CN117858623A - 提高固氮微生物活性的协同微生物菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明的实施方案提供了增加固氮生物的固氮(N)作用或为有需要的植物提高N获取的方法和组合物。所述方法和组合物的实施方案包含至少一种活的内生菌菌株，其中所述活的内生菌菌株是从在营养受限和/或水分胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离的。在一些实施方案中，可以将所述内生菌菌株施用于植物，其中所述内生菌菌株协同地增加与与所述植物相关的固氮菌株的固氮作用。在其他实施方案中，所述固氮菌株与所述植物不相关。本发明的实施方案可以广泛应用于减少肥料需求、增加植物固碳、增加用作能源或化学工业的氢气产量以及增加工业微生物菌株的生长、减少发酵罐中对铵或硝酸盐的需求。
Description
相关申请的交叉引用
本申请主张2021年6月22日提交的第63/213,517号美国临时申请的权益。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，因此通过引用将其纳入本说明书。包含该序列表的文本文件名为3915-P1118WO2UW_Seq_list_Final_20220616_ST25.txt。该文本文件为13KB；创建于2022年6月16日；并通过EFS网站随本说明书一并提交。
背景技术
自然界中的固氮(N)作用是专属于细菌的过程，它通过将空气中的N2气体转化为可用的代谢物来提供生命所需的必要的N。氮可以在微生物群落的各成员之间穿梭，但固氮生物(固氮细菌)也常见于土壤中并与植物相关。一些植物在称为结节的专用结构中容纳固氮细菌，但细菌也可以作为内生菌在植物组织内存活而不会引起疾病。内生菌为植物提供固定的氮，可能以此换取植物提供的糖和其他特殊化的分子。
因此，适当的植物微生物组可以高度地改善植物的生长和健康。除N外，内生菌还可以提供磷，并已显示可以提高植物对非生物和生物胁迫的耐受性。
只有在过去几年中，使用固氮内生菌产生N的想法才被接受(SharonL.Doty.2017.Chapter 2:Endophytic Nitrogen Fixation:Controversy and a PathForward.In Functional Importance of the Plant Endophytic Microbiome:Implications for Agriculture,Forestry and Bioenergy.Sharon L.Doty,editor.Springer doi:10.1007/978-3-319-65897-1)。现在人们普遍认识到，许多非豆科植物物种具有共生的固N内生菌，并且土壤中经常存在自由存活的固氮生物。这使得利用固氮生物的固N能力成为人们感兴趣的领域。一些农业公司一直在开发固氮的生物接种物，但是仅仅应用单一的固氮菌株并没有导致预期的作物产量的增加。
通过需要能量的化学工艺，也可以生产人造N肥。然而，由于高能量投入，这是昂贵的，成本转嫁给消费者或农民。由于在生产中使用化石燃料，土壤细菌将多余的肥料转化为氧化亚氮(一种强效的温室气体)，以及通过渗入水道干扰水生生态系统，因此化肥也对环境产生了负面影响。在热带农业中，这种污染使敏感的珊瑚礁生态系统处于危险之中。
因此，仍然需要提供技术来增加微生物生产的固氮的量，以便廉价地生成对环境无毒的氮产品。该方法应广泛适用于改善各种环境中各种植物的氮可及性以及任何需要氮的工业工艺。本发明解决了这一需求和相关需求。
发明内容
提供此发明内容是为了以简化的形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本发明内容不旨在识别所要求保护的主题的关键特征，也不打算用作确定所要求保护的主题范围的辅助手段。
根据上文所述，在本发明的一个方面，本发明提供了一种方法，以协同地增加有需要的植物中的氮获取。所述方法可以包括生成用于对有需要的植物进行田间处理的接种物。所述接种物可以包含一种溶液，所述溶液包含有效量的至少一种活的内生菌菌株，其中所述活的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的。所述方法可以进一步包括将接种物应用于有需要的植物，其中所述活的内生菌菌株接触至少一种与所述植物相关的固氮菌株，导致所述固氮菌株的固氮率与在缺少所述活的内生菌菌株时所述固氮菌株的固氮作用率相比更高。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种协同地增加至少一种活的固氮菌株的固氮作用的方法。所述方法可以包括将至少一种活的内生菌菌株与包含有效量的至少一种活的内生菌菌株的有效量的溶液接触，其中所述活的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离的；以及其中所述活的固氮菌株与所述活的内生菌菌株的接触导致所述活的固氮菌株的固氮率与在缺少所述活的内生菌菌株时所述活的固氮菌株的固氮率相比更高。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种接种物，所述接种物协同地增加有需要的植物中的氮获取。所述接种物可以包含有效量的源自冻干制剂的溶液，所述冻干制剂包含有效量的至少一种活的分离的内生菌菌株，其中所述活的分离的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的。
在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQ ID NO：1、5和10所示的16S核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQID NO：1所示的16S核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQ ID NO：5所示的16S核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQ ID NO：10所示的16S核酸序列。
在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO：2-4、6-9和11-14中所示序列的一种或多种标志物。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO：2-4中所示序列的三种标志物。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO：6-9中所示序列的四种标志物。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO：11-14中所示序列的四种标志物。
在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌(Sphingobium)物种。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于亲和素链霉菌(Herbiconiux)物种。
在一些实施方案中，所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是初级基质。在一些实施方案中，所述初级基质是鹅卵石或沙子。在其他实施方案中，所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是熔岩场、沙漠、干旱环境、半干旱环境和/或烧焦的环境之一。
在一些实施方案中，所述有需要的植物选自农作物、生物能源农作物、林业树木、园艺植物、香料或药用植物以及草坪草的组。
在一些实施方案中，所述接种物包含溶液，所述溶液包含有效量的两种或更多种活的分离的内生菌菌株。
在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株的有效量是与不存在所述至少一种活的分离的内生菌菌株时与所述植物相关的固氮菌株的固氮作用率相比，导致与所述植物相关的所述固氮菌株将固氮作用增加至少5％的量。
在一些实施方案中，所述接种物可以进一步包含至少一种活的分离的固氮菌株。
在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的协同内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是0到20的整数。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1:1+n，其中n是0到20的整数。
在一些实施方案中，将所述接种物施用于有需要的植物，并且所述至少一种活的分离的内生菌菌株与至少一种与所述植物相关的固氮菌株接触，导致所述植物相关固氮菌株与在不存在至少一种分离的内生菌菌株时该植物相关固氮菌株的固氮作用率相比以更高的比率固氮。
附图说明
当结合附图时，通过参考以下详细描述，本发明的上述方面和许多附带优点将变得更加容易理解，其中：
图1.稀释的培养物的乙炔还原测定显示，协同伙伴可以增加多种固氮生物的固氮活性。尽管效果因菌株而异，但所有协同伙伴都增加了至少两种固氮生物的活性。白色条表示单独测试的固氮生物，而条纹条表示具有协同伙伴的混合物。
图2.稀释的悬浮液的乙炔还原测定显示，协同菌株的混合物增加了多种固氮生物的活性。将协同混合物作为含有每种菌株OD600 0.2的单一悬浮液处理。白色条表示单独测试的固氮生物，而条纹条表示具有协同菌株的混合物。
图3A至3B.在无氮培养基(NFM)(A)或NFM(B)中稀释的悬浮液中稀释的培养物的乙炔还原测定。A和B都显示，随着协同菌株与固氮生物的比例的增加，固氮作用的活性也增加。白色条表示单独测试的固氮生物，而条纹条表示具有协同菌株的混合物。
图4.用固氮生物的混合物进行乙炔还原测定，所述固氮生物以单细胞悬浮液处理，每种固氮生物的OD600为0.2，其与多种与WW5相关的菌株混合。结果显示，在伙伴菌株中看到的协同活性通常不是细菌的共同特征。
具体实施方式
本发明基于如下令人惊讶和新颖的发现，即从营养受限和/或水分受胁迫的环境中分离出的协同性植物相关细菌菌株，可以包括但不限于夏威夷熔岩层定殖植物或鹅卵石为主的河岸带，可以协同地增加任何固氮菌株的固氮作用，无论该固氮菌株是自由存活的、与所述植物关联的，还是该固氮菌株是作为与内生菌菌株组合的一部分添加的(例如，作为植物的接种物或本领域普通技术人员众所周知的任何其他手段)。所公开的内生菌菌株是协同伙伴，当与固氮菌株组合时其组合的固氮作用能力大于它们各自固氮作用能力的总和。因此，一种或多种活的协同细菌菌株的组合可用于田间处理以增加植物中的氮获取。在一些实施方案中，将一种或多种活的内生菌菌株添加到植物周围的土壤中，协同地增加与所述植物相关的已有固氮菌株的固氮作用。在其他实施方案中，将一种或多种活的内生菌菌株与一种或多种活的固氮菌株以组合方式添加，并将该组合添加到植物周围的土壤中，以协同地增加与植物相关的已有固氮菌株的固氮作用。在其他实施方案中，所述组合(例如，内生菌菌株和固氮菌株)可用作种子处理/包衣的一部分，或通过本领域普通技术人员众所周知的手段优化植物生长或种子发育的其他应用。
如实施例中更详细地描述的，将这些内生菌菌株分离、表征并配制成特定组合以制备成植物接种物。使用乙炔还原测定，当与固氮菌株组合时，所述内生菌菌株表现出固氮作用和协同作用，并且固氮菌株的多样性观察到的效果将向本领域技术人员表明，所公开的内生菌菌株可以作为任何固氮菌株的协同伙伴以协同地增加其固氮作用能力。因此，这些数据表明了使用一种或多种活的内生菌菌株作为协同伙伴来增加宿主植物的固氮作用的用途，可以减少对外部化肥的需求，为化肥提供了一种环境友好且经济上可持续的替代品。
根据上文所述，在本发明的一个方面，本发明提供了一种协同地增加有需要的植物中的氮获取的方法。所述方法可以包括生成用于对有需要的植物进行田间处理的接种物。所述接种物可以包含溶液，所述溶液包含有效量的至少一种活的内生菌菌株，其中所述活的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的。所述方法可以进一步包括将接种物应用于有需要的植物，其中所述活的内生菌菌株与和所述植物相关的至少一种固氮菌株接触，导致所述固氮菌株的固氮率与在不存在所述活的内生菌菌株时固氮菌株的固氮率相比更高。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种协同地增加至少一种活的固氮菌株的固氮作用的方法。所述方法可以包括将至少一种活的固氮菌株与有效量的溶液接触，所述溶液包含有效量的至少一种活的内生菌菌株，其中所述活的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的；并且其中所述活的固氮菌株与所述活的内生菌菌株的接触导致该活的固氮菌株的固氮率与在不存在该活的内生菌菌株时所述活的固氮菌株的固氮作用率相比更高。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种接种物，以协同地增加有需要的植物中的氮获取。所述接种物可以包含有效量的源自冻干制剂的溶液，所述冻干制剂包含有效量的至少一种活的分离的内生菌菌株，其中所述活的分离的内生菌菌株是从在营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离的。
如本文所用，“固氮作用”、“氮获取”和这些短语的其他语法变化描述了双原子氮被转化为含氮有机或无机分子以提供能够被生物体用于代谢的形式的氮的化学过程。
所述一种或多种活的分离的内生菌菌株任选地从一个植物属、两个植物属、三个植物属、四个植物属、五个植物属、六个植物属、七个植物属、八个植物属、九个植物属、十个植物属或十个以上植物属中分离。在另一个实施方案中，所述活的分离的内生菌菌株任选地分离自一个植物物种、两个植物物种、三个植物物种、四个植物物种、五个植物物种、六个植物物种、七个植物物种、八个植物物种、九个植物物种、十个植物物种或多于十个植物物种。
从中分离出所述一种或多种活的内生菌菌株的植物属和物种包括、但不限于在营养受限和/或水分受胁迫的条件下存活的植物。在一些实施方案中，营养受限和/或水分受胁迫的条件包括熔岩、沙子、沙漠、岩石、半干旱和干旱气候、热带、高污染、高盐度、高矿化度、烧焦、辐射暴露、低氧、海洋以及缺乏任何单一必需或优选营养物的土壤或表土。
在一些实施方案中，从中分离出所述一种或多种活的内生菌菌株的植物属和物种包含作为初级基质的营养受限和/或水分受胁迫的环境。如本文所用，术语“初级基质”是指植物生长的表面是新形成的土地。在一些实施方案中，所述初级基质是鹅卵石或沙子。在一些实施方案中，所述初级基质是熔岩。所述熔岩可以是熔岩层、熔岩场或熔岩平原。此外，所述初级基质可能处于高污染、高盐度、高矿化度、烧焦、辐射暴露、低氧、低水、海洋、干旱、半干旱或热带的环境中。典型地，这种初级基质缺乏营养，因此，可以建立初始生长的植物被进化成能够弥补这种可获得营养的缺乏。这种弥补可以包含存在精炼的微生物群落，以促进营养物质(如固氮)的加工。
如本文所用，术语“菌株”是指微生物(例如细菌)的遗传变种或亚型。
所述一种或多种活的内生菌菌株包括从一个细菌属、两个细菌属、三个细菌属、四个细菌属、五个细菌属、六个细菌属、七个细菌属、八个细菌属、九个细菌属、十个细菌属或十个以上细菌属中分离和选择的细菌。在一个实施方案中，所述多种活的内生菌菌株含有6至8个细菌属。所述一种或多种活的内生菌菌株包含从一个细菌物种、两个细菌物种、三个细菌物种、四个细菌物种、五个细菌物种、六个细菌物种或六个以上细菌物种中分离并选择的细菌。在一个实施方案中，所述多个活的内生菌菌株是从一个指定属的一至六个物种中分离并选择的。
在其他实施方案中，所述一种或多种活的内生菌菌株是辅助菌株，所述辅助菌株协同地增加任何固氮菌株的固氮率。如本文所用，“协同地”、“协同的”或这些单词的任何语法变体都是指所述至少一种活的内生菌菌株(即辅助菌株)和任何固氮菌株之间的相互作用，其产生的固氮作用的组合增加大于其个体效应(即固氮内生菌)的总和，或与缺少所述内生菌菌株时所述固氮菌株的固氮率相比更大的效应。
在一些实施方案中，所述一种或多种活的内生菌菌株包含SEQ ID NO:1、5和10所示的16S rRNA序列。在一些实施方案中，所述一种或多种活的内生菌菌株包含SEQ ID NO:1所示的16S rRNA序列。在一些实施方案中，所述活的内生菌菌株包含SEQ ID NO:5所示的16S rRNA序列。在一些实施方案中，所述活的内生细菌包含SEQ ID NO:10所示的16S rRNA序列。
在其他实施方案中，所述一种或多种活的内生菌菌株包含至少一种标志物，所述标志物包含SEQ ID NO:2-4、6-9和11-14中所述的序列。在一些实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:2-4中的所有三种标志物。在一些实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:2-4中的至少两种标志物。在其他实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:2-4中的至少一种标志物。在其他实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:6-9中的所有四种标志物。在一些实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:6-9中的至少三种标志物。在一些实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:6-9中的至少两种标志物。在其他实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:6-9的至少一种标志物。在其他实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:11-14中的所有四种标志物。在一些实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:11-14中的至少三种标志物。在一些实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:11-14中的至少两种标志物。在其他实施方案中，所述活的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO:11-14中的至少一种标志物。
在其他实施方案中，所述一种或多种活的分离的内生菌菌株包含来自至少一个鞘脂菌物种和至少一个亲和素链霉菌物种的菌株。在其他实施方案中，所述活的分离的内生菌菌株包含SEQ ID NO:1所示的16S rRNA序列，包含选自SEQ ID NO:2-4中述的所有三种标志物，并且来自鞘脂菌物种(即辅助菌株1，WW5)。在其他实施方案中，所述活的分离的内生菌菌株包含SEQ ID NO:5所示的16S rRNA序列，包含选自SEQ ID NO:6-9中的所有四种标志物，并且来自亲和素链霉菌物种(即辅助菌株2，11R-B)。在其他实施方案中，所述活的分离的内生菌菌株包含SEQ ID NO:10所示的16S rRNA序列，包含选自SEQ ID NO:11-14中的所有四种标志物，并且来自鞘氨醇菌物种(即辅助菌株3，HT1-2)。在一些实施方案中，所述一种或多种活的分离的内生菌菌株包含选自WW5、11R-B和HT1-2的至少一种菌株。在其他实施方案中，所述活的分离的内生菌菌株包含选自WW5、11R-B和HT1-2的至少两种菌株。在其他实施方案中，所述活的分离的内生菌菌株包含选自WW5、11R-B和HT1-2的三种菌株。
如本文所用，术语“标志物”是指每个内生菌菌株特有的核苷酸序列。例如，WW5菌株(SEQ ID NO:1)包含标志物contig_60_9(SEQ ID NO:2)、标志物contig_68_34(SEQ IDNO:3)和标志物contig_89_19(SEQ ID NO:4)。11R-B菌株(SEQ ID NO:5)包含标志物contig_2_456500(SEQ ID NO:6)、标志物contig_3_405000(SEQ ID NO:7)、标志物contig_4_300500(SEQ ID NO:8)和标志物contig_5_325500(SEQ ID NO:9)。HT1-2菌株(SEQ IDNO:10)包含标志物contig_3_1377(SEQ ID NO:11)、标志物contig_1_601(SEQ ID NO:12)、标志物contig_5_262(SEQ ID NO:13)和标志物contig_1_592(SEQ ID NO:14)。
在一些实施方案中，所述至少一种固氮细菌菌株是或包含内生菌菌株。这可以是与从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离的所述一种或多种活的内生菌菌株中包含的菌株相同的菌株。在其他实施方案中，所述固氮内生菌菌株是与从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离的一种或多种活的内生菌菌株不同的菌株。在其他实施方案中，所述至少一种固氮细菌菌株是或包含非内生细菌菌株。在其他实施方案中，所述至少一种固氮细菌菌株是固氮菌株。
本领域的普通技术人员将理解，氮是所有植物所需的大量营养素。因此，本文公开的微生物菌株(例如，一种或多种活的内生菌菌株)可以通过与任何固氮菌株的协同活性而在任何植物中提供额外的氮。在一些实施方案中，植物可以包括、但不限于农作物。在一些实施方案中，所述农作物可以包括、但不限于玉米、小麦、大麦、水稻、油菜、马铃薯和大豆。在其他实施方案中，所述农作物可包括、但不限于水果、坚果和蔬菜作物，其包括、但不限于番茄、草莓、香蕉、羽衣甘蓝、菠菜、生菜、南瓜、芹菜、西兰花、柑橘、杏仁、榛子、核桃、樱桃、苹果、梨和桃树。在一些实施方案中，所述农作物可以包括、但不限于生物能源作物。在一些实施方案中，所述生物能源作物可以包括、但不限于杨树、桉树、芒、柳枝稷和柳树。
在其他实施方案中，所述植物可以包括林业树木。在一些实施方案中，所述林业树木可以包括、但不限于花旗松、异叶铁杉、西部红雪松、海滩松、黄松、橡树、枫树、梣木、云杉和红木。
在其他实施方案中，所述植物可以包括园艺植物。在一些实施方案中，所述园艺植物可以包括、但不限于映山红、杜鹃花、玫瑰和绣球花。
在其他实施方案中，所述植物可以包括香料或药用植物。在一些实施方案中，所述香料或药用植物可以包括、但不限于人参、孜然、芫荽和姜黄。
在其他实施方案中，所述植物可以包括草坪草。在一些实施方案中，所述草坪草可以包括、但不限于草地早熟禾、羊茅和多年生黑麦草。
在一些实施方案中，本文所述的一种或多种微生物菌株以及所公开的协同菌株可以直接添加到土壤中以提高固氮菌株的活性。在其他实施方案中，可以将本文所述的一种或多种微生物菌株与所公开的协同菌株一起直接添加到包含至少一种固氮菌株的植物中，以提高固氮菌株的活性。所述协同菌株(例如内生菌菌株)可以以本领域普通技术人员众所周知的任何方式应用于植物。例如，在一些实施方案中，所述协同菌株通过叶面喷雾应用于植物，作为溶液(例如接种物)应用于有根或无根的植物切条或应用于组织培养植物。在一些实施方案中，所述协同菌株可以添加到沟渠或用于植物和/或作物灌溉的灌溉溶液中。在其他实施方案中，所述协同菌株可以作为干粉或本领域普通技术人员众所周知的任何方式的组合添加到土壤中。一旦协同菌株被掺入植物中，这些植物的切条也可以继续含有这些协同菌株，无限地繁殖植物-微生物伙伴关系。因此，含有所述协同菌株的植物或种植培养基的任何部分都可以是协同菌株的持续的来源。
在一些实施方案中，所述分离的内生菌菌株可以在分离程序后冻干。在其他实施方案中，所述分离的固氮菌株可以在分离程序后冻干。在其他实施方案中，本文公开的一种或多种微生物菌株可以在分离程序后冻干。微生物菌株(例如，内生菌菌株、固氮菌株和/或其他公开的微生物菌株)可以按照本领域普通技术人员众所周知的任何技术进行冻干。
如本文所用，术语“接种物”及其语法变体是指将植物与接种物组合物接触。在一些实施方案中，通过喷雾、浸泡、除尘、吹气和本领域已知的其他技术应用接种物。所述接种物组合物也可以混合到土壤或种植植物种子(之前或之后)的其他基质中。在一些实施方案中，所述接种物可以包含溶液，所述溶液包含有效量的至少一种活的内生菌菌株。在一些实施方案中，所述接种物可以包含溶液，所述溶液包含有效量的至少两种活的内生菌菌株的溶液。在其他实施方案中，所述接种物可以包含溶液，所述溶液包含有效量的三种或更多种活的内生菌菌株。在一些实施方案中，所述活的内生菌菌株是活的分离的菌株。如本文所用，“分离的菌株”是指100％纯的菌株，所述菌株不包含任何污染性菌株。例如，活的分离的内生菌菌株WW5是100％纯的WW5菌株，其没有任何污染性菌株。
在一些实施方案中，所述接种物包含至少一种活的分离的内生菌菌株与至少一种活的分离的固氮菌株的比例。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的所述比例可以是1+n:1，其中n是0到20的整数。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的所述比例可以是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1和20:1。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的所述比例可以是1:1+n，其中n是0到20的整数。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的所述比例可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19和1:20。在其他实施方案中，两种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的所述比例可以是1+n:1+n:1，其中n是0到20的整数。在一些实施方案中，第一内生菌菌株和第二内生菌菌株的n可以相同。例如，所述比例可以是1:1:1、2:2:1、3:3:1、4:4:1、5:5:1、6:6:1、7:7:1、8:8:1、9:9:1、10:10:1、11:11:1、12:12:1、13:13:1、14:14:1、15:15:1、16:16:1、17:17:1、18:18:1、19:19:1和20:20:1。在其他实施方案中，第一内生菌菌株和第二内生菌菌株的n可以不同。例如，所述比例可以是1:2:1、2:3:1、3:4:1、4:5:1，以及本领域普通技术人员可以确定的任何变化。
在其他实施方案中，所述接种物可进一步包含溶液，所述溶液包含活固氮生物的至少一个菌株。在一些实施方案中，所述接种物可进一步包含溶液，所述溶液包含活固氮生物的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个菌株。在一些实施方案中，所述活固氮菌株是活的分离的固氮菌株。在一些实施方案中，所述固氮菌株是HT1-9，物种是固氮根瘤菌属的种(Azorhizobium sp.)，其系统发育群是α-变形菌(Alphaproteobacteria)。在一些实施方案中，所述固氮菌株是SherDot2(SD2)，物种是固氮根瘤菌属的种，系统发育群是α-变形菌。在一些实施方案中，所述固氮菌株是WP4-2-2，其物种是伯克霍尔德氏菌的种(Burkholderia sp.)，系统发育群是β-变形菌(Betaproteobacteria)。在一些实施方案中，所述固氮菌株是WPB，其物种是越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)，系统发育群是β-变形菌(Betaproteobacteria)。在一些实施方案中，所述固氮菌株是WP5，其物种是槭树拉恩氏菌(Rahnella aceris)以及其系统发育群是γ-变形菌(Gammaproteobacteria)。在一些实施方案中，所述固氮菌株是R10，其物种是槭树拉恩氏菌，其系统发育群是γ-变形菌。在其他实施方案中，所述固氮菌株是SherDot1(SD1)，其物种是拜氏固氮菌(Azotobacter beijerinckii)，其系统发育群γ-变形菌。
如本文所用，“有效量”及其语法变体是指至少一种活的内生菌菌株的量，所述量导致在培养物中分离或与植物相关联的固氮菌株的固氮作用与在不存在所述内生菌菌株时在培养物中分离的或与植物相关联的固氮菌株的固氮作用率相比增加至少5％。选择的固氮菌株的固氮作用的增加可以提高至少5％。例如，所述固氮作用的增加可以是至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％或至少超过30％。在一些实施方案中，所述固氮作用的增加可以是至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％。在一些实施方案中，选择的固氮细菌的固氮作用可以提高约2倍以上，例如约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍或更多倍(例如，超过100％的固氮作用，直至并超过1000％或更多的固氮作用)。
选择的固氮菌株的固氮作用可以提高约5％至2000％之间、约10％至1500％之间、约15％至1000％之间、约15％至800％之间、约20％至800％之间、约25％至800％之间和约30％至750％之间。在一些实施方案中，固氮作用可以提高约50％至500％之间、约50％至400％之间、约50％至200％之间和约75％至100％之间。
除非本文中明确定义，否则本文中使用的所有术语具有与本发明领域技术人员相同的含义。为了方便起见，这里提供了说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。提供这些定义是为了帮助描述特定的实施方案，而不是为了限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求书限定。
在权利要求书和说明书中使用术语“或”表示“和/或”，除非明确指出仅指各选项或各选项是互斥的，尽管本公开支持仅指各选项和“和/或”的定义。
除非特别注明，否则词语“一个”和“一种”在权利要求书或说明书中与词语“包含/包括”结合使用时表示一个(种)或多个(种)。
除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求中，“包含”、“包括”等词语应以开放和包容的意义解释，而不是封闭、排他性或穷举的意义。例如，术语“包含/包括”可以理解为表示“包括、但不限于”。术语“基本上由…组成”或其语法变体表示所述主题可以包括权利要求中未提及的其他元素，但其不会实质性影响所要求保护的主题的基本和新颖特征。此外，在本申请中使用的“本文”、“以上”和“以下”以及类似含义的词语应指本申请的整体，而不是本申请的任何特定部分。使用单数或复数的单词也分别包括复数和单数。术语“约”表示高于或低于所述参考数的微小变化范围内的数字。例如，“约”可以指在指定参考数以上或以下10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％范围内的数字。
本文公开了可用于、可与之结合使用、可用于制备所公开的方法和组合物或是所公开的方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。据了解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，特别考虑各种单独和集体组合中的每一种，即使可能不会明确提及这些化合物的每一种和每一种单一组合和排列。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于所述方法中的步骤。因此，任何前述实施例的特定元素可以组合或替代其他实施方案中的元素。例如，如果可以进行各种附加步骤，则可以理解，这些附加步骤中的每一个都可以用所公开方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集都是特别预期的并且应该被认为是公开的。另外，应理解，本文描述的实施方案可以使用任何合适的材料来实现，例如本文其他地方描述的或本领域已知的材料。
本文引用的出版物及其引用的主题在此通过引用具体地整体并入本文。
实施例
本发明描述了从植物中分离的多个活的内生菌菌株的分离、纯化、制备接种物和活性的证明，以用于接种植物，向植物提供营养而不需要过量的化肥，以及用于协同地增加多个固氮菌株中固氮作用的方法。
实施例1
分离协同菌株
对生长在营养缺乏或水分受限的环境中的植物进行取样并进行表面灭菌。然后使用研钵和研杵将大约10克组织研磨成15毫升无菌限氮组合碳培养基(nitrogen-limitedcombined carbon medium，NLCCM)液。然后将所得浆料低速离心以沉淀植物的碎块。然后将NLCCM的上清液进行连续稀释。为了选择固氮生物，将稀释液平铺到NLCCM以及无氮的NFCCM琼脂板上。然后将分离的菌落在新鲜的NLCCM或NFCCM琼脂板上重划线培养。当从划线培养板上分离的菌落在甘露醇-谷氨酸Luria液(MG/L)上重新划线培养时，富营养培养基允许其生长和分离多种非固氮菌株，其在限氮或无氮板上与固氮生物已经形成看起来像一个集落的群体。富营养培养基上的这些新生菌株是协同作用的候选菌株，通过乙炔还原测试了它们增加固氮生物中固氮作用的能力。
实施例2
乙炔还原测定
细菌的稀释悬浮液：
细菌在30℃在营养丰富的MG/L琼脂板上生长。固氮菌株也在限氮的NLCCM琼脂板上生长。然后将细菌悬浮在液体NLCCM中，或在指明的情况下悬浮在无氮培养基(NFM)中(Doty,S.L.,Oakley,B.,Xin,G.等人，Diazotrophic endophytes of native blackcottonwood and willow.Symbiosis 47,23-33(2009))。优选在NL-CCM上生长的固氮生物的细胞。然后将每种菌株的细胞稀释至在600nm的光密度(OD600)为0.4，除非图例中另有说明。
细菌培养物：
细菌在30℃在MG/L琼脂板上生长。固氮菌株也在NL-CCM琼脂板上生长。选择分离的菌落，优选在NL-CCM上生长的固氮生物的细胞，在30℃在无甘露醇的50ml MG/L中生长36小时。将培养物以5000x g离心，并在NFM中洗涤，重复此过程两次。将每个菌株的培养物在NFM中稀释至OD600为0.4。
菌株比例
当比较比例时，将固氮生物稀释至OD600 0.5，同时稀释协同菌株以制造一系列OD600为0.05、0.1、0.5、2.5和5.0的稀释物，使得当混合在一起时，形成固氮生物与协同伙伴的一系列比例。
乙炔还原：
乙炔还原成乙烯被用作固氮作用活性的标志，因为固氮酶同时进行两种化学反应。通过将稀释的悬浮液或稀释的培养物等份混合，使用150ul的总体积，将其添加到用6mlNLCCM琼脂制备的17ml琥珀色隔膜小瓶中，从而制造细胞混合物。然后向所产生的11ml顶部空间中加入0.1ml的98.6％乙炔。除非另有说明，否则在30℃下温育两天后，通过从22ml气相色谱小瓶中除去5m的顶部空间并用实验小瓶中的5ml的顶部空间将其代替，以进行采样。使用HayeSep R色谱柱，通过带有火焰离子化检测器(GC-FID，TRACE GC ULTRA，ThermoScientific)的气相色谱仪分析样品。使用高纯度N2(g)作为运载体，H2(g)作为燃料以及合成空气作为氧化气体。然后使用乙烯浓度的标准曲线将峰面积转换为百万分之几(ppm)。
实施例3
协同菌株的测序
三个协同菌株的全基因组测序表明，所有三个菌株都是独特且新颖的物种。
表1.使用Type(Strain)Genome Server(TYGS)方案鉴定菌株。TYGS数据库由>15000个模型菌株物种/亚种基因组组成。d4得分≤70.0％是潜在新物种的阈值(1-2)。
这三种菌株(例如WW5、11R-B1和HT1-2)的基因组的菌株特异性区域。
除了使用16s核糖体基因进行菌株鉴定(SEQ ID NO:1、5和10)，鞘脂菌WW5、亲和素链霉菌11R-B1和鞘脂菌HT1-2的菌株特异性引物是使用改编自Stets等人(Stets MI,等人，Quantification of Azospirillum brasilense FP2 bacteria in wheat roots bystrain-specific quantitative PCR.Appl Environ Microbiol.2015；81(19):6700-6709.doi:10.1128/AEM.01351-15)和Jo等人(Jo,J.,等人，Microbial communityanalysis using high-throughput sequencing technology:a beginner’s guide formicrobiologists.JMicrobiol.58,176-192(2020))的方案设计的。对于每个菌株，使用来自BBMap(v38.96)的shred.sh(v.2.3.7)程序将FASTA基因组序列分成500bp的非重叠区段。从NCBI参考序列数据库下载，从每个属(鞘脂菌属和亲和素链霉菌属)的7个完整基因组构建本地数据库。以下步骤已在Geneious Prime(v2022.1.1版本2022-03-15 11:43)中完成。对每个菌株的候选序列的区段FASTA文件进行BLASTn搜索，搜索本地数据库，并保留没有命中的区段。然后对过滤后的候选序列列表进行BLASTn搜索，搜索由发明人内部实验室的菌株组成的完整基因组的第二个本地数据库，再次仅保留没有命中的区段。最后，将剩余的候选序列在线提交，作为对完整NCBI核苷酸数据库的问询，并将无匹配的区段确定为独特序列，用于设计菌株特异性引物。
为每个独特序列设计了一个引物组。引物在Geneious Prime中设计，使用Primer3插件(v2.3.7)，采用以下设置：i)最佳扩增子长度400nt，范围300-500nt，ii)引物长度22-25nt，iii)Tm范围57-63degC，引物之间的最大Tm差异在2degC之间，iv)以及最佳％GC50％，范围40％-60％。将得到的产物(引物组和扩增子序列一起)定位到它们各自菌株的基因组装配体，并将完全落在CDS内的产物用作候选引物组。
对WW5共鉴定出47个菌株特异性引物组(SSP)。其中，有18个SSP靶向编码序列(CDS)，其中3个在已知的基因中。引物组和预测的产物包括在表2中。对11R-B共鉴定出29个菌株特异性引物组(SSP)。其中，10个SSP靶向有注释的编码序列(CDS)，其中只有一个靶向已知的基因，其余9个SSP靶向注释为假定蛋白的CDS。表2中包括针对该单个鉴定出的基因命中以及落在假定蛋白中的3个任意选择的引物组的4个引物组和预测产物，。对HT1-2共鉴定出217个菌株特异性引物组(SSP)。其中，89个SSP靶向被注释的编码序列(CDS)，其中7个靶向已知的基因，其余82个SSP靶向注释为假定蛋白的CDS。表2中包括靶向已鉴定基因的2个SSP和靶向假设蛋白的2个SSP的引物组和预测的产物。
表2.候选引物组以及扩增子序列
实施例4
单个协同菌株在固氮生物中诱导更高的活性
稀释的培养物的乙炔还原测定显示，协同伙伴可以增加多种固氮生物的固氮活性。图1。尽管效果因菌株而异，但所有协同伙伴都增加了至少两种固氮生物的活性。在图1中，白色条表示单独测试的固氮生物(例如WP5、HT1-9和SherDot2(SD2))。如对WP5固氮菌株所示，添加协同伙伴菌株(条纹棒)WW5和HT1-2导致固氮作用的最大协同增加，如乙炔还原成乙烯所示。与WP5固氮菌株类似，添加协同伙伴菌株11RB和HT1-2导致固氮作用的最大的协同增加。对SD2固氮菌株观察到类似的结果。然而，所有三种协同伙伴菌株(例如WW5、11RB和HT1-2)均协同地增加了SD2固氮菌株的固氮作用。
协同混合物(synergymix)诱导更高的乙炔还原
稀释的悬浮液的乙炔还原测定显示，协同菌株的混合物增加了多种固氮生物(白条)的活性。将协同混合物作为含有每种菌株OD600 0.2的单一悬浮液处理。如图2所示，如乙炔还原成乙烯所示，包含协同伙伴菌株HT1-2和11RB的协同混合物(条纹条)增加了固氮作用。在多种固氮菌株(白色条)中观察到固氮作用的增加，包括WP5、WP4-2-2、HT1-9、SD2、R10和SD1。
表现出增加的固氮活性的示例性固氮菌株代表了固氮物种的多样化选择。因为协同菌株(例如WW5、11RB和HT1-2)在固氮菌株的这种多样化选择中增加了固氮作用，所以本领域技术人员能够认识到该结果(即协同菌株增加固氮作用)代表了所有固氮菌株。因此，本实施例中公开的结果不限于在所要求保护的发明的各实施方案中公开的具体固氮菌株，而是可以应用于所有固氮菌株。
表3.固氮菌株的多样性
与固氮生物温育后，协同菌株随着浓度的增加而诱导更多的活性
与固氮菌株温育3天后，协同菌株诱导的活性随着浓度的增加而增加。在无氮培养基(NFM)中稀释培养物的乙炔还原测定显示，随着协同菌株与固氮生物比例的增加，固氮作用活性也增加。如图3A所示，(1)将协同菌株(条纹条)(例如HT1-2和11RB)与固氮菌株(例如WP5和SD2)温育三天，以及(2)增加协同菌株与固氮菌株(白色条)的比例(例如5:1和10:1)导致协同固氮作用的增加。
与固氮生物温育4天后，协同菌株诱导的活性随着浓度的增加而增加。NFM中稀释悬浮液的乙炔还原测定显示，随着协同菌株与固氮生物之例的增加，固氮活性也增加。如图3B所示，(1)将协同菌株(条纹条)(例如11RB和WW5)与固氮菌株(白色条)(例如HT9和SD2)温育四天以及2)增加协同菌株与固氮菌株的比例(例如5:1和10:1)导致协同固氮作用的增加。
协同活性通常不是细菌的共同特征
与WW5相关的菌株一起温育3天后对WP5和WPB还原乙炔的影响。用固氮菌株的混合物进行乙炔还原测定，所述固氮菌株被当作单细胞悬浮液处理，每种固氮生物的OD600为0.2，其与多种与WW5相关的菌株混合，如图4所示。在图4中，首先将与WW5相关的各种菌株与固氮菌株的混合物温育3天。如图3A所示，将协同菌株与固氮菌株温育至少3天增加了固氮作用。见图3A和3B。然而，如图4所示，在固氮菌株的混合物中温育WW5协同菌株如预期的那样增加了固氮作用，但是对于与WW5协同菌株相关的各种菌株没有观察到该结果。这些结果很重要，因为这些结果表明，在所公开的伙伴菌株中看到的协同活性对于这些内生菌菌株是独特的，并且通常不是细菌的共同特征。
虽然已经示出并描述了描述性实施方案，但是可以理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对其中进行各种更改。
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<223> 合成的
<400> 1
atcaaacttg agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcatgc ctaatacatg 60
caagtcgaac gagatcttcg gatctagtgg cgcacgggtg cgtaacgcgt gggaatctgc 120
ccttgggttc ggaataactt ctggaaacgg aagctaatac cggatgatga cgtaagtcca 180
aagatttatc gcccaaggat gagcccgcgt aggattagct agttggtggg gtaaaggctc 240
accaaggcga cgatccttag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca 300
cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga 360
tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt tacccgggat 420
gataatgaca gtaccgggag aataagctcc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 480
acggagggag ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggctattc 540
aagtcagagg tgaaagcccg gggctcaacc ccggaactgc ctttgaaact agatagcttg 600
aatccaggag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggaag 660
aacaccagtg gcgaaggcgg ctcactggac tggtattgac gctgaggtgc gaaagcgtgg 720
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgata actagctgtc 780
agggcacatg gtgttttggt ggcgcagcta acgcattaag ttatccgcct ggggagtacg 840
gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcctgc acaagcggtg gagcatgtgg 900
tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac caacgtttga catccctatc gcggatcgtg 960
gagacacttt ccttcagttc ggctggatag gtgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1020
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgcct ttagttgcca 1080
gcatttagtt gggtactcta aaggaaccgc cggtgataag ccggaggaag gtggggatga 1140
cgtcaagtcc tcatggccct tacgcgttgg gctacacacg tgctacaatg gcgactacag 1200
tgggcagcca cctcgcgaga gggagctaat ctccaaaagt cgtctcagtt cggatcgttc 1260
tctgcaactc gagagcgtga aggcggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320
gaatacgttc ccaggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gattcactcg 1380
aaggcgttga gctaaccgta aggaggcagg cgaccacagt gggtttagcg actggggtga 1440
agtcgtaaca aggtagccgt aggggaacct gcggctggat cacctccttt cta 1493
<210> 2
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
taatcgggct acctgggatc gacttgtctt ttgtgacctg aacaagctgc aagccggcct 60
ttccttgctc aacgccaatc cacgcaaaat tagtaccgtg gaccgaaatg cctgcccgct 120
cgccttcacg tttgaactcg gggcgcataa gggttgtcgc agtaaacgag gttgcgggca 180
gcttttggga gaggatagct ccattctcat agagatcctg agatcctgtc accgatttga 240
gccgaagcca cccgctttcg acggacatcc agtctgctga ggggttgcta ccaaattgcc 300
aggctaagct tatcctgtca gcgaaatcgt cgtcagacac cggcgccgct atcggctgcg 360
ctgcgacttt aggtttttga tgccgaaaaa caggttgacc 400
<210> 3
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
cagcttacgc aattgcagga gattactggt ccacattgca atccatatct gacgatagct 60
gtttccggca cgctggcggc aaagacattg aattttgctg tgaccgacat atccggcggc 120
cttccgcatg atcgtgttct ttcgaccatc gattatctgc ggcaccttca tcatgccctt 180
cccaatcagg tgaaggtgca tgacaggcct gttgattttg tgtttcaggc agaagatgta 240
cctgtgaata ttccaagcgt atcatgggaa acccggagat cctgggacca aatcatattg 300
gttccagatc tctattattt caccagtcag ggatatgaag atgctttcat tggcaccacg 360
ccatggaaca tgcggcaaaa caagatcata tggcgcggat c 401
<210> 4
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
gcccggaata agtttcaagc gggatggagc gatcgtccgg ttgacactgg ataagcctga 60
gcgcttctcc gtccagtttg acaatgaccg gctacacaat ctccatattg tcgcgggcgc 120
cctggtaccc gagcaatccc agtccgacgg aattacctat tatggacctg ggcttcacat 180
ccccgccgac ggaagcaatc ggtttccggt gaaatcgggt gatcgtatct atctggcagg 240
aggcgcagtt ctccagggct cgtttgccct ggatcatgtc aaagacgtca aaatctctgg 300
tcggggcctt ctctacaatc ccggtagcgc catcgacctg gacggggcta gcggcgtcga 360
tgttcgcgat ctgatcatcg tcaatgacga tcgcagcgat 400
<210> 5
<211> 1528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
tagaaaggag gtgatccagc cgcaccttcc ggtacggcta ccttgttacg acttagtcct 60
aatcaccgat cccaccttcg acggctccct ccaaaaggtt gggccaccgg cttcgggtgt 120
taccgacttt catgacttga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgtgg 180
cgttgctgat ccacgattac tagcgactcc gacttcatga ggtcgagttg cagacctcaa 240
tccgaactga gaccggcttt ttgggattcg ctccacctta cggtattgca gccctttgta 300
ccggccattg tagcatgcgt gaagcccaag acataagggg catgatgatt tgacgtcatc 360
cccaccttcc tccgagttga ccccggcagt ctcctatgag ttcccaccat aacgtgctgg 420
caacatagaa cgagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc 480
tgacgacaac catgcaccac ctgtttacga gtgtccaaag agttgaccat ttctggcccg 540
ttctcgtata tgtcaagcct tggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta atccgcatgc 600
tccgccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt tagccttgcg gccgtactcc 660
ccaggcgggg aacttaatgc gttagctgcg acacggagac cgtggaatgg tccccacatc 720
tagttcccaa cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc 780
tttcgctcct cagcgtcagt tacggcccag agatctgcct tcgccatcgg tgttcctcct 840
gatatctgcg cattccaccg ctacaccagg aattccaatc tcccctaccg cactctagtc 900
tgcccgtacc cactgcaggc tggaggttga gcctccagtt ttcacagcag acgcgacaaa 960
ccgcctacga gctctttacg cccaataatt ccggacaacg cttgcaccct acgtattacc 1020
gcggctgctg gcacgtagtt agccggtgct ttttctgcag gtaccgtcac tttcgcttct 1080
tccctactaa aagaggttta caacccgaag gccgtcatcc ctcacgcggc gttgctgcat 1140
caggcttgcg cccattgtgc aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt 1200
gtctcagtcc cagtgtggcc ggtcaccctc tcaggccggc tacccgtcgt cgccttggtg 1260
agccattacc tcaccaacaa gctgataggc cgcgagtcca tccttgacca aaaaatcttt 1320
ccacccccta accatgcggt tgagggtcgt atccggtatt agacgtcgtt tccaacgctt 1380
atcccagagt caagggcagg ttactcacgt gttactcacc cgttcgccac tgatccacag 1440
agcaagctct gcttcaccgt tcgacttgca tgtgttaagc acgccgccag cgttcgtcct 1500
gagccaggat caaactctcc gtaaatga 1528
<210> 6
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
catcggacga actacccgta ccgtggagaa cgccgcaata gcgtcaagct gctccgacgg 60
tccaattgct ggcaaaaacc agagcccctg gacctcaaat gacagatcct ccctcacgtt 120
gaatccgagg ttacgggcgt actccaggaa agcgagtcga ttactcgggg ccaggttggc 180
ggacggcaag tggacgacta actcgaacgt cgcatccggg ccagatccgg taccggcttt 240
gactttctcc tcaggctgaa acgacgtgat ctcttcgatc tcgcgaattt gggcgtaccg 300
ctcaggcaat tcgctgggat ctaccatcag atcgtgaagc gcctggaagg cttcaagcct 360
gcccgctaca aagatctcac tcgttccaaa ctctttgcc 399
<210> 7
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
gagaaggttc ggtactgaca ccctcgtaat agcgagggcc atccgtgctt ggcaatgaac 60
catctagcgg ctcgcacagg ccatttcgga tcgccgcctc caaactggcg agatcagtga 120
gctcgatcgt cctagcgatc tgggacgcaa tcatcgtgcg agagagggcg gacctgtcgt 180
cgtgagaacg ctcgacgttt tcggccgccg cagtttgaac cgaagccgcg agatctcggc 240
caaccagttg caatactcct gatggagtag aagtgtgctt tttcttcaag cgagtgaccg 300
tttgtgcctt tgccgcatcc catggcaacg cgagtaccca gacattgccg cacagttctc 360
gtactgcggc ctccgaaagc tcttcggcga cggatattag 400
<210> 8
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
actttggtct tccaggctgt tcgggcgaaa gctgggtagg catggacgcc acccaggcgg 60
tgaccgacaa cgggaccgga caggcaatca ttctggcgtt ggccgccagc gacgagaccc 120
acgagtcatg gaagcggttc aacctcgacg cgcaactagt ggtcacctac aactcctacc 180
cggccgaccc caccaacttg ggcatgctga cacctccgcg cacctgcggc accctcaacg 240
atcccgcata catcaacccg accctgccct tcacgctcgc agccacaatc agtgaccccg 300
acgccaccgg gtacggagtg gagggccgat tccgcatcat gccctacaac aacgggggga 360
tcaacgcgat cccagccagc gccccagccg gatatctttc 400
<210> 9
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
tactcacaga gttgcgcgaa tcgacatctg tcagagcgtt agtcagcagg aatgcgattg 60
cccacagtcg atgctcgtca gggacgttcg ggtttgcgct tttcacatcc agcaacgggc 120
tccctggaag aatgtagtgg cgaccctgac agcgaataat gctctcttct attccttcgg 180
ccgtagcctc aataccgaca ggaacgcaaa catccgtcaa ccgcccagct cgtaaccgtt 240
ccgagaagtc gaatcggtcc ttcaacatga ccggcaggtc cttcggtatc ctgaccacag 300
accagccaga cacgcctcca tgcttcttcc agagcgcacg aagaattcgc gcctcaccat 360
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<210> 10
<211> 1493
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
atcaaacttg agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcatgc ctaatacatg 60
caagtcgaac gakmwcttcg gwkmtagtgg cgcacgggtg cgtaacgcgt gggaatctgc 120
ccttgggttc ggaataactt ctggaaacgg aagctaatac cggatgatga cgtaagtcca 180
aagatttatc gcccaaggat gagcccgcgt aggattagct agttggtggg gtaaaggctc 240
accaaggcga cgatccttag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca 300
cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga 360
tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt tacccgggat 420
gataatgaca gtaccgggag aataagctcc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 480
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aagtcagagg tgaaagcccg gggctcaacc ccggaactgc ctttgaaact agatagcttg 600
aatccaggag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggaag 660
aacaccagtg gcgaaggcgg ctcactggac tggtattgac gctgaggtgc gaaagcgtgg 720
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgata actagctgtc 780
agggcacatg gtgttttggt ggcgcagcta acgcattaag ttatccgcct ggggagtacg 840
gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcctgc acaagcggtg gagcatgtgg 900
tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac caacgtttga catccctatc gcggatcgtg 960
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
tattggttga gggtgcccat gatgcgcgcc ggttcaaaaa attttttgac gatacatcat 60
gctcaataat taattgcttt ggcaaagata atgttactgg aacaatagaa aacgaacaaa 120
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cccatgccga taatgatgac ataattcatt ctgtacatca cgattttgat cttgatgttt 240
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cattgcgata cgcaaatcag cgccatcgct tagggtattc t 401
<210> 14
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
ggtcgatacc agacggttga aagacgcaat gttctggtcc tccttcgcat tgacctgaat 60
agcttcaagc cctgcgcgat tgccgggttt caggaccagc agaccaccgg gcatttcctc 120
cgtgtcgata tgctgggttg cgtgatggtg ggtgtctgca atcctcaagt caatatgctc 180
aagcaccgat ggcacttcgt cacataccat gtgccagaac ttcctcatgg ctgttggcag 240
gcgctttagg gtttcgtgcg tgacaaggag gatttcgccg tggtgcggat cagcgtcggc 300
catatgctcg actacgcggg cagcgacgcg atcattgcgc ttcttgccat acagggctgt 360
tacgttcgcg tctggagcga tgcgtttgat ctgcttcac 399
Claims (53)
1.一种在有需要的植物中协同地增加氮获取的方法，所述方法包括：
(i)生成用于有需要的植物的田间处理的接种物，其中所述接种物包含溶液，所述溶液包含有效量的至少一种活的分离的内生菌菌株，其中所述活的分离的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的；以及
(ii)将所述接种物应用于有需要的所述植物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与至少一种和所述植物相关的固氮菌株接触，导致所述固氮菌株与在缺乏所述至少一种活的分离的内生菌菌株时所述固氮菌株的固氮率相比以更高的固氮率固氮。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQ IDNO：1、5和10所示的16S核酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQ IDNO：1所示的16S核酸序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQ IDNO：5所示的16S核酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQ IDNO：10所示的16S核酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQID NO：2-4、6-9和11-14中所示的序列中的一种或多种标志物。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQID NO：2-4中所示的序列中的三种标志物。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQID NO：6-9中所示的序列中的四种标志物。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQID NO：11-14中所示的序列中的四种标志物。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌(Sphingobium)物种。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于亲和素链霉菌(Herbiconiux)物种。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌物种。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养受限和/或水分胁迫的环境是初级基质。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述初级基质是鹅卵石或沙子。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是熔岩场、沙漠、干旱环境、半干旱环境和/或烧焦的环境之一。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述有需要的植物选自农作物、生物能源农作物、林业树木、园艺植物、香料或药用植物以及草坪草的组。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述接种物包含含有有效量的两种或更多种活的分离的内生菌菌株的溶液。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株的有效量是与缺少所述至少一种活的分离的内生菌菌株时与所述植物相关的固氮菌株的固氮率相比，导致与所述植物相关的固氮菌株将固氮作用增加至少5％的量。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述接种物可以进一步包含至少一种活的分离的固氮菌株。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是1到20的整数。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的所述比例为1:1+n，其中n是1到20的整数。
22.一种接种物，所述接种物协同地增加有需要的植物中的氮获取，所述接种物包含有效量的源自冻干制剂的溶液，所述冻干制剂包含有效量的至少一种活的分离的内生菌菌株，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的。
23.根据权利要求22所述的接种物，其中所述接种物被施用于有需要的植物，并且所述至少一种活的分离的内生菌菌株与至少一种和所述植物相关的固氮菌株接触，导致所述植物相关的固氮菌株与缺少所述至少一种分离的内生菌菌株时与所述植物相关的固氮菌株的固氮率相比以更高的比率固氮。
24.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQID NO：1、5和10所示的16S核酸序列。
25.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQID NO：1所示的16S核酸序列。
26.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQID NO：5所示的16S核酸序列。
27.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含SEQID NO：10所示的16S核酸序列。
28.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO：2-4、6-9和11-14中所示的序列中的一种或多种标志物。
29.根据权利要求25所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO：2-4中所示的序列中的三种标志物。
30.根据权利要求26所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO：6-9中所示的序列中的四种标志物。
31.根据权利要求27所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自SEQ ID NO：11-14中所示的序列中的四种标志物。
32.根据权利要求29所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌属物种。
33.根据权利要求30所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于亲和素链霉菌属物种。
34.根据权利要求31所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌属物种。
35.根据权利要求22所述的接种物，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是初级基质。
36.根据权利要求35所述的接种物，其中所述初级基质是鹅卵石或沙子。
37.根据权利要求22所述的接种物，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是熔岩场、沙漠、干旱环境、半干旱环境和/或烧焦的环境之一。
38.根据权利要求22所述的接种物，其中所述有需要的植物选自农作物、生物能源农作物、林业树木、园艺植物、香料或药用植物以及草坪草的组。
39.根据权利要求22所述的接种物，其中所述源自冻干制剂的溶液包含有效量的两种或更多种活的分离的内生菌物种。
40.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株的有效量是导致所述植物相关的固氮菌株与缺少所述至少一种活的分离的内生菌菌株时所述植物相关的固氮菌株的固氮率相比将固氮作用增加至少5％的量。
41.根据权利要求22所述的接种物，其中所述源自冻干制剂的溶液进一步包含至少一种活的分离的固氮菌株。
42.根据权利要求41所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是1到20的整数。
43.根据权利要求41所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是1到20的整数。
44.一种协同地增加至少一种固氮菌株的固氮作用的方法，所述方法包括，将至少一种固氮菌株与有效量的溶液接触，所述溶液包含有效量的至少一种根据权利要求24-34中任一项所述的活的分离的内生菌菌株，其中所述至少一种活的分离的内生菌是从在营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的；并且其中将所述活的固氮菌株与所述至少一种活的分离的内生菌菌株接触，导致所述活的固氮菌株与在缺少所述至少一种活的分离的内生菌菌株时所述活的固氮菌株的固氮率相比更高的比率固氮。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是初级基质。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述初级基质是熔岩。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是熔岩场、沙漠、干旱环境、半干旱环境、烧焦的环境和/或高盐度环境之一。
48.根据权利要求44所述的方法，其中所述至少一种活的固氮菌株与植物相关。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述有需要的植物选自农作物、生物能源农作物、林业树木、园艺植物、香料或药用植物以及草坪草的组。
50.根据权利要求44所述的方法，其中所述至少一种活的固氮菌株在微生物制剂中包含分离的培养物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是1到20的整数。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1:1+n，其中n是1到20的整数。
53.根据权利要求44所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株的有效量是与缺少所述至少一种活的分离的内生菌菌株时所述固氮菌株的固氮率相比，导致所述固氮菌株将固氮作用增加至少5％的量。
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