CN117843788A

CN117843788A - 一种抗gprc5d的抗体及其多特异性抗体和相关应用

Info

Publication number: CN117843788A
Application number: CN202410034369.8A
Authority: CN
Inventors: 仝爱平; 李佳; 李和贤; 路琪中; 朱志雄; 牛挺
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2024-01-09
Filing date: 2024-01-09
Publication date: 2024-04-09

Abstract

本发明公开了一种抗GPRC5D的抗体及其多特异性抗体和相关应用，涉及生物医药领域。本发明提供的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1～3、5～7所示的CDRs或SEQ ID NO:10～12、14～16所示的CDRs，该抗体或其抗原结合片段对多发性骨髓瘤细胞系具有较好的反应活性和杀伤活性，由其构建的多特异性抗体具有较好的抗肿瘤作用，能够应用于制备预防、诊断或治疗肿瘤的相关产品。

Description

一种抗GPRC5D的抗体及其多特异性抗体和相关应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种抗GPRC5D的抗体及其多特异性抗体和相关应用。

背景技术

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种以浆细胞(plasma cells，PCs)异常增殖，同时导致体内产生大量病理性免疫球蛋白为特征的血液肿瘤性疾病。在血液肿瘤中其发病率仅次于淋巴瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10％，男女患病比例为1.6:1，大多患者年龄>40岁。在过去的二十年中，随着免疫调节药物(lenalidomide,pomalidomide)、蛋白酶体抑制剂(bortezomib,carfilzomib,ixazomib)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的引入，MM的治疗取得了重大进展，自20世纪80年代末以来，这些进展使MM患者的5年生存率几乎翻了一番。

GPRC5D(G protein-coupled receptor class C group 5member D)是在本世纪初发现的一个7次跨膜的蛋白，它是一种G蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptor，GPCR)C5家族的孤儿受体。GPRC5D的mRNA在多发性骨髓瘤细胞系中高度表达，而GPRC5D的mRNA在除毛囊外的任何正常组织中均未高表达，这使其成为多发性骨髓瘤免疫治疗中潜在的有效靶点。且其在多发性骨髓瘤细胞上的表达与BCMA表达无关，并且由于它是一种7次跨膜蛋白，不易在血清中脱落，但这种现象在其他表面抗原(如BCMA、CD38)中存在，并可能导致药效降低或产生耐药。

虽然目前MM诊治水平取得了明显进步，逐渐与国际水平接轨，但MM仍属于非根治性疾病，大部分患者最终都会复发，其治疗仍然面临很大挑战。因此，为了改善治疗过程中疗效降低等问题需要开发出更加安全、有效、多样的新药物。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗GPRC5D的抗体及其多特异性抗体和相关应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区。所述重链可变区包括：氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1、2、3所示的CDR1、CDR2和CDR3，或氨基酸序列依次如SEQ ID NO:10、11、12所示的CDR1、CDR2和CDR3。所述轻链可变区包括：氨基酸序列依次如SEQ ID NO:5、6、7所示的CDR1、CDR2和CDR3，或氨基酸序列依次如SEQ ID NO:14、15、16所示的CDR1、CDR2和CDR3。

第二方面，本发明实施例提供了一种多特异性抗体或其抗原结合片段，其包括：结合第一靶标的第一抗原结构域，所述多特异性抗体或其抗原结合片段还包括结合第二靶标的第二抗原结构域和/或结合第三靶标的第三抗原结构域；所述第一靶标包括GPRC5D，所述第一抗原结构域包括重链可变区a和轻链可变区a；所述重链可变区a为前述实施例中所述的重链可变区，所述轻链可变区a为前述实施例中所述的轻链可变区。

第三方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸、含所述分离的核酸的表达盒或含所述分离的核酸的重组载体，所述分离的核酸编码如前述实施例所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或前述实施例所述的多特异性抗体或其抗原结合片段。

第四方面，本发明实施例提供了一种宿主细胞，其含有前述实施例中所述的重组载体。

第五方面，本发明实施例提供了一种免疫缀合物或药物组合物，其包括：如前述实施例所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或前述实施例所述的多特异性抗体或其抗原结合片段。

第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或前述实施例所述的多特异性抗体或其抗原结合片段或如前述实施例所述的分离的核酸、含所述分离的核酸的表达盒或含所述分离的核酸的重组载体或前述实施例所述的重组细胞或前述实施例所述的免疫缀合物或药物组合物在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段能够特异性结合GPRC5D，对多发性骨髓瘤细胞系具有较好的反应活性和杀伤活性，由其构建的多特异性抗体具有较好的抗肿瘤作用，能够应用于制备预防、诊断或治疗肿瘤的相关产品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中利用免疫荧光(IFA)检测重组抗体与GPRC5D+-Hela细胞的结合效果图；

图2为本发明实施例中利用流式细胞术(FACS)分析单链抗体与多发性骨髓瘤细胞系的结合效果图；

图3为本发明实施例中检测ScFv-OKT3双抗(BiTE)对靶细胞的杀伤效率结果图；

图4为本发明实施例中三特异性抗体k1h1和k2h2的构建模式图；

图5为本发明实施例中三特异性抗体k1h1、k2h2的纯化；其中a为纯化过程实时监测图，b为SDS-PAGE图，M为marker，1为非还原k1h1，2为还原k1h1，3为非还原k2h2，4为还原k2h2；

图6为本发明实施例中三特异性抗体对人源GPRC5D的结合分析；

图7为本发明实施例中三特异性抗体对GPRC5D+-Hela细胞、BCMA+-Hela细胞以及野生型Hela细胞的体外杀伤活性分析；

图8为本发明实施例中三特异性抗体k1h1，k2h2对MM小鼠移植模型生存期分析。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

一方面，本发明实施例提供了一种抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包括：氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1、2、3所示的CDR1、CDR2和CDR3，或氨基酸序列依次如SEQ ID NO:10、11、12所示的CDR1、CDR2和CDR3；

所述轻链可变区包括：氨基酸序列依次如SEQ ID NO:5、6、7所示的CDR1、CDR2和CDR3，或氨基酸序列依次如SEQ ID NO:14、15、16所示的CDR1、CDR2和CDR3。

具有上述氨基酸序列的抗体与多发性骨髓瘤细胞系均具有良好的反应活性，对于天然多发性骨髓瘤细胞系均具有较强的杀伤活性。尤其是具有如SEQ ID No：10、SEQ IDNo：11和SEQ ID No：12的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、重链可变区CDR2和重链可变区CDR3以及SEQ ID No：14、SEQ ID No：15和SEQ ID No：16的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3的抗体对多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性更优。

在一些实施例中，所述重链可变区和所述轻链可变区还包括骨架区。

在一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

在一些实施例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一些实施例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

在一些实施例中，所述抗体选自：单价抗体、多价抗体、多特异性抗体、嵌合抗体和融合型抗体中的任意一种。

本文中的“多价抗体”是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比单价抗体具有更高的抗原亲和力。

本文中的“多特异性抗体”是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶标或同一靶标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。融合型抗体包括不限于通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。

本文中的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。

在一些实施例中，所述多特异性抗体包括：双特异性抗体、三特异性抗体和四特异性抗体中的任意一种。

在一些实施例中，所述抗原结合片段包括：Fab，Fab'，F(ab')₂，scFv，Fv中的任意一种。只要它们展示出所期望的抗原结合活性。

本文中的“抗原结合片段”也即抗体的功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，抗体的抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得其抗原结合片段。

所述抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

在一些实施例中，当所述抗原结合片段为scFv时，scFv的氨基酸序列如SEQ IDNO:9或18所示。

在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区。

另一方面，本发明实施例提供了一种多特异性抗体或其抗原结合片段，其包括：结合第一靶标的第一抗原结构域；所述多特异性抗体或其抗原结合片段还包括结合第二靶标的第二抗原结构域和/或结合第三靶标的第三抗原结构域。

所述第一靶标包括GPRC5D，所述第一抗原结构域包括重链可变区a和轻链可变区a；所述重链可变区a为前述任意实施例中所述的重链可变区，所述轻链可变区a为前述任意实施例中所述的轻链可变区。

在一些实施例中，所述第二靶标包括BCMA，所述第二抗原结构域包括结合BCMA的重链可变区b。

在一些实施例中，所述重链可变区b的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。

在一些实施例中，所述第三靶标包括CD3。

在一些实施例中，所述第三抗原结构域包括重链可变区c。

在一些实施例中，所述第三抗原结构域还包括轻链可变区c。

在一些实施例中，所述第三抗原结构域包括结合CD3的单链抗体。

在一些实施例中，所述结合CD3的单链抗体(scfv)的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

在一些实施例中，所述第三抗原结构域还包括轻链可变区c。

在一些实施例中，所述第一抗原结构域、所述第二抗原结构域和所述第三抗原结构域的数量独立地为1个、2个或2个以上。

在一些实施例中，所述多特异性抗体或其抗原结合片段还包括：重链恒定区和/或轻链恒定区。

在一些实施例中，所述重链恒定区包括：选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区。

在一些实施例中，所述重链恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。人种属来源的重链恒定区对于T细胞的结合能力更强。

在一些实施例中，所述重链恒定区为人IgG4的重链恒定区或其突变。以IgG4的重链恒定区作为多特异性抗体的恒定区，具有对靶细胞极高的抑制率，能够与抗原保持良好的结合活性。本发明实施例中的双特异性抗体带有人Fc片段，保留了与FcRn的结合作用，从而具有较长的半衰期。

在一些实施例中，所述重链恒定区包括：knob链和/或hole链。

knob链为具有knob突变的hIgG4的重链恒定区，knob突变包括S228P，F234A，L235A和T366W。

hole链为具有hole突变的hIgG4的重链恒定区，hole突变包括S228P，F234A，L235A，T366S，L368A和Y407V。

在一些实施例中，所述knob链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23(专利申请号：202211168052.0)所示。

在一些实施例中，所述hole链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24(专利申请号：202211168052.0)所示。

在一些实施例中，所述多特异性抗体选自：双特异性抗体和三特异性抗体。

在一些实施例中，所述多特异性抗体包括：a链和b链。

其中，所述a链包括所述第一抗原结构域和重链恒定区，重链恒定区设置于第一抗原结构域的C端。所述b链包括所述第二抗原结构域第三抗原结构域和重链恒定区，所述第二抗原结构域与所述第三抗原结构域直接相连或通过linker(例如(G₄S)_n，n为非0自然数，选自1～20，具体可以为3或4)，重链恒定区设置于第三抗原结构域的C端。

所述a链的重链恒定区能够与所述b链的重链恒定区形成二聚体。

在一些实施例中，所述a链的重链恒定区为hole链，所述b链的重链恒定区为knob链；或所述a链的重链恒定区为knob链，所述b的重链恒定区为hole链。

在一些实施例中，所述a链的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，所述b链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。

SEQ ID No：25所示的a链为SEQ ID No:18所示的抗GPRC5D的抗体+SEQ ID No:24所示的hole链(专利申请号：202211168052.0)，在本文中简称h1链。

SEQ ID No：26所示的b链为SEQ ID No:19所示的人源化抗BCMA的纳米抗体(专利申请号：202211168052.0)+SEQ ID No:20抗CD3的OKT3抗体+SEQ ID No:23所示的knob链(专利申请号：202211168052.0)，在本文中简称k1链。

k1和h1链的组合形成的异源二聚三特异性抗体(k1h1)。

在一些实施例中，所述多特异性抗体包括：c链和d链；其中，所述c链包括所述第一抗原结构域、所述第二抗原结构域和重链恒定区，重链恒定区设置于第一抗原结构域的C端，所述第二抗原结构域设置于重链恒定区的C端。所述d链包括第一抗原结构域、所述第三抗原结构域和重链恒定区，重链恒定区设置于第三抗原结构域的C端，所述第一抗原结构域与所述第三抗原结构域直接相连或通过linker(例如(G4S)n，n为非0自然数，选自1～20，具体可以为3或4)；所述c链的重链恒定区能够与所述d链的重链恒定区形成二聚体。

在一些实施例中，所述c链的重链恒定区为hole链，所述d链的重链恒定区为knob链；或所述d链的重链恒定区为knob链，所述c的重链恒定区为hole链。

在一些实施例中，所述c链的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述d链的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。

c链的氨基酸序列如SEQ ID No：27所示，其由SEQ ID No:18所示的抗GPRC5D的抗体+SEQ ID No:24所示的hole链(专利申请号：202211168052.0)+SEQ ID No:19(专利申请号：202211168052.0)所示的抗BCMA的抗体组成，本文简称为h2链。

d肽链的氨基酸序列如SEQ ID No：28所示，其由SEQ ID No:18所示的抗GPRC5D的抗体+SEQ ID No:20所示的OKT3+SEQ ID No:23所示的knob链(专利申请号：202211168052.0)组成，本文简称为k2链。

h2链与k2链的组合形成的异源二聚三特异性抗体(k2h2)。

另一方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸、含所述分离的核酸的表达盒或含所述分离的核酸的重组载体，所述分离的核酸编码如前述任意实施例所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或前述任意实施例所述的多特异性抗体或其抗原结合片段。

考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接导入宿主细胞内，进行目的基因表达。

另一方面，本发明实施例提供了一种宿主细胞，其含有前述任意实施例中所述的重组载体。

具体地，宿主细胞包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、Per6细胞。293系列细胞，Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。

另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体的制备方法，其包括：培养如前述所述的宿主细胞，以获得抗体。具体地，本发明对宿主细胞的培养条件没有具体地限定，基于常规技术知识可获得能够使得宿主细胞表达产生所述抗体的培养条件。

另一方面，本发明实施例提供了一种免疫缀合物或药物组合物，其包括：如前述任意实施例所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或前述任意实施例所述的多特异性抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，所述免疫缀合物还包括治疗剂。

在一些实施例中，所述治疗剂包括：化疗药物、放射性核素、光敏剂、光热剂、免疫检查点抑制剂、毒素、因子、激酶抑制剂、抑制性第二信号分子的抗体、PD-L1抑制剂、PD-1/PD-L1单抗药物中的至少一种。

免疫检查点抑制剂治疗的相关生物标志物包括PD-L1、MSI/bMSI、TMB/bTMB、TNB及EGFR突变、ALK融合、TP53突变、KRAS突变。

在一种可选的实施方式中，上述化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，夫拉平度、伊利替康及其代谢物SN-38、拓扑替康、替尼泊苷、依托泊苷、伊马替尼、吉非替尼、达努塞替、多柔吡星、柔红霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤、喜树碱和沙奎那韦中的任意一种或多种。

在一些实施例中，光敏剂选自：(1)5-氨基酮戊酸(ALA)或其衍生物；(2)含四吡咯环的光敏化合物；(3)中药光敏剂；或(4)ALA或其衍生物分别与(2)或(3)中的化合物的组合。

在一些实施例中，光热剂选自IR-780、IR-783、IR-805、IR-808、IR-825、IR-1045、IR-1048、IR-1061和IR-26。

在一些实施例中，抑制性第二信号分子可以是PD-1；CTLA-4；PD-1和CTLA-4。

在一些实施例中，PD-1/PD-L1单抗药物选自如下组中的至少一种：纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、皮地利珠单抗(Pidilizumab)、兰伯丽珠单抗(Lambrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atezolizumab)、AMP-224、AMP224、AUNP12、BGB108、MCLA134、MEDI0680、PDROOl、REGN2810、SHR1210、STIAllOX、STIAlllO、TSR042，BMS-936558、BGB-A317、BCD-100和JS001。

在其他实施方式中，上述治疗剂还包括细胞毒性剂。

在一些实施例中，所述药物组合物还包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。

在一些实施例中，载体为医学上可接受的载体，包括但不限于填充剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂、助流剂等。

本发明的优选技术方案中，所述药学上可接受的载体包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、聚乙烯醇及其衍生物、甲基纤维素及其衍生物、乙基纤维素及其衍生物、羟丙基纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、糊精、微晶纤维素、丙烯酸树脂、磷酸氢钙、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠、二氧化硅、二氧化钛、滑石粉、色靛中的一种或其组合。

此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或前述任意实施例所述的多特异性抗体或其抗原结合片段或如前述任意实施例所述的分离的核酸、含所述分离的核酸的表达盒或含所述分离的核酸的重组载体或前述任意实施例所述的重组细胞或前述任意实施例所述的免疫缀合物或药物组合物在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用。

在一些实施例中，所述产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种；

在一些实施例中，所述肿瘤包括：多发性骨髓瘤。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

(1)GPRC5D重组蛋白的制备：

编码人源GPRC5D的核酸序列(NM_018654.1)由安徽通用生物公司合成。PCR扩增并亚克隆至pcDNA3.1表达载体中(Invitrogen)。然后，将GPRC5D的全长序列克隆到C端携带His标签的pcDNA3.1表达载体中。通过瞬时转染293FT，使用FreeStyle^TM无血清培养基(LifeTechnologies)摇瓶培养5-7天，收集细胞沉淀，经过离心超滤，然后通过镍柱亲和层析、离子交换层析以及分子筛色谱柱纯化重组GPRC5D蛋白。

(2)表达人GPRC5D抗原的稳转细胞株制备：

将编码人源GPRC5D的全长序列构建到携带IRES-EGFP的pcDNA3.1表达载体中。Hela细胞于含10％胎牛血清的DMEM中培养。采用Lipofectamine LTX(Life Technologies)转染试剂进行细胞转染，48小时之后进行流式分选，培养至96孔板，进行单克隆稳定细胞株筛选和鉴定，并对稳定表达GPRC5D的Hela(GPRC5D+-Hela)细胞进行保种。

实施例2

1.抗GPRC5D单克隆抗体的制备。

(1)动物免疫

使用5-6周龄的Balb/c雌性小鼠作为被免疫动物，免疫剂量为100μg/只。首次免疫采用100μl弗氏完全佐剂(Sigma)与等体积重组GPRC5D蛋白混合，充分乳化后进行皮下多点注射。每隔2周，用等体积弗氏不完全佐剂(Sigma)与重组蛋白混合，充分乳化后进行皮下多点注射。加强免疫共4次，最后一次加强免疫后第10天，割尾采血检测小鼠抗体效价。细胞融合前3天，100μg重组蛋白腹腔冲击一次。

(2)细胞融合与杂交瘤筛选

无菌条件下，取小鼠脾脏，制备富含B细胞的悬液，按经典的PEG(Sigma)法，与SP2/0进行细胞融合。融合后的细胞重悬于HAT培养基进行培养。融合后第5天和第10天使用新鲜的HAT培养基进行半换液培养。融合后第11-15天进行ELISA，免疫荧光和流式细胞术(FACS)分析，筛选阳性克隆。

ELISA筛选采用96孔板进行，简言之，将GPRC5D重组蛋白按100ng/孔的量4度过夜包被到孔板底部，使用HRP偶联抗小鼠IgG抗体和化学发光试剂(碧云天生物科技公司)进行显色，并于酶标仪在450nm波长读值。

免疫荧光染色使用稳定表达GPRC5D的Hela细胞株，简言之，将细胞株在96孔板贴壁培养，加入50μl杂交瘤上清作为一抗，4度孵育2小时，PBS清洗3次，CY3标记的Goat Anti-Mouse IgG(碧云天生物科技公司)作为二抗，常温孵育1小时，PBS清洗3次，使用荧光显微镜采集图像。

流式细胞术分析采用稳定表达GPRC5D的Hela细胞、内源性表达GPRC5D的MM.1S细胞及野生型Hela细胞，简言之，离心收集细胞重悬于含有50μl杂交瘤上清的PBS缓存液中，4度孵育2小时，PBS清洗3次，每孔加入100μlAPC标记的Goat Anti-Mouse IgG(BioLegend,Cat#405308)作为二抗，常温孵育1小时，PBS清洗3次，上流式细胞仪(Agilent-NovosamplerPro)进行分析。

(3)阳性杂交瘤细胞亚克隆

根据上述ELISA、免疫荧光和流式实验的结果，采用常规方式将候选克隆进行亚克隆。之后，用上述筛选方法检测，挑出目标阳性孔，进行细胞冻存。

实施例3

(4)取5×10E5个最终筛选获得的杂交瘤细胞，使用Trizol(Invitrogen)进行裂解，参照标准方法对杂交瘤细胞的总RNA进行提取；

(5)使用反转录(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara)。，使用杂交瘤测序引物采用PCR法将抗体的重链和轻链可变区扩增出来，然后进行T-A克隆，将PCR获得的片段亚克隆至PMD-19T载体中。蓝白斑筛选后，每条链分别挑取阳性克隆进行测序。

筛选获得以下抗体。

实施例4

重组嵌合抗体对hela宫颈癌细胞过表达GPRC5D的结合分析。

将16(1#)的ScFv(SEQ ID NO:9)和48(2#)的ScFv(SEQ ID NO:18)分别与人(IgG1)重链恒定区(UniProtKB/Swiss-Prot:P01861.2)，克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)质粒载体，通过瞬时转染293FT，使用FreeStyle^TM无血清培养基(Life Technologies)摇瓶培养5-7天，收集上清，经过离心超滤，然后通过Protein A/G亲和层析以及分子筛色谱柱纯化获得相应类型抗GPRC5D重组单克隆抗体(16(#1),48(#2))。

将GPRC5D+-Hela细胞铺于24孔细胞培养皿中，第二天将重组嵌合抗体作为一抗，CY3标记的Goat Anti-Mouse IgG(碧云天生物科技公司)作为二抗，并用荧光共聚焦对其进行观察拍照。如图1所示，由图1结果表明：重组嵌合抗体可以和GPRC5D+-Hela细胞发生特异性结合。

实施例5

单克隆抗体对细胞内源的GPRC5D的结合分析。

1、IFA检测实施例4中所制备的单克隆抗体16(#1),48(#2)与GPRC5D+-Hela细胞的结合

选取按实施例1中构建的人GPRC5D抗原的稳转细胞株GPRC5D+-Hela细胞，按实施例2中所述的免疫荧光方法，进行免疫荧光分析，结果如图1所示，均能结合GPRC5D+-Hela细胞表面的GPRC5D蛋白。

2、FACS检测单克隆抗体与多发性骨髓瘤细胞的结合

选取GPRC5D表达阳性的多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226和MM.1S细胞以及不表达GPRC5D蛋白的人急性髓系白血病KG-1细胞，按实施例2中所述的流式细胞术分析方法，进行流式分析，结果如图2所示，抗体16(1#)、48(2#)均能与上述细胞良好结合。

实施例6

体外结合亲和力和动力学实验。

本实施例采用表面等离子共振(SPR)方法测定，使用GE公司Biacore 8K仪器进行分析。利用由Biacore提供的试剂盒，采用标准氨基偶联法将GPRC5D-His重组蛋白共价连接至CM5(GE)芯片上，然后将实施例4中构建的待测单克隆抗体16(#1),48(#2)按不同浓度梯度稀释于同样缓冲液中进样，进样后均以试剂盒内配再生试剂再生。数据的分析和采集使用Biacore 8K配套分析软件进行。所得结果如表1。

表1.抗体抗原体外结合亲和力和动力学分析

Sample ID	KD(M)	ka(1/Ms)	kdis(1/s)	Full R^2
					16(1#)	8.596E-09	7.532E04	6.475E-04	0.9993
48(2#)	2.347E-10	9.747E04	2.288E-05	0.9996

实施例7

双特异性抗体对GPRC5D+-Hela细胞体外杀伤活性分析。

将前述实施例4中获得的16(1#)、48(2#)单克隆抗体分别与抗CD3分子的抗体OKT3利用(G₄S)₃linker串联构建至真核表达载体，转染HEK293T细胞表达，并利用Ni柱纯化，以获得双特异性抗体。

将GPRC5D+-Hela细胞按照每孔5000个、100μL/孔(复孔)分别加入非标记杀伤检测仪(RTCA)仪器专用96孔板及普通96孔细胞培养板中，将RTCA专用96孔板置于仪器中并培养至Cell Index数值位于1.0～2.0之间，然后将制备的浓度为0.01nM的双特异性抗体分别与来自健康供者外周血的经过激活的T细胞按照效靶比2:1共孵育，RTCA监测时长为65h，评价其杀伤活性，结果如图3所示，2种双特异性抗体对GPRC5D+-Hela细胞均具有较强的杀伤活性。

实施例8

抗GPRC5D×BCMA×CD3三特异性抗体(TsAb)的体外杀伤实验。

1、抗GPRC5D×BCMA×CD3三特异性抗体的设计

参考knob-into-hole技术，选择人IgG4-Fc作为三特异性抗体构建骨架并对其进行突变改造，具体如下：

突变改造中knob链对应的突变为：S228P，F234A，L235A和T366W，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.23所示；

所述改造中hole链对应的突变为：S228P，F234A，L235A，T366S，L368A和Y407V，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。

基于上述设计基础，将抗GPRC5D单链抗体和BCMA纳米抗体以及抗CD3的抗体OKT3融合至上述骨架中分别构建成三特异性抗体并命名为k1h1和k2h2，其中：

h1为48-hole，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.25所示；k1为hu381-OKT3-knob，对应的氨基酸序列如SEQ IDNo.26所示；

h2为48-hole-hu381，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示。k2为48-OKT3-knob，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.28所示；

上述两种异源二聚三特异性抗体构造模式图如图4所示。

2、三特异性抗体k1h1和k2h2的制备及纯化

将k1、h1和k2、h2分别按照一定的质量配比后与转染试剂PEI(质量体积比3:1)混匀后，室温静置20min，缓慢加入对数生长期的HEK293T细胞中，转染6-8h后更换为Freestyle培养基并继续培养5天后收集上清，进行蛋白A亲和层析、离子交换层析及分子筛层析。结果如图5中a，b所示，其中a为纯化过程实时监测图，SDS-PAGE(图5中b)表明纯化后获得高纯度的三特异性抗体k1h1和k2h2。

实施例9

三特异性抗体对人源GPRC5D的结合分析。

FACS检测前述实施例制备获得的三特异性抗体与稳转细胞株GPRC5D+-Hela、BCMA+-Hela及多发性骨髓瘤细胞MM.1R细胞的结合，按实施例2中所述的方法，进行流式分析，结果如图6所示。所制备的三特异性抗体k1h1，k2h2与MM.1R、GPRC5D+-Hela和BCMA+-Hela细胞均具有良好的反应活性。

实施例10

三特异性抗体的体外杀伤活性分析。

按实施例6中所述方法，进行三特异性抗体k1h1、k2h2对GPRC5D+-Hela、BCMA+-Hela及野生型Hela细胞体外杀伤活性分析，结果如图7所示，所制备的三特异性抗体k1h1，k2h2对GPRC5D+-Hela、BCMA+-Hela细胞均具有较强的杀伤活性。

实施例11

体内检测三特异性抗体k1h1、k2h2在MM小鼠移植模型中的抗肿瘤活性。

将MM.1S-luciferase和RPMI-8226-luciferase细胞分别按照每只2×106个细胞通过尾静脉接种至6～10周龄的NCG小鼠中，接种10天后在活体成像仪中检测肿瘤生长情况并将其随机分为3组，每组5只。设置与给药等体积的PBS为对照组，双特异性抗体的给药方式为腹腔给药，30μg/只，第一次给药的同时每只尾静脉接种2×10⁶个激活的T细胞，双特异性抗体每7天给药1次，共计给药3次。观察统计实验组(k1h1、k2h2)、对照组(48-OKT3、hu381-OKT3)和空白组(PBS)每只小鼠的生存状态，观察统计时间长度为60天。利用Kaplan-Meier法绘制小鼠生存曲线并通过log-rank(Mantel-Cox)检验统计比较各组小鼠生存期的差异性。

结果如图8所示，实验组生存期显著长于对照组和PBS组，表明三特异性抗体对多发性骨髓瘤细胞具有持久的抗肿瘤活性。

前述实施例中所涉及的序列信息如下表所示。

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以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区；

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区和所述轻链可变区还包括骨架区；

可选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

可选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；

可选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

可选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；

可选地，所述抗体选自：单价抗体、多价抗体、多特异性抗体、嵌合抗体和融合型抗体中的任意一种；

可选地，所述多特异性抗体包括：双特异性抗体、三特异性抗体和四特异性抗体中的任意一种；

可选地，所述抗原结合片段包括：Fab，Fab'，F(ab')₂，scFv，Fv中的任意一种；

可选地，当所述抗原结合片段为scFv时，scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:9或18所示；

可选地，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区。

3.一种多特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括：结合第一靶标的第一抗原结构域；

所述多特异性抗体或其抗原结合片段还包括：结合第二靶标的第二抗原结构域和/或结合第三靶标的第三抗原结构域；

所述第一靶标包括GPRC5D，所述第一抗原结构域包括重链可变区a和轻链可变区a；所述重链可变区a为权利要求1或2中所述的重链可变区，所述轻链可变区a为权利要求1或2中所述的轻链可变区。

4.根据权利要3所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第二靶标包括BCMA，所述第二抗原结构域包括结合BCMA的重链可变区b；

可选地，所述重链可变区b氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。

5.根据权利要求3所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第三靶标包括CD3；

可选地，所述第三抗原结构域包括重链可变区c；

可选地，所述第三抗原结构域还包括轻链可变区c；

可选地，所述第三抗原结构域包括结合CD3的单链抗体；

可选地，所述结合CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；

可选地，所述第一抗原结构域、所述第二抗原结构域和所述第三抗原结构域的数量独立地为1个、2个或2个以上；

可选地，所述多特异性抗体或其抗原结合片段还包括：重链恒定区和/或轻链恒定区；

可选地，所述重链恒定区包括：选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；

可选地，所述重链恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；

可选地，所述重链恒定区包括：knob链和/或hole链；

可选地，所述knob链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；

可选地，所述hole链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；

可选地，所述多特异性抗体选自：双特异性抗体和三特异性抗体。

6.根据权利要求5所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述多特异性抗体包括：a链和b链；其中，所述a链包括所述第一抗原结构域和重链恒定区，所述b链包括所述第二抗原结构域第三抗原结构域和重链恒定区；所述a链的重链恒定区能够与所述b链的重链恒定区形成二聚体；

可选地，所述a链的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，所述b链的氨基酸序列如SEQ IDNO:26所示；

可选地，所述多特异性抗体包括：c链和d链；其中，所述c链包括所述第一抗原结构域、所述第二抗原结构域和重链恒定区；所述d链包括第一抗原结构域、所述第三抗原结构域和重链恒定区；所述c链的重链恒定区能够与所述d链的重链恒定区形成二聚体；

可选地，所述c链的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述d链的氨基酸序列如SEQ IDNO:28所示。

7.一种分离的核酸、含所述分离的核酸的表达盒或含所述分离的核酸的重组载体，其特征在于，所述分离的核酸编码如权利要求1或2所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或权利要求3～6任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段。

8.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求7中所述的重组载体。

9.一种免疫缀合物或药物组合物，其特征在于，其包括：如权利要求1或2所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或权利要求3～6任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段；

可选地，所述免疫缀合物还包括治疗剂；

可选地，所述治疗剂包括：化疗药物、放射性核素、光敏剂、光热剂、免疫检查点抑制剂、毒素、因子、激酶抑制剂、抑制性第二信号分子的抗体、PD-L1抑制剂、PD-1/PD-L1单抗药物中的至少一种；

可选地，所述药物组合物还包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。

10.如权利要求1或2所述的抗GPRC5D的抗体或其抗原结合片段或权利要求3～6任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段或如权利要求7所述的分离的核酸、含所述分离的核酸的表达盒或含所述分离的核酸的重组载体或权利要求8所述的重组细胞或权利要求9所述的免疫缀合物或药物组合物在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用；

可选地，所述产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种；

可选地，所述肿瘤包括：多发性骨髓瘤。