CN116655755A - 一种核糖体蛋白、其制备方法及其镇痛的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种核糖体蛋白A0A4D6FS24，编码该蛋白质的核酸分子，含有该核酸分子的重组载体以及含有该表达载体或基因组整合该核酸分子的宿主细胞，本发明还公开了核糖体蛋白A0A4D6FS24的制备方法及其镇痛作用，上述核糖体蛋白A0A4D6FS24、核酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物在制备镇痛药物中的应用。

Description

一种核糖体蛋白、其制备方法及其镇痛的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种核糖体蛋白A0A4D6FS24，编码该蛋白质的核酸分子，含有该核酸分子的表达载体，以及含有该表达载体或基因组整合该核酸分子的宿主细胞，以及核糖体蛋白A0A4D6FS24的制备方法，含有这种核糖体蛋白的药物组合物，以及这种蛋白质和所述药物组合物在镇痛药物中的应用。
背景技术
核糖体蛋白广泛存在于真核生物和原核生物体内，是构成核蛋白体的蛋白质，是组成核糖体的主要成分，具有很大的利用价值。
随着基因组学、蛋白质组学、微生物工程等现代生物技术的发展，天然产物来源的生物大分子药物，尤其是蛋白类药物，由于其生物活性强，生物相容性好而受到越来越多的关注。利用蛋白表达系统制备生产目的蛋白是研究基因或蛋白的生物功能的重要手段。
核糖体蛋白A0A4D6FS24是从菊科植物苍耳带总苞的果实—苍耳子中鉴定得到的一种蛋白质。现代药理研究证实苍耳子生品和炒制品均具有镇痛活性[1]，苍耳子的乙醇提取物和正丁醇部位均具有镇痛活性[2-3]。据文献报道苍耳子中的咖啡酰苍耳子噻嗪双酮苷、绿原酸和1,5-O-二咖啡酰奎宁酸具有镇痛活性[4]，苍耳子中具有镇痛活性的蛋白质尚未有文献报道。利用蛋白表达系统制备目的核糖体蛋白，进而研究其作用，具有新颖性和创造性。
参考文献
[1]CHEN DH.The processing method and the relationship betweenpesticide effect and components of Fructus Xanthii[J].Nei Mongol J TraditChin Med,2008,9(22):54-55.
[2]付小梅,孙艳朝,刘婧,等.蒙古苍耳子和苍耳子的抗炎镇痛作用比较[J].医药导报,2014,33(5):555-557.
[3]HAN T,LIHL,ZHANG QY,et a1.Bioactivity-guided fractionation foranti-inflam matory and analgesic properties and constituents of Xanthiumstrumarium L[J].Phytomedicine,2007,14(12)：825-829.
[4]韩婷,汪洋,张宏,等.苍耳子活性部位中抗炎镇痛化学成分的研究[c].中华中医药学会第九届中药鉴定学术会议论文集,293.
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种核糖体蛋白A0A4D6FS24，编码该蛋白质的核酸分子，含有该核酸分子的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞，以及核糖体蛋白A0A4D6FS24的制备方法，含有这种核糖体蛋白的药物组合物，以及这种蛋白质和所述药物组合物在镇痛药物中的应用。
为实现本发明之目的，本发明采用的技术方案为：
本发明技术方案的第一方面是提供一种来源于苍耳子的核糖体蛋白A0A4D6FS24，其特征在于，其氨基酸序列为：
(1)序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
(2)序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加1-70个氨基酸形成的生物学功能基本相同的氨基酸序列。
进一步在核糖体蛋白A0A4D6FS24上可进行常规修饰或连接利于检测或纯化的标签。
更进一步的，所述常规修饰包括乙酰化、酰胺化、烷基化、磷酸化、硫酸化、氧化、甲基化、糖基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇修饰、形成二硫键或二硫键断裂；所述标签包括His标签、GST标签、MBP标签、Nus标签、HA标签、IgG标签、c-Myc标签。
本发明技术方案的第二方面是提供一种编码第一方面所述核糖体蛋白的核酸分子。
进一步的，所述核酸分子的核苷酸序列为：
(1)序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
(2)基于SEQ ID No.2所示的核苷酸序列进行序列优化得到的核苷酸序列；
(3)与上述(1)或(2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明技术方案的第三方面是提供一种含第二方面所述核酸分子的表达载体。
进一步的，表达载体可以为pET系列、pUC系列、pQE系列、pBV系列、pMAL系列、pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα/A、pYAM75P，pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pPIC3.5K等；优选的表达载体为pET系列载体，其中pET-30a(+)载体实现包涵体表达，pET-22b(+)载体实现可溶性表达。
本发明技术方案的第四方面是提供提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有第三方面所述的表达载体或者基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。
进一步的，所述的宿主细胞包括细菌、酵母、链霉菌、植物细胞或昆虫细胞。
更进一步的，所述细菌包括大肠杆菌。
感受态宿主细胞可以为BL21系列、Transetta系列、Rosetta系列、DH5α系列、JM系列、Top系列、Orgami系列、Trans1-T1、TG1、TB1；Y11430、MG1003、GS115(AOX1)、KM71、SMD1168等；优选的表达感受态细胞为BL21(DE3)。
本发明技术方案的第五方面是提供了一种高效制备第一方面所述核糖体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.合成第一方面所述的核糖体蛋白A0A4D6FS24对应的核酸分子，将核酸分子连入相应的表达载体，将表达载体转化到宿主细胞，在一定条件下在发酵设备中培养带表达载体的宿主细胞并诱导表达核糖体蛋白A0A4D6FS24，并得到含有核糖体蛋白A0A4D6FS24的粗蛋白溶液；
B.对步骤A得到的粗蛋白溶液进行分离纯化干燥得到核糖体蛋白A0A4D6FS24。
进一步的，在步骤A中，所述宿主细胞主要为大肠杆菌，所述发酵设备包括但不仅限于摇瓶或发酵罐。
进一步的，在步骤A中，当表达载体为pET-30a(+)时，以包涵体形式表达的重组蛋白存在于菌体破碎后离心的沉淀中，沉淀用清洗剂清洗再用尿素溶液溶解，得到A0A4D6FS24粗蛋白溶液；当表达载体pET-22b(+)时，可溶性表达的重组蛋白存在于菌体破碎后离心的上清中，即为A0A4D6FS24粗蛋白溶液。
进一步的，步骤A中的培养基可以为LB培养基、TB培养基、SB培养基、SOB培养基、SOC培养基、PDA培养基、YPD培养基、孟加拉红培养基、高盐察氏培养基、DOBA培养基、米曲培养基及其改良配方等；摇瓶发酵优选LB培养基；发酵罐发酵优选LB培养基及其改良配方。
进一步的，步骤A中的诱导剂可以为IPTG、乳糖、阿拉伯糖等；优选IPTG、乳糖。
进一步的，步骤A中，获得的发酵菌液，离心，弃去上清液；沉淀悬浮于缓冲液中，破碎菌体，再离心，弃去上清液；沉淀用清洗剂清洗后，再用尿素溶液溶解，得到A0A4D6FS24粗蛋白溶液。
清洗剂可以为尿素溶液、盐酸胍溶液、Triton等，优选尿素溶液，最优选0.5M尿素溶液。
尿素溶液优选为8M尿素溶液。
进一步的，在步骤B中，所述的分离纯化的方法包括色谱纯化方法、盐析方法、超滤微滤膜技术纯化方法、透析方法。
进一步的，步骤B中，分离纯化方法如下：
(1)所述色谱纯化方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液通过色谱，例如各种交换色谱、排阻色谱或亲和色谱，分离纯化得到目标蛋白A0A4D6FS24。
优选的排阻色谱是葡聚糖凝胶色谱，Superdex 30Increase、Superdex75Increase、Superdex 200Increase、Superose 6Increase等。
优选的亲和色谱是离子交换色谱：阴离子交换色谱，HiTrap Q FF、HiTrap CaptoQ ImpRes、Capto Q ImpRes、HiTrap Capto Q、HiTrap DEAE、Toyopearl Q-650M、ToyopearlSuperQ-650M等；阳离子交换色谱，HiTrap SP FF、HiTrap Capto SP ImpRes、Capto SPImpRes、HiTrap Capto SP、Toyopearl SP 650M、Toyopearl Super SP-650M。
洗脱剂可以使用本领域常用的洗脱剂，例如水、盐溶液，所述盐溶液包括氯化钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、Tris-HCl缓冲液、醋酸钠、醋酸等。
(2)所述盐析方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液中用盐析的方法纯化，得到目标蛋白A0A4D6FS24混悬液。
盐析剂可以为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化镁、硫酸铝、硝酸铵、氯化铵、硫酸镁等；优选的盐析剂为硫酸铵及其水溶液。
(3)所述超滤微滤方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液用超滤膜或微滤膜等膜技术纯化，得到目标蛋白A0A4D6FS24浓缩溶液。
(4)所述透析方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液用透析的方法纯化，得到目标蛋白A0A4D6FS24溶液。
透析袋截留分子量可以为0.5-10kD，优选的透析袋截留分子量为3.5-10kD，最优选的透析袋截留分子量为3.5kD。
进一步的，选择梯度透析的方法使重组蛋白复性，溶解在8M尿素中的重组蛋白依次在6M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素、0.5M尿素和纯水中透析。
进一步的，步骤B纯化得到的目标蛋白A0A4D6FS24溶液可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可将浓缩液直接喷雾干燥成干粉，得到目标重组蛋白A0A4D6FS24。
本发明技术方案的第六方面涉及一种药物组合物，包括上述步骤中得到的任意一种核糖体蛋白及药学上可接受的载体。
本发明还涉及含有作为活性成份的本发明核糖体蛋白以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。
本发明还提供一种药物组合物，它包括药物有效剂量的作为活性成分的蛋白质及药学上可接受的载体。
本发明所述的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明蛋白质与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明核糖体蛋白或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺、皮肤、阴道、腹膜、直肠等，优选口服给药。
本发明核糖体蛋白或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射和穴位注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括水包油型、油包水型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等。固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明核糖体蛋白可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯毗咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯毗咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与构椽酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄菩胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。
为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明角蛋白与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明角蛋白制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明角蛋白制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、l,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的核糖体蛋白或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明核糖体蛋白药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明核糖体蛋白组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明的蛋白质或药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。
本发明技术方案的第七方面是提供了第一方面所述的核糖体蛋白A0A4D6FS24或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞或第六方面所述的药物组合物在制备镇痛药物中的应用。
为了完成本发明之目的，本发明采取如下技术方案，具体地讲，制备本发明核糖体蛋白A0A4D6FS24，包括如下步骤：
(1)合成核苷酸序列，并测定序列的准确性；
优选的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
(2)将核苷酸序列转入表达载体中；
表达载体可以为pET系列、pUC系列、pQE系列、pBV系列、pMAL系列、pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα/A、pYAM75P、pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pPIC3.5K等；优选的表达载体为pET系列载体；包涵体表达最优选的表达载体为pET-30a(+)，可溶性表达最优选的表达载体为pET-22b(+)。
(3)将表达载体转染入宿主细胞中；
宿主细胞可以为大肠杆菌或酵母；优选的宿主细胞为大肠杆菌；
感受态细胞可以为BL21系列，Transetta系列、Rosetta系列、DH5α系列、JM系列、Top系列、Orgami系列、Trans1-T1、TG1、TB1、Y11430、MG1003、GS115(AOX1)、KM71、SMD1168等；优选的表达感受态细胞为BL21(DE3)。
(4)将在适当的条件下，发酵培养宿主细胞，诱导表达目标蛋A0A4D6FS24；
发酵设备包括但不限于摇瓶或发酵罐；
培养基可以为LB培养基、TB培养基、SB培养基、SOB培养基、SOC培养基，PDA培养基、YPD培养基、孟加拉红培养基、高盐察氏培养基、DOBA培养基、米曲培养基及其改良配方等；摇瓶发酵优选LB培养基；发酵罐发酵优选LB培养基及其改良配方。
诱导剂可以为IPTG、乳糖、阿拉伯糖等；优选IPTG、乳糖，最优选乳糖。
(5)目标蛋白A0A4D6FS24产物富集；
步骤(4)获得的发酵菌液，离心，弃去上清液；沉淀悬浮于缓冲液中，破碎菌体，再离心，弃去上清液；沉淀用清洗剂清洗后，再用尿素溶液溶解，得到A0A4D6FS24粗蛋白溶液。
清洗剂可以为尿素溶液、盐酸胍溶液、Triton、buffer A等，优选为尿素溶液，最优选为0.5M尿素溶液；
尿素溶液优选为8M尿素溶液。
(6)分离纯化目标蛋白A0A4D6FS24：
步骤(5)获得的粗蛋白溶液，需经过纯化获得目标蛋白A0A4D6FS24。所述纯化方法可以是色谱纯化方法、盐析方法、超滤微滤膜技术纯化方法、透析方法。
A.所述色谱纯化方法，即将步骤(5)中获得的粗蛋白溶液通过色谱，例如各种交换色谱、排阻色谱或亲和色谱，分离纯化得到目标蛋白A0A4D6FS24。
优选的排阻色谱是葡聚糖凝胶色谱，Superdex 30Increase、Superdex75Increase，Superdex 200Increase、Superose 6Increase等。
优选的亲和色谱是离子交换色谱：阴离子交换色谱，HiTrap Q FF、HiTrap CaptoQ ImpRes、Capto Q ImpRes、HiTrap Capto Q、HiTrap DEAE、Toyopearl Q-650M、ToyopearlSuperQ-650M等；阳离子交换色谱，HiTrap SP FF、HiTrap Capto SP ImpRes、Capto SPImpRes、HiTrap Capto SP、Toyopearl SP 650M、Toyopearl Super SP-650M。最优选的是阴离子交换色谱。
洗脱剂可以使用本领域常用的洗脱剂，例如水、盐溶液，所述盐溶液包括氯化钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、Tris-HCl缓冲液、醋酸钠、醋酸等。
B.所述盐析方法，即将步骤(5)中获得的粗蛋白溶液中用盐析的方法纯化，得到目标蛋白A0A4D6FS24混悬液。
盐析剂可以为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化镁、硫酸铝、硝酸铵、氯化铵、硫酸镁等。优选的盐析剂为硫酸铵及其水溶液。
C.所述超滤微滤方法，即将步骤(5)中获得的粗蛋白溶液用超滤膜或微滤膜等膜技术纯化，得到目标蛋白A0A4D6FS24浓缩溶液。
D.所述透析方法，即将步骤(5)中获得的粗蛋白溶液用透析的方法纯化，得到目标蛋白A0A4D6FS24溶液。
透析袋截留分子量可以为0.5-10kD，优选的透析袋截留分子量为3.5-10kD，最优选的透析袋截留分子量为3.5kD。
进一步的，选择梯度透析的方法使重组蛋白复性，溶解在8M尿素中的重组蛋白依次在6M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素、0.5M尿素和纯水中透析。
进一步的，步骤A-D纯化得到的目标蛋白A0A4D6FS24溶液可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可将浓缩液直接喷雾干燥成干粉。
本发明的有益技术效果：
1.本发明蛋白为首次获得的核糖体蛋白A0A4D6FS24，且制备方法效率高、样品纯度高。
2.本发明通过核糖体蛋白A0A4D6FS24对小鼠醋酸扭体的药效试验研究，证明核糖体蛋白A0A4D6FS24显著减少醋酸引起的小鼠扭体次数，具有显著的镇痛作用。
附图说明
图1.重组蛋白A0A4D6FS24还原型SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析；(S:重组蛋白A0A4D6FS24；M:蛋白分子量标准)
图2.直接透析法得到的重组蛋白A0A4D6FS24(FS24)和梯度透析复性后的重组蛋白A0A4D6FS2(FS24-td)对醋酸引起小鼠扭体次数的影响；(FS24组与模型组比较，*P＜0.05，具有统计学意义；FS24-td组与模型组比较，**P＜0.01，具有统计学意义；)
图3.直接透析法得到的重组蛋白A0A4D6FS24(FS24)和梯度透析复性后的重组蛋白A0A4D6FS2(FS24-td)对醋酸引起小鼠扭体次数的影响；(FS24组与模型组比较，***P＜0.001，具有统计学意义；FS24-td组与模型组比较，****P＜0.0001，具有统计学意义；)
具体实施方式
下面的实施例及药理活性试验例用来进一步说明本发明，但并不意味着对本发明的任何限制。下述实施例及药理活性试验例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法；所用实验材料，如无特殊说明均购自常规生化试剂公司。
实施例1：摇瓶发酵制备并纯化得到目标蛋白A0A4D6FS24(pET-30a(+)载体)
合成如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，将其转入pET-30a(+)载体中；将表达载体转染入BL21(DE3)细胞，加入LB培养基中，在摇床中37℃、220rpm条件下培养45分钟，得到重组菌株。
取适量重组菌株于含有Kana霉素的LBA平板上划线，涂布均匀至平板完全吸收菌液，平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养12-16小时。
取一瓶灭菌后的LB培养基100ml，加入50mg/ml的Kana霉素100μl(至终浓度为50μg/ml)，取平板上单一菌落于LB培养基中，在摇床中37℃、220rpm条件下培养4小时，得到种子液。
配制LB培养基4.4L，分装22瓶，每瓶200ml。每瓶加入50mg/ml的Kana霉素100μl(至终浓度为50μg/ml)，再加入2ml种子液，在摇床中37℃、220rpm条件下培养3-4小时。监测OD600至0.8-1.0时，每瓶加入100mg/ml乳糖200μl(至终浓度为100μg/ml)作诱导剂，在摇床中20℃、220rpm条件下诱导表达重组蛋白。
合并菌液，10000rpm离心5分钟，上清液灭菌后弃去；沉淀悬浮于约400ml的缓冲液中，磁力搅拌15分钟至无明显固体沉淀，用80-100目筛网过滤，滤液用高压破碎仪器破碎，破碎压力800-1000bar，破碎两次，每次破碎2分钟。破碎后菌液10000rpm离心20分钟，弃去上清，包涵体蛋白存在于沉淀中。沉淀依次用缓冲液、0.5M尿素、1M尿素、2M尿素、4M尿素、6M尿素和8M尿素清洗，8M尿素清洗后离心得到的上清液即为蛋白A0A4D6FS24粗溶液A。
粗蛋白溶液A通过纯化、真空冷冻干燥得到目标蛋白A0A4D6FS24。
第一种方法：直接透析法；
A0A4D6FS24蛋白粗溶液A10000rpm离心15分钟，上清液用纯水透析，透析72小时，每12小时换一次水，内液真空冷冻干燥即得目标蛋白A0A4D6FS24。
第二种方法：梯度透析复性法；
A0A4D6FS24蛋白粗溶液A10000rpm离心15分钟，上清液依次用6M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素、0.5M尿素和纯水透析，每个梯度透析12小时，纯水透析24小时，内液真空冷冻干燥即得复性后的目标蛋白A0A4D6FS24。
第三种方法：盐析法；
蛋白粗溶液A置于带搅拌的容器中进行盐析，沿壁缓慢加入硫酸铵固体，使硫酸铵终浓度为20％或40％，盐析过程中蛋白析出，待盐析完全后，过滤，完成第一次盐析；沉淀中加入纯水混悬，再次沿壁缓慢加入硫酸铵固体，使硫酸铵终浓度为20％，进行第二次盐析，过滤，沉淀即为蛋白粗提物。蛋白粗提物用水进行三次清洗：加纯水混悬，搅拌，静置，过滤；如此重复三次后，沉淀真空冷冻干燥得到目标蛋白A0A4D6FS24。
蛋白A0A4D6FS24结构验证：
1、还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析
仪器：蛋白电泳分析仪(Bio-Red)。
方法和结果：蛋白A0A4D6FS24溶液用还原型SDS-PAGE分析，分离胶浓度12.5％，考马斯亮蓝R250法染色，蛋白A0A4D6FS24条带分子量在27KD附近。
2、基于LC-MS/MS的蛋白全系列分析
主要材料：碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶；
主要仪器：电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪；(Thermo Q Exative hybridquadrupole-Orbitrap Mass spectrometer)
方法和结果：蛋白A0A4D6FS24经过溶解置换、还原烷基化、胰蛋白酶等前处理得到酶切肽段溶液，经液相色谱串联质谱分析，质谱原始文件使用Maxquant(1.6.5.0)检索蛋白数据库分析数据，鉴定结果确定其与目标序列SEQ ID No.1一致。
实施例2：摇瓶发酵制备并纯化得到目标蛋白A0A4D6FS24(pET-22b(+)载体)
合成如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，将其转入pET-22b(+)载体中；将表达载体转染入BL21(DE3)细胞，加入LB培养基中，在摇床中37℃、220rpm条件下培养45分钟，得到重组菌株。
取适量重组菌株于含有AMP霉素的LBA平板上划线，涂布均匀至平板完全吸收菌液，平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养12-16小时。
取一瓶灭菌后的LB培养基100ml，加入50mg/ml的AMP霉素100μl(至终浓度为50μg/ml)，取平板上单一菌落于LB培养基中，在摇床中37℃、220rpm条件下培养4小时，得到种子液。配制LB培养基4.4L，分装22瓶，每瓶200ml。每瓶加入50mg/ml的AMP霉素100μl(至终浓度为50μg/ml)，再加入2ml种子液，在摇床中37℃、220rpm条件下培养3-4小时。监测OD600至0.8-1.0时，每瓶加入100mg/ml乳糖200μl(至终浓度为100μg/ml)作诱导剂，在摇床中20℃、220rpm条件下诱导表达重组蛋白。
合并菌液，10000rpm离心5分钟，上清液灭菌后弃去；沉淀悬浮于约400ml的缓冲液中，磁力搅拌15分钟至无明显固体沉淀，用80-100目筛网过滤，滤液用高压破碎仪器破碎，破碎压力800-1000bar，破碎两次，每次破碎2分钟。破碎后菌液10000rpm离心20分钟，可溶性表达的重组蛋白存在于上清中，即为蛋白A0A4D6FS24粗溶液B。
蛋白A0A4D6FS24粗溶液B通过纯化、真空冷冻干燥得到目标蛋白A0A4D6FS24。
第一种方法：亲和色谱法；
A0A4D6FS24蛋白粗溶液B10000rpm离心15分钟，上清液与镍柱填料10:1的比例混匀后冰浴振荡3小时，装柱，依次用20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、200mM、500mM的咪唑溶液洗脱，各洗脱流分经SDS-PAGE电泳检测合并，真空冷冻干燥得到目标蛋白A0A4D6FS24。
第二种方法：Sephadex G75分子筛色谱法；
A0A4D6FS24蛋白粗溶液B10000rpm离心15分钟，采用Sephadex G75分子筛色谱法纯化，上样后用纯水洗脱，各洗脱流分经SDS-PAGE电泳检测合并，真空冷冻干燥得到目标蛋白A0A4D6FS24。
第三种方法：直接透析法；
A0A4D6FS24蛋白粗溶液B10000rpm离心15分钟，上清液用纯水透析，透析72小时，每12小时换一次水，内液真空冷冻干燥得到目标蛋白A0A4D6FS24。
三种方法得到的目标蛋白A0A4D6FS24，经与实施例1相同的经过确证方法，确认其与实施例1制备得到的蛋白质具有相同的氨基酸序列。
药理试验1
实施例1直接透析法得到的重组蛋白A0A4D6FS24和梯度透析复性后的重组蛋白A0A4D6FS24对小鼠醋酸扭体的药效；
动物：20-25克雄性昆明小鼠；
主要材料：醋酸、生理盐水、布洛芬、重组蛋白A0A4D6FS24；
主要仪器：电子天平、计时器；
给药方式：腹腔注射；给药体积：0.01ml/g；
观测指标：小鼠腹部收缩和两侧后肢同时伸展记为一次扭体。以小鼠开始出现扭体的潜伏时间及次数作为痛反应指标，判断受试样品是否具有镇痛作用。
实验结束后处死动物的方法：颈椎脱臼法；
实验分组：
预实验组：给小鼠不同浓度的醋酸溶液(0.90％、1.25％)，预实验测得醋酸溶液的最佳浓度为1.25％，剂量为0.01ml/g；
模型组：生理盐水；
阳性对照组：布洛芬，给药量50mg/kg；
实验组：实施例1直接透析法得到的重组蛋白A0A4D6FS24即FS24和梯度透析复性后的重组蛋白A0A4D6FS24即FS24-td；给药量100mg/kg；
实验动物准备：实验动物在动物房中适应1晚上，实验前不禁食不禁水，随机分为5组，每组10只小鼠，并做标记。
实验方法：样品给药10分钟后，给小鼠腹腔注射预实验测得的最佳浓度即1.25％的醋酸溶液(用生理盐水配制)，给药量为0.01ml/g，5分钟后开始记录小鼠扭体次数，记录时间15分钟，即小鼠达到痛阈值15分钟后结束实验。
数据统计：根据实验当天测量的小鼠扭体次数，计算各组小鼠扭体次数的平均值、标准差以及标准误差，用TTEST将各组数据进行组间比较，P＜0.05认为有显著差异。抑制率＝(空白对照组扭体次数均值-样品组扭体次数均值)/空白对照组扭体次数均值×100％。
实验结果：
表1.重组蛋白A0A4D6FS24对醋酸引起的小鼠扭体次数的影响
(FS24组与模型组比较，*P＜0.05，具有统计学意义)
(FS24-td组与模型组比较，**P＜0.01，具有统计学意义)
实验结论：
分别腹腔注射布洛芬(20mg/kg)、重组蛋白A0A4D6FS24(100mg/kg)，10分钟后腹腔注射1.25％醋酸溶液(0.01ml/g)，5分钟后开始记录小鼠扭体次数，记录时间15分钟，即小鼠达到痛阈值15分钟后结束实验。本次实验结果显示：
1)腹腔注射1.25％醋酸溶液(0.01ml/g)可以成功引起小鼠扭体。
2)阳性工具药布洛芬对醋酸引起的小鼠扭体有抑制作用，可明显减少小鼠扭体次数，抑制率为87.88％，与模型组比较，***P＜0.001，具有统计学意义，阳性工具药稳定有效。
3)FS24组重组蛋白A0A4D6FS24可明显抑制醋酸引起的小鼠扭体反应，抑制率达65.37％，与模型组比较，*P＜0.05，具有统计学意义。
4)FS24-td组重组蛋白A0A4D6FS24可明显抑制醋酸引起的小鼠扭体反应，抑制率达75.32％，与模型组比较，**P＜0.01，具有统计学意义。
药理试验2
实施例1直接透析法得到的重组蛋白A0A4D6FS24和梯度透析复性后的重组蛋白A0A4D6FS2对小鼠醋酸扭体的药效；
动物：20-25克雄性昆明小鼠；
主要材料：醋酸、生理盐水、布洛芬、重组蛋白A0A4D6FS24；
主要仪器：电子天平、计时器；
给药方式：腹腔注射；给药体积：0.01ml/g；
观测指标：小鼠腹部收缩和两侧后肢同时伸展记为一次扭体。以小鼠开始出现扭体的潜伏时间及次数作为痛反应指标，判断受试样品是否具有镇痛作用。
实验结束后处死动物的方法：颈椎脱臼法；
实验分组：
预实验组：给小鼠不同浓度的醋酸溶液(0.90％、1.20％)，预实验测得醋酸溶液的最佳浓度为1.20％，剂量为0.01ml/g。
模型组：生理盐水；
阳性对照组：布洛芬，给药量20mg/kg；
实验组：实施例1直接透析法得到的重组蛋白A0A4D6FS24即FS24和梯度透析复性后的重组蛋白A0A4D6FS24即FS24-td；给药量100mg/kg；
实验动物准备：实验动物在动物房中适应1晚上，实验前不禁食不禁水，随机分为5组，每组10只小鼠，并做标记。
实验方法：样品给药10分钟后，给小鼠腹腔注射预实验测得的最佳浓度即1.20％的醋酸溶液(用生理盐水配制)，给药量为0.01ml/g，5分钟后开始记录小鼠扭体次数，记录时间15分钟，即小鼠达到痛阈值15分钟后结束实验。
数据统计：根据实验当天测量的小鼠扭体次数，计算各组小鼠扭体次数的平均值、标准差以及标准误差，用TTEST将各组数据进行组间比较，P＜0.05认为有显著差异。抑制率＝(空白对照组扭体次数均值-样品组扭体次数均值)/空白对照组扭体次数均值×100％。
实验结果：
表2.重组蛋白A0A4D6FS24对醋酸引起的小鼠扭体次数的影响
(FS24组与模型组比较，***P＜0.001，具有统计学意义)
(FS24-td组与模型组比较，****P＜0.0001，具有统计学意义)
实验结论：
分别腹腔注射布洛芬(20mg/kg)、重组蛋白(100mg/kg)，10分钟后腹腔注射1.20％醋酸溶液(0.01ml/g)，5分钟后开始记录小鼠扭体次数，记录时间15分钟，即小鼠达到痛阈值15分钟后结束实验。本次实验结果显示：
1)腹腔注射1.20％醋酸溶液(0.01ml/g)可以成功引起小鼠扭体。
2)阳性工具药布洛芬对醋酸引起的小鼠扭体有抑制作用，可明显减少小鼠扭体次数，抑制率为44.51％，与模型组比较，不具有统计学意义。
3)FS24组重组蛋白A0A4D6FS24可明显抑制醋酸引起的小鼠扭体反应，抑制率达86.23％，与模型组比较，***P＜0.001，具有统计学意义。
4)FS2-td组重组蛋白A0A4D6FS24可明显抑制醋酸引起的小鼠扭体反应，抑制率达97.25％，与模型组比较，****P＜0.0001，具有统计学意义。
<110> 中国医学科学院药物研究所
<120> 一种核糖体蛋白、其制备方法及其镇痛的用途
<130> 20220106
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 711
<212> DNA
<213> Xanthium sibiricum
<400> 1
atgacaagaa gatattggaa cattaattta gaagagatga tggaagcagg agttcatttt 60
ggccatggta ctaggaaatg gaatcctaaa atggcacctt atatctctgc aaaacgtaaa 120
ggtattcata ttacaaatct tactagaact gctcgttttt tatcagaagt ttgtgatttg 180
gtttttgatg cagcaagtag gggaaaacaa ttcttaattg ttggcactaa aaataaagaa 240
gctgattcag tagcatgggc tgcaacaagg gctcgatgtc attatgttaa taaaaaatgg 300
ctcggtggta tgttaacaaa ttggtccact acagaaacga gacttcataa gtttagagac 360
ttgagaactg aacaaaaaac agggggactc aaccgtcttc cgaaaagaga tgcggctatg 420
ttgaaaagac aattatctca tttgcaaaca tatctgggcg ggattaaata tatgacaggg 480
ttacccgata ttgtaatcat cgttgatcag cacgaagaat atacggccct tcaagaatgt 540
atcacattgg gaattccaac aatttgttta atcgatacaa attgtgaccc cgatctcgca 600
gatatttcga ttccagcgaa tgatgacgcc atatcttcaa tccgattaat tcttaacaaa 660
ttagtatttg caatttgtga gggccgttct ggctatataa gaaatccgtg a 711
<210> 2
<211> 236
<212> PRT
<213> Xanthium sibiricum
<400> 2
Met Thr Arg Arg Tyr Trp Asn Ile Asn Leu Glu Glu Met Met Glu Ala
1 5 10 15
Gly Val His Phe Gly His Gly Thr Arg Lys Trp Asn Pro Lys Met Ala
20 25 30
Pro Tyr Ile Ser Ala Lys Arg Lys Gly Ile His Ile Thr Asn Leu Thr
35 40 45
Arg Thr Ala Arg Phe Leu Ser Glu Val Cys Asp Leu Val Phe Asp Ala
50 55 60
Ala Ser Arg Gly Lys Gln Phe Leu Ile Val Gly Thr Lys Asn Lys Glu
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Ala Trp Ala Ala Thr Arg Ala Arg Cys His Tyr Val
85 90 95
Asn Lys Lys Trp Leu Gly Gly Met Leu Thr Asn Trp Ser Thr Thr Glu
100 105 110
Thr Arg Leu His Lys Phe Arg Asp Leu Arg Thr Glu Gln Lys Thr Gly
115 120 125
Gly Leu Asn Arg Leu Pro Lys Arg Asp Ala Ala Met Leu Lys Arg Gln
130 135 140
Leu Ser His Leu Gln Thr Tyr Leu Gly Gly Ile Lys Tyr Met Thr Gly
145 150 155 160
Leu Pro Asp Ile Val Ile Ile Val Asp Gln His Glu Glu Tyr Thr Ala
165 170 175
Leu Gln Glu Cys Ile Thr Leu Gly Ile Pro Thr Ile Cys Leu Ile Asp
180 185 190
Thr Asn Cys Asp Pro Asp Leu Ala Asp Ile Ser Ile Pro Ala Asn Asp
195 200 205
Asp Ala Ile Ser Ser Ile Arg Leu Ile Leu Asn Lys Leu Val Phe Ala
210 215 220
Ile Cys Glu Gly Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Asn Pro
225 230 235

Claims (15)

1.一种核糖体蛋白A0A4D6FS24，其特征在于，所述核糖体蛋白A0A4D6FS24氨基酸序列为：
(1)序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
(2)序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加1-70个氨基酸形成的生物学功能基本相同的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的核糖体蛋白A0A4D6FS24，其特征在于，在核糖体蛋白A0A4D6FS24上可进行常规修饰；或在核糖体蛋白A0A4D6FS24上连接利于检测或纯化的标签。
3.根据权利要求2的核糖体蛋白A0A4D6FS24，其特征在于，所述常规修饰包括乙酰化、酰胺化、烷基化、磷酸化、硫酸化、氧化、甲基化、糖基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇修饰、形成二硫键或二硫键断裂；所述标签包括His标签、GST标签、MBP标签、Nus标签、HA标签、IgG标签、c-Myc标签。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述核糖体蛋白A0A4D6FS24的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列为：
(1)序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
(2)基于SEQ ID No.2所示的核苷酸序列进行序列优化得到的核苷酸序列。
6.一种含有权利要求4-5任一项所述核酸分子的表达载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体或者基因组中整合有权利要求4-5任一项所述的核酸分子。
8.根据权利要求7的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括细菌、酵母、链霉菌、植物细胞或昆虫细胞。
9.根据权利要求8的宿主细胞，其特征在于，所述的细菌包括大肠杆菌。
10.一种制备生产权利要求1-3任一项所述核糖体蛋白A0A4D6FS24的方法，其特征在于,包括以下步骤：
A.合成权利要求1-3任一项所述核糖体蛋白A0A4D6FS24的核酸分子，将核酸分子连入相应的表达载体，将表达载体转化到宿主细胞，在一定条件下在发酵设备中培养带表达载体的宿主细胞并诱导表达核糖体蛋白A0A4D6FS24，并得到含有核糖体蛋白A0A4D6FS24的粗蛋白溶液；
B.对步骤A得到的粗蛋白溶液进行分离纯化干燥得到核糖体蛋白A0A4D6FS24。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于，在步骤A中，所述宿主细胞为大肠杆菌，所述发酵设备包括但不限于摇瓶或发酵罐，诱导表达后用清洗剂清洗杂质，溶液溶解得到粗蛋白溶液。
12.根据权利要求10的方法，其特征在于，在步骤B中，所述分离纯化方法包括色谱纯化方法、盐析方法、微滤膜技术纯化方法、透析方法。
13.根据权利要求10的方法，其特征在于，通过改变载体实现核糖体蛋白A0A4D6FS24的包涵体表达或可溶性表达，使用载体pET-30a(+)为包涵体表达，使用载体pET-22b(+)为可溶性表达。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1-3任一项所述的核糖体蛋白A0A4D6FS24或权利要求4-5任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体或权利要求7-9所述的宿主细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。
15.根据权利要求1-3任一项所述的核糖体蛋白A0A4D6FS24或权利要求4-5任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体或权利要求7-9所述的宿主细胞胞或权利要求14所述的药物组合物在制备镇痛药物中的应用。
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