNA药物，包括所述递送载体和封装在所述递送载体内部的外源性RNA。实验结果表明，与未加穿膜肽的非病毒蛋白笼相比，穿膜肽修饰的递送载体能够更快的被细胞摄取并实现溶酶体逃逸，有效将内部封装的RNA分子或药物释放至细胞内，进而起到更好的药物作用效果。因此，建立一种穿膜肽增强非病毒蛋白笼细胞内递送外源性RNA分子或药物的方法具有潜在应用价值。
附图说明
图1为Fn蛋白笼和穿膜肽修饰示意图；
图2为Fn和TAT-Fn的SDS-PAGE染色图；
图3为Fn和TAT-Fn的负染色TEM图，其中左图:Fn，右图:TAT-Fn；
图4为不同温度处理后Fn和TAT-Fn的可溶性变化结果；
图5为通过琼脂糖凝胶电泳监测核酸酶对siRNA的降解程度结果；
图6为不同处理后DC2.4的相对荧光强度，其中1：阴性对照组；2：游离siRNA组；3：siRNA-Fn组；4：siRNA-TAT-Fn组；
图7为不同处理后DC2.4的免疫荧光染色，其中细胞膜:红色；细胞核:蓝色；siRNA:绿色；
图8为westernblot检测各组细胞中GFP的敲低水平结果。
具体实施方式
本发明提供了一种穿膜肽在制备递送RNA药物的递送载体中的应用。
在本发明中，所述穿膜肽的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1(RKKRRQRRR)。所述递送载体的骨架蛋白优选包括非病毒蛋白笼。所述非病毒蛋白笼优选包括以下任意一种蛋白：来自强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)的24聚体铁蛋白、来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的60聚体封装蛋白、来自Aquifex aeolicus的60聚体蛋白笼、来自Pyrococcus furiosus的180聚体封装蛋白和来自Quasibacillus thermotolerans的420聚体封装蛋白。
本发明提供了一种递送RNA药物的递送载体，所述递送载体是表面修饰有穿膜肽、中空的非病毒蛋白笼。
在本发明中，所述递送载体优选是穿膜肽-非病毒蛋白笼融合蛋白重组表达后经自组装形成。所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述非病毒蛋白笼优选包括以下任意一种蛋白：来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白、来自Thermotoga maritima的60聚体封装蛋白、来自Aquifex aeolicus的60聚体蛋白笼、来自Pyrococcus furiosus的180聚体封装蛋白和来自Quasibacillus thermotolerans的420聚体封装蛋白。本发明实施例中，以来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白(Fn)作为非病毒蛋白笼为例说明递送载体的制备方法和效果。将穿膜肽TAT融合在N末端，同时N端引入组氨酸标签(HHHHHH)便于下游的蛋白纯化处理。所述穿膜肽-非病毒蛋白笼融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ IDNO:4所示。所述穿膜肽-非病毒蛋白笼融合蛋白经重组表达得到表面携带24个TAT的Fn笼状蛋白。
在本发明中，穿膜肽的修饰未对Fn的蛋白表达纯化产生明显影响，同时TEM结果显示，递送载体显示均匀一致的蛋白笼形态，偶联TAT后的Fn粒径略微增加，表明TAT的添加未对Fn的笼状结构形态产生显著影响。此外，稳定评估结果表明，Fn和TAT-Fn对高温(65～75℃)具有较高的耐受性，经不同温度处理后，笼状蛋白的溶解性未发生明显变化，表明TAT的插入未对Fn的稳定性产生明显影响。与此同时，非病毒蛋白笼可有效保护内部封装的RNA分子或药物免受核酸酶降解。
本发明提供了一种具有透膜能力的RNA药物，包括所述递送载体和封装在所述递送载体内部的外源性RNA。
在本发明中，每摩尔递送载体封装所述外源性RNA的质量为100～200Kg，更优选为150Kg。
本发明对所述外源性RNA的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的RNA分子或RNA药物即可。在本发明实施例中，所述外源性RNA优选包括siRNA。
在本发明中，递送评估实验表明，与siRNA-Fn组相比，TAT-Fn显著促进了细胞对蛋白笼的摄取，荧光强度显著增强；与此同时，针对DC2.4的免疫荧光染色显示，与Fn相比，TAT修饰的Fn能够实现溶酶体逃逸，有效将内部封装的siRNA释放至细胞内。上述均证明TAT增强了Fn进入细胞的能力并有效实现溶酶体逃逸，完成内部封装siRNA的更好释放，这对于实现下游更好的药物治疗奠定了基础。药效评估实验表明，与游离siRNA相比，siRNA-Fn对GFP的敲低水平更高；同时，Fn添加TAT后，与siRNA-Fn相比，GFP的敲低水平进一步升高，表明添加TAT后蛋白笼siRNA-TAT-Fn产生了更好的药物作用效果，可能原因是TAT修饰的蛋白笼有效将siRNA递送至细胞并实现内体逃逸，使内部封装的siRNA更有效的在细胞内释放。
下面结合实施例对本发明提供的一种穿膜肽在制备递送RNA药物的递送载体中的应用和具有透膜能力的RNA药物进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
非病毒蛋白笼穿膜肽修饰与表达纯化
选择来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白(Fn)用于非病毒蛋白笼穿膜肽修饰，随后进行蛋白表达和纯化。
1.1非病毒蛋白笼Fn穿膜肽修饰
由于Fn(MLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFA NWMKAQAEEEIGHALRFYNYIYDRNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEA AYEHEKFISKSIYELAALAEEEKDYSTRAFLEWFINEQVEEEASVKKILDK LKFAKDSPQILFMLDKELSARAPKLPG，SEQ ID NO:2)的亚基N末端在笼表面暴露，有利于对其进行遗传修饰。因此，为了给Fn笼表面配备穿膜肽TAT(RKKRRQRRR，SEQ ID NO:1)，将穿膜肽融合在N末端，形成表面携带24个TAT的Fn笼状蛋白。同时N端引入组氨酸标签(HHHHHH，SEQ ID NO:3)便于下游的蛋白纯化处理，见图1。
1.2TAT-Fn表达纯化与一般表征
1.2.1TAT-Fn的表达纯化
将图1构建的TAT-Fn序列进行基因合成，在5’端添加起始密码子，得到的编码序列(SEQ ID NO:4，atgcatcatcatcatcatcatggcagccgcaaaaaacgccgcc agcgccgccgcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcatgctgagcgaacgcatgctgaaagcgctgaacgatcagctgaaccgcgaactgtatagcgcgtatctgtattttgcgatggcggcgtattttgaagatctgggcctggaaggctttgcgaactggatgaaagcgcaggcggaagaagaaattggccatgcgctgcgcttttataactatatttatgatcgcaacggccgcgtggaactggatgaaattccgaaaccgccgaaagaatgggaaagcccgctgaaagcgtttgaagcggcgtatgaacatgaaaaatttattagcaaaagcatttatgaactggcggcgctggcggaagaagaaaaagattatagcacccgcgcgtttctggaatggtttattaacgaacaggtggaagaagaagcgagcgtgaaaaaaattctggataaactgaaatttgcgaaagatagcccgcagattctgtttatgctggataaagaactgagcgcgcgcgcgccgaaactgccgggc)克隆到pET28a表达质粒中，质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行扩大培养，加入1mM IPTG诱导TAT-Fn蛋白表达，得到TAT-Fn重组蛋白。同时将编码Fn序列的序列按照上述方法进行重组表达，得到Fn重组蛋白(MHHHHHHGSRKKRRQRRRGGGGSGGGGSGGGGS MLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEEIGHALRFYNYIYDRNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKFISKSIYELAALAEEEKDYSTRAFLEWFINEQVEEEASVKKILDKLKFAKDSPQILFMLDKELSARAPKLPG，SEQ ID NO:5)。
收集细胞，采用超声破碎细胞、亲和层析(Ni-NTA)和尺寸排阻色谱法(SEC)纯化目的蛋白，浓缩后采用SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色进行蛋白纯度鉴定。
1.2.2TAT-Fn的一般表征
(1)Fn和TAT-Fn的纯度鉴定
将Fn和TAT-Fn蛋白经过SDS-PAGE电泳。结果见图2。
SDS-PAGE显示，Fn和TAT-Fn均以高纯度纯化，表明TAT的添加未对Fn的蛋白表达纯化产生明显影响。
(2)Fn和TAT-Fn的负染色TEM表征，结果见图3。
电镜结果显示，Fn和TAT-Fn镜下显示均匀一致的蛋白笼形态，偶联TAT后的Fn粒径略微增加，表明TAT的添加未对Fn的笼状结构形态产生显著影响。
(3)Fn和TAT-Fn的zeta电位分析，使用Zetasizer 3000(Malvern Instruments，UK)进行zeta电位测量。
结果见表1。
表1 Fn和TAT-Fn的zeta电位结果
| Size(nm) | ξ(mV) | |
| Fn | 18.2±1.3 | -3.77±1.26 |
| TAT-Fn | 19.3±1.6 | -2.13±1.33 |
Zeta电位分析测量显示，与表面未添加TAT的蛋白笼相比，由于富含精氨酸的TAT肽的高阳离子电荷的引入，TAT-Fn的表面电荷趋向于正电荷。考虑到细胞膜的负电荷，表面添加TAT的可能在结合和/或穿透细胞方面具有优势。
实施例2
穿膜肽修饰的非病毒蛋白笼稳定性评估
1 Fn和TAT-Fn的热稳定测试
纯化的Fn和TAT-Fn于25、37、65和75℃条件下孵育48h，离心去除任何聚集体，SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色测试蛋白的可溶性比例变化。
结果见图4和表2。
表2不同温度处理后Fn和TAT-Fn的可溶性变化
| 处理温度(℃) | Fn | TAT-Fn |
| 25 | 1 | 1 |
| 37 | 0.98 | 0.85 |
| 65 | 0.88 | 0.81 |
| 75 | 0.82 | 0.84 |
结果表明，Fn和TAT-Fn对高温具有较高的耐受性，经不同温度处理后，笼状蛋白的溶解性未发生明显变化，表明TAT的插入未对Fn的稳定性产生明显影响。
2 Fn和TAT-Fn保护内部封装的siRNA免受核酸酶降解
2.1封装的siRNA(序列为：上游GAACTTCAGGGTCAGCTTGGG，SEQ ID NO:6；下游CAAGCTGACCCTGAAGTTCTT，SEQ ID NO:7)于生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.2取2nM递送载体，调节递送载体(Fn或TAT-Fn)的体系pH至2.0，使蛋白笼发生可逆性拆卸，加入0.2mg上述合成的外源性siRNA，恢复至中性，蛋白笼重新自组装，得到内部封装有外源性siRNA的递送系统。
2.3向封装有siRNA的递送载体中加入终浓度为10μg/mL RNaseA，放入37℃温箱消化12h。提取RNA，通过GelRed染色的琼脂糖凝胶电泳(2％)分析样品。
结果见图5。笼状蛋白可有效保护内部封装的siRNA免受核酸酶降解。
实施例3
穿膜肽修饰的非病毒蛋白笼细胞内递送评估
为了直观监测添加TAT后对蛋白笼封装的RNA细胞内递送的影响，将配备荧光适配体的siRNA封装在Fn和TAT-Fn蛋白笼内，具体方法同实施例2记载。
小鼠树突状细胞(DC2.4)分为阴性对照组、游离siRNA组、siRNA-Fn组和siRNA-TAT-Fn组。游离siRNA组、siRNA-Fn组和siRNA-TAT-Fn组中siRNA为等摩尔。处理DC2.4，12h后，流式细胞术和免疫荧光染色检测荧光标记DCs的荧光强度，阴性对照组为常规细胞培养。
(1)流式细胞术检测荧光强度变化，结果见图6和表3。
表3不同处理后DC2.4的相对荧光强度(％)
| 处理组 | 相对荧光强度(％) |
| 1 | 2 |
| 2 | 14 |
| 3 | 33 |
| 4 | 59 |
结果表明，与siRNA-Fn组相比，TAT-Fn显著促进了细胞对蛋白笼的摄取，荧光强度显著增强。
(2)免疫荧光染色检测荧光强度变化
结果见图7。针对DC2.4的免疫荧光染色显示，与Fn相比，TAT修饰的Fn能够实现溶酶体逃逸，有效将内部封装的siRNA释放至细胞内。上述均证明TAT增强了Fn进入细胞的能力并有效实现溶酶体逃逸，完成内部封装siRNA的更好释放，这对于实现下游更好的药物治疗奠定了基础。
实施例4
穿膜肽修饰的非病毒蛋白笼药物效果评估
为了进一步评估TAT-Fn递送siRNA的药物有效性，对基因的敲低展开研究。采用用封装有靶向敲低GFP基因的siRNA(序列为：上游GAACTT CAGGGTCAGCTTGGG；下游CAAGCTGACCCTGAAGTTCTT)的TAT-Fn处理GFP-Hela细胞，通过蛋白免疫印迹法检测Hela细胞中GFP的蛋白(MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFI CTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK，SEQ ID NO:8)表达水平反映siRNA对GFP的基因敲低效果。Hela细胞分为4组：阴性对照组、游离siRNA组、siRNA-Fn组、siRNA-TAT-Fn组。游离siRNA、siRNA-Fn组和siRNA-TAT-Fn组中siRNA为等摩尔。处理Hela细胞，24h后，western检测GFP的蛋白敲除水平，阴性对照组为常规细胞培养。
结果见图8。结果显示，与游离siRNA相比，siRNA-Fn对GFP的敲低水平更高；同时，Fn添加TAT后，与siRNA-Fn相比，GFP的敲低水平进一步升高，表明添加TAT后蛋白笼siRNA-TAT-Fn产生了更好的药物作用效果，可能原因是TAT修饰的蛋白笼有效将siRNA递送至细胞并实现内体逃逸，使内部封装的siRNA更有效的在细胞内释放。
综上，蛋白笼Fn和TAT-Fn具有较高的稳定性，经不同温度处理后，笼状蛋白的溶解性未发生明显变化，表明TAT的插入未对Fn的稳定性产生明显影响，并能有效保护内部封装的RNA免受核酸酶降解。与Fn相比，TAT修饰的Fn能够更快的被细胞摄取并实现溶酶体逃逸，有效将内部封装的RNA分子或药物释放至细胞内，进而起到更好的药物作用效果。因此，建立一种穿膜肽增强非病毒蛋白笼细胞内递送外源性RNA分子或药物的方法具有潜在应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种穿膜肽在制备递送RNA药物的递送载体中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述递送载体的骨架蛋白包括非病毒蛋白笼；
所述非病毒蛋白笼包括以下任意一种蛋白：来自强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)的24聚体铁蛋白、来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的60聚体封装蛋白、来自Aquifex aeolicus的60聚体蛋白笼、来自Pyrococcus furiosus的180聚体封装蛋白和来自Quasibacillus thermotolerans的420聚体封装蛋白。
4.一种递送RNA药物的递送载体，其特征在于，所述递送载体是表面修饰有穿膜肽、中空的非病毒蛋白笼。
5.根据权利要求4所述递送RNA药物的递送载体，其特征在于，所述递送载体是穿膜肽-非病毒蛋白笼融合蛋白重组表达后经自组装形成；
所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求4所述递送RNA药物的递送载体，其特征在于，所述非病毒蛋白笼包括以下任意一种蛋白：来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白、来自Thermotogamaritima的60聚体封装蛋白、来自Aquifex aeolicus的60聚体蛋白笼、来自Pyrococcusfuriosus的180聚体封装蛋白和来自Quasibacillus thermotolerans的420聚体封装蛋白。
7.根据权利要求4～6任意一项所述递送RNA药物的递送载体，其特征在于，所述穿膜肽-非病毒蛋白笼融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
8.一种具有透膜能力的RNA药物，其特征在于，包括权利要求4～7任意一项所述递送载体和封装在所述递送载体内部的外源性RNA。
9.根据权利要求8所述靶向细胞的RNA药物，其特征在于，每摩尔递送载体封装所述外源性RNA的质量为100～200Kg。
10.根据权利要求8或9所述RNA药物，其特征在于，所述外源性RNA包括siRNA。
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