CN117843753A - 一种角蛋白yk93-2、制法和其药物组合物与用途 - Google Patents

一种角蛋白yk93-2、制法和其药物组合物与用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域，公开了一种角蛋白YK93‑2、制法和其药物组合物与用途，具体涉及一种角蛋白YK93‑2，编码角蛋白YK93‑2的核酸分子，含有该核酸分子的表达载体，以及含有该表达载体或基因组整合该核酸分子的宿主细胞，以及角蛋白YK93‑2的制备方法，含有角蛋白YK93‑2的药物组合物，以及上述角蛋白YK93‑2、核酸分子、表达载体、宿主细胞、或药物组合物在制备前列腺增生、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、乳腺癌、泌乳、镇痛、子宫肌瘤、凝血药物中的应用。

Description

一种角蛋白YK93-2、制法和其药物组合物与用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种角蛋白YK93-2，编码角蛋白YK93-2的核酸分子，含有该核酸分子的表达载体，以及含有该表达载体或基因组整合该核酸分子的宿主细胞，以及角蛋白YK93-2的制备方法，含有这种角蛋白的药物组合物，以及这种角蛋白和所述药物组合物在制备预防或治疗前列腺增生、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、乳腺癌、泌乳、镇痛、子宫肌瘤、凝血药物中的应用。
背景技术
角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，根据是否纤维化，分为软角蛋白和硬角蛋白两大类。其中，硬角蛋白是构成毛发、羽毛、蹄、壳、爪、角、鳞片等的主要成分，是结缔组织中重要的结构蛋白质，起着保护机体的作用。
由于硬角蛋白不易溶于各种溶剂，并且角蛋白一般都较其他蛋白质更耐蛋白酶的酶解，目前对角蛋白的研究较多侧重于细胞内软角蛋白的研究，而对自然界中占绝大部分的硬角蛋白资源，即动物体表覆盖物(蹄、角、甲、壳等)中的硬角蛋白研究较少，未得到有效的利用，通常被作为废物而丢弃。
随着基因组学、蛋白质组学、基因工程、微生物工程等现代生物技术的飞速发展，角蛋白在材料、生物、医学等方面应用研究逐渐引起重视。因此，利用蛋白表达系统制备生产硬角蛋白，进而研究其药理作用，开发以硬角蛋白为药效物质的新药物，具有新颖性和创新性。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种角蛋白YK93-2，编码角蛋白YK93-2的核酸分子，含有该核酸分子的表达载体，以及含有该表达载体或基因组整合该核酸分子的宿主细胞，以及角蛋白YK93-2的制备方法，含有角蛋白YK93-2的药物组合物，以及上述角蛋白YK93-2、核酸分子、表达载体、宿主细胞、或药物组合物在制备前列腺增生、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、乳腺癌、泌乳、镇痛、子宫肌瘤、凝血药物中的应用。
为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面是提供了一种角蛋白YK93-2，其特征在于，所述角蛋白YK93-2的氨基酸序列为：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加1-35个氨基酸形成的基本上保持相同生物学功能的氨基酸序列。
进一步的，在角蛋白YK93-2上可进行常规修饰；或者在角蛋白YK93-2上还连接有用于检测或纯化的标签。
更进一步的，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰、硫酸化、氧化、甲基化、脱氨化、形成二硫键或二硫键断裂；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。
本发明技术方案的第二方面是提供了一种编码第一方面所述角蛋白YK93-2的核酸分子。
进一步的，所述的核酸分子的核苷酸序列为：
(1)序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(2)基于SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行序列优化得到的核苷酸序列；
(3)与上述(1)或(2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明技术方案的第三方面是提供了一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有第二方面所述的核酸分子。
进一步的，表达载体可以为pET系列、pUC系列、pQE系列、pBV系列、pMAL系列，pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα/A、pYAM75P，pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pPIC3.5K等；优选的表达载体为pET系列载体；最优选的表达载体为pET-30a(+)。
本发明技术方案的第四方面是提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有第三方面所述的表达载体或者基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。
进一步的，所述的宿主细胞包括细菌、酵母、曲霉菌、植物细胞、或昆虫细胞。
更进一步的，所述的细菌包括大肠杆菌或酵母。
感受态宿主细胞可以为BL21系列，Transetta系列，Rosetta系列，DH5α系列，JM系列，Top系列，Orgami系列，Trans1-T1，TG1，TB1；Y11430，MG1003，GS115(AOX1)，KM71，SMD1168等；优选的表达感受态细胞为BL21(DE3)，Transetta(DE3)。
本发明技术方案的第五方面是提供了一种制备第一方面所述角蛋白YK93-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.合成第一方面所述的角蛋白YK93-2对应的核酸分子，将核酸分子连入相应的表达载体，将表达载体转化到宿主细胞，在一定条件下在发酵设备中培养带表达载体的宿主细胞并诱导表达角蛋白YK93-2，得到含有角蛋白YK93-2的粗蛋白溶液；
B.对步骤A中所表达的粗蛋白溶液进行分离纯化干燥得到角蛋白YK93-2。
进一步的，在步骤A中，所述的宿主细胞主要为选自大肠杆菌，所述的角蛋白YK93-2在大肠杆菌包涵体中表达，所述的发酵设备包括摇瓶或发酵罐。
进一步的，在步骤A中，诱导表达角蛋白YK93-2后，可用清洗剂清洗杂质，用溶液溶解得到粗蛋白溶液。
进一步的，步骤A中的培养基可以为LB培养基、TB培养基、SB培养基、SOB培养基、SOC培养基，PDA培养基、YPD培养基、孟加拉国红培养基、高盐察氏培养基、DOBA培养基、米曲培养基及其改良配方等；摇瓶发酵优选LB培养基；发酵罐优选LB培养基及其改良配方。
进一步的，步骤A中的诱导剂可以为IPTG、乳糖、阿拉伯糖等；优选为IPTG、乳糖。
进一步的，步骤A中，获得的发酵菌液，离心，弃去上清液；沉淀悬浮于缓冲液中，破碎菌体，再离心，弃去上清液；沉淀用清洗剂清洗后，再用尿素溶液溶解，得到YK93-2粗蛋白溶液。
其中，缓冲液优选为buffer A，其用量为：发酵液体积：buffer A体积＝1～100∶1，优选为10∶1；
清洗剂可以为尿素溶液、盐酸胍溶液、Triton、buffer A等，优选为尿素溶液，最优选为2M尿素溶液(可含有1％Triton)，其用量为：发酵液体积：1M尿素(可含有1％Triton)体积＝0.2～100∶1，优选为1～15∶1；
尿素溶液优选为8M尿素溶液，其用量为：发酵液体积∶8M尿素体积＝0.2～100∶1，优选为2～15：1。
进一步的，在步骤B中，所述的分离纯化的方法包括超滤微滤膜技术纯化方法、柱色谱纯化方法、盐析方法、透析方法。
进一步的，步骤B中，分离纯化方法如下：
(1)所述透析方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液用透析的方法纯化，得到目标蛋白YK93-2溶液。
透析袋截留分子量可以为0.5-10kD，优选的透析袋截留分子量为3.5-10kD，最优选的透析袋截留分子量为10kD。
(2)所述超滤微滤方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液用超滤膜或微滤膜等膜技术纯化，得到目标蛋白YK93-2浓缩溶液。
优选的是两次微滤膜纯化，第一次膜孔径1000～1500nm，第二次膜孔径20～50nm。
(3)所述柱色谱方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液通过柱色谱，例如各种交换柱或排阻柱色谱，分离纯化得到目标蛋白YK93-2。
优选的排阻柱是葡聚糖凝胶柱，Superdex 30 Increase，Superdex 75 Increase，Superdex 200 Increase，Superose 6 Increase等；优选的交换柱是离子交换树脂柱：阴离子交换树脂柱，HiTrap Q FF，HiTrap Capto Q ImpRes，Capto Q ImpRes，HiTrap Capto Q，HiTrap DEAE，Toyopearl Q-650M，Toyopearl SuperQ-650M等；阳离子交换树脂柱，HiTrapSP FF，HiTrap Capto SP ImpRes，Capto SP ImpRes，HiTrap Capto SP，Toyopearl SP-650M，Toyopearl Super SP-650M。最优选的是阴离子交换树脂柱。
洗脱剂可以使用本领域常用的洗脱剂，例如水、盐溶液，所述盐溶液包括氯化钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、醋酸钠、醋酸等。
(4)所述盐析方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液中用盐析的方法纯化，得到目标蛋白YK93-2混悬液。
盐析剂可以为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化镁、硫酸铝，硝酸铵、氯化铵、硫酸镁等。优选的盐析剂为硫酸铵及其水溶液。加入饱和硫酸铵水溶液使硫酸铵终浓度达到10～50％，优选为20～30％，更优选为25％。
盐析次数为1～3次，优选为2次。
盐析后沉淀加入纯水清洗，清洗次数为2～5次，优选为3次。
进一步的，步骤B纯化得到的目标蛋白YK93-2溶液可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可将浓缩液直接喷雾干燥成干粉。
本发明技术方案的第六方面是提供了一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有第一方面所述的角蛋白YK93-2或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明上述步骤中得到的角蛋白可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可把浓缩液体直接喷雾干燥成干粉，然后制成各种剂型。
本发明涉及一种药物组合物，包括上述步骤中得到的任意一种角蛋白及药学上可接受的载体。
本发明还涉及含有作为活性成份的本发明角蛋白以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明角蛋白占药物组合物总重量的0.1～100.0％。
本发明还提供一种药物组合物，它包括药物有效剂量的作为活性成分的蛋白质及药学上可接受的载体。
本发明所述的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明蛋白质与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明角蛋白或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺、皮肤、阴道、腹膜、直肠等，优选口服给药。
本发明角蛋白或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射和穴位注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括水包油型、油包水型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等。固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明角蛋白可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯毗咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯毗咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与构椽酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄菩胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。
为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明角蛋白与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明角蛋白制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明角蛋白制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、l,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的角蛋白或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明角蛋白药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明角蛋白组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明角蛋白的每天的合适剂量范围：本发明的角蛋白的用量为0.01～1000mg/kg体重，优选为5～1000mg/kg体重，更优选为10～500mg/kg体重，最优选为20～300mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这取决于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的蛋白质或药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。
本发明技术方案的第七方面是提供了第一方面所述的角蛋白YK93-2或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞或第六方面所述的药物组合物在制备前列腺增生、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、乳腺癌、泌乳、镇痛、子宫肌瘤、凝血药物中的应用。
为了完成本发明之目的，本发明采取如下技术方案，具体地讲，制备本发明角蛋白YK93-2，包括如下步骤：
(1)合成核苷酸序列，并测定序列的准确性；
优选的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
(2)将核苷酸序列转入表达载体中；
表达载体可以为pET系列、pUC系列、pQE系列、pBV系列、pMAL系列，pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα/A、pYAM75P，pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pPIC3.5K等；优选的表达载体为pET系列载体；最优选的表达载体为pET-30a(+)。
(3)将表达载体转染入宿主细胞中；
宿主细胞可以为大肠杆菌或酵母；优选的宿主细胞为大肠杆菌；
感受态细胞可以为BL21系列，Transetta系列，Rosetta系列，DH5α系列，JM系列，Top系列，Orgami系列，Trans1-T1，TG1，TB1；Y11430，MG1003，GS115(AOX1)，KM71，SMD1168等；优选的表达感受态细胞为BL21(DE3)，Transetta(DE3)。
(4)将在适当的条件下，发酵培养宿主细胞，诱导表达目标蛋白YK93-2；
发酵设备可以采用摇瓶或发酵罐；
培养基可以为LB培养基、TB培养基、SB培养基、SOB培养基、SOC培养基，PDA培养基、YPD培养基、孟加拉国红培养基、高盐察氏培养基、DOBA培养基、米曲培养基及其改良配方等；摇瓶发酵优选LB培养基；发酵罐优选LB培养基及其改良配方。
诱导剂可以为IPTG、乳糖、阿拉伯糖等；优选为IPTG、乳糖。
(5)目标蛋白YK93-2产物富集；
步骤(4)获得的发酵菌液，离心，弃去上清液；沉淀悬浮于缓冲液中，破碎菌体，再离心，弃去上清液；沉淀用清洗剂清洗后，再用尿素溶液溶解，得到YK93-2粗蛋白溶液。
其中，缓冲液优选为buffer A，其用量为：发酵液体积：buffer A体积＝1～100：1，优选为10：1；
清洗剂可以为尿素溶液、盐酸胍溶液、Triton、buffer A等，优选为尿素溶液，最优选为2M尿素溶液(可含有1％Triton)，其用量为：发酵液体积：1M尿素(可含有1％Triton)体积＝0.2～100：1，优选为1～15：1；
尿素溶液优选为8M尿素溶液，其用量为：发酵液体积：8M尿素体积＝0.2～100：1，优选为2～15：1。
(6)分离纯化目标蛋白YK93-2：
步骤(5)获得的粗蛋白溶液，需经过纯化获得目标蛋白YK93-2。所述纯化可以通过透析、或超滤微滤、或柱色谱、或盐析步骤进行。
A.所述透析步骤，即将步骤(5)获得的粗蛋白溶液用透析的方法纯化，得到目标蛋白YK93-2溶液。
透析袋截留分子量可以为0.5-10kD，优选的透析袋截留分子量为3.5-10kD，最优选的透析袋截留分子量为10kD。
B.所述超滤微滤步骤，即将步骤(5)获得的粗蛋白溶液用超滤膜或微滤膜等膜技术纯化，得到目标蛋白YK93-2浓缩溶液。
优选的是两次微滤膜纯化，第一次膜孔径1000～1500nm，第二次膜孔径20～50nm。
C.所述柱色谱步骤，即将步骤(5)获得的粗蛋白溶液通过柱色谱，例如各种交换柱或排阻柱色谱，分离纯化得到目标蛋白YK93-2。
优选的排阻柱是葡聚糖凝胶柱，Superdex 30 Increase，Superdex 75 Increase，Superdex 200 Increase，Superose 6 Increase等；优选的交换柱是离子交换树脂柱：阴离子交换树脂柱，HiTrap Q FF，HiTrap Capto Q ImpRes，Capto Q ImpRes，HiTrap Capto Q，HiTrap DEAE，Toyopearl Q-650M，Toyopearl SuperQ-650M等；阳离子交换树脂柱，HiTrapSP FF，HiTrap Capto SP ImpRes，Capto SP ImpRes，HiTrap Capto SP，Toyopearl SP-650M，Toyopearl Super SP-650M。最优选的是阴离子交换树脂柱。
洗脱剂可以使用本领域常用的洗脱剂，例如水、盐溶液，所述盐溶液包括氯化钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、醋酸钠、醋酸等。
D.所述盐析步骤，即将步骤(5)获得的粗蛋白溶液中用盐析的方法纯化，得到目标蛋白YK93-2混悬液。
盐析剂可以为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化镁、硫酸铝，硝酸铵、氯化铵、硫酸镁等。优选的盐析剂为硫酸铵及其水溶液。加入饱和硫酸铵水溶液使硫酸铵终浓度达到10～50％，优选为20～30％，更优选为25％。
盐析次数为1～3次，优选为2次。
盐析后沉淀加入纯水清洗，清洗次数为2～5次，优选为3次。
步骤A～D纯化得到的目标蛋白YK93-2溶液可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可将浓缩液直接喷雾干燥成干粉。
本发明的有益技术效果：
1、本发明蛋白为首次获得的角蛋白，本发明的制备方法具备收率高、样品纯度高的特点。
2、本发明通过蛋白YK93-2对小鼠前列腺增生模型的药效研究，证明蛋白YK93-2可显着降低前列腺湿重与前列腺指数。
3、本发明通过蛋白YK93-2对Lewis肺癌药效研究，证明蛋白YK93-2具有明显的抑制肺癌增殖作用。
4、本发明通过蛋白YK93-2对孕鼠泌乳研究，证明蛋白YK93-2可一定程度上增加母鼠血清泌乳素的含量。
5、本发明通过蛋白YK93-2对EL-4淋巴瘤药效研究，证明蛋白YK93-2具有明显的抑制淋巴瘤增殖作用。
6、本发明通过蛋白YK93-2对小鼠镇痛模型的药效研究，证明蛋白YK93-2可一定程度上降低扭体次数，具有一定的镇痛作用。
7、本发明通过蛋白YK93-2对B16F10黑色素瘤药效研究，证明蛋白YK93-2具有明显的抑制黑色素瘤增殖作用。
附图说明
图1：表达蛋白YK93-2还原型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
(M：蛋白分子量标准；S：表达蛋白YK93-2)
图2.YK93-2对Lewis肺癌小鼠血常规的影响
(与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)
图3.YK93-2对母鼠泌乳量的影响
(与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)
图4.YK93-2对母鼠血清泌乳素的影响
(与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)
图5.YK93-2对EL-4淋巴瘤小鼠血常规的影响
(与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)
图6.YK93-2对小鼠醋酸扭体的抑制作用
(与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)
图7.YK93-2对B16F10黑色素瘤小鼠血常规的影响
(与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)
具体实施方式
下面的实施例及药理活性试验例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
下述实施例及药理活性试验例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。
实施例1摇瓶发酵制备蛋白YK93-2粗溶液A(LB培养基)
合成如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，将其转入pET-30a(+)载体中；测序确定得到含有正确序列的表达载体；将表达载体转染入BL21(DE3)细胞，得到含有目标核苷酸序列的表达感受态宿主细胞。加入LB培养基中，于摇床中，在37℃、220rpm条件下培养1小时，得到重组菌株。
蘸取重组菌株在含有Kana霉素的LBA平板中划线，平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养16小时。
配置400ml LB培养基，分装2瓶，每瓶200ml。在每瓶(200ml)LB培养基中加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，取平板上单一菌落加入LB培养基中，于摇床中，在37℃、220rpm条件下过夜扩增培养，得到种子液。
配置9.6L LB培养基，分装于48瓶，每瓶200ml。在每瓶(200ml)LB培养基中加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，再加入2ml种子液，于摇床中，在37℃、220rpm条件下培养2-3小时。监测OD600，当OD600达到1.0左右时，加入诱导剂，于摇床中诱导表达蛋白，诱导条件选自下表。
合并各瓶菌液，7000rpm离心5分钟，上清液灭菌后弃去；沉淀悬浮于约1L缓冲液中，用80-100目筛网过滤，滤液用高压破碎仪破碎，压力800-1000bar，2次，每次2分钟。破碎后菌液7000rpm离心30分钟，弃去上清液，得到沉淀(即包涵体)。沉淀加入600ml清洗剂清洗2次，离心，弃去上清液。沉淀再加入尿素溶液溶解3次，体积均为600ml。合并3次溶液，7000rpm离心30分钟，沉淀弃去，上清液即为蛋白粗溶液A。
蛋白YK93-2粗溶液A，用还原型SDS-PAGE分析，分离胶浓度为12.5％，考马斯亮蓝R250法染色；在分子量55KD附近显示明显蓝色条带。
实施例2发酵罐制备蛋白YK93-2粗溶液B
实施例1中合成并测序确定得到含有如SEQ ID No.2所示的序列的表达载体；将表达载体转染入BL21(DE3)细胞，得到含有目标核苷酸序列的表达感受态宿主细胞。加入LB培养基中，于摇床中，在37℃、220rpm条件下培养1小时，得到重组菌株。
在含有Kana霉素的LBA平板中，加入重组菌株100μl，涂布器涂至均匀变干，平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。分别取三个单菌落在含有Kana霉素的平板中划线，平板过夜培养，经三批摇瓶发酵表达验证确认无误后，用15％甘油保存菌株，分装成每支1ml，即得工作细胞库，冻存于-80℃冰箱备用。
从工作细胞库中取出1支甘油菌，取100μl，加入40ml LB培养基中，加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，于振荡器中，以37℃、220rpm条件培养6小时，得一级种子液。
取一级种子液1.2ml，加入120ml LB培养基中，加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，于振荡器中，以37℃、220rpm条件培养7小时，得二级种子液。
5L发酵罐中加入3L改良的LB培养液，再加入120ml二级种子液，3ml Kana霉素(终浓度50μg/ml)，以37℃、溶氧30％(串联转速)条件培养约4小时。监测OD值在20左右，15g乳糖作为诱导剂，于20℃进行诱导，以30ml/小时的速率进行补料，20℃培养24小时。
菌液7000rpm离心5分钟，上清液灭菌后弃去；沉淀悬浮于约200ml buffer A中，用80-100目筛网过滤，滤液用高压破碎仪破碎，压力800-1000bar，2次，每次2分钟。破碎后菌液7000rpm离心30分钟，弃去上清液。
沉淀加入1M尿素溶液(含1％Triton)清洗3次，每次600ml，离心，弃去上清液。沉淀依次加入4M尿素溶液溶解1次，8M尿素溶液溶解2次，体积均为600ml。合并三次溶液，7000rpm离心30分钟，沉淀弃去，上清液即为蛋白粗溶液B。
蛋白YK93-2粗溶液B，用还原型SDS-PAGE分析，分离胶浓度为12.5％，考马斯亮蓝R250法染色；在分子量55KD附近显示明显蓝色条带。
实施例3蛋白粗溶液B通过膜技术制备得蛋白YK93-2
实施例2获得的蛋白粗溶液B，通过微滤膜技术进行纯化：先用1500nm或1000nm陶瓷膜芯进行固液分离；内液弃去，外液再用20nm或50nm陶瓷膜芯反复微滤除去尿素；二次微滤的内液冷冻干燥，即得目标蛋白YK93-2。
蛋白YK93-2结构确证：
1、还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析
仪器：蛋白质电泳仪(Bio-Rad)。
方法和结果：蛋白YK93-2溶液，用还原型SDS-PAGE分析，分离胶浓度为12.5％，考马斯亮蓝R250法染色。YK93-2条带分子量在55KD附近。
2、基于LC-MS/MS的蛋白质全序列分析
主要材料：乙腈、甲酸、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Pepsin、Elastase；
主要仪器：纳流液相色谱仪(Thermo EastnLC1200)，质谱仪(Thermo OrbitrapFusion Lumos)，恒温培养箱(中仪国科(北京)科技有限公司，DHP-9052)。
方法和结果：
蛋白YK93-2通过溶解置换、还原烷基化、多种蛋白酶解等前处理，得到酶切肽段；酶切肽段溶液，经液相色谱串联质谱分析，质谱原始文件使用Byonic软件分析数据，鉴定结果覆盖率100％，确定其与目标序列SEQ ID No.1一致。
实施例4蛋白粗溶液A纯化制备得蛋白YK93-2
实施例1获得的蛋白粗溶液A通过下述三种方法进行纯化：
第一种方法：透析；
蛋白粗溶液A用0.45μm滤膜过滤，滤液用水透析，透析72小时以上，内液冷冻干燥，即得目标蛋白YK93-2。
透析袋 截留分子量：0.5kD、3.5kD、5kD、10kD
第二种方法：盐析；
蛋白粗溶液A置于带搅拌的容器中进行两次盐析：沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％或50％，盐析过程中蛋白析出，待盐析完全后，过滤，完成第一次盐析；沉淀中加入400ml纯水混悬，再次沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％，进行第二次盐析，过滤，沉淀即为蛋白粗提物。蛋白粗提物用水进行三次清洗：加200ml纯水混悬，搅拌，静置，过滤；如此重复三次后，沉淀冷冻干燥即得目标蛋白YK93-2。
第三种方法：柱色谱；
蛋白粗溶液A分别经过HiTrap Q FF 16/10，HiTrap Capto Q ImpRes，Capto QImpRes，HiTrap Capto Q，HiTrap DEAE等阴离子交换树脂柱纯化。洗脱液为NaCl溶液梯度洗脱，加20mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液(pH 8.0)。各洗脱流份用SDS-PAGE电泳检测合并，合并的洗脱液7000rpm离心2次，每次1小时；上清液用0.45μm滤膜过滤，合并滤液。滤液用水透析浓缩，透析袋截留分子量10kD，内液冷冻干燥，即得目标蛋白YK93-2。
三种方法得到的产物蛋白YK93-2，经与实施例3相同的结构确证方法，确认其与实施例3制备得到的蛋白具有相同的氨基酸序列。
实施例5蛋白粗溶液B通过盐析方法得蛋白YK93-2
实施例2获得的蛋白粗溶液B置于带搅拌的容器中进行两次盐析：沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％，盐析过程中蛋白析出，待盐析完全后，过滤，完成第一次盐析；沉淀中加入400ml纯水混悬，再次沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％，进行第二次盐析，过滤，沉淀即为蛋白粗提物。蛋白粗提物用水进行三次清洗：加200ml纯水混悬，搅拌，静置，过滤；如此重复三次后，沉淀冷冻干燥即得目标蛋白YK93-2。
产物蛋白YK93-2，经与实施例3相同的结构确证方法，确认其与实施例3制备得到的蛋白具有相同的氨基酸序列。
药理试验
实验例1 YK93-2(实施例3蛋白)对小鼠前列腺增生模型的药效试验
动物：雄性昆明种小鼠18-20克
药品：丙酸睾酮注射液(宁波第二激素厂)；非那雄胺(默沙东)：
仪器：电子天平
实验分组：
正常对照组；
模型组：雄激素负荷模型；
阳性对照组：非那雄胺(1mg/kg)组；非那雄胺(3mg/kg)组；
YK93-2(0.5g/kg)组。
方法：
实验动物的准备：实验动物在实验环境(温度22℃±2℃，相对湿度50％±2％)中适应1天。
皮下注射丙酸睾酮复制小鼠前列腺增生模型：造模前随机分组，每组10只。皮下注射丙酸睾酮(0.01mg/kg)，大豆油配制，每日一次，连续30日。对照组皮下注射等体积羧甲基纤维素钠。造模后立即口服给予非那雄胺1mg/kg、非那雄胺3mg/kg及YK93-2 0.5g/kg。隔日称量体重。给药30天后称重，处死小鼠，通过下腹正中切口切除前列腺，称取湿重，以前列腺湿重(mg)/小鼠体重(g)计算前列腺指数。
数据统计：
计算各组前列腺湿重、前列腺指数的均值、标准差及标准误差，应用T.TEST将各组数据进行组间比较，P<0.05认为有显着性差异。
实验结果：
结果见表1。
表1.YK93-2对小鼠体重、前列腺湿重和前列腺指数的影响
(与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)
实验结论：
1)雄激素负荷法可成功诱导小鼠前列腺增生，模型组小鼠造模后前列腺湿重与前列腺指数明显升高，与正常组比较，P<0.05，有统计学差异。
2)阳性药非那雄胺组低剂量和高剂量在造模后均可以有效降低模型小鼠前列腺湿重与指数，且高剂量效果略好，与模型组比较，P<0.05，有统计学差异。
3)与模型组比较，YK 93-2明显降低小鼠的前列腺湿重与前列腺指数(P<0.05)。
实验例2 YK93-2(实施例3蛋白)对Lewis肺癌模型的药效试验
动物：雄性C57BL/6J小鼠
药品：注射用环磷酰胺(CTX)，YK93-2；
仪器：电子天平、五分类计数仪
实验分组：
对照组；
阳性对照组：环磷酰胺(100mg/kg)
YK93-2(0.5g/kg)组。
方法：
实验动物的准备：实验动物在实验环境(温度22℃±2℃，相对湿度50％±2％)中适应1天。
皮下接种Lewis细胞悬液复制小鼠乳腺癌模型：将Lewis瘤组织用玻璃匀浆器研磨制成悬液，用注射器吸取瘤悬液，计算活细胞数，用生理盐水调整细胞浓度为2.6*106/ml，再将悬液按照0.2ml/只注射到小鼠左侧腋下。第二天随机分成对照组、环磷酰胺(100mg/kg)组和YK93-2(0.5g/kg)组。环磷酰胺单次腹腔注射，YK93-2组每日灌胃，连续10日，对照组口服等量体积羧甲基纤维素钠。处理当天测量体重，通过眼眶取血得到20μL血液并进行血常规分析，剥取瘤块，称重拍照，计算抑瘤率。
数据统计：
以(对照组平均质量-实验组平均质量)/对照组平均质量×100％计算抑瘤率及瘤重的均值、标准差及标准误，应用TTEST将各组数据进行组间比较，P<0.05认为有显着性差异。
实验结果：
结果见表2、图2。
表2.YK93-2对小鼠Lewis肺癌的抑制作用
(与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)
实验结论：
1)皮下接种Lewis细胞可成功建立小鼠肺癌模型。
2)阳性药环磷酰胺组可以显着抑制肿瘤生长，瘤重明显降低，抑瘤率达95.35％，与对照组比较，P<0.05，有统计学差异。
3)与对照组比较，YK93-2(0.5g/kg)可显着抑制肺癌的生长，瘤重明显降低，抑瘤率达27.38％，与对照组比较，P<0.05，有统计学差异。但YK93-2并不能降低动物外周血白细胞的数量。
实验例3蛋白YK93-2(实施例3蛋白)对孕鼠泌乳的药效试验
动物：雌性昆明种孕鼠30-50克
药品：YK93-2
仪器：电子天平
实验分组：
对照组；
YK93-2(2g/kg)组
方法：
实验动物的准备：实验动物在实验环境(温度22℃±2℃，相对湿度50％±2％)中适应1天。记录每只孕鼠生产日期，按照出生日期进行随机分为对照组、YK 93-2组。
YK93-2(2g/kg)灌胃给药，每天记录幼鼠体重及体重增加量。给药13天后颈椎脱臼法处死母鼠，眼眶取血400μl，室温静置1-2h，1000g离心20min；取血清测泌乳素的含量。
数据统计：
计算各组幼鼠每天平均体重增加量(母鼠泌乳量)与母鼠血清泌乳素含量，应用T.TEST将各组数据进行组间比较，P<0.05认为有显着性差异。
实验结果：
结果见图3、图4。
实验结论：
1)YK93-2对幼鼠的体重增长无明显影响。
2)与对照组比较，YK93-2可一定程度上增加母鼠血清泌乳素的含量。
实验例4 YK93-2(实施例3蛋白)EL-4淋巴瘤模型的药效试验
动物：雄性C57BL/6J小鼠
药品：注射用环磷酰胺(CTX)，YK93-2
仪器：电子天平、五分类计数仪
实验分组：
对照组；
阳性对照组：环磷酰胺(100mg/kg)
YK93-2(2g/kg)组。
方法：
实验动物的准备：实验动物在实验环境(温度22℃±2℃，相对湿度50％±2％)中适应1天。
皮下接种EL-4细胞悬液复制小鼠淋巴瘤模型：将EL-4瘤组织用玻璃匀浆器研磨制成悬液，用注射器吸取瘤悬液，计算活细胞数，用生理盐水调整细胞浓度为2.0*106/ml，再将悬液按照0.2ml/只注射到小鼠左侧腋下。第二天随机分成对照组、环磷酰胺(100mg/kg)组、YK93-2(2g/kg)组。环磷酰胺单次腹腔注射，YK93-2(2g/kg)组每日灌胃，连续13日，对照组口服等量体积羧甲基纤维素钠。处理当天测量体重，通过眼眶取血得到20μL血液并进行血常规分析，剥取瘤块，称重拍照，计算抑瘤率。数据统计：
以(对照组平均质量-实验组平均质量)/对照组平均质量×100％计算抑瘤率及瘤重的均值、标准差及标准误，应用TTEST将各组数据进行组间比较，P<0.05认为有显着性差异。
实验结果：
结果见表3、图5。
表3.YK93-2对小鼠EL-4淋巴瘤的抑制作用
(与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)
实验结论：
1)皮下接种EL-4细胞建立小鼠T细胞淋巴瘤模型。
2)阳性药环磷酰胺组可以显着抑制肿瘤生长，瘤重明显降低，抑瘤率达95.67％，与对照组比较，P<0.05，有统计学差异。环磷酰胺组还可明显降低白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞，P<0.05，有统计学差异。
3)与对照组比较，YK93-2抑制淋巴瘤的生长，瘤重明显降低，抑瘤率达25.59％，与对照组比较，P<0.05，有统计学差异。YK93-2对外周血白细胞无明显影响。
实验例5蛋白YK93-2(实施例3蛋白)对小鼠疼痛模型的药效试验
动物：雄性昆明小鼠
药品：盐酸曲马多缓释片，冰醋酸、YK93-2；
仪器：电子天平、计时器
实验分组：
对照组；
阳性对照组：盐酸曲马多组；
YK93-2(2g/kg)组。
方法：
实验动物的准备：实验动物在实验环境(温度22℃±2℃，相对湿度50％±2％)中适应1天。
YK93-2(2g/kg)组灌胃给药,模型组给予等体积的CMC-Na，每日1次,连续给药7日。末次给药30分钟后,均腹腔注射给予1％的醋酸,记录小鼠15min内扭体次数,并计算药物扭体反应抑制率。观察标准为腹腔内凹,伸展后肢,臀部抬高。
数据统计：
以(对照组扭体反应平均数-给药组扭体反应平均数)/对照组扭体反应平均数×100％计算抑制率。记录扭体次数的均值、标准差及标准误，应用TTEST将各组数据进行组间比较，P<0.05认为有显着性差异。
实验结果：
结果见表4、图6。
表4.YK93-2对小鼠疼痛模型的抑制作用
(与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)
实验结论：
1)腹腔注射1％醋酸可成功诱导小鼠疼痛模型。15分钟平均扭体次数为19次。
2)阳性药盐酸曲马多组可以显着缓解疼痛，扭体发生次数明显减少，与对照组比较，P<0.05，有统计学差异。
3)与对照组比较，YK93-2能一定程度效缓解疼痛，扭体发生次数降低。
实验例6 YK93-2(实施例3蛋白)对B16F10黑色素瘤模型的药效试验
动物：雌性C57BL/6J小鼠
药品：注射用环磷酰胺(CTX)，YK93-2；
仪器：电子天平、五分类计数仪
实验分组：
对照组；
阳性对照组：环磷酰胺(100mg/kg)
YK93-2(2g/kg)组。
方法：
实验动物的准备：实验动物在实验环境(温度22℃±2℃，相对湿度50％±2％)中适应1天。
皮下接种B16F10细胞悬液复制小鼠黑色素瘤模型：无菌条件下取出瘤块，研磨成瘤液，生理盐水调整浓度至2.58×106/ml，取0.2ml均匀接种于小鼠腋背部皮下。第二天将动物随机分组，开始给药(记为第0天)。CTX(100mg/kg)每周给药一次，YK-93-2(2g/kg)每天给药，对照组口服等量体积羧甲基纤维素钠。处理当天测量体重，通过眼眶取血得到20μL血液并进行血常规分析，剥取瘤块，称重拍照，计算抑瘤率。
数据统计：
以(对照组平均质量-实验组平均质量)/对照组平均质量×100％计算抑瘤率及瘤重的均值、标准差及标准误，应用TTEST将各组数据进行组间比较，P<0.05认为有显着性差异。
实验结果：
结果见表5、图7。
表5.YK93-2对小鼠B16F10黑色素瘤的抑制作用
(与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)
实验结论：
1)皮下接种B16F10细胞可成功建立小鼠黑色素瘤模型。
2)阳性药环磷酰胺组可以显着抑制肿瘤生长，瘤重明显降低，抑瘤率达85.82％，与对照组比较，P<0.05，有统计学差异。
3)与对照组比较，YK93-2(2g/kg)可显着抑制肺癌的生长，瘤重明显降低，抑瘤率达62.43％，与对照组比较，P<0.05，有统计学差异。YK93-2明显降低动物外周血中性粒细胞的数量，P<0.05，有统计学差异。

Claims (15)

1.一种角蛋白YK93-2，其特征在于，所述角蛋白YK93-2的氨基酸序列为：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加1-35个氨基酸形成的基本上保持相同生物学功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的角蛋白YK93-2，其特征在于，在角蛋白YK93-2上可进行常规修饰；或者在角蛋白YK93-2上还连接有用于检测或纯化的标签。
3.根据权利要求2的角蛋白YK93-2，其特征在于，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰、硫酸化、氧化、甲基化、脱氨化、形成二硫键或二硫键断裂；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述角蛋白YK93-2的核酸分子。
5.根据权利要求4的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的核苷酸序列为：
(1)序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(2)基于SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行序列优化得到的核苷酸序列；
(3)与上述(1)或(2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求4-5任一项所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体或者基因组中整合有权利要求4-5任一项所述的核酸分子。
8.根据权利要求7的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括细菌、酵母、曲霉菌、植物细胞、或昆虫细胞。
9.根据权利要求8的宿主细胞，其特征在于，所述的细菌包括大肠杆菌或酵母。
10.一种制备生产权利要求1～3任一项所述角蛋白YK93-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.合成权利要求1～3任一项所述的角蛋白YK93-2对应的核酸分子，将核酸分子连入相应的表达载体，将表达载体转化到宿主细胞，在一定条件下在发酵设备中培养带表达载体的宿主细胞并诱导表达角蛋白YK93-2，得到含有角蛋白YK93-2的粗蛋白溶液；
B.对步骤A中所表达的粗蛋白溶液进行分离纯化干燥得到角蛋白YK93-2。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于，在步骤A中，所述的宿主细胞主要为选自大肠杆菌，所述的角蛋白YK93-2在大肠杆菌包涵体中表达，所述的发酵设备包括摇瓶或发酵罐。
12.根据权利要求10的方法，其特征在于，在步骤A中，诱导表达角蛋白YK93-2后，可用清洗剂清洗杂质，用溶液溶解得到粗蛋白溶液。
13.根据权利要求10的方法，其特征在于，在步骤B中，所述的分离纯化的方法包括超滤微滤膜技术纯化方法、柱色谱纯化方法、盐析方法、透析方法。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1～3任一项所述的角蛋白YK93-2及以及药学上可接受的载体或赋形剂。
15.权利要求1～3任一项所述的角蛋白YK93-2或权利要求4-5任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体或权利要求7-9所述的宿主细胞或权利要求14所述的药物组合物在制备预防或治疗前列腺增生、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、乳腺癌、子宫肌瘤以及泌乳、镇痛、凝血药物中的应用。
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