CN117849353A - 一种基于荧光素酶技术的抗趋化因子抗体的高通量筛选方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于荧光素酶技术的抗趋化因子抗体的高通量筛选方法及试剂盒。所述方法包括以下步骤：步骤(1)准备以下筛选材料：CCLxx‑teLuc‑his标签蛋白；CCRx质粒转染的细胞；以及荧光素酶底物Furimazine，以及步骤(2)抗趋化因子抗体的高通量筛选。本发明还涉及一种用于抗趋化因子抗体的高通量筛选的试剂盒，其包括CCLxx‑teLuc‑his标签蛋白；CCRx质粒转染的细胞；及荧光素酶底物Furimazine。本发明的方法简单，经济，有一定普适性，可直接使用杂交瘤上清进行抗体药物筛选，大大节省了人力物力。另外，本发明的方法和试剂盒还可用于小批量的抗趋化因子抗体阻断活性分析。
Description
技术领域
本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种基于荧光素酶技术的抗趋化因子抗体的高通量筛选方法及试剂盒。
背景技术
抗体药物作为一种新颖而高效的治疗手段，已经在多个疾病领域展现了巨大的潜力。其用于治疗的疾病包括但不限于癌症、自身免疫、传染病以及炎症等。抗体药物通过识别、结合、中和、清除抗原、激活免疫系统和调节免疫应答等机制发挥治疗作用。
趋化因子(下文中称为CCLxx)与趋化因子受体(下文中称为CCRx)结合的失调在免疫性疾病和某些癌症中是一个重要的病理机制，它导致了免疫细胞或癌细胞的异常迁移，从而引发病理性的组织损伤和疾病发展。因此CCLxx就成为了筛选抑制免疫性疾病和某些癌症的药物靶点。
研究抗趋化因子抗体的重要性体现在其对炎症疾病、肿瘤转移、免疫调节等领域的潜在应用。通过阻断趋化因子信号通路，抗趋化因子抗体可以为这些疾病的治疗提供新的靶向治疗策略，为患者带来更好的疗效和生存质量。
CCRx是一类属于G蛋白偶联受体家族的重要膜蛋白，其结构复杂，包括七次跨膜结构。在体外表达的CCRx与其在正常生理状态下的结构可能存在差异。细胞内环境中的特定条件，如膜环境、分子修饰和蛋白折叠等因素，可能会影响蛋白的结构和功能。因此，单纯依靠体外表达的分子并不能完全代表在细胞水平上CCLxx-CCRx结合的情况。为了筛选出具有阻断CCLxx-CCRx相互作用的抗体药物，需要开展在细胞水平上的研究。这种研究可以通过使用表达CCRx的细胞模型来评估抗体对CCLxx-CCRx结合的阻断作用。
目前在细胞水平上针对阻断CCLxx-CCRx相互作用的抗体药物筛选的常规方法主要包括以下几种：
(1)流式细胞术(Flow CytoMetry，FCM)：它通过将细胞悬浮液通过流式细胞仪进行分析和排序，实现对单个细胞的快速、高通量的检测和分析。此方法可以高通量检测CCLxx和细胞上CCRx之间的相互作用，然而，流式细胞术需要专业的设备和试剂，包括流式细胞仪、抗体和荧光标记物等。这些设备和试剂的购买和维护成本较高，特别是对于小型实验室或研究团队来说，可能需要承受较大的经济压力。此外，它需要用到的抗原量较大，且检测窗口也不够大。结果如图1A所示，当CCL25浓度达到256nM时，窗口为27倍。
(2)钙流检测(Calcium Flux Assay)：是一种用于测量细胞内钙离子水平变化的实验方法。它通过使用钙感受器荧光探针或染料，能够标记细胞内的钙离子，并通过荧光信号的变化来监测钙离子的流动情况。CCRx属于G蛋白偶联受体家族，激活CCRx会导致G蛋白的活化，从而触发下游信号传导通路中钙离子的释放。在筛选抗体药物用于阻断CCLxx-CCRx相互作用时，钙流检测可以用来评估抗体对细胞受体激活和信号转导的影响。然而，钙流检测的高通量筛选相对较困难。由于钙流检测通常需要针对每个细胞逐个进行观察和测定，因此其单位时间内处理的样本数较少，无法实现大规模的高通量筛选。此外，它需要用到的抗原量较大，而且窗口较小，结果如图1B所示，当CCL25浓度达到132nM时，窗口仅为1.4倍。
(3)功能性分析：通过功能性实验，如细胞迁移、细胞增殖等，评估抗体对CCLxx-CCRx相互作用的影响。然而，这种方法耗时耗力，需要纯化蛋白质样品和较复杂的实验条件，无法进行大规模高通量筛选。
总的来说，这些方法在细胞水平上针对阻断CCLxx-CCRx相互作用的抗体药物筛选中具有一定的应用价值。然而，在进行大规模高通量筛选时，可能需要结合其他技术或方法来提高筛选效率，并降低筛选的成本。
自1975年杂交瘤技术问世以来到现在，依然是发现单克隆抗体的首选技术。FDA批准的90％以上的抗体都是由传统的杂交瘤技术产生的，其原理是通过将产生抗体但寿命短的B细胞和永生的骨髓瘤细胞融合，而达到既能在体外培养中无限增殖，又能分泌单克隆抗体的目的。经过单克隆化的杂交瘤细胞的上清中分泌有单克隆抗体，但由于抗体含量低以及纯度不高等原因，后续需要进行杂交瘤细胞扩大培养以及对上清液中的抗体进行纯化等操作，才能制备得到高纯度和足够量的单克隆抗体，以满足后续研究或应用的需求。
因此，相比于一般的抗体筛选，直接筛选杂交瘤上清中的抗体可以快速获取到单克隆抗体，并且由于不需要进行细胞培养和抗体纯化等步骤，可以节省大量的时间和实验费用。这种方法特别适用于需要快速获得抗体的研究或应用需求，从而提高效率和经济性。但杂交瘤上清中抗体含量较低以及存在一些杂质，因此需要一种对抗体检测灵敏的、受杂质干扰小的、高通量、快捷、信号强、检测方便和成本可控的检测方法，才能实现对杂交瘤上清快速、低成本的高通量筛选。然而，目前在细胞水平上针对阻断CCLxx-CCRx相互作用的抗体药物筛选中，并不存在直接对杂交瘤上清进行低成本且高通量的筛选方法。
为了解决现有技术的不足，需要开发一种直接对杂交瘤上清进行低成本且高通量的抗体药物筛选方法。
发明内容
本发明提供了一种基于荧光素酶技术的抗趋化因子抗体的高通量筛选方法及其应用。采用teLuc荧光素酶催化底物发光原理，将CCLxx与可催化荧光底物发光的荧光素酶teLuc融合表达，与CCRx质粒转染的细胞结合可催化荧光底物发光。本发明能直接筛选杂交瘤上清中的抗体，利用该方法筛选抗趋化因子抗体具有高通量、灵敏、快捷、信号强、干扰小、检测方便和成本可控等优点。
一方面，本申请提供一种抗趋化因子抗体的高通量筛选方法，其包括以下步骤：
(1)筛选材料的准备：
1-1)CCLxx-teLuc-his标签蛋白，其通过以下方法获得：将荧光素酶基因和组氨酸基因连接到趋化因子(CCLxx)基因上构建CCLxx-teLuc-his标签蛋白的质粒，将所述质粒直接转染瞬时转染易感细胞，标签蛋白通过信号肽引导，跨膜分泌到培养基中，再从细胞培养基中利用其中的组氨酸标签进行纯化得到所述CCLxx-teLuc-his标签蛋白；
1-2)CCRx质粒转染的细胞，其是通过用趋化因子受体(CCRx)
质粒转染瞬时转染易感细胞而获得的在细胞膜表面表达趋化因子受体的细胞；
1-3)荧光素酶底物Furimazine，
(2)抗趋化因子抗体的高通量筛选，所述筛选包括以下工序：
2-1)在多孔板中加入用稀释液稀释的以一定浓度的CCLxx-teLuc-his标签蛋白；
2-2)分别将含有待筛选抗体的样品和含10％ FBS的DMEM加入到步骤2-1)的多孔板中孵育，使待筛选抗体充分结合CCLxx-teLuc-his标签蛋白以分别作为实验组和空白对照组；
2-3)将步骤2-2)经过孵育后的混合液置于另一多孔板，并加入所述CCRx质粒转染的细胞，混匀孵育；
2-4)用缓冲液清洗细胞，重悬细胞，取细胞重悬液加入多孔板，加入荧光素酶底物Furimazine，酶标仪读取415-455nm波长的化学发光值，将空白对照组的化学发光值作为CCLxx-teLuc-his与CCRx质粒转染的细胞结合后催化底物发光的本底值，将实验组的化学发光值与空白对照组相比，化学发光值越低，表明结合到CCRx质粒转染的细胞上的CCLxx-teLuc-his越少，即筛选的抗趋化因子抗体的阻断能力越强，
或者，步骤(2)包括以下工序：
2-1’)分别将含有待筛选抗体的样品和含10％ FBS的DMEM加入到多孔板中进行孵育以分别作为实验组和空白对照组；
2-2’)在步骤2-1’)的多孔板中加入用稀释液稀释的以一定浓度的CCLxx-teLuc-his标签蛋白，使待筛选抗体充分结合CCLxx-teLuc-his标签蛋白；
2-3’)将步骤2-2’)经过孵育后的混合液置于另一多孔板，并加入所述CCRx质粒转染的细胞，混匀孵育；
2-4’)用缓冲液清洗细胞，重悬细胞，取细胞重悬液加入多孔板，加入荧光素酶底物Furimazine，酶标仪读取415-455nm波长的化学发光值，将空白对照组的化学发光值作为CCLxx-teLuc-his与CCRx质粒转染的细胞结合后催化底物发光的本底值，与空白对照组相比，化学发光值越低，代表结合到CCRx质粒转染的细胞上的CCLxx-teLuc-his越少，即筛选的抗趋化因子抗体的阻断能力越强。
在具体实施方式中，在步骤2-1)或2-2’)中CCLxx-teLuc-his标签蛋白的浓度通过以下方法确定：
将CCLxx-teLuc-his标签蛋白按照一定的浓度梯度用稀释液连续稀释，取CCRx质粒转染的细胞于多孔板1，并分别加入稀释后的各个浓度的CCLxx-teLuc-his标签蛋白以及稀释液，稀释混匀后，用缓冲液清洗细胞，最终用磷酸缓冲液(PBS)重悬细胞，取细胞重悬液加入多孔板2，加入荧光素酶底物Furimazine，酶标仪读取415-455nm波长的化学发光值，取CCLxx-teLuc-his标签蛋白与CCRx质粒转染的细胞结合后催化底物发光的化学发光值/稀释液与CCRx质粒转染的细胞结合后催化底物发光的化学发光值的比值大于等于1000时，优选1000时的CCLxx-teLuc-his标签蛋白浓度作为筛选时所用的浓度。
在具体实施方式中，当CCLxx-teLuc-his标签蛋白为CCL25-teLuc-his标签蛋白时，将CCL25-teLuc-his标签蛋白按首孔10nM起，按照1:2的浓度梯度连续稀释6个浓度。
在具体实施方式中，所述多孔板1为96孔板；所述多孔板2为384孔板。
在具体实施方式中，根据上述方法确定的筛选时所用的CCL25-teLuc-his标签蛋白的浓度≥1nM，优选为1nM。
在具体实施方式中，所述稀释液和缓冲液均为含1％BSA的磷酸缓冲液(PBS)。
在具体实施方式中，所述趋化因子CCLxx和趋化因子受体CCRx可选自以下各组：
在具体实施方式中，所述瞬时转染易感细胞为HEK293细胞或CHO细胞。
在具体实施方式中，所述趋化因子CCLxx和趋化因子受体CCRx为以上组别24，即，CCLxx为CCL25，且CCRx为CCR9，所述CCLxx-teLuc-his标签蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的CCL25-teLuc-his标签蛋白，所述CCRx质粒为核苷酸序列为SEQ ID NO:2的CCR9质粒。
在具体实施方式中，在步骤2-1)至2-3)或步骤2-1’)至2-3’)中，所述多孔板为96孔板。
在具体实施方式中，在步骤2-2)或步骤2-1’)中，所述含待筛选抗体的样品为杂交瘤细胞的上清液，孵育温度为室温，时间为30-45min。
在具体实施方式中，在步骤2-3)或步骤2-3’)中，孵育温度为4℃，时间为30-45min。
在具体实施方式中，在步骤2-4)或步骤2-4’)中，所述多孔板为384孔板或1536孔板。这些多孔板的使用可以保证高通量检测。
另一方面，本申请提供一种抗趋化因子抗体的高通量筛选试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)CCLxx-teLuc-his标签蛋白，其通过以下方法获得：将荧光素酶基因和组氨酸基因连接到趋化因子(CCLxx)基因上构建CCLxx-teLuc-his标签蛋白的质粒，将所述质粒直接转染瞬时转染易感细胞，标签蛋白通过信号肽引导，跨膜分泌到培养基中，再从细胞培养基中利用其中的组氨酸标签进行纯化得到所述CCLxx-teLuc-his标签蛋白；
(2)CCRx质粒转染的细胞，其是通过用趋化因子受体(CCRx)质粒转染瞬时转染易感细胞而获得的在细胞膜表面表达趋化因子受体的细胞；以及
(3)荧光素酶底物Furimazine。
在具体实施方式中，所述趋化因子和趋化因子受体选自以下各组：
在具体实施方式中，当CCLxx为CCL25，CCRx为CCR9时，所述CCLxx-teLuc-his标签蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的CCL25-teLuc-his标签蛋白，所述CCRx质粒为核苷酸序列为SEQ ID NO:2的CCR9质粒。
在具体实施方式中，所述瞬时转染易感细胞为HEK293细胞或CHO细胞。
又一方面，本发明提供上述试剂盒在抗趋化因子抗体的高通量筛选或抗趋化因子抗体阻断活性分析中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用了teLuc荧光素酶催化底物发光技术。该技术的优势在于：i.具有更准确的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)生物模型，teLuc荧光素酶可以作为小蛋白标签，对目的蛋白的构像干扰较小；ii.灵敏度高，teLuc荧光素酶产生的光信号明亮，在低浓度时具有较低的背景噪音，从而提高了灵敏度；iii.检测方法简便，teLuc荧光素酶产生的发光信号可以使用常规的发光检测仪进行检测，无需特定的滤光片或进样器，试剂稳定性高；iv.具有可调整的实验通量，teLuc荧光素酶技术可适应不同的实验板，如96孔、384孔和1536孔板，适合高通量检测，可用于药物筛选等应用。
(2)本发明的方法简单，经济，有一定的普遍适应性。可以直接使用杂交瘤上清进行抗体药物筛选，大大节省了人力物力。大多数小实验室都可以进行类似操作，完成小批量的抗趋化因子抗体阻断活性分析。本发明可以微量化，用作高通量筛选。微量化后，所用试剂的量进一步减少，大大降低实验成本。
附图说明
图1为流式细胞术检测CCL25蛋白与HEK293-CCR9细胞的结合曲线(A)以及钙流检测CCL25蛋白对HEK293-CCR9-GNa15细胞的激活曲线的测定结果(B)。
图2为本申请中通过teLuc荧光素酶催化底物发光检测抗趋化因子抗体活性的原理图。
图3为含有荧光素酶的CCL25-teLuc-his标签蛋白中荧光素酶活性的测定结果，其中A：CCL25-teLuc-his标签蛋白结合HEK293-CCR9细胞催化底物发光的化学发光值vs.CCL25-teLuc-his标签蛋白浓度，B：CCL25-teLuc-his标签蛋白结合HEK293-CCR9细胞催化底物发光的化学发光值相对于HEK293-CCR9细胞中加入稀释液催化底物发光的化学发光值的倍数vs.CCL25-teLuc-his标签蛋白浓度。
图4为杂交瘤上清中抗趋化因子抗体的高通量筛选流程图。
具体实施方式
如图2所示，本发明采用teLuc荧光素酶催化底物发光原理如下：将CCLxx与可催化荧光底物发光的荧光素酶teLuc融合表达，与CCRx质粒转染的细胞结合可催化荧光底物Furimazine发光。当抗体药物阻断CCLxx与CCRx的相互作用时，带有荧光素酶的CCLxx-teLuc-his没有结合到CCRx质粒转染的细胞上，而被清洗除去，CCRx质粒转染的细胞本身无法催化底物产生荧光，荧光信号值低。当抗体药物没有阻断活性时，带有荧光素酶的CCLxx-teLuc-his结合到CCRx质粒转染的细胞上催化底物产生荧光，荧光信号值高。这样就能筛选出有阻断活性的抗趋化因子抗体。
为更好的理解本发明，以下进行具体的实施举例说明本申请的技术内容，然而这些实施例并不用于限制本申请的范围。
实施例1：生产CCL25-teLuc-his标签蛋白和构建HEK293-CCR9细胞
将荧光素酶基因和组氨酸基因连接到趋化因子上构建CCL25-teLuc-his标签蛋白(SEQ ID NO:1)的质粒。将含编码表达标签蛋白的质粒直接转染HEK293细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)，标签蛋白通过信号肽引导，跨膜分泌到培养基中，再从细胞培养基中利用其中的组氨酸标签进行纯化可得到CCL25-teLuc-his标签蛋白。
用CCR9质粒(SEQ ID NO:2)瞬时转染HEK293细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)，可得到在细胞膜表面表达趋化因子受体的HEK293-CCR9细胞。本申请设计的蛋白表达纯化简单易行，成本可控；表达的蛋白结构稳定便于储存使用。且瞬转质粒到HEK293细胞易于操作。
SEQ ID NO:1
以上序列中，下划线部分表示信号肽；
斜体部分表示CCL25；
GS表示连接子；
粗体部分表示teLuc；
HHHHHH为蛋白纯化标签。
实施例2：含有荧光素酶的CCL25-teLuc-his标签蛋白中荧光素酶活性的测定
CCL25-teLuc-his标签蛋白按首孔10nM起，其后以1：2浓度梯度用含1％BSA的PBS连续稀释6个浓度。取50μL HEK293-CCR9细胞于96孔板，并加入50μL用含1％ BSA的PBS稀释好的CCL25-teLuc-his标签蛋白，以稀释液为空白对照，混匀后放4℃孵育30分钟；用含1％BSA的PBS清洗细胞4次，最终以80μL/孔PBS重悬细胞，取16μL细胞重悬液加入384孔板，加入4μL荧光素酶底物Furimazine(Targetmol,T15359)，酶标仪(Tecan,Spark 10M)读取415-455nm波长的化学发光值。根据其活性确定具体实验时所用的浓度。具体实验结果如图3所示，将1nM(此时CCL25-teLuc-his标签蛋白与HEK293-CCR9细胞结合后催化底物发光的化学发光值/稀释液与HEK293-CCR9细胞结合后催化底物发光的化学发光值＝1000)作为正式实验时所用的稀释浓度。其中，图3A中，横轴为hCCL25-teLuc-his标签蛋白的浓度，纵轴表示CCL25-teLuc-his标签蛋白与HEK293-CCR9细胞结合后催化底物发光的化学发光值，图3B中，横轴为hCCL25-teLuc-his标签蛋白的浓度，纵轴示出CCL25-teLuc-his标签蛋白与HEK293-CCR9细胞结合后催化底物发光的化学发光值/稀释液与HEK293-CCR9细胞结合后催化底物发光的化学发光值的倍数。
实施例3：杂交瘤上清中抗趋化因子抗体的高通量筛选
具体方法如图4所示。
1)利用电动排枪将稀释好的CCL25-teLuc-his标签蛋白加入96孔板中，每孔加50μL；
2)待筛选化合物为培养杂交瘤细胞的上清，该上清含有待筛选的抗体。同时以含10％ FBS的DMEM作为空白对照，加入50μL/孔的杂交瘤上清到步骤1)的96孔板中，室温下孵育30分钟，使化合物充分结合CCL25-teLuc-his标签蛋白；
3)取50μL在步骤2)经过孵育后的抗原-抗体混合液于另一96孔板，并加入50μLHEK293-CCR9细胞，混匀后放4℃孵育30分钟；
4)用含1％ BSA的PBS清洗细胞4次，最终以80μL/孔PBS重悬细胞，取16μL细胞重悬液加入384孔板，加入4μL荧光素酶底物Furimazine(Targetmol,T15359)，立即置于酶标仪(Tecan,Spark 10M)读取415-455nm波长的化学发光值，并在30min内读取结束。由于空白对照组不存在阻断活性，化学发光值为CCL25-teLuc-his与HEK293-CCR9细胞结合后催化底物发光的本底值。与空白对照组相比，化学发光值越低，代表杂交瘤上清中抗趋化因子抗体的阻断能力越强。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而不能解释为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种抗趋化因子抗体的高通量筛选方法，其包括以下步骤：
(1)筛选材料的准备：
1-1)CCLxx-teLuc-his标签蛋白，其通过以下方法获得：将荧光素酶基因和组氨酸基因连接到趋化因子(CCLxx)基因上构建CCLxx-teLuc-his标签蛋白的质粒，将所述质粒直接转染瞬时转染易感细胞，标签蛋白通过信号肽引导，跨膜分泌到培养基中，再从细胞培养基中利用其中的组氨酸标签进行纯化得到所述CCLxx-teLuc-his标签蛋白；
1-2)CCRx质粒转染的细胞，其是通过用趋化因子受体(CCRx)质粒转染瞬时转染易感细胞而获得的在细胞膜表面表达趋化因子受体的细胞；
1-3)荧光素酶底物Furimazine，
(2)抗趋化因子抗体的高通量筛选，所述筛选包括以下工序：
2-1)在多孔板中加入用稀释液稀释的以一定浓度的CCLxx-teLuc-his标签蛋白；
2-2)分别将含有待筛选抗体的样品和含10％FBS的DMEM加入到步骤2-1)的多孔板中孵育，使待筛选抗体充分结合CCLxx-teLuc-his标签蛋白以分别作为实验组和空白对照组；
2-3)将步骤2-2)经过孵育后的混合液置于另一多孔板，并加入所述CCRx质粒转染的细胞，混匀孵育；
2-4)用缓冲液清洗细胞，重悬细胞，取细胞重悬液加入多孔板，加入荧光素酶底物Furimazine，酶标仪读取415-455nm波长的化学发光值，将空白对照组的化学发光值作为CCLxx-teLuc-his与CCRx质粒转染的细胞结合后催化底物发光的本底值，将实验组的化学发光值与空白对照组相比，化学发光值越低，表明结合到CCRx质粒转染的细胞上的CCLxx-teLuc-his越少，即筛选的抗趋化因子抗体的阻断能力越强，
或者，步骤(2)包括以下工序：
2-1’)分别将含有待筛选抗体的样品和含10％FBS的DMEM加入到多孔板中进行孵育以分别作为实验组和空白对照组；
2-2’)在步骤2-1’)的多孔板中加入用稀释液稀释的以一定浓度的CCLxx-teLuc-his标签蛋白，使待筛选抗体充分结合CCLxx-teLuc-his标签蛋白；
2-3’)将步骤2-2’)经过孵育后的混合液置于另一多孔板，并加入所述CCRx质粒转染的细胞，混匀孵育；
2-4’)用缓冲液清洗细胞，重悬细胞，取细胞重悬液加入多孔板，加入荧光素酶底物Furimazine，酶标仪读取415-455nm波长的化学发光值，将空白对照组的化学发光值作为CCLxx-teLuc-his与CCRx质粒转染的细胞结合后催化底物发光的本底值，与空白对照组相比，化学发光值越低，代表结合到CCRx质粒转染的细胞上的CCLxx-teLuc-his越少，即筛选的抗趋化因子抗体的阻断能力越强。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2-1)或2-2’)中CCLxx-teLuc-his标签蛋白的浓度通过以下方法确定：
将CCLxx-teLuc-his标签蛋白按照一定的浓度梯度用稀释液连续稀释，取CCRx质粒转染的细胞于多孔板1，并分别加入稀释后的各个浓度的CCLxx-teLuc-his标签蛋白以及稀释液，稀释混匀后，用缓冲液清洗细胞，最终用PBS重悬细胞，取细胞重悬液加入多孔板2，加入荧光素酶底物Furimazine，酶标仪读取415-455nm波长的化学发光值，取CCLxx-teLuc-his标签蛋白与CCRx质粒转染的细胞结合后催化底物发光的化学发光值/稀释液与CCRx质粒转染的细胞结合后催化底物发光的化学发光值的比值大于等于1000时的CCLxx-teLuc-his标签蛋白浓度作为筛选时所用的浓度，
具体地，当CCLxx-teLuc-his标签蛋白为CCL25-teLuc-his标签蛋白时，将CCL25-teLuc-his标签蛋白按首孔10nM起，按照1:2的浓度梯度连续稀释6个浓度，并且根据上述方法确定的筛选时所用的CCL25-teLuc-his标签蛋白的浓度≥1nM，优选为1nM。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述稀释液和缓冲液均为含1％BSA的PBS。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述趋化因子和趋化因子受体选自以下各组：
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述瞬时转染易感细胞为HEK293细胞或CHO细胞。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述CCLxx为CCL25，且所述CCRx为CCR9，所述CCLxx-teLuc-his标签蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的CCL25-teLuc-his标签蛋白，所述CCRx质粒为核苷酸序列为SEQ ID NO:2的CCR9质粒。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，
在步骤2-1)至2-3)或步骤2-1’)至2-3’)中，所述多孔板为96孔板；和/或
在步骤2-4)或步骤2-4’)中，所述多孔板为384孔板或1536孔板。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，
在步骤2-2)或步骤2-1’)中，所述含待筛选抗体的样品为杂交瘤细胞的上清液，孵育温度为室温，时间为30-45min；和/或
在步骤2-3)或步骤2-3’)中，孵育温度为4℃，时间为30-45min。
9.一种抗趋化因子抗体的高通量筛选试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)CCLxx-teLuc-his标签蛋白，其通过以下方法获得：将荧光素酶基因和组氨酸基因连接到趋化因子(CCLxx)基因上构建CCLxx-teLuc-his标签蛋白的质粒，将所述质粒直接转染瞬时转染易感细胞，标签蛋白通过信号肽引导，跨膜分泌到培养基中，再从细胞培养基中利用其中的组氨酸标签进行纯化得到所述CCLxx-teLuc-his标签蛋白；
(2)CCRx质粒转染的细胞，其是通过用趋化因子受体(CCRx)质粒转染瞬时转染易感细胞而获得的在细胞膜表面表达趋化因子受体的细胞；以及
(3)荧光素酶底物Furimazine，
具体地，所述趋化因子和趋化因子受体选自以下各组：
具体地，当CCLxx为CCL25，且CCRx为CCR9时，所述CCLxx-teLuc-his标签蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的CCL25-teLuc-his标签蛋白，所述CCRx质粒为核苷酸序列为SEQ IDNO:2的CCR9质粒，
具体地，所述瞬时转染易感细胞为HEK293细胞或CHO细胞。
10.如权利要求9所述的试剂盒在抗趋化因子抗体的高通量筛选或抗趋化因子抗体阻断活性分析中的应用。
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