CN117836413A - 连接蛋白-4抗体和缀合物 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了连接蛋白‑4抗体及其寡核苷酸缀合物。还提供了相关的其制备方法及其使用方法，包括治疗用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年8月20日提交的美国临时专利申请系列号63/235,656、于2021年8月25日提交的美国临时专利申请系列号63/236,809和于2021年10月13日提交的美国临时专利申请系列号63/255,318的优先权的权益，出于所有目的其每一个的内容通过引用整体并入本文。
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技术领域
本公开内容涉及连接蛋白-4(nectin-4)抗体及其缀合物以及其用途，包括治疗用途。
背景技术
连接蛋白细胞粘附分子4(基因ID 81607；UniProt初始登记号Q96NY8；称为连接蛋白-4、PVRL4、LNIR、PRR4)是连接蛋白家族(其包括连接蛋白-1、连接蛋白-2、连接蛋白-3和连接蛋白-4)的I型跨膜蛋白。在针对与连接蛋白胞外域相似的序列的生物信息学筛选中，鉴定出了连接蛋白-4(Reymond等，Nectin4/PRR4,a new afadin-associated member ofthe nectin family that trans-interacts with nectin1/PRR1 through V domaininteraction,J.Biol.Chem.2001Nov 16；276(46):43205-15)。该蛋白含有两个免疫球蛋白样(Ig样)C2型结构域和一个Ig样V型结构域(IgV)。连接蛋白家族调控各种细胞功能，如增殖、分化和迁移(Miyoshi和Takai,Nectin and nectin-like molecules:biology andpathology,Am.J.Nephrol.2007；27(6):590-604)。特别地，连接蛋白是参与不同细胞类型之间的粘附连接和紧密连接的细胞粘附分子。连接蛋白-4还被证明通过驱动细胞间附着和基质独立性来促进锚定独立性(Pavlova等，A role for PVRL4-driven cell-cellinteractions in tumorigenesis,eLife2013；2:e00358)。据报道，连接蛋白-4与其自身具有同质相互作用，与连接蛋白-1具有异质相互作用(Samanta和Almo,Nectin family ofcell-adhesion molecules:structural and molecular aspects of function andspecificity,Cell Mol.Life Sci.2015Feb；72(4):645-58)。连接蛋白-4的可溶性形式是通过金属蛋白酶ADAM10/17的蛋白水解切割产生的，并且可能作为预后标志物。
连接蛋白-4是在食道癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、胰腺腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胆囊癌和肺癌上过表达的肿瘤相关蛋白。肿瘤上的异常表达与促进增殖和转移相关。在很多肿瘤类型中，连接蛋白-4过表达还与预后不良相关。在正常人组织中，表达最初局限于胚胎和胎盘，但在皮肤、食道、乳房、口腔粘膜、膀胱、胎盘和扁桃体中检测到弱至中等水平的连接蛋白-4表达(蛋白质图谱)。
病原体相关分子模式(PAMP)是与各种病原体相关的分子，并且被toll样受体(TLR)和激活先天性免疫应答的其他模式识别受体(PRR)识别。PAMP在不存在病原体的情况下募集免疫系统的能力提供了通过使用先天性免疫系统应答来治疗涉及细胞破坏的多种疾病的策略(例如，抗癌疗法)。已经针对各种治疗应用研究的一类PAMP是免疫刺激寡核苷酸，如含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)(例如，agatolimod)。据认为CpG ODN介导免疫细胞(例如，B细胞、单核细胞和浆细胞样树突细胞(pDC))中的TLR9二聚化来上调细胞因子(例如，I型干扰素和白介素)，从而激活天然杀伤细胞。
Toll样受体9(TLR9)，也称为CD289，是在免疫系统细胞中表达的重要受体，所述免疫系统细胞包括树突细胞(DC)、B淋巴细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞和其他抗原呈递细胞。TLR9激活触发细胞内信号级联，导致这些免疫细胞中的激活、成熟、增殖和细胞因子产生，因此桥接先天性免疫和适应性免疫。Martinez-Campos等，Viral Immunol.2016,30,98-105；Notley等，Sci.Rep.2017,7,42204。天然TLR-9激动剂包括含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。
CpG ODN可以包括，例如，寡脱氧核苷酸，其包含在3’-和5’-末端具有硫代磷酸酯主链的聚-G尾，和在其中心回文序列内具有包括磷酸酯主链和CpG的中心回文序列，或具有完全硫代磷酸酯主链和用于TLR9激活的在5’端的序列的寡脱氧核苷酸，或具有完全硫代磷酸酯主链的寡脱氧核苷酸，其具有能够形成双链体的3’-末端序列。然而，CpG ODN常常易于在血清中降解，且因此CpG ODN的药代动力学可能是其作为治疗剂开发的限制因素之一。而且，CpG ODN常常在体内表现出不均匀的组织分布，主要积累位点在肝、肾和脾中。这样的分布可以引发与PAMP相关的脱靶活性和局部毒性。因此，设计具有改进的稳定性性质、效力和递送系统的CpG将是有利的。
需要与免疫调节寡核苷酸缀合的抗连接蛋白-4抗体以治疗疾病、病症和病况，如癌症。
发明内容
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个包含至少一个谷氨酰胺残基的Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过Q标签肽的谷氨酰胺残基和接头(L)的酰胺键连接至Q标签肽，如式(A)中所示：
其中表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
其中每个P是独立地包含以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中
和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与接头L的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点，和其中/>表示与所述寡核苷酸的其余部分的连接点；
Z是O或S；
U5’是-H或卤素；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数(如约0至约10、约0至约30、约10至约30、约20至约30及其间范围中的值)，并且其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P是独立地包含以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，
其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个包含氨基酸序列RPQGF(SEQ IDNO:47)的Q标签肽(Q)，
并且其中每个免疫调节寡核苷酸(P)通过与所述Q标签肽的所述谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示：
其中表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含两条抗体轻链、两条抗体重链和两个Q标签肽，每个Q标签肽包含肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；其中每个所述Q标签肽连接至所述抗体重链中的一个的C末端；并且其中所述Q标签肽中的至少一个通过与所述Q标签肽的所述谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至免疫调节寡核苷酸(P)，如图9A或图9B中所示。
在一个方面中，本文提供了缀合物，其包含抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段(Ab)、至少一个包含谷氨酰胺残基的Q标签肽和至少一个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述Q标签肽序列是天然存在的或合成的，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签，其中至少一个Q标签肽序列选自由SEQ ID NO:39-55组成的组。
在一些实施方式中，所述缀合物的抗体包含轻链可变区(VL)结构域和重链可变区(VH)结构域，其中：
(a)所述VL结构域包含来自选自由以下组成的组的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列：SEQ ID NO:248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942和944，和所述VH结构域包含来自选自由以下组成的组的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列：SEQ ID NO:249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943和945；
(b)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:248的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:249的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(c)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:250的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:251的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(d)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:252的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:253的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(e)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:254的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:255的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(f)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:256的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:257的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(g)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:258的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:259的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(h)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:260的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:261的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(i)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:262的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:263的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(j)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:264的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:265的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(k)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:266的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:267的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(l)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:268的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:269的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(m)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:270的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:271的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(n)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:900的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:901的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(o)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:902的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:903的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(p)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:904的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:905的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(q)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:906的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:907的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(r)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:908的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:909的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(s)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:910的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:911的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(t)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:912的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:913的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(u)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:914的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:915的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(v)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:916的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:917的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(w)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:918的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:919的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(x)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:920的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:921的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(y)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:922的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:923的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(z)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:924的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:925的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(aa)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:926的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:927的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(bb)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:928的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:929的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(cc)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:930的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:931的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(dd)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:932的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ IDNO:933的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ee)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:934的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:935的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ff)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:936的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:937的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(gg)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:938的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:939的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(hh)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:940的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:941的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ii)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:942的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:943的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；或者
(jj)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:944的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:945的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中：
(a)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275、CDR-H2包含SEQ ID NO:276、CDR-H3包含SEQ ID NO:277、CDR-L1包含SEQ ID NO:272、CDR-L2包含SEQ ID NO:273和CDR-L3包含SEQID NO:274；
(b)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:293、CDR-H2包含SEQ ID NO:294、CDR-H3包含SEQ IDNO:295、CDR-L1包含SEQ ID NO:290、CDR-L2包含SEQ ID NO:291和CDR-L3包含SEQID NO:292；
(c)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:311、CDR-H2包含SEQ ID NO:312、CDR-H3包含SEQ ID NO:313、CDR-L1包含SEQ ID NO:308、CDR-L2包含SEQ ID NO:309和CDR-L3包含SEQID NO:310；
(d)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:329、CDR-H2包含SEQ ID NO:330、CDR-H3包含SEQ ID NO:331、CDR-L1包含SEQ ID NO:326、CDR-L2包含SEQ ID NO:327和CDR-L3包含SEQID NO:328；
(e)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:347、CDR-H2包含SEQ ID NO:348、CDR-H3包含SEQ ID NO:349、CDR-L1包含SEQ ID NO:344、CDR-L2包含SEQ ID NO:345和CDR-L3包含SEQID NO:346；
(f)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:365、CDR-H2包含SEQ ID NO:366、CDR-H3包含SEQ ID NO:367、CDR-L1包含SEQ ID NO:362、CDR-L2包含SEQ ID NO:363和CDR-L3包含SEQID NO:364；
(g)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:383、CDR-H2包含SEQ ID NO:384、CDR-H3包含SEQ ID NO:385、CDR-L1包含SEQ ID NO:380、CDR-L2包含SEQ ID NO:381和CDR-L3包含SEQID NO:382；
(h)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401、CDR-H2包含SEQ ID NO:402、CDR-H3包含SEQ ID NO:403、CDR-L1包含SEQ ID NO:398、CDR-L2包含SEQ ID NO:399和CDR-L3包含SEQID NO:400；
(i)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:419、CDR-H2包含SEQ ID NO:420、CDR-H3包含SEQ ID NO:421、CDR-L1包含SEQ ID NO:416、CDR-L2包含SEQ ID NO:417和CDR-L3包含SEQID NO:418；
(j)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:437、CDR-H2包含SEQ ID NO:438、CDR-H3包含SEQ ID NO:439、CDR-L1包含SEQ ID NO:434、CDR-L2包含SEQ ID NO:435和CDR-L3包含SEQID NO:436；
(k)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:455、CDR-H2包含SEQ ID NO:456、CDR-H3包含SEQ ID NO:457、CDR-L1包含SEQ ID NO:452、CDR-L2包含SEQ ID NO:453和CDR-L3包含SEQID NO:454；
(l)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:281、CDR-H2包含SEQ ID NO:282、CDR-H3包含SEQ ID NO:283、CDR-L1包含SEQ ID NO:278、CDR-L2包含SEQ ID NO:279和CDR-L3包含SEQID NO:280；
(m)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:299、CDR-H2包含SEQ ID NO:300、CDR-H3包含SEQ ID NO:301、CDR-L1包含SEQ ID NO:296、CDR-L2包含SEQ ID NO:297和CDR-L3包含SEQID NO:298；
(n)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:317、CDR-H2包含SEQ ID NO:318、CDR-H3包含SEQ ID NO:319、CDR-L1包含SEQ ID NO:314、CDR-L2包含SEQ ID NO:315和CDR-L3包含SEQID NO:316；
(o)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:335、CDR-H2包含SEQ ID NO:336、CDR-H3包含SEQ ID NO:337、CDR-L1包含SEQ ID NO:332、CDR-L2包含SEQ ID NO:333和CDR-L3包含SEQID NO:334；
(p)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:353、CDR-H2包含SEQ ID NO:354、CDR-H3包含SEQ ID NO:355、CDR-L1包含SEQ ID NO:350、CDR-L2包含SEQ ID NO:351和CDR-L3包含SEQID NO:352；
(q)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:371、CDR-H2包含SEQ ID NO:372、CDR-H3包含SEQ ID NO:373、CDR-L1包含SEQ ID NO:368、CDR-L2包含SEQ ID NO:369和CDR-L3包含SEQID NO:370；
(r)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:389、CDR-H2包含SEQ ID NO:390、CDR-H3包含SEQ ID NO:391、CDR-L1包含SEQ ID NO:386、CDR-L2包含SEQ ID NO:387和CDR-L3包含SEQID NO:388；
(s)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:407、CDR-H2包含SEQ ID NO:408、CDR-H3包含SEQ ID NO:409、CDR-L1包含SEQ ID NO:404、CDR-L2包含SEQ ID NO:405和CDR-L3包含SEQID NO:406；
(t)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:425、CDR-H2包含SEQ ID NO:426、CDR-H3包含SEQ ID NO:427、CDR-L1包含SEQ ID NO:422、CDR-L2包含SEQ ID NO:423和CDR-L3包含SEQID NO:424；
(u)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:443、CDR-H2包含SEQ ID NO:444、CDR-H3包含SEQ ID NO:445、CDR-L1包含SEQ ID NO:440、CDR-L2包含SEQ ID NO:441和CDR-L3包含SEQID NO:442；
(v)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:461、CDR-H2包含SEQ ID NO:462、CDR-H3包含SEQ ID NO:463、CDR-L1包含SEQ ID NO:458、CDR-L2包含SEQ ID NO:459和CDR-L3包含SEQID NO:460；
(w)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:287、CDR-H2包含SEQ ID NO:288、CDR-H3包含SEQ ID NO:289、CDR-L1包含SEQ ID NO:284、CDR-L2包含SEQ ID NO:285和CDR-L3包含SEQID NO:286；
(x)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:305、CDR-H2包含SEQ ID NO:306、CDR-H3包含SEQ ID NO:307、CDR-L1包含SEQ ID NO:302、CDR-L2包含SEQ ID NO:303和CDR-L3包含SEQID NO:304；
(y)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:323、CDR-H2包含SEQ ID NO:324、CDR-H3包含SEQ ID NO:325、CDR-L1包含SEQ ID NO:320、CDR-L2包含SEQ ID NO:321和CDR-L3包含SEQID NO:322；
(z)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:341、CDR-H2包含SEQ ID NO:342、CDR-H3包含SEQ ID NO:343、CDR-L1包含SEQ ID NO:338、CDR-L2包含SEQ ID NO:339和CDR-L3包含SEQID NO:340；
(aa)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:359、CDR-H2包含SEQ ID NO:360、CDR-H3包含SEQ ID NO:361、CDR-L1包含SEQ ID NO:356、CDR-L2包含SEQ ID NO:357和CDR-L3包含SEQID NO:358；
(bb)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:377、CDR-H2包含SEQ ID NO:378、CDR-H3包含SEQ ID NO:379、CDR-L1包含SEQ ID NO:374、CDR-L2包含SEQ ID NO:375和CDR-L3包含SEQID NO:376；
(cc)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:395、CDR-H2包含SEQ ID NO:396、CDR-H3包含SEQ ID NO:397、CDR-L1包含SEQ ID NO:392、CDR-L2包含SEQ ID NO:393和CDR-L3包含SEQID NO:394；
(dd)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:413、CDR-H2包含SEQ ID NO:414、CDR-H3包含SEQ ID NO:415、CDR-L1包含SEQ ID NO:410、CDR-L2包含SEQ ID NO:411和CDR-L3包含SEQID NO:412；
(ee)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:431、CDR-H2包含SEQ ID NO:432、CDR-H3包含SEQ ID NO:433、CDR-L1包含SEQ ID NO:428、CDR-L2包含SEQ ID NO:429和CDR-L3包含SEQID NO:430；
(ff)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:449、CDR-H2包含SEQ ID NO:450、CDR-H3包含SEQ ID NO:451、CDR-L1包含SEQ ID NO:446、CDR-L2包含SEQ ID NO:447和CDR-L3包含SEQID NO:448；
(gg)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:467、CDR-H2包含SEQ ID NO:468、CDR-H3包含SEQ ID NO:469、CDR-L1包含SEQ ID NO:464、CDR-L2包含SEQ ID NO:465和CDR-L3包含SEQID NO:466；
(hh)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:479、CDR-H2包含SEQ ID NO:480、CDR-H3包含SEQ ID NO:481、CDR-L1包含SEQ ID NO:476、CDR-L2包含SEQ ID NO:477和CDR-L3包含SEQID NO:478；
(ii)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:485、CDR-H2包含SEQ ID NO:486、CDR-H3包含SEQ ID NO:487、CDR-L1包含SEQ ID NO:482、CDR-L2包含SEQ ID NO:483和CDR-L3包含SEQID NO:484；
(jj)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:473、CDR-H2包含SEQ ID NO:474、CDR-H3包含SEQ ID NO:475、CDR-L1包含SEQ ID NO:470、CDR-L2包含SEQ ID NO:471和CDR-L3包含SEQID NO:472；
(kk)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:562、CDR-L2包含SEQ ID NO:563和CDR-L3包含SEQ ID NO:564，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:565、CDR-H2包含SEQ ID NO:566和CDR-H3包含SEQ ID NO:567；
(ll)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:580、CDR-L2包含SEQ ID NO:581和CDR-L3包含SEQ ID NO:582，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:583、CDR-H2包含SEQ ID NO:584和CDR-H3包含SEQ ID NO:585；
(mm)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:598、CDR-L2包含SEQ ID NO:599和CDR-L3包含SEQ ID NO:600，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:601、CDR-H2包含SEQ ID NO:602和CDR-H3包含SEQ ID NO:603；
(nn)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:616、CDR-L2包含SEQ ID NO:617和CDR-L3包含SEQ ID NO:618，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:619、CDR-H2包含SEQ ID NO:620和CDR-H3包含SEQ ID NO:621；
(oo)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:634、CDR-L2包含SEQ ID NO:635和CDR-L3包含SEQ ID NO:636，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:637、CDR-H2包含SEQ ID NO:638和CDR-H3包含SEQ ID NO:639；
(pp)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:652、CDR-L2包含SEQ ID NO:653和CDR-L3包含SEQ ID NO:654，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:655、CDR-H2包含SEQ ID NO:656和CDR-H3包含SEQ ID NO:657；
(qq)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:670、CDR-L2包含SEQ ID NO:671和CDR-L3包含SEQ ID NO:672，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:673、CDR-H2包含SEQ ID NO:674和CDR-H3包含SEQ ID NO:675；
(rr)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:688、CDR-L2包含SEQ ID NO:689和CDR-L3包含SEQ ID NO:690，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:691、CDR-H2包含SEQ ID NO:692和CDR-H3包含SEQ ID NO:693；
(ss)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:706、CDR-L2包含SEQ ID NO:707和CDR-L3包含SEQ ID NO:708，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:709、CDR-H2包含SEQ ID NO:710和CDR-H3包含SEQ ID NO:711；
(tt)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:724、CDR-L2包含SEQ ID NO:725和CDR-L3包含SEQ ID NO:726，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:727、CDR-H2包含SEQ ID NO:728和CDR-H3包含SEQ ID NO:729；
(uu)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:742、CDR-L2包含SEQ ID NO:743和CDR-L3包含SEQ ID NO:744，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:745、CDR-H2包含SEQ ID NO:746和CDR-H3包含SEQ ID NO:747；
(vv)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:760、CDR-L2包含SEQ ID NO:761和CDR-L3包含SEQ ID NO:762，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:763、CDR-H2包含SEQ ID NO:764和CDR-H3包含SEQ ID NO:765；
(ww)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:778、CDR-L2包含SEQ ID NO:779和CDR-L3包含SEQ ID NO:780，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:781、CDR-H2包含SEQ ID NO:782和CDR-H3包含SEQ ID NO:783；
(xx)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:796、CDR-L2包含SEQ ID NO:797和CDR-L3包含SEQ ID NO:798，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:799、CDR-H2包含SEQ ID NO:800和CDR-H3包含SEQ ID NO:801；
(yy)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:814、CDR-L2包含SEQ ID NO:815和CDR-L3包含SEQ ID NO:816，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:817、CDR-H2包含SEQ ID NO:818和CDR-H3包含SEQ ID NO:819；或者
(zz)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:832、CDR-L2包含SEQ ID NO:833和CDR-L3包含SEQ ID NO:834，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:835、CDR-H2包含SEQ ID NO:836和CDR-H3包含SEQ ID NO:837。
在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含轻链可变区(VL)结构域和重链可变区(VH)结构域，其中：
(a)所述VH结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943和945，和/或所述VL结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942和944；
(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO:248的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:249的序列；
(c)所述VL结构域包含SEQ ID NO:250的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:251的序列；
(d)所述VL结构域包含SEQ ID NO:252的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:253的序列；
(e)所述VL结构域包含SEQ ID NO:254的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:255的序列；
(f)所述VL结构域包含SEQ ID NO:256的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:257的序列；
(g)所述VL结构域包含SEQ ID NO:258的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:259的序列；
(h)所述VL结构域包含SEQ ID NO:260的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:261的序列；
(i)所述VL结构域包含SEQ ID NO:262的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:263的序列；
(j)所述VL结构域包含SEQ ID NO:264的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:265的序列；
(k)所述VL结构域包含SEQ ID NO:266的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:267的序列；
(l)所述VL结构域包含SEQ ID NO:268的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:269的序列；
(m)所述VL结构域包含SEQ ID NO:270的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:271的序列；
(n)所述VL结构域包含SEQ ID NO:900的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:901的序列；
(o)所述VL结构域包含SEQ ID NO:902的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:903的序列；
(p)所述VL结构域包含SEQ ID NO:904的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:905的序列；
(q)所述VL结构域包含SEQ ID NO:906的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:907的序列；
(r)所述VL结构域包含SEQ ID NO:908的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:909的序列；
(s)所述VL结构域包含SEQ ID NO:910的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:911的序列；
(t)所述VL结构域包含SEQ ID NO:912的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:913的序列；
(u)所述VL结构域包含SEQ ID NO:914的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:915的序列；
(v)所述VL结构域包含SEQ ID NO:916的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:917的序列；
(w)所述VL结构域包含SEQ ID NO:918的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:919的序列；
(x)所述VL结构域包含SEQ ID NO:920的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:921的序列；
(y)所述VL结构域包含SEQ ID NO:922的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:923的序列；
(z)所述VL结构域包含SEQ ID NO:924的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:925的序列；
(aa)所述VL结构域包含SEQ ID NO:926的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:927的序列；
(bb)所述VL结构域包含SEQ ID NO:928的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:929的序列；
(cc)所述VL结构域包含SEQ ID NO:930的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:931的序列；
(dd)所述VL结构域包含SEQ ID NO:932的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:933的序列；
(ee)所述VL结构域包含SEQ ID NO:934的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:935的序列；
(ff)所述VL结构域包含SEQ ID NO:936的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:937的序列；
(gg)所述VL结构域包含SEQ ID NO:938的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:939的序列；
(hh)所述VL结构域包含SEQ ID NO:940的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:941的序列；
(ii)所述VL结构域包含SEQ ID NO:942的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:943的序列；或者
(jj)所述VL结构域包含SEQ ID NO:944的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:945的序列。
在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体是Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、scFv、单一结构域、单一重链或单一轻链抗体或抗体片段。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体是人源化抗体、人抗体或嵌合抗体或其片段。
在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是选自由以下组成的组的人Fc区：IgG1 Fc区、IgG2 Fc区和IgG4 Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是人Fc区，其包含降低与C1q结合的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述Fc区是人Fc区，其包含增加与C1q结合的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述Fc区是显示出野生型补体激活的人Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是人Fc区，其包含增加补体激活的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述Fc区是包含一个或多个氨基酸取代的人Fc区，与缺乏该氨基酸取代的人Fc区相比所述一个或多个氨基酸取代降低效应子功能。在一些实施方式中，所述Fc区是：(a)包含L234A、L235A和/或G237A取代的人IgG1 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；(b)包含A330S和/或P331S取代的人IgG2Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；或者(c)包含S228P和/或L235E取代的人IgG4 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号。在一些实施方式中，所述Fc区是野生型人IgG1Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区已被工程化以改善效应子功能，任选地其中改善的效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施方式中，所述Fc区已被工程化以显示出选自由以下组成的组的至少两种特征：改善的ADCC活性、改善的ADCP活性和改善的CDC活性。在一些实施方式中，所述Fc区包含取代G236A，其中氨基酸位置根据EU索引。在一些实施方式中，所述Fc区包含取代G236A，其中氨基酸位置根据EU索引，并且所述Fc区是非岩藻糖基化的。在一些实施方式中，所述Fc区已被工程化以改善ADCC活性。在一些实施方式中，所述Fc区已被工程化以改善ADCP活性。在一些实施方式中，所述Fc区已被工程化以改善CDC活性。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体在所述Fc区中包含改善ADCC活性的至少一个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体在所述Fc区中包含改善ADCP活性的至少一个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体在所述Fc区中包含改善CDC活性的至少一个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体的所述重链的至少一条或至少两条是非岩藻糖基化的。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体在具有α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中或过表达β1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖转移酶III(GnT-III)的细胞系中生产，其中任选地所述细胞系是CHO细胞系。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体在表达系统中在存在2-氟岩藻糖化合物或5-炔基岩藻糖衍生物的条件下生产。在一些实施方式中，所述细胞系过表达Golgiμ-甘露糖苷酶II(ManII)，其中任选地，所述细胞系是CHO细胞系。在一些实施方式中，所述Fc区包含N297A取代，氨基酸位置编号根据EU索引。在一些实施方式中，所述Fc区包含D265A取代，氨基酸位置编号根据EU索引。
在一些实施方式中，所述缀合物进一步包含与所述Fc区残基的Q295连接的免疫调节寡核苷酸P，如下式中所示，
其中L是通过酰胺键连接至所述Fc区的Q295的接头部分。
在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含抗体重链恒定结构域，所述抗体重链恒定结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:92-107、111、112、178和494-497。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含人λ轻链。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含人κ轻链。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含抗体轻链恒定结构域，所述抗体轻链恒定结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID No:108-110。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链，和其中一个Q标签连接至所述抗体的一条或两条重链。在一些实施方式中，所述Q标签融合至所述抗体的所述重链的C末端。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链，和其中一个Q标签连接至所述抗体的一条或两条轻链。在一些实施方式中，所述Q标签在所述Fc结构域内。
在一些实施方式中，所述缀合物诱导TLR9的激活。在一些实施方式中，每个Q标签独立地包含肽序列，所述肽序列包含5至15个之间的氨基酸残基。在一些实施方式中，所述Q标签是天然存在的。在一些实施方式中，每个Q标签的所述肽序列独立地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:39-55。在一些实施方式中，所述Q标签包含所述肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)。在一些实施方式中，每个Q标签独立地包含RPQGF(SEQ ID NO:47)、RPQGFPP(SEQ IDNO:48)或RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。在一些实施方式中，每个Q标签独立地包含RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。在一些实施方式中，1或2个Q标签连接至所述抗体。在一些实施方式中，所述缀合物具有1或2的DAR。
在一些实施方式中，所述接头L包含聚乙二醇部分。在一些实施方式中，所述接头L是
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与T3的连接点，和/>表示与所述缀合物的其余部分的连接点。
在一些实施方式中，m是约20至约30。在一些实施方式中，其中m是约24。在一些实施方式中，Z是S。在一些实施方式中，所述寡核苷酸P包含至少一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基1的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基2的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基3的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基5的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基6的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基7的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基8的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基9的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基10的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基11的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基12的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基13的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基14的3’位置处。在一些实施方式中，至少一对其中T1是S和T2是S的偕位T1和T2位于核苷残基15的3’位置处。在一些实施方式中，所述寡核苷酸P包含至少两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。在一些实施方式中，其中R5’是H。在一些实施方式中，R5’是甲氧基。在一些实施方式中，Rc1是H。在一些实施方式中，Rc1是甲氧基。在一些实施方式中，R2是甲基。在一些实施方式中，R2是H。在一些实施方式中，U5’是溴。在一些实施方式中，U5’是-H。在一些实施方式中，m是范围从20至25的整数。在一些实施方式中，m是24。
在一些实施方式中，每个P独立地包含选自表2、表3和表4的寡核苷酸。在一些实施方式中，在所述缀合物中的每个(L)和(P)独立地包含选自表2、表5和表6的结构，任选地化合物7.6b或化合物7.7b。在一些实施方式中，在所述缀合物中的每个(P)和(L)独立地包含选自SEQ ID NO:1-38和129-166的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸。在一些实施方式中，每个免疫调节寡核苷酸P独立地是
其中
b和c分别独立地是从1至25的整数；条件是b和c之和至少是5；
表示所述免疫调节寡核苷酸P与所述缀合物其余部分的连接点；
X5’是包含结构的5’末端核苷；
X3’是包含结构的3’末端核苷；
YPTE是包含结构的核苷间磷酸三酯，其中*表示与所述寡核苷酸的其余部分的连接点，和/>表示与所述接头L的连接点，或者，如果L不存在，则/>表示通过酰胺键与所述Q标签肽在所述谷氨酰胺残基处的连接点；
Y3’是包含结构的末端磷酸三酯；
每个XN独立地是包含结构的核苷；
每个YN独立地是包含结构的核苷间接头；
其中每个BN独立地是修饰的或未经修饰的核碱基；
每个RN独立地是-H或-O-C1-4-烷基，其中所述-O-C1-4-烷基的C1-4-烷基任选地进一步被-O-C1-C4-烷基取代；
B5’和B3’独立地是修饰的或未经修饰的核碱基；
R5’和R3’独立地是-H或-O-C1-C4-烷基，其中所述-O-C1-4-烷基的C1-4-烷基任选地进一步被-O-C1-4-烷基取代；
每个T1独立地是O或S；
每个T2独立地是O-或S-；和
T3是包含寡乙二醇部分的基团；和
R1是C1-4-亚烷基-羟基。
在一些实施方式中，b是3。在一些实施方式中，(i)P包含至少一个修饰的核苷XN；(ii)P具有至少一个修饰的核苷间接头YN，其中T1或T2中的至少一个是S；或者(iii)(i)和(ii)两者。在一些实施方式中，P具有至少一个二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯核苷间接头。在一些实施方式中，P包含0、1、2或3个二硫代磷酸酯核苷间接头。在一些实施方式中，P包含选自由以下组成的组的修饰的核苷：2’-O-烷基核苷、2’-O-烷氧基烷基核苷、2’-脱氧核苷和核糖核苷。在一些实施方式中，所述修饰的核苷选自由以下组成的组：5-溴-2’-O-甲基尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基尿苷、2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基胸苷、2’-O-甲基胞苷、2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷和8-氧代-7,8-二氢-2’-脱氧鸟苷。在一些实施方式中，X5’是5-溴-2’-O-甲基尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基尿苷或2’-脱氧尿苷。在一些实施方式中，Y3’或在X5’的3’位置处的YN包含未取代的或取代的硫代磷酸酯在一些实施方式中，YPTE是：
其中Z是O或S；d是从0至95的整数；所述结构右侧的两个表示与所述寡核苷酸P中的相邻核苷XN的连接点，和所述结构左侧的/>表示与所述接头L的连接点。
在一些实施方式中，YPTE是：
其中Z是O或S；d是从0至95的整数；所述结构右侧的两个表示与所述寡核苷酸P中的相邻核苷XN的连接点，和所述结构左侧的一个/>表示与所述接头L的连接点。
在一些实施方式中，Z是S。在一些实施方式中，d是从1至25的整数。在一些实施方式中，所述接头L包含聚乙二醇部分。在一些实施方式中，所述接头L是
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与YPTE的连接点，和/>表示与所述缀合物的其余部分的连接点。
在所述缀合物的一些实施方式中，P包含一个或多个CpG位点。在一些实施方式中，P包含至少3个CpG位点。在一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含两条抗体轻链、两条抗体重链和两个Q标签肽；其中所述Q标签肽的每一个连接至所述抗体重链中的一个的C末端；和其中所述Q标签肽中的一个通过与所述Q标签肽的所述谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)与免疫调节寡核苷酸(P)连接。
在所述缀合物的一些实施方式中：
(a)所述抗体包含轻链，所述轻链包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ IDNO:236-247和1000-1022，和/或重链，所述重链含有重链序列和Q标签，其中所述重链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:224-235和1030-1065；
(b)所述抗体包含轻链，所述轻链包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ IDNO:236-247和1000-1022，和/或重链，所述重链包含选自由以下组成的组的重链序列：SEQID NO:1070-1117；
(c)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:224的重链；
(d)所述抗体包含含有SEQ ID NO:237的轻链和/或含有SEQ ID NO:225的重链；
(e)所述抗体包含含有SEQ ID NO:238的轻链和/或含有SEQ ID NO:226的重链；
(f)所述抗体包含含有SEQ ID NO:239的轻链和/或含有SEQ ID NO:227的重链；
(g)所述抗体包含含有SEQ ID NO:240的轻链和/或含有SEQ IDNO:228的重链；
(h)所述抗体包含含有SEQ ID NO:241的轻链和/或含有SEQ ID NO:229的重链；
(i)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:230的重链；
(j)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:231的重链；
(k)所述抗体包含含有SEQ ID NO:244的轻链和/或含有SEQ ID NO:232的重链；
(l)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:233的重链；
(m)所述抗体包含含有SEQ ID NO:246的轻链和/或含有SEQ ID NO:234的重链；
(n)所述抗体包含含有SEQ ID NO:247的轻链和/或含有SEQ ID NO:235的重链；
(o)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1000的轻链和/或含有SEQ ID NO:1030的重链；
(p)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和/或含有SEQ ID NO:1031的重链；
(q)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和/或含有SEQ ID NO:1032的重链；
(r)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和/或含有SEQ ID NO:1033的重链；
(s)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和/或含有SEQ ID NO:1034的重链；
(t)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和/或含有SEQ ID NO:1035的重链；
(u)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和/或含有SEQ ID NO:1036的重链；
(v)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1037的重链；
(w)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1038的重链；
(x)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和/或含有SEQ ID NO:1039的重链；
(y)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和/或含有SEQ ID NO:1040的重链；
(z)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和/或含有SEQ ID NO:1041的重链；
(aa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1042的重链；
(bb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和/或含有SEQ ID NO:1043的重链；
(cc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和/或含有SEQ ID NO:1044的重链；
(dd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和/或含有SEQ ID NO:1045的重链；
(ee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和/或含有SEQ ID NO:1046的重链；
(ff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1047的重链；
(gg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1048的重链；
(hh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1049的重链；
(ii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1050的重链；
(jj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1051的重链；
(kk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1052的重链；
(ll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1053的重链；
(mm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1054的重链；
(nn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1055的重链；
(oo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1056的重链；
(pp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1057的重链；
(qq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1058的重链；
(rr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1059的重链；
(ss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1060的重链；
(tt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1061的重链；
(uu)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1062的重链；
(vv)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1063的重链；
(ww)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1064的重链；
(xx)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1065的重链；
(yy)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1070的重链；
(zz)所述抗体包含含有SEQ ID NO:237的轻链和/或含有SEQ ID NO:1071的重链；
(aaa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:238的轻链和/或含有SEQ ID NO:1072的重链；
(bbb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:239的轻链和/或含有SEQ ID NO:1073的重链；
(ccc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:240的轻链和/或含有SEQ ID NO:1074的重链；
(ddd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:241的轻链和/或含有SEQ ID NO:1075的重链；
(eee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1076的重链；
(fff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1077的重链；
(ggg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:244的轻链和/或含有SEQ ID NO:1078的重链；
(hhh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1079的重链；
(iii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:246的轻链和/或含有SEQ ID NO:1080的重链；
(jjj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:247的轻链和/或含有SEQ ID NO:1081的重链；
(kkk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1000的轻链和/或含有SEQ ID NO:1082的重链；
(lll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和/或含有SEQ ID NO:1083的重链；
(mmm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和/或含有SEQ ID NO:1084的重链；
(nnn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和/或含有SEQ ID NO:1085的重链；
(ooo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和/或含有SEQ ID NO:1086的重链；
(ppp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和/或含有SEQ ID NO:1087的重链；
(qqq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和/或含有SEQ ID NO:1088的重链；
(rrr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1089的重链；
(sss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1090的重链；
(ttt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和/或含有SEQ ID NO:1091的重链；
(uuu)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和/或含有SEQ ID NO:1092的重链；
(vvv)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和/或含有SEQ ID NO:1093的重链；
(www)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1094的重链；
(xxx)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和/或含有SEQ ID NO:1095的重链；
(yyy)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和/或含有SEQ ID NO:1096的重链；
(zzz)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和/或含有SEQ ID NO:1097的重链；
(aaaa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和/或含有SEQ ID NO:1098的重链；
(bbbb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1099的重链；
(cccc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1100的重链；
(dddd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1101的重链；
(eeee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1102的重链；
(ffff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1103的重链；
(gggg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1104的重链；
(hhhh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1105的重链；
(iiii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1106的重链；
(jjjj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1107的重链；
(kkkk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1108的重链；
(llll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1109的重链；
(mmmm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1110的重链；
(nnnn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1111的重链；
(oooo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1112的重链；
(pppp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1113的重链；
(qqqq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1114的重链；
(rrrr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1115的重链；
(ssss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1116的重链；或者
(tttt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1117的重链。
在一个方面中，本文提供了一种与人连接蛋白-4特异性结合的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)结构域和重链可变区(VH)结构域，其中：
(a)所述VL结构域包含来自选自由以下组成的组的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列：SEQ ID NO:248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942和944，和所述VH结构域包含来自选自由以下组成的组的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列：SEQ ID NO:249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943和945；
(b)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:248的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:249的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(c)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:250的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:251的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(d)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:252的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:253的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(e)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:254的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:255的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(f)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:256的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:257的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(g)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:258的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:259的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(h)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:260的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:261的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(i)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:262的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:263的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(j)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:264的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:265的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(k)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:266的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:267的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(l)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:268的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:269的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(m)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:270的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:271的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(n)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:900的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:901的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(o)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:902的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:903的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(p)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:904的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:905的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(q)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:906的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:907的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(r)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:908的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:909的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(s)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:910的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:911的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(t)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:912的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:913的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(u)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:914的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:915的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(v)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:916的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:917的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(w)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:918的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ IDNO:919的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(x)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:920的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:921的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(y)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:922的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:923的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(z)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:924的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:925的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(aa)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:926的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:927的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(bb)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:928的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:929的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(cc)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:930的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:931的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(dd)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:932的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:933的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(ee)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:934的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:935的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(ff)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:936的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:937的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(gg)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:938的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:939的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(hh)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:940的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:941的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(ii)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:942的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:943的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；或者
(jj)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:944的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:945的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。
在所述抗体的一些实施方式中，
(a)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275、CDR-H2包含SEQ ID NO:276、CDR-H3包含SEQ ID NO:277、CDR-L1包含SEQ ID NO:272、CDR-L2包含SEQ ID NO:273和CDR-L3包含SEQID NO:274；
(b)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:293、CDR-H2包含SEQ ID NO:294、CDR-H3包含SEQ ID NO:295、CDR-L1包含SEQ ID NO:290、CDR-L2包含SEQ ID NO:291和CDR-L3包含SEQID NO:292；
(c)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:311、CDR-H2包含SEQ ID NO:312、CDR-H3包含SEQ ID NO:313、CDR-L1包含SEQ ID NO:308、CDR-L2包含SEQ ID NO:309和CDR-L3包含SEQID NO:310；
(d)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:329、CDR-H2包含SEQ ID NO:330、CDR-H3包含SEQ ID NO:331、CDR-L1包含SEQ ID NO:326、CDR-L2包含SEQ ID NO:327和CDR-L3包含SEQID NO:328；
(e)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:347、CDR-H2包含SEQ ID NO:348、CDR-H3包含SEQ ID NO:349、CDR-L1包含SEQ ID NO:344、CDR-L2包含SEQ ID NO:345和CDR-L3包含SEQID NO:346；
(f)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:365、CDR-H2包含SEQ ID NO:366、CDR-H3包含SEQ ID NO:367、CDR-L1包含SEQ ID NO:362、CDR-L2包含SEQ ID NO:363和CDR-L3包含SEQID NO:364；
(g)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:383、CDR-H2包含SEQ ID NO:384、CDR-H3包含SEQ ID NO:385、CDR-L1包含SEQ ID NO:380、CDR-L2包含SEQ ID NO:381和CDR-L3包含SEQID NO:382；
(h)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401、CDR-H2包含SEQ ID NO:402、CDR-H3包含SEQ ID NO:403、CDR-L1包含SEQ ID NO:398、CDR-L2包含SEQ ID NO:399和CDR-L3包含SEQID NO:400；
(i)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:419、CDR-H2包含SEQ ID NO:420、CDR-H3包含SEQ ID NO:421、CDR-L1包含SEQ ID NO:416、CDR-L2包含SEQ ID NO:417和CDR-L3包含SEQID NO:418；
(j)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:437、CDR-H2包含SEQ ID NO:438、CDR-H3包含SEQ ID NO:439、CDR-L1包含SEQ ID NO:434、CDR-L2包含SEQ ID NO:435和CDR-L3包含SEQID NO:436；
(k)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:455、CDR-H2包含SEQ ID NO:456、CDR-H3包含SEQ ID NO:457、CDR-L1包含SEQ ID NO:452、CDR-L2包含SEQ ID NO:453和CDR-L3包含SEQID NO:454；
(l)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:281、CDR-H2包含SEQ ID NO:282、CDR-H3包含SEQ ID NO:283、CDR-L1包含SEQ ID NO:278、CDR-L2包含SEQ ID NO:279和CDR-L3包含SEQID NO:280；
(m)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:299、CDR-H2包含SEQ ID NO:300、CDR-H3包含SEQ ID NO:301、CDR-L1包含SEQ ID NO:296、CDR-L2包含SEQ ID NO:297和CDR-L3包含SEQID NO:298；
(n)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:317、CDR-H2包含SEQ ID NO:318、CDR-H3包含SEQ ID NO:319、CDR-L1包含SEQ ID NO:314、CDR-L2包含SEQ ID NO:315和CDR-L3包含SEQID NO:316；
(o)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:335、CDR-H2包含SEQ ID NO:336、CDR-H3包含SEQ ID NO:337、CDR-L1包含SEQ ID NO:332、CDR-L2包含SEQ ID NO:333和CDR-L3包含SEQID NO:334；
(p)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:353、CDR-H2包含SEQ ID NO:354、CDR-H3包含SEQ ID NO:355、CDR-L1包含SEQ ID NO:350、CDR-L2包含SEQ ID NO:351和CDR-L3包含SEQID NO:352；
(q)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:371、CDR-H2包含SEQ ID NO:372、CDR-H3包含SEQ ID NO:373、CDR-L1包含SEQ ID NO:368、CDR-L2包含SEQ ID NO:369和CDR-L3包含SEQID NO:370；
(r)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:389、CDR-H2包含SEQ ID NO:390、CDR-H3包含SEQ ID NO:391、CDR-L1包含SEQ ID NO:386、CDR-L2包含SEQ ID NO:387和CDR-L3包含SEQID NO:388；
(s)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:407、CDR-H2包含SEQ ID NO:408、CDR-H3包含SEQ ID NO:409、CDR-L1包含SEQ ID NO:404、CDR-L2包含SEQ ID NO:405和CDR-L3包含SEQID NO:406；
(t)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:425、CDR-H2包含SEQ ID NO:426、CDR-H3包含SEQ ID NO:427、CDR-L1包含SEQ ID NO:422、CDR-L2包含SEQ ID NO:423和CDR-L3包含SEQID NO:424；
(u)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:443、CDR-H2包含SEQ ID NO:444、CDR-H3包含SEQ ID NO:445、CDR-L1包含SEQ ID NO:440、CDR-L2包含SEQ ID NO:441和CDR-L3包含SEQID NO:442；
(v)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:461、CDR-H2包含SEQ ID NO:462、CDR-H3包含SEQ ID NO:463、CDR-L1包含SEQ ID NO:458、CDR-L2包含SEQ ID NO:459和CDR-L3包含SEQID NO:460；
(w)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:287、CDR-H2包含SEQ ID NO:288、CDR-H3包含SEQ ID NO:289、CDR-L1包含SEQ ID NO:284、CDR-L2包含SEQ ID NO:285和CDR-L3包含SEQID NO:286；
(x)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:305、CDR-H2包含SEQ ID NO:306、CDR-H3包含SEQ ID NO:307、CDR-L1包含SEQ ID NO:302、CDR-L2包含SEQ ID NO:303和CDR-L3包含SEQID NO:304；
(y)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:323、CDR-H2包含SEQ ID NO:324、CDR-H3包含SEQ ID NO:325、CDR-L1包含SEQ ID NO:320、CDR-L2包含SEQ ID NO:321和CDR-L3包含SEQID NO:322；
(z)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:341、CDR-H2包含SEQ ID NO:342、CDR-H3包含SEQ ID NO:343、CDR-L1包含SEQ ID NO:338、CDR-L2包含SEQ ID NO:339和CDR-L3包含SEQID NO:340；
(aa)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:359、CDR-H2包含SEQ ID NO:360、CDR-H3包含SEQ ID NO:361、CDR-L1包含SEQ ID NO:356、CDR-L2包含SEQ ID NO:357和CDR-L3包含SEQID NO:358；
(bb)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:377、CDR-H2包含SEQ ID NO:378、CDR-H3包含SEQ ID NO:379、CDR-L1包含SEQ ID NO:374、CDR-L2包含SEQ ID NO:375和CDR-L3包含SEQID NO:376；
(cc)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:395、CDR-H2包含SEQ ID NO:396、CDR-H3包含SEQ ID NO:397、CDR-L1包含SEQ ID NO:392、CDR-L2包含SEQ ID NO:393和CDR-L3包含SEQID NO:394；
(dd)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:413、CDR-H2包含SEQ ID NO:414、CDR-H3包含SEQ ID NO:415、CDR-L1包含SEQ ID NO:410、CDR-L2包含SEQ ID NO:411和CDR-L3包含SEQID NO:412；
(ee)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:431、CDR-H2包含SEQ ID NO:432、CDR-H3包含SEQ ID NO:433、CDR-L1包含SEQ ID NO:428、CDR-L2包含SEQ ID NO:429和CDR-L3包含SEQID NO:430；
(ff)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:449、CDR-H2包含SEQ ID NO:450、CDR-H3包含SEQ ID NO:451、CDR-L1包含SEQ ID NO:446、CDR-L2包含SEQ ID NO:447和CDR-L3包含SEQID NO:448；
(gg)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:467、CDR-H2包含SEQ ID NO:468、CDR-H3包含SEQ ID NO:469、CDR-L1包含SEQ ID NO:464、CDR-L2包含SEQ ID NO:465和CDR-L3包含SEQID NO:466；
(hh)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:479、CDR-H2包含SEQ ID NO:480、CDR-H3包含SEQ ID NO:481、CDR-L1包含SEQ ID NO:476、CDR-L2包含SEQ ID NO:477和CDR-L3包含SEQID NO:478；
(ii)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:485、CDR-H2包含SEQ ID NO:486、CDR-H3包含SEQ ID NO:487、CDR-L1包含SEQ ID NO:482、CDR-L2包含SEQ ID NO:483和CDR-L3包含SEQID NO:484；
(jj)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:473、CDR-H2包含SEQ ID NO:474、CDR-H3包含SEQ ID NO:475、CDR-L1包含SEQ ID NO:470、CDR-L2包含SEQ ID NO:471和CDR-L3包含SEQID NO:472；
(kk)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:562、CDR-L2包含SEQ ID NO:563和CDR-L3包含SEQ ID NO:564，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:565、CDR-H2包含SEQ ID NO:566和CDR-H3包含SEQ ID NO:567；
(ll)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:580、CDR-L2包含SEQ ID NO:581和CDR-L3包含SEQ ID NO:582，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:583、CDR-H2包含SEQ ID NO:584和CDR-H3包含SEQ ID NO:585；
(mm)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:598、CDR-L2包含SEQ ID NO:599和CDR-L3包含SEQ ID NO:600，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:601、CDR-H2包含SEQ ID NO:602和CDR-H3包含SEQ ID NO:603；
(nn)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:616、CDR-L2包含SEQ ID NO:617和CDR-L3包含SEQ ID NO:618，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:619、CDR-H2包含SEQ ID NO:620和CDR-H3包含SEQ ID NO:621；
(oo)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:634、CDR-L2包含SEQ ID NO:635和CDR-L3包含SEQ ID NO:636，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:637、CDR-H2包含SEQ ID NO:638和CDR-H3包含SEQ ID NO:639；
(pp)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:652、CDR-L2包含SEQ ID NO:653和CDR-L3包含SEQ ID NO:654，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:655、CDR-H2包含SEQ ID NO:656和CDR-H3包含SEQ ID NO:657；
(qq)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:670、CDR-L2包含SEQ ID NO:671和CDR-L3包含SEQ ID NO:672，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:673、CDR-H2包含SEQ ID NO:674和CDR-H3包含SEQ ID NO:675；
(rr)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:688、CDR-L2包含SEQ ID NO:689和CDR-L3包含SEQ ID NO:690，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:691、CDR-H2包含SEQ ID NO:692和CDR-H3包含SEQ ID NO:693；
(ss)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:706、CDR-L2包含SEQ ID NO:707和CDR-L3包含SEQ ID NO:708，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:709、CDR-H2包含SEQ ID NO:710和CDR-H3包含SEQ ID NO:711；
(tt)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:724、CDR-L2包含SEQ ID NO:725和CDR-L3包含SEQ ID NO:726，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:727、CDR-H2包含SEQ ID NO:728和CDR-H3包含SEQ ID NO:729；
(uu)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:742、CDR-L2包含SEQ ID NO:743和CDR-L3包含SEQ ID NO:744，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:745、CDR-H2包含SEQ ID NO:746和CDR-H3包含SEQ ID NO:747；
(vv)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:760、CDR-L2包含SEQ ID NO:761和CDR-L3包含SEQ ID NO:762，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:763、CDR-H2包含SEQ ID NO:764和CDR-H3包含SEQ ID NO:765；
(ww)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:778、CDR-L2包含SEQ ID NO:779和CDR-L3包含SEQ ID NO:780，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:781、CDR-H2包含SEQ ID NO:782和CDR-H3包含SEQ ID NO:783；
(xx)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:796、CDR-L2包含SEQ ID NO:797和CDR-L3包含SEQ ID NO:798，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:799、CDR-H2包含SEQ IDNO:800和CDR-H3包含SEQ ID NO:801；
(yy)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:814、CDR-L2包含SEQ ID NO:815和CDR-L3包含SEQ ID NO:816，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:817、CDR-H2包含SEQ ID NO:818和CDR-H3包含SEQ ID NO:819；或者
(zz)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:832、CDR-L2包含SEQ ID NO:833和CDR-L3包含SEQ ID NO:834，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:835、CDR-H2包含SEQ ID NO:836和CDR-H3包含SEQ ID NO:837。
在所述抗体的一些实施方式中：
(a)所述VH结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943和945，和/或所述VL结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942和944；
(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO:248的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:249的序列；
(c)所述VL结构域包含SEQ ID NO:250的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:251的序列；
(d)所述VL结构域包含SEQ ID NO:252的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:253的序列；
(e)所述VL结构域包含SEQ ID NO:254的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:255的序列；
(f)所述VL结构域包含SEQ ID NO:256的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:257的序列；
(g)所述VL结构域包含SEQ ID NO:258的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:259的序列；
(h)所述VL结构域包含SEQ ID NO:260的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:261的序列；
(i)所述VL结构域包含SEQ ID NO:262的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:263的序列；
(j)所述VL结构域包含SEQ ID NO:264的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:265的序列；
(k)所述VL结构域包含SEQ ID NO:266的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:267的序列；
(l)所述VL结构域包含SEQ ID NO:268的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:269的序列；
(m)所述VL结构域包含SEQ ID NO:270的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:271的序列；
(n)所述VL结构域包含SEQ ID NO:900的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:901的序列；
(o)所述VL结构域包含SEQ ID NO:902的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:903的序列；
(p)所述VL结构域包含SEQ ID NO:904的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:905的序列；
(q)所述VL结构域包含SEQ ID NO:906的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:907的序列；
(r)所述VL结构域包含SEQ ID NO:908的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:909的序列；
(s)所述VL结构域包含SEQ ID NO:910的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:911的序列；
(t)所述VL结构域包含SEQ ID NO:912的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:913的序列；
(u)所述VL结构域包含SEQ ID NO:914的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:915的序列；
(v)所述VL结构域包含SEQ ID NO:916的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:917的序列；
(w)所述VL结构域包含SEQ ID NO:918的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:919的序列；
(x)所述VL结构域包含SEQ ID NO:920的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:921的序列；
(y)所述VL结构域包含SEQ ID NO:922的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:923的序列；
(z)所述VL结构域包含SEQ ID NO:924的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:925的序列；
(aa)所述VL结构域包含SEQ ID NO:926的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:927的序列；
(bb)所述VL结构域包含SEQ ID NO:928的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:929的序列；
(cc)所述VL结构域包含SEQ ID NO:930的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:931的序列；
(dd)所述VL结构域包含SEQ ID NO:932的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:933的序列；
(ee)所述VL结构域包含SEQ ID NO:934的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:935的序列；
(ff)所述VL结构域包含SEQ ID NO:936的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:937的序列；
(gg)所述VL结构域包含SEQ ID NO:938的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:939的序列；
(hh)所述VL结构域包含SEQ ID NO:940的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:941的序列；
(ii)所述VL结构域包含SEQ ID NO:942的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:943的序列；或者
(jj)所述VL结构域包含SEQ ID NO:944的序列和/或所述VH结构域包含SEQ IDNO:945的序列。
在一些实施方式中，所述抗体连接至一个或多个包含至少一个谷氨酰胺残基的Q标签肽(Q)。在一些实施方式中，所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链，和其中一个Q标签连接至所述抗体的一条或两条重链。在一些实施方式中，所述Q标签融合至所述抗体的所述重链的C末端。在一些实施方式中，每个Q标签独立地包含含有5至15个之间氨基酸残基的肽序列。在一些实施方式中，所述Q标签是天然存在的。在一些实施方式中，每个Q标签的肽序列独立地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:39-55。在一些实施方式中，所述Q标签包含所述肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)。在一些实施方式中，每个Q标签独立地包含RPQGF(SEQID NO:47)、RPQGFPP(SEQ ID NO:48)或RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。在一些实施方式中，1或2个Q标签连接至所述抗体。在一些实施方式中，所述抗体进一步包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID No:92-107、111、112、178和494-497。
在一些实施方式中，所述抗体是Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、scFv、单一结构域、单一重链或单一轻链抗体或抗体片段。在一些实施方式中，所述抗体包含Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是选自由以下组成的组的人Fc区：IgG1 Fc区、IgG2 Fc区和IgG4 Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含降低与C1q结合的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含增加与C1q结合的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述Fc区是显示出野生型补体激活的人Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含增加补体激活的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含一个或多个氨基酸取代并且显示出与C1q的野生型结合。在一些实施方式中，所述Fc区是包含一个或多个氨基酸取代的人Fc区，与缺乏该氨基酸取代的人Fc区相比所述一个或多个氨基酸取代降低效应子功能。在一些实施方式中，所述Fc区是：(a)包含L234A、L235A和/或G237A取代的人IgG1 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；(b)包含A330S和/或P331S取代的人IgG2 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；或者(c)包含S228P和/或L235E取代的人IgG4 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号。在一些实施方式中，所述Fc区进一步包含N297A取代，根据EU索引对氨基酸位置编号。在一些实施方式中，所述Fc区是野生型人IgG1Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是人IgG1Fc区，所述人IgG1Fc区已被工程化以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方式中，所述抗体的两条重链的至少一个或两个是非岩藻糖基化的。在一些实施方式中，所述抗体在具有α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中生产。在一些实施方式中，所述抗体在过表达β1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖转移酶III(GnT-III)的细胞系中生产。在一些实施方式中，所述细胞系另外过表达Golgiμ-甘露糖苷酶II(ManII)。在一些实施方式中，所述抗体在所述Fc区中包含改善ADCC活性的至少一个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述抗体在所述Fc区中包含改善ADCP活性的至少一个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述抗体在所述Fc区中包含改善CDC活性的至少一个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述Fc区包含取代G236A，其中根据EU索引编号。在一些实施方式中，所述Fc区包含取代G236A，其中根据EU索引编号，并且所述Fc区是非岩藻糖基化的。
在所述抗体的一些实施方式中：
(a)所述抗体包含轻链，所述轻链包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ IDNO:236-247和1000-1022，和/或重链，所述重链包含重链序列和Q标签，其中所述重链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:224-235和1030-1065；
(b)所述抗体包含轻链，所述轻链包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ IDNO:236-247和1000-1022，和/或重链，所述重链包含选自由以下组成的组的重链序列：SEQID NO:1070-1117；
(c)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:224的重链；
(d)所述抗体包含含有SEQ ID NO:237的轻链和/或含有SEQ ID NO:225的重链；
(e)所述抗体包含含有SEQ ID NO:238的轻链和/或含有SEQ ID NO:226的重链；
(f)所述抗体包含含有SEQ ID NO:239的轻链和/或含有SEQ ID NO:227的重链；
(g)所述抗体包含含有SEQ ID NO:240的轻链和/或含有SEQ ID NO:228的重链；
(h)所述抗体包含含有SEQ ID NO:241的轻链和/或含有SEQ ID NO:229的重链；
(i)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:230的重链；
(j)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:231的重链；
(k)所述抗体包含含有SEQ ID NO:244的轻链和/或含有SEQ ID NO:232的重链；
(l)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:233的重链；
(m)所述抗体包含含有SEQ ID NO:246的轻链和/或含有SEQ ID NO:234的重链；
(n)所述抗体包含含有SEQ ID NO:247的轻链和/或含有SEQ ID NO:235的重链；
(o)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1000的轻链和/或含有SEQ ID NO:1030的重链；
(p)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和/或含有SEQ ID NO:1031的重链；
(q)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和/或含有SEQ ID NO:1032的重链；
(r)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和/或含有SEQ ID NO:1033的重链；
(s)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和/或含有SEQ ID NO:1034的重链；
(t)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和/或含有SEQ ID NO:1035的重链；
(u)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和/或含有SEQ ID NO:1036的重链；
(v)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1037的重链；
(w)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1038的重链；
(x)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和/或含有SEQ ID NO:1039的重链；
(y)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和/或含有SEQ ID NO:1040的重链；
(z)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和/或含有SEQ ID NO:1041的重链；
(aa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1042的重链；
(bb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和/或含有SEQ ID NO:1043的重链；
(cc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和/或含有SEQ ID NO:1044的重链；
(dd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和/或含有SEQ ID NO:1045的重链；
(ee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和/或含有SEQ ID NO:1046的重链；
(ff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1047的重链；
(gg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1048的重链；
(hh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1049的重链；
(ii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1050的重链；
(jj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1051的重链；
(kk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1052的重链；
(ll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1053的重链；
(mm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1054的重链；
(nn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1055的重链；
(oo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1056的重链；
(pp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1057的重链；
(qq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1058的重链；
(rr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1059的重链；
(ss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1060的重链；
(tt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1061的重链；
(uu)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1062的重链；
(vv)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1063的重链；
(ww)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1064的重链；
(xx)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1065的重链；
(yy)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1070的重链；
(zz)所述抗体包含含有SEQ ID NO:237的轻链和/或含有SEQ ID NO:1071的重链；
(aaa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:238的轻链和/或含有SEQ ID NO:1072的重链；
(bbb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:239的轻链和/或含有SEQ ID NO:1073的重链；
(ccc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:240的轻链和/或含有SEQ ID NO:1074的重链；
(ddd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:241的轻链和/或含有SEQ ID NO:1075的重链；
(eee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1076的重链；
(fff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1077的重链；
(ggg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:244的轻链和/或含有SEQ ID NO:1078的重链；
(hhh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1079的重链；
(iii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:246的轻链和/或含有SEQ ID NO:1080的重链；
(jjj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:247的轻链和/或含有SEQ ID NO:1081的重链；
(kkk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1000的轻链和/或含有SEQ ID NO:1082的重链；
(lll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和/或含有SEQ ID NO:1083的重链；
(mmm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和/或含有SEQ ID NO:1084的重链；
(nnn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和/或含有SEQ ID NO:1085的重链；
(ooo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和/或含有SEQ ID NO:1086的重链；
(ppp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和/或含有SEQ ID NO:1087的重链；
(qqq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和/或含有SEQ ID NO:1088的重链；
(rrr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1089的重链；
(sss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1090的重链；
(ttt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和/或含有SEQ ID NO:1091的重链；
(uuu)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和/或含有SEQ ID NO:1092的重链；
(vvv)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和/或含有SEQ ID NO:1093的重链；
(www)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1094的重链；
(xxx)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和/或含有SEQ ID NO:1095的重链；
(yyy)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和/或含有SEQ ID NO:1096的重链；
(zzz)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和/或含有SEQ ID NO:1097的重链；
(aaaa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和/或含有SEQ ID NO:1098的重链；
(bbbb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1099的重链；
(cccc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1100的重链；
(dddd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1101的重链；
(eeee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1102的重链；
(ffff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1103的重链；
(gggg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1104的重链；
(hhhh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1105的重链；
(iiii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1106的重链；
(jjjj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1107的重链；
(kkkk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1108的重链；
(llll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1109的重链；
(mmmm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1110的重链；
(nnnn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1111的重链；
(oooo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1112的重链；
(pppp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1113的重链；
(qqqq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1114的重链；
(rrrr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1115的重链；
(ssss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1116的重链；或者
(tttt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1117的重链。
在一些实施方式中，所述抗体是双特异性或多特异性抗体，所述抗体至少包含第二VL结构域和第二VH结构域，其中所述第二VL结构域和第二VH结构域特异性结合与人连接蛋白-4不同的靶标。
在一个方面中，本文提供了一种制备缀合物的方法，所述缀合物包含(i)特异性结合人连接蛋白-4的抗体或其抗原结合片段(Ab)和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含氨基酸序列RPQGF(SEQ ID NO:47)，和其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的所述谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示，
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与Q连接的接头部分；和
每个P独立地是免疫调节寡核苷酸；
其包括在转谷氨酰胺酶存在的条件下使式(B)化合物
其中Ab和Q如上文针对式(A)所定义，且e是从1至20的整数，
与一个或多个免疫调节寡核苷酸P接触，其中每个P独立地：
(i)具有下式：
其中
X5’是5’末端核苷；
X3’是3’末端核苷；
YPTE是核苷间磷酸三酯；
Y3’是末端磷酸三酯；
每个XN独立地是核苷；
每个YN独立地是核苷间接头；
b和c各自独立地是从1至25的整数；条件是b和c的总和至少是5；和
L是包含末端胺的接头部分；或者
(ii)是式(C)或(D)的免疫调节寡核苷酸。在一些实施方式中，每个免疫调节寡核苷酸独立地是式(C)或式(D)的寡核苷酸：其选自表4和表6的寡核苷酸。在一些实施方式中，所述抗体是根据上文所述的抗体的任一个。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将DAR为1的缀合物与游离寡核苷酸、未缀合的抗体和DAR为2的缀合物分离。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含与药剂缀合的上文所述的抗体的任一个。在一些实施方式中，所述药剂是标签。在一些实施方式中，所述药剂是细胞毒性药剂。在一些实施方式中，所述药剂是调节免疫系统的部分。在一些实施方式中，所述部分选自由以下组成的组：IDO/TDO抑制剂、AhR抑制剂、精氨酸酶抑制剂、A2aR抑制剂、TLR激动剂、STING激动剂和Rig-1激动剂。在一些实施方式中，所述部分包含细胞因子。在一些实施方式中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL2、IL7、IL10、IL15或IFN。在一些实施方式中，所述部分调节细胞因子的活性。在一些实施方式中，所述部分调节IL2、IL7、IL10、IL15或干扰素的活性。在一些实施方式中，所述部分包含癌症疫苗。
在上文所述的抗体或者上文所述的缀合物的一些实施方式中，所述抗体或所述缀合物的所述抗体是连接至根据表3-6的修饰的寡核苷酸结构的任一个的修饰的寡核苷酸结构。
在一个方面中，本文提供了一种药物组合物，其包含上文所述的抗体的任一个或上文所述的缀合物的任一个，以及药学上可接受的载体。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点/>
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:276的序列、CDR-H3包含SEQ IDNO:277的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:272的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:273的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:274的序列。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:402的序列、CDR-H3包含SEQ IDNO:403的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:398的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:399的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:400的序列。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
/>
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:679的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:680的序列、CDR-H3包含SEQ IDNO:681的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:676的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:677的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:678的序列。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:276的序列、CDR-H3包含SEQ IDNO:277的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:272的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:273的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:274的序列。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:402的序列、CDR-H3包含SEQ IDNO:403的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:398的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:399的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:400的序列。
在一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:679的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:680的序列、CDR-H3包含SEQ IDNO:681的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:676的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:677的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:678的序列。
在所述缀合物的一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含(a)含有SEQ IDNO:935的重链可变区(VH)结构域和含有SEQ ID NO:934的轻链可变区(VL)结构域；(b)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1047，和包含SEQ ID NO:1017的轻链；(c)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1060，和包含SEQ IDNO:1017的轻链；(d)包含SEQ ID NO:1099的重链和包含SEQ ID NO:1017的轻链；或者(e)包含SEQ ID NO:1112的重链和包含SEQ ID NO:1017的轻链。在所述缀合物的一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO:937的重链可变区(VH)结构域和含有SEQ ID NO:936的轻链可变区(VL)结构域；(b)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1048，和包含SEQ ID NO:1018的轻链；(c)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1061，和包含SEQ ID NO:1018的轻链；(d)包含SEQ ID NO:1100的重链和包含SEQ ID NO:1018的轻链；或者(e)包含SEQ ID NO:1113的重链和包含SEQ IDNO:1018的轻链。在所述缀合物的一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含(a)含有SEQID NO:939的重链可变区(VH)结构域和含有SEQ ID NO:938的轻链可变区(VL)结构域；(b)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1049，和包含SEQ ID NO:1019的轻链；(c)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1062，和包含SEQID NO:1019的轻链；(d)包含SEQ ID NO:1101的重链和包含SEQ ID NO:1019的轻链；或者(e)包含SEQ ID NO:1114的重链和包含SEQ ID NO:1019的轻链。
在所述缀合物的一些实施方式中，m是从约20至约30。在所述缀合物的一些实施方式中，m是约24或m是24。在所述缀合物的一些实施方式中，L包含聚乙二醇部分。在所述缀合物的一些实施方式中，所述聚乙二醇部分包含约24个乙二醇单元或包含24个乙二醇单元。在所述缀合物的一些实施方式中，在所述缀合物中的每个(P)和(L)独立地包含SEQ ID NO:35的修饰的寡核苷酸。在所述缀合物的一些实施方式中，在所述缀合物中的每个(P)和(L)独立地包含SEQ ID NO:9的修饰的寡核苷酸。在所述缀合物的一些实施方式中，所述缀合物的所述抗体包含Fc区。在所述缀合物的一些实施方式中，所述Fc区是人IgG1 Fc区。在所述缀合物的一些实施方式中，所述Fc区是非岩藻糖基化的。在所述缀合物的一些实施方式中，所述Fc区包含取代G236A，其中根据EU索引编号。在所述缀合物的一些实施方式中，所述Fc区包含取代G236A，其中根据EU索引编号，并且Fc区是非岩藻糖基化的。在所述缀合物的一些实施方式中，所述缀合物具有1或2的DAR。
在一个方面中，本文提供了一种药物组合物，其包含上文所述的缀合物的任一个以及药学上可接受的载体。
在一个方面中，本文提供了一种治疗癌症的方法，其包括向个体施用有效量的上文所述的缀合物的任一个，上文所述的抗体的任一个或者上文所述的药物组合物的任一个。在一些实施方式中，与所述癌症来源的正常细胞相比，所述癌细胞过表达连接蛋白-4。在一些实施方式中，与所述癌症来源的正常细胞相比，所述癌肿瘤细胞表达正常或中等水平的连接蛋白-4。在一些实施方式中，与所述癌症来源的正常细胞相比，所述癌肿瘤细胞表达低水平的连接蛋白-4。在一些实施方式中，所述方法进一步包括施用至少一种其他癌症治疗剂。在一些实施方式中，所述至少一种其他癌症治疗剂包含化学治疗剂、免疫治疗剂、小分子抑制剂(SMQ)、治疗性抗体或癌症疫苗。在一些实施方式中，所述癌症是实体癌症。在一些实施方式中，所述癌症是液体肿瘤。在一些实施方式中，所述癌症是食道癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺腺癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、直肠癌或胆囊癌。在一些实施方式中，施用所述缀合物或所述药物组合物活化T细胞、树突状细胞、单核细胞和/或NK细胞。
在一个方面中，本文提供了一种在个体中活化免疫细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的上文所述的缀合物的任一个或包含缀合物的上文所述的药物组合物的任一个，其中施用所述缀合物或所述药物组合物活化T细胞、树突状细胞、单核细胞和/或NK细胞。在一些实施方式中，所述个体患有癌症。在一些实施方式中，所述方法进一步包括施用至少一种其他癌症治疗剂。在一些实施方式中，所述至少一种其他癌症治疗剂包含化学治疗剂、免疫治疗剂、小分子抑制剂(SMQ)、治疗性抗体或癌症疫苗。在一些实施方式中，所述癌症是实体癌症。在一些实施方式中，所述癌症是液体肿瘤。在一些实施方式中，所述癌症是食道癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺腺癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、直肠癌或胆囊癌。在一些实施方式中，所述癌症是免疫检查点抑制剂疗法难治性的。在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂疗法包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
在一个方面中，本文提供了一种治疗肿瘤或肿瘤细胞的方法，其包括施用有效量的上文所述的缀合物的任一个，上文所述的抗体的任一个或者上文所述的药物组合物的任一个。在一些实施方式中，治疗所述肿瘤或肿瘤细胞包括杀死所述肿瘤或肿瘤细胞、诱导所述肿瘤或肿瘤细胞的细胞毒性、降低或抑制所述肿瘤或肿瘤细胞的活力、抑制所述肿瘤或肿瘤细胞生长、抑制所述肿瘤或肿瘤细胞建立、抑制或降低所述肿瘤或肿瘤细胞转移、缩小所述肿瘤的尺寸或者激活针对所述肿瘤或肿瘤细胞的免疫应答。
在一个方面中，本文提供了一种核酸，其编码上文所述的缀合物的任一个的抗体或者上文所述的抗体的任一个。
在一个方面中，本文提供了一种载体，其包含上文所述的核酸。在一些实施方式中，所述载体是表达载体。
在一个方面中，本文提供了一种宿主细胞，其包含上文所述的载体的任一个。在一些实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞或细菌细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞是CHO细胞。
在一个方面中，本文提供了一种生产上文所述的抗体任一个的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中表达所述抗体的条件下，培养上文所述的宿主细胞的任一个。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞中分离和/或纯化所述抗体。
附图说明
可以通过结合附图参考以下描述理解本申请。
图1A-1B描述了基于观察到的(a)HLADR(图1A)和(b)CD40(图1B)的表达增加的，仅免疫调节寡核苷酸在人PBMC中的活性。
图2A-2C显示了免疫调节寡核苷酸及其抗体缀合物对于增加B细胞数量和活化的作用。图2A描述了通过单独的各种免疫调节多肽观察到的对B细胞数量的影响。图2B-2C描述了观察到的由单独的免疫调节寡核苷酸产生的B细胞的活化(通过检测CD40表达)。
图3显示了转谷氨酰胺酶介导的与聚乙二醇接头(-NH-C(＝O)-PEG23-NH2)和各种Q标签的缀合和去缀合的百分比收率。展示的是SEQ ID No:39-47和50-52。
图4A和图4B显示了在两个Q标签肽(LSLSPGLLQGG，SEQ ID NO:39；和RPQGF，SEQ IDNO:47)的转谷氨酰胺酶缀合中缀合和去缀合随着时间的变化百分比。
图5显示了如通过CD19+B细胞上CD40表达所测定的人PBMC上所指示的游离CpG寡核苷酸的活性。
图6显示了如通过Ramos NFkb报告子测定所测定的人PBMC上所指示的游离CpG寡核苷酸的活性。
图7A-7C显示了如通过CD40表达所观察的来自三个不同供体系(D559，图7A、D804，图7B和D643，图7C)的人PBMC上所指示的游离CpG寡核苷酸的活性。
图8显示了如通过CD19+B细胞上CD40表达所测定的人PBMC上所指示的游离CpG寡核苷酸的活性。
图9A-9D显示了根据一些实施方式的示例性缀合物的示意图。具有与重链的C末端融合的工程化Q标签的示例性抗体：CpG缀合物显示在图9A(具有DAR 1)和图9B(具有DAR 2)中。具有暴露用于通过N297A突变缀合的天然存在的Q标签(Q295)的示例性抗体：CpG缀合物显示在图9C(具有DAR 1)和图9D(具有DAR 2)中。
图10显示了各种连接蛋白-4抗体之间的竞争实验的结果。
图11显示了在表达连接蛋白-4的细胞(左图)和连接蛋白-4阴性细胞(右图)中通过连接蛋白-4抗体-CpG缀合物的单核细胞活化。
图12显示了在表达连接蛋白-4的细胞(左图)和连接蛋白-4阴性细胞(右图)中通过连接蛋白-4抗体-CpG缀合物的树突状细胞活化。
图13显示了通过各种连接蛋白-4抗体缀合物对肿瘤吞噬作用的增强。
图14A-14D显示了通过各种连接蛋白-4抗体-CpG缀合物增强PBMC的细胞因子分泌，以相应未缀合的连接蛋白-4抗体的活性倍数作图。图14A显示了IFNα2诱导，图14B显示了IFNγ诱导，图14C显示了IL6诱导和图14D显示了IL10诱导。
图15显示了连接蛋白-4抗体的内化。
图16A-16B显示了连接蛋白-4抗体缀合物对MC38连接蛋白-4肿瘤的抗肿瘤活性。图16A显示了连接蛋白-4在MC38连接蛋白-4细胞上的广泛表达和图16B显示了连接蛋白-4抗体缀合物的抗肿瘤活性。
图17显示了如通过CD3+T细胞上的CD69百分比所测定的通过连接蛋白-4抗体缀合物的T细胞活化。
图18显示了如通过CD56+CD3-NK细胞上的CD69表达所测定的通过连接蛋白-4抗体缀合物的NK细胞活化。
图19显示了如通过IRF7表达所测定的通过连接蛋白-4抗体缀合物的NK细胞活化。
图20A-20B显示了连接蛋白-4抗体缀合物的体内抗肿瘤活性。箭头表示施用日。
图21显示了各种连接蛋白-4抗体与内源性表达连接蛋白-4的SKBR3细胞的结合。
图22显示了在T47D(上图)或连接蛋白-4-DLD细胞(下图)中所示连接蛋白-4抗体的内化。
图23显示了在连接蛋白-4-DLD细胞中通过连接蛋白-4抗体缀合物的免疫细胞活化，以相应未缀合的连接蛋白-4抗体的倍数作图。
图24显示了在OE19细胞中通过连接蛋白-4抗体缀合物的免疫细胞活化，以相应未缀合的连接蛋白-4抗体的倍数作图。
图25显示了在连接蛋白-4-DLD细胞中通过连接蛋白-4抗体缀合物的免疫细胞活化，以相应未缀合的连接蛋白-4抗体的倍数作图。
图26显示了在HT1376细胞中通过连接蛋白-4抗体缀合物的免疫细胞活化，以相应未缀合的连接蛋白-4抗体的倍数作图。
图27显示了在H292细胞中通过连接蛋白-4抗体缀合物的免疫细胞活化，以相应未缀合的连接蛋白-4抗体的倍数作图。
图28显示了在OE19细胞中通过连接蛋白-4抗体CpG缀合物(TNT-266a，左图)或与TLR8激动剂缀合的连接蛋白-4抗体(将缀合物称为TNT-347xx，右图)的免疫细胞活化，以相应未缀合的连接蛋白-4抗体的倍数作图。
图29显示了连接蛋白-4抗体缀合物和连接蛋白-4抗体MMAE缀合物在MC38连接蛋白-4肿瘤上的抗肿瘤活性。
图30显示了在连接蛋白-4DLD细胞中通过具有人IgG1或非岩藻糖基化的人IgG1的连接蛋白-4抗体缀合物的免疫细胞活化。
图31显示了在连接蛋白-4DLD(左上图)、HT1376(右上图)、OE19(左下图)和H292(右下图)细胞中通过连接蛋白-4抗体缀合物的B细胞活化。
图32显示了在连接蛋白-4DLD(左上图)、HT1376(右中图)和H292(左下图)细胞中通过连接蛋白-4抗体缀合物的B细胞活化。
图33显示了使用所示抗体缀合物或PBS处理后在MC38肿瘤细胞中的记忆应答。
图34显示了连接蛋白-4抗体缀合物对SKBR3肿瘤的体内抗肿瘤活性。
图35A-35B显示了连接蛋白-4抗体缀合物对表达连接蛋白-4的CT26肿瘤(图35A)和EMT6肿瘤(图35B)的体内抗肿瘤活性。
图36A-36B显示了连接蛋白-4抗体缀合物对表达连接蛋白-4的CT26肿瘤(图36A)和EMT6肿瘤(图36B)的体内抗肿瘤活性。
图37显示了具有DAR1和DAR2的连接蛋白-4抗体缀合物的体内抗肿瘤活性比较。
图38显示了在HT1376和H292细胞系中岩藻糖基化和非岩藻糖基化的缀合物的活性。
图39显示了岩藻糖基化和非岩藻糖基化的连接蛋白-4抗体缀合物对于树突状细胞增殖的活性。
图40显示了连接蛋白-4抗体缀合物对于肿瘤细胞细胞毒性的活性。
具体实施方式
以下描述阐述了示例性方法、参数等。然而，应当认识到，这样的描述不旨在作为对本公开的范围的限制，而是作为示例性实施方式的描述来提供。
本公开内容至少部分地基于新的连接蛋白-4抗体(即，抗连接蛋白-4抗体；结合连接蛋白-4的抗体；特异性结合连接蛋白-4的抗体)的发现。本公开内容进一步部分地基于连接蛋白-4抗体与药剂(如免疫调节寡核苷酸)的缀合。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体与CpG寡核苷酸缀合(即，在本文中也称为连接蛋白-4抗体CpG缀合物、连接蛋白-4抗体寡核苷酸缀合物、连接蛋白-4抗体缀合物、抗连接蛋白-4抗体缀合物，或者，除非上下文另有指明，“缀合物”)，其提供了用于TLR9活化的CpG寡核苷酸的靶向递送。还描述了这些缀合物的制备方法。特别地，可以通过转谷氨酰胺酶(Tgase)介导的反应进行缀合。还提供了能够用于制备这些缀合物的中间化合物。
本文还提供了包含连接蛋白-4抗体缀合物和连接蛋白-4抗体的药物组合物，使用缀合物和抗体的试剂盒和治疗方法(包括治疗癌症的方法)。
I.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文提及的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物通过引用整体并入。如果本部分中阐述的定义与通过引用并入本文的专利、申请或其他出版物中阐述的定义相反或另外不一致，则本部分中阐述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的情况中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式情况中描述的本公开的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与特定方法步骤、试剂或条件有关的实施方式的所有组合明确地包括在本公开中，并且在本文中公开，就如同每个组合被单独地和明确地公开一样。
如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该”包括复数表示物，除非上下文另有明确规定。还应注意，权利要求书可以被撰写为排除任何任选要素。因此，这个陈述旨在用作与权利要求要素叙述相关的诸如“单独”、“仅”等排他性术语的使用或“否定性”限制的使用的先行基础。
在整个本申请中，除非上下文另有说明，否则提及式(A)-(D)化合物包括其离子形式、多晶型物、假多晶型物、无定形形式、溶剂化物、共晶体、螯合物、异构体、互变异构体、氧化物(例如，N-氧化物、S-氧化物)、酯、前药、同位素和/或保护形式。在一些实施方式中，提及式(A)-(D)的化合物包括其多晶型物、溶剂化物、共晶体、异构体、互变异构体和/或氧化物。在一些实施方式中，提及式(A)-(D)的化合物包括其多晶型物、溶剂化物和/或共晶体。在一些实施方式中，提及式(A)-(D)的化合物包括其异构体、互变异构体和/或氧化物。在一些实施方式中，提及式(A)-(D)的化合物包括其溶剂化物。
“烷基”包括具有所示碳原子数的直链和支链碳链，例如1至20个碳原子，或1至8个碳原子，或1至6个碳原子。例如，C1-6烷基包括1至6个碳原子的直链和支链烷基。当命名具有特定碳数的烷基残基时，旨在涵盖具有该碳数的所有支链和直链形式；因此，例如，“丙基”包括正丙基和异丙基；“丁基”包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、3-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基和3-甲基戊基。
当给出值的范围(例如，C1-6烷基)时，该范围内的每个值以及所有中间范围都包括在内。例如，“C1-6烷基”包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C2-6、C3-6、C4-6、C5-6、C1-5、C2-5、C3-5、C4-5、C1-4、C2-4、C3-4、C1-3、C2-3和C1-2烷基。
“烯基”是指具有所示碳原子数(例如，2至8或2至6个碳原子)和至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基。该基团可以是关于双键的顺式或反式构型(Z或E构型)。烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基(例如，丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基)和丁烯基(例如，丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基)。
“炔基”是指具有所示碳原子数(例如，2至8或2至6个碳原子)和至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基。炔基包括但不限于乙炔基、丙炔基(例如，丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基)和丁炔基(例如，丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基)。
本文所用的术语“氨基”表示-N(RN1)2，其中，如果氨基是未取代的，则两个RN1都是H；或者，如果氨基被取代，则每个RN1独立地是H、-OH、-NO2、-N(RN2)2、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、N-保护基团、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳氧基、环烷基、环烯基、杂烷基或杂环基，条件是至少一个RN1不是H，并且其中每个RN2独立地是H、烷基或芳基。每个取代基本身可以是未取代的或被本文对于每个相应基团所定义的未取代的取代基取代。在一些实施方式中，氨基是未取代的氨基(即，-NH2)或取代的氨基(例如，-NHRN1)，其中RN1独立是-OH、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、任选取代的烷基或任选取代的芳基，和每个RN2可以是任选取代的烷基或任选取代的芳基。在一些实施方式中，取代的氨基可以是烷基氨基，其中烷基基团如本文针对烷基所述的是任选取代的。在某些实施方式中，氨基基团为-NHRN1，其中RN1是任选取代的烷基。-NHRN1的非限制性实例，其中RN1是任选取代的烷基，包括：任选取代的烷基氨基、蛋白氨基酸、非蛋白氨基酸、蛋白氨基酸的C1-6烷基酯和非蛋白氨基酸的C1-6烷基酯。所用的氨基酸任选地是L-型。
本文所用的术语“免疫调节寡核苷酸”表示含有总共6至50个通过核苷间桥连基团共价结合在一起的连续核苷的寡核苷酸构建体，所述核苷间桥连基团独立地选自核苷间磷酸酯和任选地核苷间无碱基间隔基。免疫调节寡核苷酸在5’-和3’-末端分别用5’-和3’-加帽基团加帽。免疫调节寡核苷酸能够调节先天性免疫反应，如通过例如胞内信号传导途径(包括但不限于NFkB)的激活的变化、激活标志物表达的变化或免疫调节寡核苷酸所递送的免疫细胞(例如，抗原呈递细胞)(例如，与免疫调节寡核苷酸未递送的另一免疫细胞(例如，抗原呈递细胞相比))中或与免疫调节寡核苷酸所递送的免疫细胞(例如，抗原呈递细胞)相互作用(包括直接细胞-细胞相互作用以及间接刺激，例如来自由免疫调节寡核苷酸所递送的细胞分泌的一种或多种细胞因子)的免疫细胞中至少一种炎性细胞因子或至少一种I型干扰素的分泌的变化所确定的。免疫调节寡核苷酸可以含有缀合基团，或者如果免疫调节寡核苷酸是缀合物的一部分，含有与靶向部分和任选地与一个或多个(例如，1至6个)辅助部分(例如，聚乙二醇)键合的接头。缀合基团或接头可以是磷酸三酯或封端基团的一部分。
如本文所用的，术语“免疫刺激寡核苷酸”表示能够激活免疫反应的免疫调节寡核苷酸，如通过例如胞内信号传导途径(如NFκB)的激活增加或激活或功能的细胞表面标志物的水平增加或免疫调节寡核苷酸所递送的免疫细胞(例如，抗原呈递细胞)(例如，与未递送免疫刺激寡核苷酸的另一免疫细胞(例如，抗原呈递细胞相比))中或与免疫刺激寡核苷酸所递送的免疫细胞(例如，抗原呈递细胞)相互作用(包括直接细胞间相互作用以及间接刺激，例如来自由免疫调节寡核苷酸所递送的细胞分泌的一种或多种细胞因子)的免疫细胞中至少一种炎性细胞因子或至少一种I型干扰素的分泌的增加所确定的。在一些实施方式中，免疫刺激寡核苷酸含有至少一个胞苷-β-鸟苷(CpG)序列，其中P是核苷间磷酸二酯(例如，磷酸酯或硫代磷酸酯)或核苷间磷酸三酯或硫代磷酸三酯。如本文所用，含CpG的免疫刺激寡核苷酸可以是天然存在的，如细菌或病毒来源的CpG ODN，或是合成的。例如，在一些实施方式中，免疫刺激寡核苷酸中的CpG序列含有2’-脱氧核糖。
本文所用的术语“免疫抑制寡核苷酸”表示能够拮抗免疫反应的免疫调节寡核苷酸，如通过例如NFkB的激活减少或缺乏激活或者缺乏功能激活的细胞表面标志物水平的增加，或免疫抑制寡核苷酸所递送的免疫细胞(例如，抗原呈递细胞)(例如，与未递送免疫抑制寡核苷酸的另一免疫细胞(例如，抗原呈递细胞相比))中或与免疫抑制寡核苷酸所递送的免疫细胞(例如，抗原呈递细胞)相互作用(包括直接细胞间相互作用以及间接刺激，例如来自由免疫调节寡核苷酸所递送的细胞分泌的一种或多种细胞因子)的免疫细胞中至少一种炎性细胞因子或至少一种I型干扰素的分泌增加的缺乏所确定的。
应当理解，术语“寡核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用。还应理解，术语“免疫调节寡核苷酸”、“免疫刺激寡核苷酸”、“免疫抑制寡核苷酸”和“缀合物”分别涵盖免疫调节寡核苷酸、免疫刺激寡核苷酸、免疫抑制寡核苷酸和缀合物的盐。例如，术语“免疫调节寡核苷酸”、“免疫刺激寡核苷酸”、“免疫抑制寡核苷酸”和“缀合物”涵盖磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的质子化中性形式(P-XH部分，其中X是O或S)和磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的去质子化离子形式(P-X-部分，其中X是O或S)。因此，应当理解，描述为具有作为氢的RE1、RE2和RE3中的一个或多个的磷酸酯和磷酸二酯涵盖其中磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯以去质子化的离子形式存在的盐。此外，涉及免疫调节寡核苷酸、免疫刺激寡核苷酸、免疫抑制寡核苷酸和/或寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)的术语“游离的”、“裸的”和“未缀合的”在本文中可互换使用。
本文所用的术语“磷酸三酯”是指其中所有三个化合价都被非氢取代基取代的磷酸酯。所述磷酸三酯由磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯；一个或两个与核苷或无碱基间隔基和/或磷酰基的键；以及一个或两个独立地选自以下的基团组成：生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；以及与靶向部分并且任选地与一个或多个(例如，1至6个)辅助部分键合的接头。末端磷酸三酯包括与含有核苷的基团的一个键和独立地选自以下的两个基团：生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；磷酰基；以及与靶向部分并且任选地与一个或多个(例如，1至6个)辅助部分键合的接头。在一些实施方式中，末端磷酸三酯含有1或0个与靶向部分并且任选地与一个或多个(例如，1至6个)辅助部分键合的接头。核苷间磷酸三酯包括两个与含核苷基团的键。磷酸三酯可以是以下结构的基团：
其中：
每个XE1和XE2独立地为O或S；
每个RE1和RE2独立地是与核苷的键；无碱基间隔基的糖类似物；生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如，1至6个)辅助部分键合的接头；或式-P(＝XE1)(-XE2-RE2A)-O-的基团中的磷原子，
其中RE2A是氢；生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；或与靶向部分和一个或多个(例如，1至6个)辅助部分键合的接头；和
RE2是生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；或与靶向部分和一个或多个(例如，1至6个)辅助部分键合的接头；
条件是RE1和RE3中的至少一个是与含有至少一个核苷的基团的键。
如果RE1和RE3都是与含有至少一个核苷的基团的键，则磷酸三酯是核苷间磷酸三酯。如果RE1和RE3中的一个且仅一个是与含核苷的基团的键，则磷酸三酯是末端磷酸三酯。
如本文所用的，术语“氨基酸”是指任何氨基酸(标准和非标准氨基酸)，包括但不限于α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸和δ-氨基酸。合适的氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。合适的氨基酸的其他实例包括但不限于鸟氨酸、高赖氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、β-丙氨酸、α-乙基-甘氨酸、α-丙基-甘氨酸和正亮氨酸。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“Ig”在本文中可互换使用，并且以最广泛的含义使用，且具体涵盖例如单个单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要其呈现出所需的生物活性)、单链抗体和抗体片段。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和力成熟的以及来自其他物种(例如，小鼠和兔)的抗体。
术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白类多肽内的B细胞的多肽产物，其能够结合特异性抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，并且每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见Borrebaeck(编著)(1995)AntibodyEngineering，第二版，Oxford University Press.；Kuby(1997)Immunology，第三版，W.H.Freeman and Company,New York。抗体还包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体及其功能性片段，其是指保留了衍生该片段的抗体的一些或全部结合活性的抗体重链或轻链多肽的一部分。抗体的功能性片段的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性或双特异性)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fd片段、Fv片段、scRV-Fc、纳米抗体、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。在一些实施方式中，抗体包含具有降低或消除的效应子功能的Fc变体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有结合抗原的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如，抗CD56抗体或抗SIRPα抗体的一个或多个互补决定区(CDR))。此类抗体片段描述于例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；Myers(编著)，Molec.Biologyand Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,New York:VCH Publisher,Inc.；Huston等，Cell Biophysics1993,22,189-224；Plückthun和Skerra,Meth.Enzymol.1989,178,497-515；和Day,Advanced Immunochemistry，第二版，Wiley-Liss,Inc.,New York,NY(1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)。
术语“抗原”是指抗体可以选择性结合的预定靶标。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其片段，或其他天然存在的或合成的化合物。在一个实施方式中，靶抗原是多肽。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”和“抗原结合区”是指包含与抗原(例如，多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其片段，或其他天然存在的或合成的化合物)相互作用并赋予结合剂对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(例如，互补决定区(CDR))的抗体的一部分。
术语“特异性结合”、“特异性地结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或者“对其特异性”可以通过例如对靶标具有至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M或至少约10-12M的解离常数(Kd)的分子(例如，抗体)来呈现。在一个实施方式中，术语“特异性结合”是指其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位的结合。
4-链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的杂四聚体糖蛋白。在IgG的情况下，4-链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接(取决于H链同种型)。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N-末端具有可变结构域(VH)，随后是对于每条α和γ链的三个恒定结构域(CH)，以及对于μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N-末端具有可变结构域(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。据认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和性质，参见，例如，Basicand Clinical Immunology，第8版，Stites等(编著)，Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994，第6章和第71页。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端，并且在重链中具有约120至130个氨基酸的长度，而在轻链中具有约100至110个氨基酸的长度，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可称为“VH”。轻链的可变区可称为“VL”。术语“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间的序列差异很大的事实。V区介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变区的110个氨基酸跨度上不是均匀分布的。相反，V区由约15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的较低可变(例如，相对不变)的区段组成，所述框架区由各自约9-12个氨基酸长的称为“超变区”的较高可变(例如，极端可变性)的较短区域分隔开。重链和轻链的可变区各自包含通过三个超变区连接的四个FR(主要采用β片层构型)，该超变区形成连接β片层结构的环，并且在一些情况下形成β片层结构的一部分。每条链中的超变区通过FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的超变区一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但呈现出各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。不同抗体之间的可变区序列差异很大。序列的可变性集中在CDR中，而可变区中较低可变的部分被称为框架区(FR)。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。在具体的实施方式中，可变区是人可变区。
术语“如Kabat中的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化是指用于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中的抗体编译的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入其中的更少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列在同源性区域的比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等，Sequences of Immunological Interest，第五版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如Kabat等报道的EU索引，同上)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。已经描述了其他编号系统，包括例如AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可包括人恒定区或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
术语“抗体片段”指完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体和双-双抗体(参见，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1993,90,6444-8；Lu等，J.Biol.Chem.2005,280,19665-72；Hudson等，Nat.Med.2003,9,129-134；WO 93/11161；和美国专利号5,837,242和6,492,123)；单链抗体分子(参见例如，美国专利号4,946,778；5,260,203；5,482,858和5,476,786)；双重可变结构域抗体(参见例如，美国专利号7,612,181)；单可变结构域抗体(SdAb)(参见例如，Woolven et al.,Immunogenetics1999,50,98-101Streltsov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2004,101,12444-12449)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语抗体的“功能性片段”、“结合片段”或“抗原结合片段”是指呈现出至少一种归因于完整抗体的生物学功能的分子，所述功能包括至少与靶抗原结合。
用于指抗体时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120-130个或更多个氨基酸的可变区，且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的五种不同类型(例如，同种型)之一。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε含有约550个氨基酸。与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五种众所周知的抗体类别(例如，同种型)，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人重链。
用于指抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100至约110个或更多个氨基酸的可变区，羧基末端部分包括恒定区。轻链的大致长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同的类型，称为kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域熟知的。轻链可以是人轻链。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，例如，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变外，构成群体的单个抗体是相同的，并且每个单克隆抗体通常将识别抗原上的单一表位。在具体的实施方式中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单一杂交瘤或其他细胞产生的抗体，其中抗体仅结合βKlotho表位，如例如通过ELISA或本领域已知的其他抗原结合或竞争性结合分析所测定的。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，可用于本公开的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等，Nature1975,256,495描述的杂交瘤方法制备；或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如，美国专利号4,816,567)。例如，“单克隆抗体”也可以使用Clackson等，Nature1991,352,624-628和Marks等，J.Mol.Biol.1991,222,581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。用于制备克隆细胞系和由其表达的单克隆抗体的其他方法是本领域熟知的(参见，例如，Short Protocols in Molecular Biology,(2002)，第5版中的第11章，Ausubel等编著，John Wiley and Sons,New York)。在本文的实施例中提供了产生单克隆抗体的示例性方法。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是包括人免疫球蛋白(例如，受体抗体)的嵌合抗体，其中天然CDR残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(例如，供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的相应CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。人源化抗体重链或轻链可包含至少一个或多个可变区的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR对应于非人免疫球蛋白的那些并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。在某些实施方式中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc。关于进一步的细节，参见Jones等，Nature1986,321,522-525；Riechmann等，Nature1988,332,323-329；Presta,Curr.Opin.Biotechnol.1992,3,394-398；Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1992,89,4285-4289；美国专利号：6,800,738、6,719,971、6,639,055、6,407,213和6,054,297。
“人抗体”是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列，和/或使用本文公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这种定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.1991,227,381；Marks等，J.Mol.Biol.1991,222,581)和酵母展示文库(Chao等，Nature Protocols2006,1,755-768)。还有可用于制备人单克隆抗体的方法描述于Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,p.77(1985)；Boerner等，J.Immunol.1991,147,86-95。还参见van Dijk和van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.2001,5,368-374。可以通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已经失能，例如小鼠(参见例如，Jakobovits,Curr.Opin.Biotechnol.1995,6,561-566；Brüggemann and Taussing,Curr.Opin.Biotechnol.1997,8,455-458；以及关于XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，也参见，例如，Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2006,103,3557-3562。
“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个超变区(HI、H2或H3)之一，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个超变区(LI、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR区是本领域技术人员熟知的，并且已经由例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内最高可变性的区域。Kabat等，J.Biol.Chem.1977,252,6609-6616；Kabat,Adv.Protein Chem.1978,32,1-75。CDR区序列也已经由Chothia在结构上定义为不是保守β-折叠框架的部分的那些残基，且因此能够采取不同的构象。Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.1987,196,901-917。这两个术语在本领域中都是公知的。CDR区序列也已由AbM、Contact和IMGT定义。通过比较许多结构已经确定了经典抗体可变区内CDR的位置。Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.1997,273,927-948；Morea等，Methods.2000,20,267-279。因为超变区内的残基数目在不同抗体中变化，所以相对于规范位置的额外残基通常在规范可变区编号方案中的残基编号旁边用a、b、c等编号。Al-Lazikani等，同上(1997)。这样的命名法类似地是本领域技术人员熟知的。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226或从Pro230的氨基酸残基至其羧基末端的延伸。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化期间或通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组成可包含去除所有K447残基的抗体群体、未去除K447残基的抗体群体及具有含和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。
“环烷基”表示具有指定碳原子数，例如3-10，或3-8，或3-6个环碳原子的非芳族完全饱和碳环。环烷基可以是单环或多环的(例如，双环、三环)。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基，以及桥连和笼状环基团(例如，降冰片烷、双环[2.2.2]辛烷)。此外，多环环烷基基团的一个环可以是芳族的，条件是多环环烷基基团通过非芳族碳与母体结构结合。例如，1,2,3,4-四氢萘-1-基(其中该部分通过非芳族碳原子与母体结构结合)是环烷基，而1,2,3,4-四氢萘-5-基(其中该部分通过芳族碳原子与母体结构结合)不被认为是环烷基。由与芳环稠合的环烷基组成的多环环烷基基团的实例如下所述。
“环烯基”表示含有指定数目的碳原子(例如，3至10，或3至8，或3至6个环碳原子)和至少一个碳-碳双键的非芳族碳环。环烯基基团可以是单环或多环的(例如，双环、三环)。环烯基基团的实例包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基和环己烯基，以及桥连和笼状环基团(例如，双环[2.2.2]辛烯)。此外，多环环烯基基团的一个环可以是芳族的，条件是多环烯基通过非芳族碳原子与母体结构键合。例如，茚-1-基(其中该部分通过非芳族碳原子与母体结构结合)被认为是环烯基，而茚-4-基(其中该部分通过芳族碳原子与母体结构结合)不被认为是环烯基。由与芳环稠合的环烯基组成的多环环烯基基团的实例如下所述。
“环炔基”是指环烷基内具有至少一个炔属不饱和位点(即，具有至少一个式C≡C的部分)的不饱和烃基。环炔基可以由一个环(例如环辛炔)或多个环组成。一个环炔基部分是具有5至10个环碳原子的不饱和环烃(“C5-C10环炔基”)。实例包括环戊炔、环己炔、环庚炔、环辛炔、环壬炔等。
“芳基”表示具有指定碳原子数(例如，6至12或6至10个碳原子)的芳族碳环。芳基基团可以是单环或多环的(例如，双环、三环)。在一些情况下，多环芳基的两个环都是芳族的(例如萘基)。在其他情况下，多环芳基基团可以包括与芳族环稠合的非芳族环，条件是多环芳基基团经由芳族环中的原子键合至母体结构。因此，1,2,3,4-四氢萘-5-基基团(其中该部分通过芳族碳原子与母体结构结合)被认为是芳基，而1,2,3,4-四氢萘-1-基(其中该部分通过非芳族碳原子与母体结构结合)不被认为是芳基。类似地，1,2,3,4-四氢喹啉-8-基基团(其中该部分通过芳族碳原子与母体结构结合)被认为是芳基，而1,2,3,4-四氢喹啉-1-基(其中该部分通过非芳族氮原子与母体结构结合)不被认为是芳基。然而，术语“芳基”不涵盖如本文所定义的“杂芳基”或不与如本文所定义的“杂芳基”重叠，无论连接点如何(例如，喹啉-5-基和喹啉-2-基都是杂芳基)。在一些情况下，芳基是苯基或萘基。在某些情况下，芳基是苯基。包含与非芳族环稠合的芳族碳环的芳基的其他实例如下所述。
术语“DAR”是指寡核苷酸-抗体缀合物的药物-抗体比率，更具体地是免疫调节寡核苷酸-抗体比率。在一些情况下，例如，寡核苷酸-抗体缀合物在本文中可以描述为具有1的DAR或描述为DAR1缀合物，其中寡核苷酸-抗体比率为1:1。在其他情况下，寡核苷酸-抗体缀合物在本文中可以描述为具有2的DAR或描述为DAR2缀合物，其中寡核苷酸-抗体比率为2:1。
“杂芳基”表示含有指定原子数的芳族环(例如，5至12，或5至10元杂芳基)，其由一个或多个选自N、O和S的杂原子(例如1、2、3或4个杂原子)和作为碳的其余环原子构成。杂芳基不含相邻的S和O原子。在一些实施方式中，杂芳基中S和O原子的总数不超过2。在一些实施方式中，杂芳基中S和O原子的总数不超过1。除非另有说明，杂芳基可以在化合价允许的情况下通过碳或氮原子与母体结构结合。例如，“吡啶基”包括2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基基团，并且“吡咯基”包括1-吡咯基、2-吡咯基和3-吡咯基基团。
在一些情况下，杂芳基是单环的。实例包括吡咯、吡唑、咪唑、三唑(例如，1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,2,4-三唑)、四唑、呋喃、异噁唑、噁唑、噁二唑(例如，1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、1,3,4-噁二唑)、噻吩、异噻唑、噻唑、噻二唑(例如，1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、1,3,4-噻二唑)、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪(例如，1,2,4-三嗪、1,3,5-三嗪)和四嗪。
在一些情况下，多环杂芳基的两个环都是芳族的。实例包括吲哚、异吲哚、吲唑、苯并咪唑、苯并三唑、苯并呋喃、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噁二唑、苯并噻吩、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并噻二唑、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶、1H-吡唑并[3,4-b]吡啶、3H-咪唑并[4,5-b]吡啶、3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶、1H-吡唑并[4,3-b]吡啶、1H-咪唑并[4,5-b]吡啶、1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶、1H-吡咯并[2,3-c]吡啶、1H-吡唑并[3,4-c]吡啶、3H-咪唑并[4,5-c]吡啶、3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶、1H-吡咯并[3,2-c]吡啶、1H-吡唑并[4,3-c]吡啶、1H-咪唑并[4,5-c]吡啶、1H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶、呋喃并[2,3-b]吡啶、噁唑并[5,4-b]吡啶、异噁唑并[5,4-b]吡啶、[1,2,3]噁二唑并[5,4-b]吡啶、呋喃并[3,2-b]吡啶、噁唑并[4,5-b]吡啶、异噁唑并[4,5-b]吡啶、[1,2,3]噁二唑并[4,5-b]吡啶、呋喃并[2,3-c]吡啶、噁唑并[5,4-c]吡啶、异噁唑并[5,4-c]吡啶、[1,2,3]噁二唑并[5,4-c]吡啶、呋喃并[3,2-c]吡啶、噁唑并[4,5-c]吡啶、异噁唑并[4,5-c]吡啶、[1,2,3]噁二唑并[4,5-c]吡啶、噻吩并[2,3-b]吡啶、噻唑并[5,4-b]吡啶、异噻唑并[5,4-b]吡啶、[1,2,3]噻二唑并[5,4-b]吡啶、噻吩并[3,2-b]吡啶、噻唑并[4,5-b]吡啶、异噻唑并[4,5-b]吡啶、[1,2,3]噻二唑并[4,5-b]吡啶、噻吩并[2,3-c]吡啶、噻唑并[5,4-c]吡啶、异噻唑并[5,4-c]吡啶、[1,2,3]噻二唑并[5,4-c]吡啶、噻吩并[3,2-c]吡啶、噻唑并[4,5-c]吡啶、异噻唑并[4,5-c]吡啶、[1,2,3]噻二唑并[4,5-c]吡啶、喹啉、异喹啉、噌啉、喹唑啉、喹喔啉、酞嗪、萘啶(例如，1,8-萘啶、1,7-萘啶、1,6-萘啶、1,5-萘啶、2,7-萘啶、2,6-萘啶)、咪唑并[1,2-a]吡啶、1H-吡唑并[3,4-d]噻唑、1H-吡唑并[4,3-d]噻唑和咪唑并[2,1-b]噻唑。
在其他情况下，多环杂芳基可包括与杂芳基环稠合的非芳族环(例如，环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基)，条件是多环杂芳基通过芳族环中的原子与母体结构结合。例如，4,5,6,7-四氢苯并[d]噻唑-2-基基团(其中该部分通过芳族碳原子与母体结构结合)被认为是杂芳基，而4,5,6,7-四氢苯并[d]噻唑-5-基(其中该部分通过非芳族碳原子与母体结构结合)不被认为是杂芳基。由与非芳族环稠合的杂芳基环组成的多环杂芳基的实例如下所述。
如本文所用的，术语“包括”、“含有”和“包含”以其开放的非限制性意义使用。还应理解，本文所述的本发明的方面和实施方式可包括“由(方面和实施方式)组成”和/或“基本上由(方面和实施方式)组成”。
应当理解，无论术语“约”是否明确使用，本文给出的每个量都意指实际给定值，并且还意指基于本领域普通技术人员可合理推断的该给定值的近似值，包括由于该给定值的实验和/或测量条件导致的等同值和近似值。
如本文所用，“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所用剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒。生理上可接受的载体常常是水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的非限制性实例包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文所用的，术语物质的“有效量”或“治疗有效量”至少是引起特定病症的可测量的改善或预防特定病症所需的最小浓度。本文中的有效量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及物质在个体中引发期望反应的能力等因素而变化。有效量也是其中治疗有益效果超过治疗的任何毒性或有害效果的量。关于癌症，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤的生长速率(例如，抑制肿瘤生长)或预防肿瘤生长或防止或延迟癌症中的其他不想要的细胞增殖的量。在一些实施方式中，有效量是足以延迟癌症发生的量。在一些实施方式中，有效量是足以预防或延迟复发的量。在一些实施方式中，有效量是足以降低个体复发率的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延迟、减缓并优选阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；(vii)降低肿瘤的复发率，和/或(viii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。有效量可以在一次或多次施用中施用。出于本公开的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或不与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的背景下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药剂结合，可以实现或实现期望的结果，则可以认为单一药剂以有效量给予。
“包装插页”是指通常包括在药物的商业包装中的说明书，其包含通常包括在药物的商业包装中的说明书中的关于适应症的信息，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、与包装产品组合的其他药物的信息，和/或关于使用此类药物的警告等。
本文所用术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还包括天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。通常，用于本文的蛋白质将具有至少约5-20kDa，或者至少约20-100kDa，或至少约100kDa的分子量。定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的蛋白质。
“药学上可接受的盐”是无毒的、生物学可耐受的或其它生物学上适于施用于受试者的盐形式。通常参见Berge等，(1977)J.Pharm.Sci.66,1。具体的药学上可接受的盐是药理学上有效的并且适合于与受试者的组织接触而没有过度毒性、刺激或过敏反应的那些。药学上可接受的盐包括但不限于与无机酸或有机酸形成的酸加成盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；所述有机酸如乙酸、草酸、丙酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸。这些盐可以衍生自无机酸或有机酸。药学上可接受的盐的非限制性实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、甲基磺酸盐、丙基磺酸盐、苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐和扁桃酸盐。在一些实施方式中，药学上可接受的盐当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换时；或与有机碱配位时形成。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂的盐，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、氨丁三醇、氨基丁三醇、二环己胺、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-乙基葡糖胺、N-甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂、氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)等。药学上可接受的碱加成盐的实例包括衍生自无机碱的那些，如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。在一些实施方式中，有机非毒性碱是L-氨基酸，如L-赖氨酸和L-精氨酸、氨丁三醇、N-乙基葡糖胺和N-甲基葡糖胺。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。其他合适的药学上可接受的盐的列表可见于Remington'sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985。
“溶剂化物”是通过溶剂和化合物的相互作用形成的。合适的溶剂包括例如水和醇(例如，乙醇)。溶剂化物包括具有任何化合物与水比率的水合物，如一水合物、二水合物和半水合物。
“受试者”、“患者”或“个体”包括哺乳动物，如人或其它动物，并且通常是人。在一些实施方式中，向其施用治疗剂和组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方式中，灵长类动物是猴或猿。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青年、成人和老年受试者。在一些实施方式中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物、狗、猫、农场动物(如牛或马)等。
术语“癌症”或“肿瘤”是指存在具有致癌细胞的典型特征的细胞，如不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速生长和增殖速率以及某些特征性形态学特征。癌细胞通常是实体瘤的形式，其可基于肿瘤块检测，例如通过诸如CAT扫描、MR成像、X射线、超声或触诊的程序，和/或其由于可从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达是可检测的。在一些实施方式中，实体瘤不需要具有可测量的尺寸。癌细胞也可以是液体肿瘤的形式，该癌细胞可以单独存在或在动物体内播散。如本文所用的，术语“播散性肿瘤”和“液体肿瘤”可互换使用，并且包括但不限于白血病和淋巴瘤以及其他血液细胞癌症。
术语“白血病”是指一种类型的血液或骨髓癌症，其特征在于称为“母细胞(blast)”的未成熟白细胞的异常增加。白血病是涵盖一系列疾病的广义术语。随之，它是影响血液、骨髓和淋巴系统的甚至更广泛的疾病组的一部分，这些疾病都被称为血液肿瘤。白血病可分为四种主要分类：急性淋巴细胞性(或成淋巴细胞性)白血病(ALL)、急性骨髓性(或髓系或非淋巴性)白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)。其它类型的白血病包括毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞性白血病和成人T细胞白血病。
术语“淋巴瘤”是指由淋巴细胞发展而来的一组血细胞肿瘤。淋巴瘤的两个主要类别是霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。淋巴瘤包括淋巴组织的任何赘生物。主要类别是淋巴细胞的癌症，淋巴细胞是属于淋巴和血液两者并遍布两者的一种白细胞类型。
如本文所用的，术语“癌症”包括恶变前以及恶性癌症，并且还包括原发性肿瘤(例如，其细胞没有迁移到受试者体内除了原始肿瘤部位之外的部位的那些)和继发性肿瘤(例如，由转移、肿瘤细胞迁移到与原始肿瘤部位不同的继发性部位引起的那些)、复发性癌症和难治性癌症。
术语“癌症复发(recurrence)”和“癌症再发(relapse)”可互换使用，并且是指在缓解后体征、症状或疾病的恢复。复发性癌细胞可以重新出现在原发性肿瘤的相同部位或另一个位置，例如在继发性癌症中。癌细胞可以以与原发性癌症相同的患病形式或不同的患病形式再次出现。例如，在一些实施方式中，原发性癌症是实体瘤，并且复发性癌症是液体瘤。在其他实施方式中，原发性癌症是液体瘤，并且复发性癌症是实体瘤。在其他实施方式中，原发性癌症和复发性癌症都是实体瘤，或都是液体瘤。在一些实施方式中，复发性肿瘤表达至少一种也由原发性肿瘤表达的肿瘤相关抗原。
本文所用的术语“难治性癌症”是指对治疗无反应的癌症，例如，在治疗(例如，用免疫疗法治疗)开始时具有抗性的癌症或在治疗期间可能变得具有抗性的癌症。术语“反应”、“响应”或“响应性”是指抗癌反应，例如在减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的意义上。该术语还可以指改善的预后，例如，如通过增加的复发时间(其是作为第一事件的第二原发性癌症的第一次复发检查或没有复发证据的死亡的时间段)或增加的总存活期(其是从治疗到任何原因的死亡的时间段)所反映的。响应或具有响应意味着当暴露于刺激时存在有益的终点。或者，在暴露于刺激时，负面或有害症状被最小化、减轻或减弱。应当理解，评估肿瘤或受试者将表现出有利响应的可能性等同于评估肿瘤或受试者将不表现出有利响应(即，将表现出缺乏响应或无响应)的可能性。
如本文所用的，癌症包括但不限于黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌、B细胞癌，例如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，例如，α链病、γ链病和μ链病，良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞性淀粉样变性等。适用于本发明所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、体细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆斯瘤、宫颈癌、骨癌、脑瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。在一些实施方式中，癌症本质上是上皮性的，并且包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方式中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其他实施方式中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以以各种其他方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、布伦纳或未分化的。
本文所用的术语“癌症疗法”或“癌症治疗剂”是指可发挥抗肿瘤作用或具有抗肿瘤活性的那些疗法或药剂。这种抗肿瘤作用或抗肿瘤活性可以表现为肿瘤细胞增殖速率、活力或转移活性的降低。显示抗肿瘤活性的可能方式是显示在治疗期间出现的异常细胞的生长速率下降或肿瘤大小稳定或减小。可以使用公认的体外或体内肿瘤模型评估这种活性，包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、MMTV模型和本领域已知的其他已知模型以研究抗肿瘤活性。
术语“治疗(treat)”、“处理(treating)”和“疗法(treatment)”意指包括缓解或消除病症、障碍或疾病，或与病症、障碍或疾病相关的一种或多种症状；或减轻或根除病症、障碍或疾病本身的病因。
术语“预防(prevent)”、“防止(preventing)”和“阻止(prevention)”意指包括延迟和/或阻止病症、障碍或疾病和/或其伴随症状的发作；阻止受试者获得病症、障碍或疾病；或降低受试者获得病症、障碍或疾病的风险的方法。
术语“取代的”是指特定的基团或部分带有一个或多个取代基，所述取代基包括但不限于如烷氧基、酰基、酰氧基、烷氧基羰基、羰基烷氧基、酰氨基、氨基、氨基酰基、氨基羰基氨基、氨基羰基氧、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、芳氧基、氰基、叠氮基、卤素、羟基、硝基、羧基、巯基、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、杂环基、芳烷基、氨基磺酰基、磺酰基氨基、磺酰基、氧代等的取代基。术语“未取代的”是指所指基团不带有取代基。在术语“取代的”用于描述结构体系的情况下，取代意指在体系上的任何化合价允许的位置处发生。当基团或部分带有多于一个取代基时，应理解取代基可以彼此相同或不同。在一些实施方式中，取代的基团或部分带有一至五个取代基。在一些实施方式中，取代的基团或部分带有一个取代基。在一些实施方式中，取代的基团或部分带有两个取代基。在一些实施方式中，取代的基团或部分带有三个取代基。在一些实施方式中，取代的基团或部分带有四个取代基。在一些实施方式中，取代的基团或部分带有五个取代基。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且该描述包括其中事件或情况发生的情况和其中事件或情况不发生的情况。例如，“任选取代的烷基”涵盖如本文所定义的“烷基”和“取代的烷基”两者。本领域技术人员将理解，关于含有一个或多个取代基的任何基团，此类基团不旨在引入空间上不切实际、合成上不可行和/或固有不稳定的任何取代或取代模式。还应理解，在基团或部分任选地被取代的情况下，本公开包括其中所述基团或部分被取代的实施方式和其中所述基团或部分未被取代的实施方式。
如本文所用的，术语“Q标签”是指含有谷氨酰胺残基的多肽部分，其在转谷氨酰胺酶介导的与含有-NH2胺的化合物的反应后，提供含有多肽部分的缀合物，其中谷氨酰胺残基包括经修饰以包括与化合物键合的酰胺的侧链。Q标签是本领域已知的。Q标签的非限制性实例是LLQGG(SEQ ID NO:172)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:173)、RPQGF(SEQ ID NO:47)、RPQGFPP(SEQ ID NO:48)、RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)以及在本公开内容的表16中公开的Q标签。在一些实施方式中，Q标签连接在抗体重链的C末端。在一些实施方式中，Q标签连接在抗体的轻链。在一些实施方式中，Q标签是天然存在的。例如，N297突变为N297A暴露了抗体的Q295，此处可以发生缀合(根据EU索引编号，例如，如在Edelman,G.M.等，Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)和Kabat,E.A.等，Sequences of proteins ofimmunological interest.第5版-USDepartment of Health and Human Services,NIHpublication n°91-3242,pp 662,680,689(1991)中所列的)。在一些实施方式中，Q标签在抗体的Fc结构域内。
本申请通篇，抗体和缀合物以“TNT-y”形式表示，其中“y”是数字(例如，TNT-201)或者数字和字母的组合(例如，“TNT-347xx”)。连字符仅出于风格和可及性提供，并且连字符和非连字符的名称是相同的(例如，“TNT-201”是与“TNT201”相同的构建体)。每种抗体或缀合物可以由多种组成性序列定义(例如，TNT-201至少包括CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、VL、VH、重链和轻链的序列)。
II.缀合物
为了提高靶向特异性和体内分布，可以将免疫调节寡核苷酸(例如，CpG ODN)与连接蛋白-4抗体缀合。任何连接蛋白-4抗体(例如，特异性结合至连接蛋白-4的任何抗体)均可以与本文所述的免疫调节寡核苷酸缀合。特别地，可以使用本公开内容的标题为“连接蛋白-4抗体”的章节中的连接蛋白-4抗体。可以使用本文所述的任何免疫调节寡核苷酸，包括在本公开内容的标题为“免疫调节寡核苷酸”的章节中描述的那些。使用本文所述的方法或者通过本领域公知的其他方法，包括在US 2018/0312536 A1中和描述的那些，可以将连接蛋白-4抗体与免疫调节寡核苷酸缀合，出于所有目的其内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，如本公开内容通篇所描述的，缀合物的免疫调节寡核苷酸包含式(C)、(C’)、(C”)、(D)、(D’)或(D”)中任一个的结构。在一些实施方式中，在免疫刺激寡核苷酸中CpG序列是非甲基化的。
本文提供了连接蛋白-4抗体缀合物(即，在本文中也称为与CpG ODN缀合的连接蛋白-4抗体；连接蛋白-4抗体缀合物、抗连接蛋白-4抗体缀合物或仅称为“缀合物”)，其中CpG寡核苷酸和连接蛋白-4抗体通过连接部分连接在一起。在一些实施方式中，一个连接蛋白-4抗体可以与一个或多个寡核苷酸缀合。在一些实施方式中，寡核苷酸-抗体缀合物是包含连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含至少一个谷氨酰胺残基，其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示：
或其立体异构体、两种或更多种非镜像异构体的混合物、互变异构体或两种或更多种互变异构体的混合物；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
每个Q独立地是包含至少一个谷氨酰胺残基的Q标签肽序列；
每个L独立地是键或通过与谷氨酰胺残基的酰胺键与Q连接的接头部分；和
每个P独立地是免疫调节寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述缀合物是包含连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)的缀合物，其中所述连接蛋白-4抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含氨基酸序列RPQGF(SEQ ID NO:47)，其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示，
或其立体异构体、两种或更多种非镜像异构体的混合物、互变异构体或两种或更多种互变异构体的混合物；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
每个Q独立地包含Q标签肽，所述Q标签肽包含肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或通过与谷氨酰胺残基的酰胺键与Q连接的接头部分；和
每个P独立地是免疫调节寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述缀合物是包含连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)的缀合物，其中所述连接蛋白-4抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含氨基酸序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)，其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示，
或其立体异构体、两种或更多种非镜像异构体的混合物、互变异构体或两种或更多种互变异构体的混合物；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
每个Q独立地包含Q标签肽，所述Q标签肽包含肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或通过与谷氨酰胺残基的酰胺键与Q连接的接头部分；和
每个P独立地是免疫调节寡核苷酸。
在其他实施方式中，所述缀合物是包含连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含至少一个谷氨酰胺残基，其中每个免疫调节寡核苷酸通过与Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示，
或其立体异构体、两种或更多种非镜像异构体的混合物、互变异构体或两种或更多种互变异构体的混合物；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
每个Q独立地是Q标签肽，所述Q标签肽包含至少一个谷氨酰胺残基；
每个L独立地是键或通过与谷氨酰胺残基的酰胺键与Q连接的接头部分；和
每个P独立地是选自由表4的寡核苷酸组成的组的免疫调节寡核苷酸。
在一个实施方式中，寡核苷酸连接蛋白-4抗体缀合物具有范围从约1至约20、从约1至约10、从约1至约8、从约1至约4或从约1至约2的DAR。在另一个实施方式中，寡核苷酸连接蛋白-4抗体缀合物具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8的DAR。
在一些实施方式中，缀合物包含一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个或者二十个或更多个Q标签肽。在一些实施方式中，缀合物包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或二十个Q标签肽。在一些实施方式中，缀合物具有2个Q标签肽。在一些实施方式中，缀合物包含一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个或者二十个或更多个免疫调节寡核苷酸。在一些实施方式中，缀合物包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或二十个免疫调节寡核苷酸。在一些实施方式中，缀合物具有一个免疫调节寡核苷酸。示例性缀合物显示在图9A-9D中，其可以包含本文所述的任何连接蛋白-4抗体(包含本文所述的任何VH/VL和/或本文所述的任何Fc区)、本文所述的任何接头、本文所述的任何寡核苷酸和/或本文所述的任何Q标签。
在一些实施方式中，如本文所提供的缀合物还可以通过连接蛋白-4抗体与一个或多个药剂(如一个或多个免疫调节寡核苷酸)的缀合制备，所述缀合通过抗体表面和/或其表面上暴露的氨基酸残基(如赖氨酸和/或半胱氨酸)和/或在本领域中公知的适宜化学条件下。在一些实施方式中，用能够与存在于药剂(如免疫调节寡核苷酸)或抗体上的官能团或暴露于或存在于连接蛋白-4抗体表面上的氨基酸残基结合的官能团来修饰药剂(如一个或多个免疫调节寡聚核苷酸)和/或连接蛋白-4抗体。例如，在一些实施方式中，药剂(如一个或多个免疫调节寡核苷酸)可以用能够与赖氨酸残基反应的官能团修饰，如通过酰化机制，包括但不限于N-羟基硫酰亚胺酯、异(硫)氰酸酯和苯甲酰卤化物。在其他实施方式中，药剂(如一个或多个免疫调节寡核苷酸)可以用能够与半胱氨酸残基反应的官能团修饰，如通过形成二硫键，包括但不限于马来酰亚胺、卤代乙酰胺、2-硫代吡啶和3-芳基丙腈。
II.A.免疫调节寡核苷酸
在一个方面中，在连接蛋白-4抗体寡核苷酸缀合物中寡核苷酸是免疫调节(例如，免疫刺激)寡核苷酸。在某些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包括5-修饰的尿苷或5-修饰的胞苷。在某些实施方式中，在免疫调节寡核苷酸的5’-末端(例如，在两个5’-末端核苷中)包含5-修饰的尿苷(例如，5-乙炔基-尿苷)增强了寡核苷酸的免疫调节性质。在某些实施方式中，免疫调节寡核苷酸比长度为18至28个核苷酸的典型CpG ODN短(例如，包含总共约6至约16个核苷酸或约12至约14个核苷酸)。在某些实施方式中，较短的免疫调节寡核苷酸(例如，包含总共约6至约16个核苷酸或约12至约14个核苷酸的那些)保留较长的典型CpG ODN的免疫调节活性；或者与较长的CpG ODN相比，呈现出更高的免疫调节活性(例如，通过NFkB激活或通过激活或功能的细胞表面标志物(如CD40、HLADR、CD69或CD80)的表达水平的变化或通过至少一种细胞因子(例如，IL-6或IL-10)的水平的变化来测量)。在某些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含无碱基间隔基。在某些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含核苷间磷酸三酯。
在某些实施方式中，本文提供的免疫调节寡核苷酸表现出优于主要含有核苷间磷酸酯(例如，超过50％的核苷间磷酸酯)的CpG ODN的稳定性(例如，针对核酸酶的稳定性)，而基本上不牺牲其免疫刺激活性。这种效果可以例如通过掺入至少50％(例如，至少70％)核苷间硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯或通过包含核苷间磷酸三酯和/或核苷间无碱基间隔基来实现。磷酸三酯和无碱基间隔基也便于与靶向部分缀合。相对于具有完全硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸，基于磷酸酯的磷酸三酯和无碱基间隔基也可以用于降低脱靶活性。不希望受理论束缚，这种效果可以通过减少自身递送而不破坏靶向部分介导的向靶细胞的递送来实现。因此，本文提供的寡核苷酸可包含约15个或更少、约14个或更少、约13个或更少、约12个或更少、约11个或更少，或约10个或更少的连续核苷间硫代磷酸酯。例如，包含总共约12至约16个核苷的免疫刺激寡核苷酸可含有约10个或更少的连续核苷间硫代磷酸酯。
本文提供的免疫刺激寡核苷酸可含有总共约50个或更少，约30个或更少，约28个或更少，或约16个或更少的核苷。免疫刺激寡核苷酸可含有总共至少6个、约10个或更多个、或约12个或更多个核苷。例如，免疫刺激寡核苷酸可含有总共约6至约30个、约6至约28个、约6至约20个、约6至约16个、约10至约20个、约10至约16个、约12至约28个、约12至约20个或约12至约16个核苷。
在某些实施方式中，免疫刺激寡核苷酸包含一个或多个磷酸三酯(例如，核苷间磷酸三酯)和/或硫代磷酸酯(例如，约1至约6个或约1至约4个)，例如，在一个或两个末端(例如，在六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷内)。包含一个或多个核苷间磷酸三酯和/或硫代磷酸酯可以通过降低核酸外切酶介导的降解速率来增强寡核苷酸的稳定性。
在某些实施方式中，免疫刺激寡核苷酸包含磷酸三酯或末端磷酸二酯，其中磷酸三酯或末端磷酸二酯包含与靶向部分或缀合基团和任选地与一个或多个(例如，约1至约6个)辅助部分键合的接头。在某些实施方式中，免疫刺激寡核苷酸仅包含一个接头。在某些实施方式中，免疫刺激寡核苷酸仅包含一个缀合基团。
本文提供的寡核苷酸可以是包括一条链及其部分或整个互补序列的杂交寡核苷酸。杂交寡核苷酸可具有至少6个互补碱基配对(例如，约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或约23个)，直至所包括的较短链中存在的核苷酸的总数。例如，杂交的寡核苷酸的杂交部分可以含有约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或约23个碱基对。
在一个方面中，寡核苷酸-连接蛋白-4抗体缀合物中的寡核苷酸包含一个或多个CpG位点。在一些实施方式中，寡核苷酸包含至少1个、至少2个或至少3个CpG位点。在一些实施方式中，寡核苷酸是反义寡核苷酸。如本文所用的，“修饰的核苷酸”是除核糖核苷酸(2’-羟基核苷酸)以外的核苷酸。在一些实施方式中，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的核苷酸是修饰的核苷酸。如本文所用的，修饰的核苷酸包括但不限于脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱碱基核苷酸、2’-修饰的核苷酸、3’至3’连接(反向)核苷酸、包含非天然碱基的核苷酸、桥连核苷酸、肽核酸(PNA)、2’,3’-开环核苷酸模拟物(解锁核碱基类似物)、锁定核苷酸、3’-O-甲氧基(2’核苷间连接的)核苷酸、2’-F-阿拉伯糖核苷酸、5’-Me、2’-氟代核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、含有乙烯基膦酸酯的核苷酸和含有环丙基膦酸酯的核苷酸(cPrpN)。2’-修饰的核苷酸(即在五元糖环的2’位处具有除羟基以外的基团的核苷酸)包括但不限于2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧-2’-卤代核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-甲氧基乙基(2’-O-2-甲氧基乙基)核苷酸、2’-氨基核苷酸、2’-氨基烷基核苷酸和2’-烷基核苷酸。在一些实施方式中，修饰的核苷酸选自5-溴-2’-O-甲基尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基尿苷、2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基胸苷、2’-O-甲基胞苷、2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷和8-氧代-7,8-二氢-2’-脱氧鸟苷。给定化合物中的所有位置不必均一地修饰。相反，可以在单个寡核苷酸中或甚至在其单个核苷酸中掺入多于一种修饰。寡核苷酸可以通过本领域已知的方法合成和/或修饰。一个核苷酸处的修饰独立于另一个核苷酸处的修饰。
修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，例如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(例如，2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-烷基(例如，6-甲基、6-乙基、6-异丙基或6-正丁基)衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-烷基(例如，2-甲基、2-乙基、2-异丙基或2-正丁基)和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶(例如，5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶)、胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基、8-氧代和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(例如，5-溴和5-碘)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
在一些实施方式中，寡核苷酸的一个或多个核苷酸通过非标准键或骨架(例如，修饰的核苷间键或修饰的骨架)连接。在一些实施方式中，修饰的核苷间键是非含磷酸酯的共价核苷间键。修饰的核苷间键或骨架包括但不限于5’-硫代磷酸酯基团、手性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如，甲基膦酸酯或3’-亚烷基膦酸酯)、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(例如，3’-氨基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯)、硫代烷基-膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、吗啉代键、具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯的2’-5’连接类似物或具有相反极性的硼烷磷酸酯，其中相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接。在一些实施方式中，修饰的核苷间键或骨架缺乏磷原子。缺少磷原子的修饰的核苷间键包括但不限于短链烷基或环烷基糖间键、混合杂原子和烷基或环烷基糖间键，或一个或多个短链杂原子或杂环糖间键。在一些实施方式中，修饰的核苷间骨架包括但不限于硅氧烷骨架、硫化物骨架、亚砜骨架、砜骨架、甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架、亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架、含烯烃的骨架、氨基磺酸酯骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架、磺酸酯和磺酰胺骨架、酰胺骨架和具有混合的N、O、S和CH2组分的其他骨架。
在一些实施方式中，寡核苷酸包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，寡核苷酸包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个二硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个二硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，硫代磷酸酯核苷间键或二硫代磷酸酯核苷间键位于从寡核苷酸的5’端的1-3、2-4、3-5、4-6、4-5、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19、18-20或19-21位的核苷酸之间。在一些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸和一个或多个修饰的核苷间键。
在一些实施方式中，寡核苷酸包含末端帽。在一些实施方式中，末端帽位于寡核苷酸的3’端。在一些实施方式中，末端帽位于寡核苷酸的5’端。在一些实施方式中，末端帽位于寡核苷酸的5’端和3’端。术语“末端帽”也可称为“帽”，并且具有本领域中普遍接受的含义。例如，术语是指可以是化学修饰的核苷酸或非核苷酸的部分，其可以在本发明的一个或多个核酸分子的一个或多个末端掺入。这些末端修饰可以保护核酸分子免受核酸外切酶降解，并且可以帮助在细胞内递送和/或定位。在非限制性实例中，帽包括但不限于聚合物；配体；锁核酸(LNA)；甘油基；无碱基核糖残基；反向脱氧无碱基残基；反向核苷酸；4’,5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；5’-巯基部分；4’-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1,5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3’,4’-开环核苷酸；无环3,4-二羟基丁基核苷酸；无环3,5-二羟基戊基核苷酸；3’-3’-反向核苷酸部分；3’-3’-反向脱碱基部分；3’-2’-反向核苷酸部分；3’-2’-反向脱碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；3’-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3’-磷酸酯；3’-硫代磷酸酯；5’-5’-反向核苷酸部分；5’-5’-反向脱碱基部分；5’-氨基磷酸酯；5’-硫代磷酸酯；1,4-丁二醇磷酸酯；5’-氨基；桥接和/或非桥接5’-氨基磷酸酯；硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯；或桥接或非桥接甲基膦酸酯部分。在一些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个末端帽分子。在一些实施方式中，[N]是3’末端帽。在一些实施方式中，3’末端帽是O-(3-羟丙基)硫代磷酸酯。
在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为约10-30、约10-15、约15-20、约20-25、约25-30、约15-25个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为约18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
在另一个方面中，缀合物的寡核苷酸是：
其中
b和c各自独立地是从1至25的整数；条件是b和c的总和至少是5；
表示免疫调节寡核苷酸P与缀合物其余部分的连接点；
X5’是5’末端核苷，其包含结构
X3’是3’末端核苷，其包含结构
YPTE是核苷间磷酸三酯，其包含结构其中*表示与寡核苷酸其余部分的连接点和/>表示与所述接头L的连接点，或者，如果L不存在，则/>表示通过酰胺键与Q标签肽Q在谷氨酰胺残基处的连接点；/>
Y3’是末端磷酸三酯，其包含结构
每个XN独立地是核苷，其包含结构
每个YN独立地是核苷间接头，其包含结构
其中每个BN独立地是修饰的或未经修饰的核碱基；
每个RN独立地是-H或-O-C1-4-烷基，其中-O-C1-4-烷基的C1-4-烷基任选地进一步被-O-C1-4-烷基取代；
B5’和B3’独立地是修饰的或未经修饰的核碱基；
R5’和R3’独立地是-H或-O-C1-4-烷基，其中-O-C1-4-烷基的C1-4-烷基任选地进一步被-O-C1-4-烷基取代；
每个T1独立地是O或S；
每个T2独立地是O-或S-；和
T3是包含寡乙二醇部分的基团；和
R1是C1-4-亚烷基-羟基。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含具有修饰的核碱基的核苷酸。在一些实施方式中，B5’是修饰的核碱基。在其他实施方式中，B3’是修饰的核碱基。在一些实施方式中，B5’是未经修饰的核碱基。在其他实施方式中，B3’是未经修饰的核碱基。在又一个其他实施方式中，至少一个BN是修饰的核碱基。
在某些实施方式中，b是约1至约15的整数。在某些实施方式中，b是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15的整数。在某些实施方式中，b为约3、约4、约11或约14的整数。在某些实施方式中，b为约3的整数。在某些实施方式中，b为约4的整数。在某些实施方式中，b为约11的整数。在某些实施方式中，b为约14的整数。
在某些实施方式中，c是约0至约10的整数。在某些实施方式中，c为约0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的整数。在某些实施方式中，c是约0或约8的整数。在某些实施方式中，c是约0的整数。在某些实施方式中，c为约8的整数。
在某些实施方式中，b是约3的整数，且c是约8的整数。在某些实施方式中，b是约4的整数，且c是约8的整数。在某些实施方式中，b是约11的整数，且c是约0的整数。在某些实施方式中，b是约14的整数，且c是约0的整数。
在某些实施方式中，b和c一起总计在约5至约20的范围内。在某些实施方式中，b和c一起总计在约5至约15的范围内。在某些实施方式中，b和c一起总计为约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在某些实施方式中，b和c一起总计为约8、约9、约10、约11、约12、约13或约14。在某些实施方式中，b和c一起总计为约11。在某些实施方式中，b和c一起总计为约12。在某些实施方式中，b和c一起总计为约14。
在某些实施方式中，每个XN独立地是2’-脱氧核糖核苷或2’-修饰的核糖核苷。在某些实施方式中，每个XN独立地是2’-脱氧腺苷(A)、2’-脱氧鸟苷(G)、2’-脱氧胞苷(C)、5-卤代-2’-脱氧胞苷、2’-脱氧胸苷(T)、2’-脱氧尿苷(U)、5-卤代-2’-脱氧尿苷、2’-氟核糖核苷、2’-甲氧基核糖核苷或2’-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷。在某些实施方式中，每个XN独立地是2’-脱氧核糖核苷。在某些实施方式中，每个XN独立地是2’-脱氧腺苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧胞苷、5-卤代-2’-脱氧胞苷、2’-脱氧胸苷、2’-脱氧尿苷或5-卤代-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，每个XN独立地为2’-脱氧腺苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧胞苷、2’-脱氧胸苷、5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。
在某些实施方式中，X3’是2’-脱氧核糖核苷或2’-修饰的核糖核苷。在某些实施方式中，X3’是2’-脱氧核糖核苷。在某些实施方式中，X3’是2’-脱氧腺苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧胞苷、5-卤代-2’-脱氧胞苷、2’-脱氧胸苷、2’-脱氧尿苷、5-卤代-2’-脱氧尿苷、2’-氟核糖核苷、2’-甲氧基核糖核苷或2’-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷。在某些实施方式中，X3’是2’-脱氧腺苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧胞苷、5-卤代-2’-脱氧胞苷、2’-脱氧胸苷、2’-脱氧尿苷或5-卤代-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X3’是2’-脱氧胸苷。在某些实施方式中，X3’是具有取代的嘧啶碱基的2’-脱氧核糖核苷。在某些实施方式中，X3’是具有5-取代嘧啶碱基的2’-脱氧核糖核苷。在某些实施方式中，X3’是2’-脱氧胸苷、5-卤代-2’-脱氧胞苷或5-卤代-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X3’是2’-脱氧胸苷、5-溴-2’-脱氧胞苷、5-碘-2’-脱氧胞苷、5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X3’是2’-脱氧胸苷、5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X3’是包含3’加帽基团的末端核苷酸。在某些实施方式中，3’加帽基团是末端磷酸酯。在某些实施方式中，3’加帽基团是3-羟基-丙基磷酰基(即，-P(O)2-OCH2CH2CH2OH)。
在某些实施方式中，X5’是2’-脱氧核糖核苷或2’-修饰的核糖核苷。在某些实施方式中，X5’是2’-脱氧核糖核苷。在某些实施方式中，X5’是2’-脱氧腺苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧胞苷、5-卤代-2’-脱氧胞苷、2’-脱氧胸苷、2’-脱氧尿苷、5-卤代-2’-脱氧尿苷、2’-氟核糖核苷、2’-甲氧基核糖核苷或2’-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷。在某些实施方式中，X5’是2’-脱氧腺苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧胞苷、5-卤代-2’-脱氧胞苷、2’-脱氧胸苷、2’-脱氧尿苷或5-卤代-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X5’是具有取代的嘧啶碱基的2’-脱氧核糖核苷。在某些实施方式中，X5’是具有5-取代嘧啶碱基的2’-脱氧核糖核苷。在某些实施方式中，X5’是2’-脱氧胸苷、5-卤代-2’-脱氧胞苷或5-卤代-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X5’是5-卤代-2’-脱氧胞苷。在一些实施方式中，X5’是2’-脱氧尿苷、5-卤代-2’-脱氧尿苷、2’-甲氧基尿苷或5-卤代-2’-甲氧基尿苷。在某些实施方式中，X5’是5-卤代-2’-脱氧尿苷。在某些其他实施方式中，X5’是2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X5’是5-卤代-2’-甲氧基尿苷。在某些其他实施方式中，X5’是2’-甲氧基尿苷。在某些实施方式中，X5’是2’-脱氧胸苷、5-溴-2’-脱氧胞苷、5-碘-2’-脱氧胞苷、5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X5’是2’-脱氧胸苷、5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X5’是5-溴-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X5’是5-碘-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，X5’具有3’-硫代磷酸酯基团。在某些实施方式中，X5’具有手性为Rp的3’-硫代磷酸酯基团。在某些实施方式中，X5’具有手性为Sp的3’-硫代磷酸酯基团。
在某些实施方式中，YPTE是核苷间硫代磷酸三酯。在一些实施方式中，YPTE是 其中Z是O或S；d是范围从约0至约50的整数；在结构右侧的两个/>表示与寡核苷酸P的连接点；和在结构左侧的/>表示与缀合物其余部分的连接点。在某些实施方式中，Z是O。在某些实施方式中，Z是S。在某些实施方式中，d是范围从约0至约10的整数。在某些实施方式中，d是范围从约0至约5的整数。在某些实施方式中，d是约0、约1、约2、约3、约4或约5的整数。在某些实施方式中，d是约0、约1或约3的整数。
在一些实施方式中，YPTE是其中Z是O或S；d是范围从约0至约50的整数；在结构右侧的两个/>表示与寡核苷酸P的连接点；和在结构左侧的/>表示与缀合物其余部分的连接点。在某些实施方式中，Z是O。在某些实施方式中，Z是S。在某些实施方式中，d是范围从约0至约10的整数。在某些实施方式中，d是范围从约0至约5的整数。在某些实施方式中，d是约0、约1、约2、约3、约4或约5的整数。在某些实施方式中，d是约0、约1或约3的整数。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个另外的核苷间磷酸三酯。在一个实施方式中，另外的核苷间磷酸三酯是C1-6烷基磷酸三酯。在另一个实施方式中，另外的核苷间磷酸三酯是乙基磷酸三酯。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个5-卤代-2’-脱氧尿苷。在一个实施方式中，5-卤代-2’-脱氧尿苷是5-氟-2’-脱氧尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。在另一个实施方式中，5-卤代-2’-脱氧尿苷是5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。在又一个实施方式中，5-卤代-2’-脱氧尿苷是5-氟-2’-脱氧尿苷。在另一个实施方式中，5-卤代-2’-脱氧尿苷是5-溴-2’-脱氧尿苷。在另一个实施方式中，5-卤代-2’-脱氧尿苷是5-碘-2’-脱氧尿苷。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含三个或更多个2’-脱氧胞苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含三个2’-脱氧胞苷。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含四个或更多个2’-脱氧鸟苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含四个2’-脱氧鸟苷。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含三个2’-脱氧胞苷和四个2’-脱氧鸟苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个、两个或三个CG二核苷酸。在某些实施方式中，寡核苷酸包含三个CG二核苷酸。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含三个或更多个2’-脱氧胸苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含三个、四个、五个、六个、七个或八个2’-脱氧胸苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含三个、四个、五个或八个2’-脱氧胸苷。
在某些实施方式中，寡核苷酸不包含2’-脱氧腺苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或两个2’-脱氧腺苷。
在某些实施方式中，寡核苷酸的长度范围为约5至约20或约6至约15。在某些实施方式中，寡核苷酸具有约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15的长度。在某些实施方式中，寡核苷酸具有约10、约11、约12、约13、约14或约15的长度。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方式中，寡核苷酸中的所有核苷间磷酸酯是核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个手性核苷间硫代磷酸酯。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含序列N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)，或其立体异构体、两种或更多种非镜像异构体的混合物、互变异构体、或两种或更多种互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，如例如WO2018/189382A1中所述的。
在一个实施方式中，寡核苷酸包含序列N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)，或其立体异构体、两种或更多种非镜像异构体的混合物、互变异构体或两种或更多种互变异构体的混合物；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；其中：
x是约1至约4的整数；
N1不存在或是2’-脱氧胸苷；
N2是具有修饰的核碱基的2’-脱氧核糖核苷酸；
N3是2’-脱氧腺苷或2’-脱氧胸苷，各自任选地包含3’-磷酸三酯；
N4是2’-脱氧腺苷或2’-脱氧胸苷；
N5是2’-脱氧胸苷，任选地包含3’-磷酸三酯；和
C是2’-脱氧胞苷，以及G是2’-脱氧鸟苷。
在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，x是约1、约2、约3或约4的整数。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，x是约1的整数。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，x是约4的整数。
在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N1不存在。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N1是2’-脱氧胸苷。
在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N2是具有取代的嘧啶碱基的2’-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ IDNO:174)中，N2是具有5-取代的嘧啶碱基的2’-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N2是5-卤代-2’-脱氧胞苷或5-卤代-2’-脱氧尿苷。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N2是5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。
在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N3是包含3’-磷酸三酯的2’-脱氧腺苷。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N3是2’-脱氧胸苷。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N3是包含3’-磷酸三酯的2’-脱氧胸苷。
在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N4是2’-脱氧腺苷。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N4是2’-脱氧胸苷。
在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N5是2’-脱氧胸苷。在某些实施方式中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)中，N5是包含3’-磷酸三酯的2’-脱氧胸苷。
在某些实施方式中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)的寡核苷酸包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在某些实施方式中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)的寡核苷酸包含至少一个手性核苷间硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在某些实施方式中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)的寡核苷酸包含至少一个手性二硫代磷酸酯。在某些实施方式中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:174)的寡核苷酸是如例如WO2018/189382A1中所述的寡核苷酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸是免疫刺激寡核苷酸。在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸用作PAMS。在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸通过触发TLR9信号传导来激活先天性免疫应答或刺激适应性免疫应答。在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸是TLR9激动剂。
在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸是CpG寡核苷酸，其包含修饰，包括5-卤代尿苷或5-炔基尿苷或其截短形式(例如，包含总共约6至约16个核苷的那些)。在某些实施方式中，本文提供的截短的寡核苷酸包含截短的寡核苷酸序列，从其消除一个或多个3’-末端核苷酸被或切除一个或多个序列内核苷酸。
在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸包含至少一个免疫刺激序列(ISS)。在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸包含约1、约2、约3或约4个ISS。免疫刺激寡核苷酸中的ISS取决于靶向的生物体。本文提供的寡核苷酸中使用的ISS的共同特征是胞苷-p-鸟苷序列，其中p是核苷间磷酸二酯(例如磷酸酯或硫代磷酸酯)或核苷间磷酸三酯。在某些实施方式中，ISS中的胞苷和鸟苷各自独立地包含2’-脱氧核糖。在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸包含约1、约2或约3个人ISS。在某些实施方式中，人ISS是CG或NCG，其中N是尿苷、胞苷或胸苷，或修饰的尿苷或胞苷；并且G是鸟苷或修饰的鸟苷。在某些实施方式中，修饰的尿苷或胞苷为5-卤代尿苷(例如，5-碘尿苷或5-溴尿苷)、5-炔基尿苷(例如，5-乙炔基尿苷或5-丙炔基尿苷)、5-杂芳基尿苷或5-卤代胞苷。在某些实施方式中，修饰的鸟苷是7-脱氮鸟苷。在某些实施方式中，人ISS是NCG，在一个实施方式中，N是5-卤代尿苷。在某些实施方式中，人ISS是UCG，在一个实施方式中，U是5-炔基尿苷，并且在另一个实施方式中，U是5-乙炔基尿苷。在某些实施方式中，本文提供的靶向人的寡核苷酸在包括5’-末端核苷酸的四个连续核苷酸内包含ISS。在某些实施方式中，本文提供的靶向人的寡核苷酸包含5’-末端ISS。在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸包含鼠ISS。在某些实施方式中，鼠ISS是六聚体核苷酸序列：Pu-Pu-CG-Py-Py(SEQ ID NO:498)，其中每个Pu独立地是嘌呤核苷酸，并且每个Py独立地是嘧啶核苷酸。
在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸中相对于CpG的5’-侧翼核苷酸不含2’-烷氧基核糖。在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸中相对于CpG的5’-侧翼核苷酸仅包含2’-脱氧核糖作为糖。
在某些实施方式中，本文提供的寡核苷酸具有(1)高含量的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯(例如，至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的核苷可以通过硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接)；(2)不存在聚-G尾；(3)寡核苷酸中的核苷包含2’-脱氧核糖或2’-修饰的核糖(例如2’-卤代(例如2’-氟代、2’-溴代或2’-碘代)或任选取代的2’-烷氧基(例如2’-甲氧基))；和/或(4)包含是NCG的5’-末端ISS，其中N是尿苷、胞苷，或胸苷，或修饰的尿苷或胞苷，且G是鸟苷或修饰的鸟苷。
在某些实施方式中，寡核苷酸通过减少TLR9信号传导的激活(例如，通过TLR9拮抗作用)来抑制适应性免疫应答。在某些实施方式中，本文提供的免疫抑制寡核苷酸包含至少两个2’-烷氧基核苷酸，其相对于CpG处于5’-侧翼，如通过式N1-N2-CG所述，其中N1和N2各自独立地为含有2’-烷氧基核糖(例如2’-甲氧基核糖)的核苷酸。在一些实施方式中，免疫抑制寡核苷酸是甲基化的。
在一些实施方式中，寡核苷酸包含以下结构：
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是O-或S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
U5’是-H或卤素；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基；
R1是C1-4-亚烷基-羟基；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数。
在其他实施方式中，寡核苷酸包含以下结构：
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是O-或S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基；
R1是C1-4-亚烷基-羟基；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数。
在又一个其他实施方式中，寡核苷酸包含以下结构：
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是O-或S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基；
R1是C1-4-亚烷基-羟基；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数。
在一些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个与表1所示序列相差0、1、2或3个核碱基的未经修饰序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个与表2所示序列相差0、1、2或3个核碱基的修饰的序列。
表1：未经修饰的寡核苷酸
表2：修饰的寡核苷酸
/>
/>
*u：5-溴-2’-脱氧尿苷
g：8-氧代-7,8-二氢-2’-脱氧鸟苷
u：5-溴2’-OMe尿苷
c：2’-OMe-胞苷
t：2’-OMe-胸苷
u：2’-OMe-尿苷
u：2’-脱氧尿苷
T：2’-OMOE胸苷
ts：胸苷后的磷酸三酯接头-PEG24-NH2
ts：胸苷后的磷酸三酯接头；
小写：2’-脱氧核苷酸
s：硫代磷酸酯键
s2：二硫代磷酸酯键
c3：
s2-c3：
在一些实施方式中，寡核苷酸用化学标签官能化以连接到连接部分。在一些实施方式中，化学标签连接至寡核苷酸的核苷间键。在一些实施方式中，化学标签连接至5’核苷间键。在一些实施方式中，化学标签连接至3’核苷间键。在一些实施方式中，核苷间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，核苷间键是二硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，化学标签相比于寡核苷酸的3’端更靠近其5’端。在一些实施方式中，化学标签与核碱基连接。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(C)的结构，
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
U5’是-H或卤素；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，任选地其中Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的至少一个是氧代，和其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基或2-甲氧基乙氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在本方面的一些实施方式中，U5’是–H。在其他实施方式中，U5’是卤素。在某些实施方式中，U5’是碘或溴。在本方面的一些实施方式中，式(C)的免疫调节寡核苷酸是式(C’)的免疫调节寡核苷酸。在本方面的其他实施方式中，式(C)的免疫调节寡核苷酸是式(C”)的免疫调节寡核苷酸。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(C’)的结构，
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，任选地其中Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的至少一个是氧代，和其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基或2-甲氧基乙氧基；
R1 is-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(C”)的结构，
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，任选地其中Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的至少一个是氧代，和其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基或2-甲氧基乙氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(C’)的结构，
其中：
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(C”)的结构，
其中：
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在本方面的一些实施方式中，Z是S。在其他实施方式中，寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。在某些实施方式中，寡核苷酸包含至少两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。偕位T1和T2的对(其中T1是S和T2是S-)也可以描述为二硫代磷酸酯键。
应当意识到的是，在一些情况下，其中寡核苷酸具有至少一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-，一个或多个二硫代磷酸酯键可以根据键所处的寡核苷酸内的位置来进一步描述。键的位置可以表征为，例如，在两个核苷残基之间，例如，从寡核苷酸的5’端开始计数的第一和第二核苷残基(或核苷残基1和2之间)之间。或者，键的位置可以描述为位于给定核苷残基的3’-位置，例如，紧接在指定核苷残基之后的核苷间接头上或3’-末端残基的3’-位置。
在其中寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)且其中n是0的一些实施方式中，至少一个二硫代磷酸酯键在核苷残基1和2之间、核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间、核苷残基10和11之间或者核苷残基11和12之间。在其中寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)且其中n是0的一些实施方式中，至少一个二硫代磷酸酯键位于核苷残基1、核苷残基2、核苷残基3、核苷残基5、核苷残基6、核苷残基7、核苷残基8、核苷残基9、核苷残基10、核苷残基11、核苷残基12或核苷残基13的3’位置处。
在其中寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)且其中n是1的一些实施方式中，至少一个二硫代磷酸酯键在核苷残基1和2之间、核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间、核苷残基10和11之间、核苷残基11和12之间或者核苷残基12和13之间。在其中寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)且其中n是0的一些实施方式中，至少一个二硫代磷酸酯键位于核苷残基1、核苷残基2、核苷残基3、核苷残基5、核苷残基6、核苷残基7、核苷残基8、核苷残基9、核苷残基10、核苷残基11、核苷残基12、核苷残基13或核苷残基14的3’位置处。
在其中寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)且其中n是1的一些实施方式中，至少一个二硫代磷酸酯键在核苷残基1和2之间、核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间、核苷残基10和11之间、核苷残基11和12之间或者核苷残基12和13之间。在其中寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)且其中n是1的一些实施方式中，至少一个二硫代磷酸酯键位于核苷残基1、核苷残基2、核苷残基3、核苷残基5、核苷残基6、核苷残基7、核苷残基8、核苷残基9、核苷残基10、核苷残基11、核苷残基12、核苷残基13或核苷残基14的3’位置处。
在其中寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)且其中n是2的一些实施方式中，至少一个二硫代磷酸酯键在核苷残基1和2之间、核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间、核苷残基10和11之间、核苷残基11和12之间、核苷残基12和13之间或者核苷残基13和14之间。在其中寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)且其中n是2的一些实施方式中，至少一个二硫代磷酸酯键位于核苷残基1、核苷残基2、核苷残基3、核苷残基5、核苷残基6、核苷残基7、核苷残基8、核苷残基9、核苷残基10、核苷残基11、核苷残基12、核苷残基13、核苷残基14或残基15的3’位置处。
在其中寡核苷酸具有至少两个硫代磷酸酯键或包含至少两对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S-)的又一个其他实施方式中，可以指定一个或两个硫代磷酸酯键或T1和T2对的位置。应当意识到的是，一个或两个硫代磷酸酯键的位置可以独立地变化。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(C’)的结构，
其中：
或/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(C”)的结构，
其中：
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在本方面的一些实施方式中，Z是S。在其他实施方式中，寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。在某些实施方式中，寡核苷酸包含至少两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(C)的结构，
其中和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
条件是寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，
T3是基团其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
U5’是-H或卤素；
R5’是-H；
Rc1是-H；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-甲基；和
n是1，
或其药学上可接受的盐。
在前述任意的一些实施方式中，其中T1是S和T2是S的至少一对偕位T1和T2在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。在前述的另外其他实施方式中，寡核苷酸包含至少两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，并且其中至少两对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S)在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。
在一些实施方式中，寡核苷酸包含一对或两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，并且其中一对或两对偕位T1和T2在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，并且其中该对偕位T1和T2在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。在某些其他实施方式中，寡核苷酸包含两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，并且其中两对偕位T1和T2(其中T1是S和T2是S)在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。
在一些实施方式中，R5’是H。在其他实施方式中，R5’是甲氧基。在一些实施方式中，Rc1是H。在另外其他实施方式中，Rc1是甲氧基。在另外进一步的实施方式中，R2是甲基。在又一个其他实施方式中，R2是H。在又一个其他附加的实施方式中，其可以与任何前述实施方式组合，T3是在又一个其他个实施方式中，T3是在某些实施方式中，m是从20至25的整数。
在另一个方面中，式(C)的免疫调节寡核苷酸是选自由表3和表4的寡核苷酸组成的组的寡核苷酸，或其药学上可接受的盐。在又一个其他实施方式中，式(C)的免疫调节寡核苷酸是选自由表4的寡核苷酸组成的组的寡核苷酸，或其药学上可接受的盐。
表3：修饰的寡核苷酸结构(具有PEG3NH2)
/>
/>
表4：修饰的寡核苷酸结构(具有PEG3NH2)
/>
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/>
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/>
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/>
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在一些实施方式中，式(C)的免疫调节寡核苷酸可用作用于制备包含通过Q标签连接的连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和一个或多个式(C)的免疫调节寡核苷酸的缀合物的前体，如本文所述的式(A)的结构中所示。
在一些实施方式中，式(C)的免疫调节寡核苷酸可以被修饰以将接头部分L与式(C)中的末端基团T3连接，以提供式(D)的免疫调节寡核苷酸。在另外另一个方面中，免疫调节寡核苷酸包含式(D)的结构，
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
L是基团其中m是从0至50的整数(如约0至约10、约0至约30、约10至约30、约20至约30及其间范围内的值)，并且其中/>表示通过T3与寡核苷酸的其余部分的连接点；
Z是O或S；
U5’是-H或卤素；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，任选地其中Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的至少一个是氧代，和其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基或2-甲氧基乙氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在本方面的一些实施方式中，U5’是–H。在其他实施方式中，U5’是卤素。在某些实施方式中，U5’是碘或溴。在本方面的一些实施方式中，式(D)的免疫调节寡核苷酸是式(D’)的免疫调节寡核苷酸。在本方面的其他实施方式中，式(D)的免疫调节寡核苷酸是式(D”)的免疫调节寡核苷酸。
在本方面的一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(D’)的结构，
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
L是基团其中m是从0至50的整数(如约0至约10、约0至约30、约10至约30、约20至约30和其间范围内的值)，并且其中/>表示通过T3与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，任选地其中Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的至少一个是氧代，和其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基或2-甲氧基乙氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在本方面的其他实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(D”)的结构，
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；/>
L是基团其中m是从0至50的整数(如约0至约10、约0至约30、约10至约30、约20至约30和其间范围内的值)，并且其中/>表示通过T3与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H或氧代，任选地其中Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的至少一个是氧代，和其中如果Rg1、Rg2、Rg3和Rg4中的一个是氧代，则氧代所连接的碳在7位处与环氮具有单键；
R3’是甲氧基或2-甲氧基乙氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在本方面的一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(D’)的结构，
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
L是基团其中m是从0至50的整数(如约0至约10、约0至约30、约10至约30、约20至约30和其间范围内的值)，并且其中/>表示通过T3与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在本方面的另外其他实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含式(D”)的结构，
其中
和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
L是基团其中m是从0至50的整数(如约0至约10、约0至约30、约10至约30、约20至约30和其间范围内的值)，并且其中/>表示通过T3与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数，
或其药学上可接受的盐。
在本方面的一些实施方式中，Z是S。在其他实施方式中，寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。在某些实施方式中，寡核苷酸包含至少两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。
在本方面的另外再另一个实施方式中，寡核苷酸包含式(D)的结构，
其中和/>表示寡核苷酸内的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
条件是寡核苷酸包含至少一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，
T3是基团其中/>表示与L的连接点和其中/>表示与寡核苷酸其余部分的连接点；
L是基团其中m是从0至50的整数(如约0至约10、约0至约30、约10至约30、约20至约30和其间范围内的值)，并且其中/>表示通过T3与寡核苷酸其余部分的连接点；
Z是O或S；
U5’是-H或卤素；
R5’是-H；
Rc1是-H；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-甲基；和
n是1，
或其药学上可接受的盐。
在前述任意的一些实施方式中，其中T1是S和T2是S的至少一对偕位T1和T2在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。在前述的另外其他实施方式中，寡核苷酸包含至少两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，并且其中T1是S和T2是S的至少两对偕位T1和T2在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。
在一些实施方式中，寡核苷酸包含一对或两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，并且其中一对或两对偕位T1和T2在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，并且其中该对偕位T1和T2在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。在某些其他实施方式中，寡核苷酸包含两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S，并且其中T1是S和T2是S的该两对偕位T1和T2在核苷残基2和3之间、核苷残基3和4之间、核苷残基5和6之间、核苷残基6和7之间、核苷残基7和8之间、核苷残基8和9之间、核苷残基9和10之间或者核苷残基10和11之间。
在一些实施方式中，R5’是H。在其他实施方式中，R5’是甲氧基。在一些实施方式中，Rc1是H。在另外其他实施方式中，Rc1是甲氧基。在另外进一步的实施方式中，R2是甲基。在又一个其他个实施方式中，R2是H。在另外其他额外的实施方式中，其可以与前述实施方式的任一者组合，T3是在又一个其他个实施方式中，T3是在某些实施方式中，m是从20至25的整数(如20、21、22、23、24和25的任一个)。
在另一个方面中，式(D)的免疫调节寡核苷酸是选自由表5和表6的寡核苷酸组成的组的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。在本方面的另外进一步的实施方式中，式(D)的寡核苷酸是选自由表6的寡核苷酸组成的组的寡核苷酸。
表5：修饰的寡核苷酸结构(具有-PEG3NHCOPEG24NH2)
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表6：修饰的寡核苷酸结构(具有-PEG3NHCOPEG24NH2)
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与式(C)的寡核苷酸相同，式(D)的免疫调节寡核苷酸可用作制备包含通过Q标签连接的连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和式(D)的一个或多个免疫调节寡核苷酸的缀合物的前体，如本文所描述的式(A)的结构中所示。
如本文所描述的式(C)和(D)的免疫调节寡核苷酸可以根据本领域公知的方法制备。用于制备免疫调节寡核苷酸(包括本发明中所提供的那些)的通用方法描述在本公开内容的题目为“通用寡核苷酸合成”的章节中。
II.B.连接部分
在另一个方面中，寡核苷酸通过连接部分缀合至连接蛋白-4抗体。连接部分的长度、刚性和化学组成影响缀合反应速率和所得缀合物的稳定性。在一些实施方式中，缀合部分包含聚乙二醇(PEG)。在一些实施方式中，PEG包含约10-50个聚乙二醇单元。在一些实施方式中，连接部分是脂族链。
对于式(A)，连接部分由L表示。在一些实施方式中，接头L包含寡乙二醇或聚乙二醇部分。在某些实施方式中，接头L是包含结构的基团，其中/>表示与YPTE的连接点，并且/>表示与缀合物其余部分的连接点。
在其他实施方式中，接头L是包含结构的基团，其中表示与YPTE的连接点，并且/>表示与缀合物其余部分的连接点。在一些实施方式中，L1不存在。在一些实施方式中，L1是未取代的烷基。在一些实施方式中，L1独立地是未取代的C1-6烷基。在一些实施方式中，每个L1是甲基或乙基。在一些实施方式中，L1独立地是取代的烷基。在一些实施方式中，L1独立地是取代的C1-6烷基。在一些实施方式中，L1是被一个或多个选自以下的取代基取代的C1-6烷基：烷氧基、酰基、酰氧基、烷氧羰基、羰基烷氧基、酰氨基、氨基、氨基酰基、氨基羰基氨基、氨基羰基氧基、环烷基、环烯基、氰基、叠氮基、卤素、羟基、硝基、羧基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、杂环基、氨基磺酰基、磺酰基氨基、磺酰基和氧代。
在一些实施方式中，L2不存在。在一些实施方式中，L2是未取代的或取代的烷基。
在一些实施方式中，L3不存在。在一些实施方式中，L3是接头部分。在一些实施方式中，接头部分是未取代的或取代的烷基。在一些实施方式中，接头部分独立地是未取代的C1-6烷基。在一些实施方式中，接头部分是甲基或乙基。在一些实施方式中，接头部分独立地是取代的烷基。在一些实施方式中，接头部分独立地是取代的C1-6烷基。在一些实施方式中，接头部分是被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代的C1-6烷基：烷氧基、酰基、酰氧基、烷氧羰基、羰基烷氧基，酰氨基、氨基、氨基酰基、氨基羰基氨基、氨基羰基氧基、环烷基、环烯基、氰基、叠氮基、卤素、羟基、硝基、羧基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、杂环基、氨基磺酰基、磺酰基氨基、磺酰基和氧代。在一些实施方式中，接头部分是氨基酸残基。在一些实施方式中，氨基酸选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸。在一些实施方式中，接头是甲基。在一些实施方式中，接头部分是-R5C(O)R6NHR7-，其中R5和R7独立地是不存在的或者未取代的或取代的烷基，并且R6是氨基酸残基。在一些实施方式中，氨基酸选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸。在一些实施方式中，接头部分是-R3C(O)NHR4-，其中R3和R4独立地是不存在的或者未取代的或取代的烷基。在一些实施方式中，R3是亚甲基和R4是–(CH2)4-。在一些实施方式中，R3是亚甲基和R4不存在。当超过一个寡核苷酸时(即，p＝2)，两个L1可以是不同的或相同的，两个L2可以是不同的或相同的以及两个L3可以是不同的或相同的。
在一些实施方式中，m是约3-10、约10-15、约15-20、约20-25、约25-30、约5-16、约15-30、约15-25或约20-30。在一些实施方式中，m是20、21、22、23、24或25。在一些实施方式中，m是约24。
在所描述的实施方式的任一个中，接头可以是可切割接头。在所描述的实施方式的任一个中，接头可以是不可切割接头。
III.连接蛋白-4抗体
在各种实施方式中，本文描述的是特异性结合连接蛋白-4的抗体(即，抗连接蛋白-4抗体、连接蛋白-4抗体、靶向连接蛋白-4的抗体)，特别是特异性结合人连接蛋白-4的抗体及其缀合物。在一些实施方式中，连接蛋白-4指人连接蛋白-4以及特异性结合人连接蛋白-4的抗体。连接蛋白-4基因和多肽序列(例如，人基因和多肽序列)是本领域公知的。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体特异性结合至连接蛋白-4多肽的胞外域，例如人连接蛋白-4多肽。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体特异性结合至连接蛋白-4多肽的IgV结构域，例如，人连接蛋白-4多肽。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体特异性结合至胞外域，其不是连接蛋白-4多肽的IgV结构域，例如，人连接蛋白-4多肽。在一些实施方式中，连接蛋白-4缀合物(即，抗连接蛋白-4缀合物)特异性结合至在其细胞表面上表达连接蛋白-4多肽(例如，人连接蛋白-4多肽)的细胞(例如，肿瘤细胞)。
在一些实施方式中，寡核苷酸通过一个或多个Q标签缀合至连接蛋白-4抗体。在一些实施方式中，Q标签包含谷氨酰胺残基，其连接至缀合物的其余部分。在本方面另外进一步的实施方式中，其可以与本文实施方式的任一个组合，每个Q标签独立地包含选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO:39-55。在一些实施方式中，每个Q标签独立地包含或是选自由表16的肽序列组成的组的肽序列。在本方面的其他实施方式中，每个Q标签独立地包含或是选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO:40-55。在另外其他实施方式中，每个Q标签独立地包含或是选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO:47-49。在一些实施方式中，Q标签包含LLQGG(SEQ ID NO:172)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:173)、RPQGF(SEQ ID NO:47)或RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。在一些实施方式中，Q标签包含肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)。在某些实施方式中，包含肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)的Q标签选自由以下组成的组：RPQGF(SEQ ID NO:47)、RPQGFPP(SEQ ID NO:48)和RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体选自由以下组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体和抗体片段。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、Fv片段、scFv、单域抗体、单一重链抗体和单一轻链抗体。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体是双特异性抗体(即，特异性结合至人连接蛋白-4和特异性结合至人连接蛋白-4以外的其他靶标)。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体是多特异性的(即，特异性结合至人连接蛋白-4和特异性结合至人连接蛋白-4以外的至少两个其他靶标)。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含称为以下的抗体的VH结构域和VL结构域：TNT-201、TNT-202、TNT-203、TNT-204、TNT-205、TNT-206、TNT-207、TNT-208、TNT-209、TNT-210、TNT-211、TNT-212、TNT-317、TNT-318、TNT-320、TNT-321、TNT-322、TNT-323、TNT-324、TNT-327、TNT-328、TNT-330、TNT-331、TNT-332、TNT-333、TNT-334、TNT-335、TNT-336、TNT-337、TNT-412、TNT-413、TNT-414、TNT-417、TNT-418、TNT-419、TNT-420、TNT-421、TNT-422、TNT-423、TNT-424、TNT-425、TNT-426、TNT-427、TNT-428、TNT-429、TNT-430、TNT-431或TNT-432，其中VH结构域如在表7中所示和VL结构域如在表8中所示。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含称为以下的抗体的包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域和包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L2的VL结构域：TNT-201、TNT-202、TNT-203、TNT-204、TNT-205、TNT-206、TNT-207、TNT-208、TNT-209、TNT-210、TNT-211、TNT-212、TNT-317、TNT-318、TNT-320、TNT-321、TNT-322、TNT-323、TNT-324、TNT-327、TNT-328、TNT-330、TNT-331、TNT-332、TNT-333、TNT-334、TNT-335、TNT-336或TNT-337，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3如在表9中所示。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含称为以下的抗体的包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域和包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L2的VL结构域：TNT-201、TNT-202、TNT-203、TNT-204、TNT-205、TNT-206、TNT-207、TNT-208、TNT-209、TNT-210、TNT-211、TNT-212、TNT-317、TNT-318、TNT-320、TNT-321、TNT-322、TNT-323、TNT-324、TNT-327、TNT-328、TNT-330、TNT-331、TNT-332、TNT-333、TNT-334、TNT-335、TNT-336或TNT-337，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3如表10中所示。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含称为以下的抗体的包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域和包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L2的VL结构域：TNT-201、TNT-202、TNT-203、TNT-204、TNT-205、TNT-206、TNT-207、TNT-208、TNT-209、TNT-210、TNT-211、TNT-212、TNT-317、TNT-318、TNT-320、TNT-321、TNT-322、TNT-323、TNT-324、TNT-327、TNT-328、TNT-330、TNT-331、TNT-332、TNT-333、TNT-334、TNT-335、TNT-336或TNT-337，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3如表11中所示。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含称为以下的抗体的重链和轻链：TNT-201、TNT-202、TNT-203、TNT-204、TNT-205、TNT-206、TNT-207、TNT-208、TNT-209、TNT-210、TNT-211、TNT-212、TNT-317、TNT-318、TNT-320、TNT-321、TNT-322、TNT-323、TNT-324、TNT-327、TNT-328、TNT-330、TNT-331、TNT-332、TNT-333、TNT-334、TNT-335、TNT-336、TNT-337、TNT-412、TNT-413、TNT-414、TNT-417、TNT-418、TNT-419、TNT-420、TNT-421、TNT-422、TNT-423、TNT-424、TNT-425、TNT-426、TNT-427、TNT-428、TNT-429、TNT-430、TNT-431或TNT-432，其中轻链如表14中所示，以及(i)重链包含Q标签并且如表15中所示或(ii)重链如表15A中所示。
在一些实施方式中，抗体或缀合物包含轻链可变区结构域(VL)和重链可变区结构域(VH)。在一些实施方式中，VH包含选自由下表7中所公开的序列组成的组的序列。在一些实施方式中，VL包含选自由下表8中所公开的序列组成的组的序列。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:248和VH包含序列SEQ ID NO:249。在一些实施方式中，VL包含序列SEQID NO:250和VH包含序列SEQ ID NO:251。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:252和VH包含序列SEQ ID NO:253。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:254和VH包含序列SEQ ID NO:255。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:256和VH包含序列SEQ ID NO:257。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:258和VH包含序列SEQ ID NO:259。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:260和VH包含序列SEQ ID NO:261。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:262和VH包含序列SEQ ID NO:263。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:264和VH包含序列SEQ ID NO:265。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:266和VH包含序列SEQ ID NO:267。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:268和VH包含序列SEQ ID NO:269。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:270和VH包含序列SEQ IDNO:271。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:900和VH包含序列SEQ ID NO:901。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:902和VH包含序列SEQ ID NO:903。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:904和VH包含序列SEQ ID NO:905。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:906和VH包含序列SEQ ID NO:907。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ IDNO:908和VH包含序列SEQ ID NO:909。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:910和VH包含序列SEQ ID NO:911。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:912和VH包含序列SEQID NO:913。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:914和VH包含序列SEQ ID NO:915。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:916和VH包含序列SEQ ID NO:917。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:918和VH包含序列SEQ ID NO:919。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:920和VH包含序列SEQ ID NO:921。在一些实施方式中，VL包含序列SEQID NO:922和VH包含序列SEQ ID NO:923。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:924和VH包含序列SEQ ID NO:925。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:926和VH包含序列SEQ ID NO:927。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:928和VH包含序列SEQ ID NO:929。在一些实施方式中，VL包含序列SEQ ID NO:930和VH包含序列SEQ ID NO:931。
表7：连接蛋白-4抗体VH结构域
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表8：连接蛋白-4抗体VL结构域
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在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，其中所述VH结构域包含来自选自由上表7中所示的序列组成的组的VH结构域序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。在一些实施方式中，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据Kabat。在一些实施方式中，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据Chothia。在一些实施方式中，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据IMGT。
在其他实施方式中，其可以与前述实施方式的任一个组合，连接蛋白-4抗体或缀合物包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，其中所述VL结构域包含来自选自由上表8中所示的序列组成的组的VL结构域序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方式中，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat。在一些实施方式中，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Chothia。在一些实施方式中，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据IMGT。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275、CDR-H2包含SEQ ID NO:276、CDR-H3包含SEQ ID NO:277、CDR-L1包含SEQ ID NO:272、CDR-L2包含SEQ ID NO:273和CDR-L3包含SEQ ID NO:274。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:293、CDR-H2包含SEQ ID NO:294、CDR-H3包含SEQ ID NO:295、CDR-L1包含SEQ ID NO:290、CDR-L2包含SEQ ID NO:291和CDR-L3包含SEQ ID NO:292。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:311、CDR-H2包含SEQ ID NO:312、CDR-H3包含SEQ ID NO:313、CDR-L1包含SEQ ID NO:308、CDR-L2包含SEQ ID NO:309和CDR-L3包含SEQ ID NO:310。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:329、CDR-H2包含SEQ ID NO:330、CDR-H3包含SEQ ID NO:331、CDR-L1包含SEQ ID NO:326、CDR-L2包含SEQ ID NO:327和CDR-L3包含SEQ ID NO:328。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:347、CDR-H2包含SEQ ID NO:348、CDR-H3包含SEQ ID NO:349、CDR-L1包含SEQ ID NO:344、CDR-L2包含SEQ ID NO:345和CDR-L3包含SEQ ID NO:346。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:365、CDR-H2包含SEQ ID NO:366、CDR-H3包含SEQ ID NO:367、CDR-L1包含SEQ ID NO:362、CDR-L2包含SEQ ID NO:363和CDR-L3包含SEQ ID NO:364。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:383、CDR-H2包含SEQ ID NO:384、CDR-H3包含SEQ ID NO:385、CDR-L1包含SEQ ID NO:380、CDR-L2包含SEQ ID NO:381和CDR-L3包含SEQ ID NO:382。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401、CDR-H2包含SEQ ID NO:402、CDR-H3包含SEQ ID NO:403、CDR-L1包含SEQ ID NO:398、CDR-L2包含SEQ ID NO:399和CDR-L3包含SEQ ID NO:400。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:419、CDR-H2包含SEQ ID NO:420、CDR-H3包含SEQ ID NO:421、CDR-L1包含SEQ ID NO:416、CDR-L2包含SEQ ID NO:417和CDR-L3包含SEQ ID NO:418。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:437、CDR-H2包含SEQ ID NO:438、CDR-H3包含SEQ ID NO:439、CDR-L1包含SEQ ID NO:434、CDR-L2包含SEQ ID NO:435和CDR-L3包含SEQ ID NO:436。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:455、CDR-H2包含SEQ ID NO:456、CDR-H3包含SEQ ID NO:457、CDR-L1包含SEQ ID NO:452、CDR-L2包含SEQ ID NO:453和CDR-L3包含SEQ ID NO:454。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:473、CDR-H2包含SEQ ID NO:474、CDR-H3包含SEQ ID NO:475、CDR-L1包含SEQ ID NO:470、CDR-L2包含SEQ ID NO:471和CDR-L3包含SEQ ID NO:472。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:281、CDR-H2包含SEQ ID NO:282、CDR-H3包含SEQ ID NO:283、CDR-L1包含SEQ ID NO:278、CDR-L2包含SEQ ID NO:279和CDR-L3包含SEQ ID NO:280。
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在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:730、CDR-L2包含SEQID NO:731和CDR-L3包含SEQ ID NO:732，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:733、CDR-H2包含SEQID NO:734和CDR-H3包含SEQ ID NO:735。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:736、CDR-L2包含SEQID NO:737和CDR-L3包含SEQ ID NO:738，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:739、CDR-H2包含SEQID NO:740和CDR-H3包含SEQ ID NO:741。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:742、CDR-L2包含SEQID NO:743和CDR-L3包含SEQ ID NO:744，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:745、CDR-H2包含SEQID NO:746和CDR-H3包含SEQ ID NO:747。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:748、CDR-L2包含SEQID NO:749和CDR-L3包含SEQ ID NO:750，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:751、CDR-H2包含SEQID NO:752和CDR-H3包含SEQ ID NO:753。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:754、CDR-L2包含SEQID NO:755和CDR-L3包含SEQ ID NO:756，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:757、CDR-H2包含SEQID NO:758和CDR-H3包含SEQ ID NO:759。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:760、CDR-L2包含SEQID NO:761和CDR-L3包含SEQ ID NO:762，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:763、CDR-H2包含SEQID NO:764和CDR-H3包含SEQ ID NO:765。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:766、CDR-L2包含SEQID NO:767和CDR-L3包含SEQ ID NO:768，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:769、CDR-H2包含SEQID NO:770和CDR-H3包含SEQ ID NO:771。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:772、CDR-L2包含SEQID NO:773和CDR-L3包含SEQ ID NO:774，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:775、CDR-H2包含SEQID NO:776和CDR-H3包含SEQ ID NO:777。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:778、CDR-L2包含SEQID NO:779和CDR-L3包含SEQ ID NO:780，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:781、CDR-H2包含SEQID NO:782和CDR-H3包含SEQ ID NO:783。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:784、CDR-L2包含SEQID NO:785和CDR-L3包含SEQ ID NO:786，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:787、CDR-H2包含SEQID NO:788和CDR-H3包含SEQ ID NO:789。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:790、CDR-L2包含SEQID NO:791和CDR-L3包含SEQ ID NO:792，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:793、CDR-H2包含SEQID NO:794和CDR-H3包含SEQ ID NO:795。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:796、CDR-L2包含SEQID NO:797和CDR-L3包含SEQ ID NO:798，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:799、CDR-H2包含SEQID NO:800和CDR-H3包含SEQ ID NO:801。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:802、CDR-L2包含SEQID NO:803和CDR-L3包含SEQ ID NO:804，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:805、CDR-H2包含SEQID NO:806和CDR-H3包含SEQ ID NO:807。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:808、CDR-L2包含SEQID NO:809和CDR-L3包含SEQ ID NO:810，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:811、CDR-H2包含SEQID NO:812和CDR-H3包含SEQ ID NO:813。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:814、CDR-L2包含SEQID NO:815和CDR-L3包含SEQ ID NO:816，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:817、CDR-H2包含SEQID NO:818和CDR-H3包含SEQ ID NO:819。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:820、CDR-L2包含SEQID NO:821和CDR-L3包含SEQ ID NO:822，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:823、CDR-H2包含SEQID NO:824和CDR-H3包含SEQ ID NO:825。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:826、CDR-L2包含SEQID NO:827和CDR-L3包含SEQ ID NO:828，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:829、CDR-H2包含SEQID NO:830和CDR-H3包含SEQ ID NO:831。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含VL结构域和VH结构域，其中所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:832、CDR-L2包含SEQID NO:833和CDR-L3包含SEQ ID NO:834，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:835、CDR-H2包含SEQID NO:836和CDR-H3包含SEQ ID NO:837。
表9：根据CHOTHIA的连接蛋白-4抗体CDR
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表10：根据KABAT的连接蛋白-4抗体CDR
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表11：根据IMGT的连接蛋白-4抗体CDR
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在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有选自由下表12中所示的序列组成的组的序列的轻链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体包含含有选自由下表13中所示的序列组成的组的序列的重链。
表12：连接蛋白-4抗体小鼠IgG2a轻链
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表13：具有Q标签的连接蛋白-4抗体小鼠IgG2a重链
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在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有选自由下表14中所公开的序列组成的组的序列的轻链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有选自由下表15中所公开的序列组成的组的序列的含有Q标签的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有选自由下表15A中所公开的序列组成的组的序列的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有选自由表14中所公开的序列组成的组的序列的轻链，以及含有选自由表15中所公开的序列组成的组的序列的含有Q标签的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有选自由表14中所公开的序列组成的组的序列的轻链，以及含有选自由表15A中所公开的序列组成的组的序列的重链。
表14：连接蛋白-4抗体人IgG1轻链
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表15：具有Q标签的连接蛋白-4抗体人IgG1重链
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表15A：连接蛋白-4抗体人IgG1重链
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在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:236的轻链和含有SEQ ID NO:224的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:236的轻链和含有SEQ ID NO:1070的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:237的轻链和含有SEQ ID NO:225的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:237的轻链和含有SEQ ID NO:1071的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:238的轻链和含有SEQ ID NO:226的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:238的轻链和含有SEQ ID NO:1072的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:239的轻链和含有SEQ ID NO:227的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:239的轻链和含有SEQ ID NO:1073的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:240的轻链和含有SEQ ID NO:228的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:240的轻链和含有SEQ ID NO:1074的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:241的轻链和含有SEQ ID NO:229的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:241的轻链和含有SEQ ID NO:1075的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:242的轻链和含有SEQ ID NO:230的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:242的轻链和含有SEQ ID NO:1076的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:243的轻链和含有SEQ ID NO:231的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:243的轻链和含有SEQ ID NO:1077的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:244的轻链和含有SEQ ID NO:232的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:244的轻链和含有SEQ ID NO:1078的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:245的轻链和含有SEQ ID NO:233的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:245的轻链和含有SEQ ID NO:1079的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:246的轻链和含有SEQ ID NO:234的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:246的轻链和含有SEQ ID NO:1080的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:247的轻链和含有SEQ ID NO:235的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:247的轻链和含有SEQ ID NO:1081的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:1000的轻链和含有SEQ ID NO:1030的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1000的轻链和含有SEQ ID NO:1082的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和含有SEQ ID NO:1031的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1001的轻链和含有SEQ ID NO:1083的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和含有SEQ ID NO:1032的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1002的轻链和含有SEQ ID NO:1084的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和含有SEQ ID NO:1033的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1003的轻链和含有SEQ ID NO:1085的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和含有SEQ ID NO:1034的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1004的轻链和含有SEQ ID NO:1086的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和含有SEQ ID NO:1035的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1005的轻链和含有SEQ ID NO:1087的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和含有SEQ ID NO:1036的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1006的轻链和含有SEQ ID NO:1088的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和含有SEQ ID NO:1037的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1007的轻链和含有SEQ ID NO:1089的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和含有SEQ ID NO:1038的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1008的轻链和含有SEQ ID NO:1090的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和含有SEQ ID NO:1039的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1009的轻链和含有SEQ ID NO:1091的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和含有SEQ ID NO:1040的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1010的轻链和含有SEQ ID NO:1092的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和含有SEQ ID NO:1041的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1011的轻链和含有SEQ ID NO:1093的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和含有SEQ ID NO:1042的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1012的轻链和含有SEQ ID NO:1094的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和含有SEQ ID NO:1043的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1013的轻链和含有SEQ ID NO:1095的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和含有SEQ ID NO:1044的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1014的轻链和含有SEQ ID NO:1096的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和含有SEQ ID NO:1045的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1015的轻链和含有SEQ ID NO:1097的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和含有SEQ ID NO:1046的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1016的轻链和含有SEQ ID NO:1098的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和含有SEQ ID NO:1047的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1017的轻链和含有SEQ ID NO:1099的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和含有SEQ ID NO:1048的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1018的轻链和含有SEQ ID NO:1100的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和含有SEQ ID NO:1049的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1019的轻链和含有SEQ ID NO:1101的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和含有SEQ ID NO:1050的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1020的轻链和含有SEQ ID NO:1102的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和含有SEQ ID NO:1051的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1021的轻链和含有SEQ ID NO:1103的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和含有SEQ ID NO:1052的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1022的轻链和含有SEQ ID NO:1104的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:236的轻链和含有SEQ ID NO:1053的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:236的轻链和含有SEQ ID NO:1105的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:242的轻链和含有SEQ ID NO:1054的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:242的轻链和含有SEQ ID NO:1106的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:243的轻链和含有SEQ ID NO:1055的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:243的轻链和含有SEQ ID NO:1107的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:245的轻链和含有SEQ ID NO:1056的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:245的轻链和含有SEQ ID NO:1108的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和含有SEQ ID NO:1057的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1007的轻链和含有SEQ ID NO:1109的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和含有SEQ ID NO:1058的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1008的轻链和含有SEQ ID NO:1110的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ IDNO:1012的轻链和含有SEQ ID NO:1059的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1012的轻链和含有SEQ ID NO:1111的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:236的轻链和含有SEQ ID NO:1060的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1017的轻链和含有SEQ ID NO:1112的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:243的轻链和含有SEQ ID NO:1061的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1018的轻链和含有SEQ ID NO:1113的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和含有SEQ ID NO:1062的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1019的轻链和含有SEQ ID NO:1114的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和含有SEQ ID NO:1063的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1020的轻链和含有SEQ ID NO:1115的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和含有SEQ ID NO:1064的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1021的轻链和含有SEQ ID NO:1116的重链。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和含有SEQ ID NO:1065的重链。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含含有SEQID NO:1022的轻链和含有SEQ ID NO:1117的重链。
靶向细胞表面抗原的抗体可引发与免疫细胞上的Fc受体(FcR)接合相关的免疫刺激和效应子功能。有许多对特定类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。Fc区与细胞表面上的Fc受体的结合可以触发许多生物反应，包括抗体包被颗粒的吞噬作用(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用或ADCP)、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被细胞的裂解(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)和炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。此外，补体的C1组分与抗体的结合能够激活补体系统和补体依赖性细胞溶解(CDC)。补体的激活对于细胞病原体的裂解可能是重要的。然而，补体的激活还可以刺激炎症反应，并且还可以参与自身免疫超敏反应或其他免疫病症。具有降低或消除的结合某些Fc区的能力的变体Fc区对于开发治疗性抗体和Fc融合多肽构建体是有用的，其通过靶向、激活或中和配体功能而不损伤或破坏局部细胞或组织来起作用。具有与某些Fc受体结合的增强或活性Fc结构域的变体Fc区也可用于开发治疗性抗体和Fc融合多肽构建体，并可提供活性或增强的免疫反应。Fc结构域不直接参与抗体与其靶标的结合，但可以参与各种效应子功能，例如抗体参与ADCP、ADCC和CDC。在一些实施方式中，其可以与前述实施方式的任一个结合，连接蛋白-4抗体或连接蛋白-4抗体缀合物包含Fc区。在本文所述的连接蛋白-4抗体和连接蛋白-4抗体缀合物的一些实施方式中，Fc区是人IgG1 Fc区。在一些情况下，人IgG1 Fc结构域是野生型IgG1 Fc结构域，如人野生型IgG1Fc结构域。在一些情况下，人IgG1 Fc结构域是人IgG1 Fc变体，如人IgG1 Fc变体。在一些情况下，与野生型人IgG1序列相比，人IgG1 Fc变体共计具有至多12、11、10、9、8、7、6、5或4个或更少突变。在一些实施方式中，在这样的IgG1 Fc变体中包括一个或多个其他缺失。例如，在一些实施方式中，Fc IgG1重链恒定区的C末端赖氨酸缺失，例如，当多肽在细菌或哺乳动物细胞中产生时，以增加多肽的均一性。
在本文所述的连接蛋白-4抗体和连接蛋白-4抗体缀合物的一些实施方式中，Fc区是具有降低或缺失的与某些Fc受体结合的能力的变体Fc区(在本文中也称为非天然Fc区和变体Fc结构域)。这种Fc变体可用于开发治疗性抗体和治疗性缀合物，其通过靶向、激活或中和配体功能而起作用，同时不损伤或破坏局部细胞或组织。在一些实施方式中，本公开内容的抗体或缀合物中的Fc结构域包括一个或多个氨基酸取代、添加或插入、缺失或其任何组合，其导致效应子功能降低，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)降低、补体依赖性细胞溶解(CDC)降低、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)降低，或其任何组合。在一些实施方式中，本公开内容的抗体或缀合物的特征在于与人Fc受体的结合减少(例如，最小结合或不结合)和与补体蛋白C1q的结合减少(例如，最小结合或不结合)。在一些实施方式中，所述抗体或缀合物包含具有降低的效应子功能的Fc区并且所述Fc区包含下表25中所示的一种或多种突变。
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在一些实施方式中，Fc结构域可以指两个Fc结构域单体的二聚体。在野生型Fc结构域中，两个Fc结构域单体通过两个CH3抗体恒定结构域之间的相互作用以及在两个二聚化Fc结构域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键二聚化。在一些实施方式中，Fc结构域被突变以缺少效应子功能，例如“死Fc结构域”。在一些实施方式中，Fc结构域中的每个Fc结构域单体包括CH2抗体恒定结构域中的氨基酸置换，以减少Fc结构域与Fc受体(如Fcγ受体(FcγR)、Fcα受体(FcαR)或Fcε(FcεR))之间的相互作用或结合。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，在本文中也称为ADCC，是指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤细胞(NK)和中性粒细胞)上的Fc受体(FcRs)上，使这些细胞毒性效应子细胞能够特异性结合到携带抗原的靶细胞并随后杀死靶细胞。抗体依赖性细胞介导的吞噬作用，在本文中也称为ADCP，是指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合到存在于某些吞噬细胞(例如，巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)上，使这些吞噬效应子细胞能够特异性结合到携带抗原的靶细胞，随后吞噬和消化靶细胞。指向靶细胞表面的配体特异性高亲和力IgG抗体可以刺激细胞毒性或吞噬细胞，并且可以用于这种杀伤。Fc受体包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。
在一些实施方式中，本文的Fc变体是最低限度糖基化的或相对于野生型序列具有降低的糖基化。在一些实施方式中，降低的糖基话调节Fc区提供的效应子功能水平。在一些实施方式中，去糖基化是通过N297A突变或通过将N297突变为任何不是N的氨基酸来实现的。在一些实施方式中，去糖基化通过破坏基序N-Xaa1-Xaa2-Xaa3来实现(其中N＝天冬酰胺；Xaa1＝除P(脯氨酸)以外的任何氨基酸；Xaa2＝T(苏氨酸)、S(丝氨酸)或C(半胱氨酸)；和Xaa3＝除P(脯氨酸)以外的任何氨基酸)。在一个实施方式中，N-Xaa1-Xaa2-Xaa3基序指根据Kabat等，1991指定的残基297-300。在一些实施方式中，N、Xaa1、Xaa2或Xaa3中的任何一个或多个突变导致Fc变体的去糖基化。
在一些实施方式中，与包含天然Fc区的多肽构建体相比，包含变体Fc区的本文所述的抗体或缀合物显示出降低或消除的与Fcγ受体CD16a、CD32a、CD32b、CD32c和CD64的至少一种的结合。在一些情况下，本文所述的抗体或缀合物显示出降低或消除的与CD16a、CD32a、CD32b、CD32c和CD64 Fcγ受体的结合。在一些实施方式中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体显示出降低的与受试者的Fc受体的结合。在一些实施方式中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体显示出消除的与受试者的Fc受体的结合。在一些情况下，Fc变体与Fcγ受体的结合减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全消除效应子功能)的因子。在一些实施方式中，减少的结合是针对任何一个或多个Fcγ受体，例如，CD16a、CD32a、CD32b、CD32c或CD64。在一些实施方式中，与Fcγ受体结合的降低或消除导致ADCC降低或消除。在一些实施方式中，如本文所述的包含Fc变体的抗体或缀合物显示出ADCC降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方式中，如本文所述的包含Fc变体的抗体或缀合物显示出100％(完全消除)ADCC。
在一些实施方式中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体显示出吞噬作用(ADCP)降低。与其野生型人IgG Fc区相比，此类Fc变体显示出吞噬作用降低，其中吞噬作用活性降低是例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的因子。在一些情况下，与其野生型人IgG Fc相比，Fc变体显示出吞噬作用消除。
补体导向的细胞毒性，在本文中也称为CDC，是指一种细胞毒性形式，其中补体级联被与抗体Fc结合的补体组分C1q激活。在一些实施方式中，与包含野生型Fc区的抗体或缀合物相比，包含本文所述的非天然Fc区的抗体和缀合物的C1q结合显示出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少。在一些情况下，与包含野生型Fc区的抗体或缀合物相比，包含如本文所述的非天然Fc区的抗体或缀合物显示出CDC降低。在一些实施方式中，与包含野生型Fc区的抗体或缀合物相比，包含本文所述的非天然Fc区的抗体和缀合物显示出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的CDC减少。在一些情况下，与包含野生型Fc区的抗体或缀合物相比，包含如本文所述的非天然Fc变体的抗体或缀合物显示出可忽略的CDC。
在一些情况下，包含如本文所述的非天然Fc变体的抗体或缀合物显示出降低的或可忽略的CDC，并且其特征还在于与以下中的一个或多个的结合减少(例如，极小结合或不存在结合)：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或缀合物的Fc区具有野生型或天然CDC活性。在一些实施方式中，本文所述的抗体或缀合物的Fc区具有野生型或天然CDC活性并且其特征在于与以下中的一个或多个的结合减少(例如，极小结合或不存在结合)：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。
在某些实施方式中，本文所述的连接蛋白-4抗体或连接蛋白-4抗体缀合物包含选自由以下组成的组的IgG Fc区：IgG1 Fc区、IgG2Fc区和IgG4 Fc区。在一些实施方式中，Fc区是野生型人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施方式中，与缺乏氨基酸取代的人Fc区的效应子功能相比，IgG Fc区是包含一个或多个氨基酸取代的人IgG Fc区，所述氨基酸取代降低或消除一个或多个效应子功能。例如，在一些实施方式中，Fc结构域被突变以缺少效应子功能，成为典型的“死”Fc结构域。在一些实施方式中，为改变或降低抗体依赖性效应子功能，如ADCC、CDC、ADCP或其任何组合，本公开内容的抗体或缀合物中的Fc结构域是IgG类别并且包含在以下位置的一个或多个氨基酸取代：E233、L234、L235、G236、G237、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331或P329(根据Kabat的EU索引编号(Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991))；给定抗体的氨基酸残基的Kabat编号可以通过在抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列比对来确定)。
在一些实施方式中，本文中的IgG Fc变体与野生型序列相比是最低糖基化的或具有降低的糖基化。在一些实施方式中，降低的糖基化调节由Fc区提供的效应子功能的水平。在一些实施方式中，去糖基化是通过N297A突变或通过将N297突变为任何不是N的氨基酸来实现的。在一些实施方式中，去糖基化通过破坏基序N-Xaa1-Xaa2-Xaa3来实现(其中N＝天冬酰胺；Xaa1＝除P(脯氨酸)以外的任何氨基酸；Xaa2＝T(苏氨酸)、S(丝氨酸)或C(半胱氨酸)；和Xaa3＝除P(脯氨酸)以外的任何氨基酸)。在一个实施方式中，N-Xaa1-Xaa2-Xaa3基序指根据Kabat等，1991指定的残基297-300。在一些实施方式中，N、Xaa1、Xaa2或Xaa3中的任何一个或多个突变导致Fc变体的去糖基化。
在本文所述的连接蛋白-4抗体和连接蛋白-4抗体缀合物的一些实施方式中，Fc区是人IgG1 Fc区。在一些情况下，人IgG1 Fc结构域是野生型IgG1 Fc结构域，如人野生型IgG1 Fc结构域。在一些情况下，人IgG1 Fc结构域是人IgG1 Fc变体，如人IgG1 Fc变体。在一些情况下，与野生型人IgG1序列相比，人IgG1 Fc变体共计具有至多12、11、10、9、8、7、6、5或4个或更少突变。在一些实施方式中，在此类IgG1 Fc变体中包括一个或多个其他缺失。例如，在一些实施方式中，缺失Fc IgG1重链恒定区的C末端赖氨酸，例如当在细菌或哺乳动物细胞中产生多肽时，以增加多肽的均一性。
在一些实施方式中，Fc结构域单体来自IgG1抗体并且包括氨基酸取代L234A、L235A、G237A和N297A(如根据Kabat等，1991的EU编号系统所表示)中的一个或多个。在一些实施方式中，在此类IgG1 Fc变体中包括一个或多个其他突变。针对人IgG1 Fc变体的此类其他突变的非限制性实例包括E318A和K322A。
在一些实施方式中，Fc结构域包括已知使Fc结构域与Fcγ受体之间的相互作用降至最低的特定氨基酸取代。在一些情况下，Fc区是包含L234A、L235A和/或G237A取代的人IgG1 Fc区，氨基酸位置根据EU索引编号。在一些实施方式中，Fc变体包括突变L234A、L235A、G237A中的至少一个。在一些实施方式中，Fc变体包括IgG1Fc区的突变L234A、L235A、G237A中的至少两个。在一些实施方式中，Fc区包括IgG1 Fc区的突变L234A、L235A和G237A(IgG1AAA)。在一些实施方式中，IgG1 Fc变体包括突变L234A、L235A和G237A的1、2或3个，并且进一步包括其他一个或多个突变，如N297A和D265A。
在一些实施方式中，抗体或缀合物包含具有例如通过抗体与新生儿Fc受体(FcRn)的结合导致抗体再循环和最小内体降解的一个或多个改进抗体半衰期的修饰的变体Fc区。在一些情况下，具有延长半衰期的Fc变体可能与一个或多个Fc受体的结合或亲和力增加或增强。在一些情况下，结合或亲和力可以在例如与内体中的pH相关的特定pH范围下受到影响。在一些实施方式中，本文中的抗体或缀合物包含具有一个或多个修饰的变体Fc区，所述修饰延长抗体循环半衰期并且包含下表26中提供的一个或多个突变。
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在本文所述的连接蛋白-4抗体和连接蛋白-4抗体缀合物的一些实施方式中，Fc区是具有增强的效应子功能的变体Fc区，如针对一种或多种Fc受体的结合或活性增强。在一些实施方式中，本文所述的抗体或缀合物的Fc区的特征在于与以下中的一个或多个的结合增强或增加：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb。在一些情况下，变体Fc区具有改善的与C1q的结合。在一些实施方式中，本文所述的抗体或缀合物的Fc区的特征在于与以下中的一个或多个的结合增强或增加：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb，并且Fc区具有改善的与C1q的结合。在一些实施方式中，抗体或缀合物包含效应子功能增强的Fc区，并且Fc区包含下表27中显示的突变中的一个或多个。
在一些实施方式中，Fc区已经工程化改造以改善效应子功能，包括但不限于下表27中的Fc修饰和增强的效应子功能。在一些实施方式中，本文中的抗体或缀合物包含显示出增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的变体Fc区。在一些实施方式中，与野生型Fc区相比，变体Fc区显示出ADCC活性增加至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方式中，本文中的抗体或缀合物包含显示出增强的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性的变体Fc区。在一些实施方式中，与野生型Fc区相比，变体Fc区显示出ADCP活性增加至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方式中，本文中的抗体或缀合物包含显示出增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的变体Fc区。在一些实施方式中，与野生型Fc区相比，变体Fc区显示出CDC活性增加至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
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在一些实施方式中，与包含天然Fc区的多肽构建体相比，包含变体Fc区的本文中的抗体或缀合物显示出与Fcγ受体CD16a、CD32a、CD32b、CD32c和CD64中的至少一个的结合改善。在一些情况下，本文所述的抗体或缀合物显示出与CD16a、CD32a、CD32b、CD32c和CD64Fcγ受体的结合改善。在一些实施方式中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体显示出与受试者的Fc受体的结合改善。在一些情况下，与野生型相比，Fc变体与Fcγ受体的结合改善10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的因子。在一些实施方式中，结合改善针对一种或多种Fcγ受体，例如，CD16a、CD32a、CD32b、CD32c或CD64。在一些实施方式中，与Fcγ受体的结合改善导致ADCC改善。在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc变体的抗体或缀合物显示出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的ADCC改善。
在一些实施方式中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体显示出吞噬作用(ADCP)改善。此类Fc变体与其野生型人IgG Fc区相比显示出吞噬作用改善，其中吞噬活性改善是例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的因子。
补体导向的细胞毒性，在本文中也称为CDC，是指一种细胞毒性形式，其中补体级联被与抗体Fc结合的补体组分C1q激活。在一些实施方式中，与包含野生型Fc区的抗体或缀合物相比，包含本文所述的非天然Fc区的抗体和缀合物显示出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的C1q结合改善。在一些情况下，与包含野生型Fc区的抗体或缀合物相比，包含如本文所述的非天然Fc区的抗体或缀合物显示出改善的CDC。在一些实施方式中，与包含野生型Fc区的抗体或缀合物相比，包含如本文所述的非天然Fc区的抗体或缀合物显示出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的CDC改善。
在一些情况下，包含如本文所述的非天然Fc变体的抗体或缀合物显示出改善的CDC，并且其特征还在于与以下中的一种或多种的结合改善：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或缀合物的Fc区具有野生型或天然CDC活性。在一些实施方式中，本文所述的抗体或缀合物的Fc区具有野生型或天然CDC活性，并且其特征在于与以下中的一种或多种的结合改善：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。
在本文中的任何实施方式中，可以对连接蛋白-4抗体和连接蛋白-4抗体缀合物进行工程化改造以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞溶解(CDC)活性。在本文中的任何实施方式中，抗体和缀合物可以包含两条重链，并且其中抗体的两条重链中的至少一条或两条是非岩藻糖基化的。在其他实施方式中，可以在具有α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除的细胞系中生产抗体和缀合物。在一些其他实施方式中，可以在过度表达β1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖转移酶III(GnT-III)的细胞系中生产抗体和缀合物。在其他实施方式中，细胞系另外过表达Golgiμ-甘露糖苷酶II(ManII)。在本文中的任何实施方式中，抗体和缀合物可以在Fc区中包含至少一个改善ADCC活性的氨基酸取代。
在本文中的任何实施方式中，连接蛋白-4抗体和连接蛋白-4抗体缀合物可以在Fc区中包含至少一个改善ADCC活性的氨基酸取代。一些示例性Fc修饰包括人IgG的Fc区中的氨基酸取代的以下组合：例如，L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L、S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、P247I/A339Q、S298A/E333A/K334A(Liu等，Fc-engineering for modulatedeffector functions–improving antibodies for cancer treatment,Antibodies 2020,9,64；Kellner等，Modulating cytotoxic effector functions by Fc engineering toimprove cancer therapy,Transfus.Med.Hemother.2017；44:327-336)。
在一些实施方式中，本公开内容的Q标签连接至连接蛋白-4抗体。在一些实施方式中，本公开内容的Q标签连接至连接蛋白-4抗体，并且Q标签作为缀合寡核苷酸(如CpG寡核苷酸，其可以用接头被缀合至Q标签)的组分。
在一些实施方式中，Q标签连接至连接蛋白-4抗体的重链。在一些实施方式中，Q标签通过接头(例如，氨基酸或其他化学接头)连接至连接蛋白-4抗体的重链。在一些实施方式中，Q标签连接至连接蛋白-4抗体的重链(例如，与重链框架中融合)。在一些实施方式中，Q标签连接在连接蛋白-4抗体重链的C末端。在一些实施方式中，Q标签与连接蛋白-4抗体重链的C末端融合(例如，在框架中并与C末端的氨基酸序列邻接)。在一些实施方式中，Q标签在连接蛋白-4抗体的Fc结构域内。在一些实施方式中，Q标签是天然存在的。例如，N297到N297A的突变暴露了抗体的Q295，其中可能发生缀合。在其中Fc区包含N297A取代的一些实施方式中，缀合物进一步包含与Q295残基连接的免疫调节寡核苷酸P，如下式中所示：其中L是通过酰胺键与Q295连接的接头部分。
在一些实施方式中，Q标签包含表16中所示的一个或多个序列。
表16：Q标签肽序列
| SEQ ID NO. | 肽序列 |
| 39 | LSLSPGLLQGG-OH |
| 40 | WPAQGPT |
| 41 | WPQGPT |
| 42 | WAPQGPT |
| 43 | WAQGPT |
| 44 | TPGQAPW |
| 45 | PNPQLPF |
| 46 | RPQQF |
| 47 | RPQGF |
| 48 | RPQGFPP |
| 49 | RPQGFGPP |
| 50 | RPRPQQF |
| 51 | LSQSKVLG |
| 52 | WGGQLL |
| 53 | WALQRPHYSYPD |
| 54 | WALQRPYTLTES |
| 55 | WALQGPYTLTES |
在一些实施方式中，本公开内容的抗体或缀合物可作为裸蛋白-药物缀合物递送，或作为与载体配制的蛋白-药物缀合物并递送，例如，作为封装的或作为部分的纳米载体、纳米颗粒、脂质体、聚合物囊泡或病毒包膜递送。在一些实施方式中，本公开内容的抗体或缀合物可以在胞内递送，例如，通过与蛋白转导结构域或模拟物缀合。在一些实施方式中，本公开内容的抗体或缀合物可以通过电穿孔或显微注射递送。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物具有一种或多种效应子功能，包括但不限于ADCC和/或ADCP。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含人Fc区，例如，人IgG Fc区。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含野生型人IgG1、IgG2或IgG4Fc区。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或缀合物包含抗体恒定结构域序列SEQ ID NO:178。
在某些实施方式中，本文所述的连接蛋白-4抗体或连接蛋白-4抗体缀合物包含选自由以下组成的组的IgG Fc区：IgG1 Fc区、IgG2Fc区和IgG4 Fc区。在一些实施方式中，Fc区是野生型人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施方式中，与缺乏氨基酸取代的人Fc区的效应子功能相比，IgG Fc区是包含增加或增强一种或多种效应子功能的一个或多个氨基酸取代的人IgG Fc区。例如，在一些实施方式中，IgG Fc结构域被突变以增加效应子功能，以形成“活性”或增强的Fc结构域。在一些实施方式中，为了改变或增强抗体依赖性效应子功能，如ADCC、CDC、ADCP或其任何组合，FC结构域属于IgG类别并且包含如表27中所描述和列出的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体或缀合物包含抗体恒定结构域。在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体或缀合物包含表17中列出的抗体重链恒定结构域和/或抗体轻链恒定结构域。在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体或缀合物包含选自由以下组成的组的抗体重链恒定结构域：SEQ ID NO:92-107、111、112、178和494-497。在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体包含在Fc区的C末端处具有Q标签的抗体重链恒定结构域，例如，如在SEQ ID No:95或178中所示。在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体或缀合物包含两条抗体重链，每条具有恒定结构域，其中两条抗体重链的每一条包含在Fc区的C末端处的Q标签，例如，如在SEQ ID No:95或178中所示。在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体或缀合物包含两条抗体重链，每条具有恒定结构域，其中两条抗体重链中仅一条包含在Fc区的C末端处的Q标签，例如，如在SEQ ID No:95或178中所示。在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体或缀合物包含选自由以下组成的组的抗体轻链恒定结构域：SEQ ID No:108-110。在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体或缀合物包含Fc结构域的非岩藻糖基化或降低的岩藻糖基化。在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体或缀合物包含Fc结构域的非岩藻糖基化或降低的岩藻糖基化，并且抗体恒定结构域包含SEQ ID NO:95、112和178中的一个。
表17：抗体恒定结构域序列
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在本公开内容的另一个方面中，本文提供了一种缀合物，其包含连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述连接蛋白-4抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含氨基酸序列RPQGF(SEQ ID NO:47)，其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示，
其中：
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数(如约0至约10、约0至约30、约10至约30、约20至约30以及其间范围中的值)，并且其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的缀合物的其余部分的连接点；
并且每个P独立地是包含以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中和/>表示寡核苷酸内的连接点，并且其中/>表示与L的连接点；
其中Ab包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，其中VH结构域包含来自选自以下的组的VH结构域序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列：根据Kabat、Chothia或IMGT的表7中公开的序列；
其中VL结构域包含来自选自以下的组的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列：根据Kabat、Chothia或IMGT的表8中公开的序列。
在另外其他方面中，本文提供了一种缀合物，其包含蛋白、含有谷氨酰胺残基的至少一个Q标签肽和至少一个免疫调节寡核苷酸，其中所述Q标签肽序列是天然存在的或合成的，并且其中所述免疫调节寡核苷酸通过与谷氨酰胺残基的酰胺键连接至Q标签，其中至少一个Q标签肽序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:39-55。
在一些实施方式中，免疫调节寡核苷酸具有选自由以下组成的组的序列：表4和表6的寡核苷酸。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体包含含有谷氨酰胺残基的至少一个Q标签肽。在一些实施方式中，Q标签肽序列是天然存在的或合成的。在某些实施方式中，Q标签肽序列是通过氨基酸取代暴露的内部反应性谷氨酰胺。在其他实施方式中，Q标签与蛋白重链的C末端融合。在另外进一步的实施方式中，至少一个Q标签肽序列的至少一个选自由以下组成的组：SEQ ID NO:39-55。
在本公开内容的另一个方面中，本文提供了式(B)的连接蛋白-4抗体
其中：
每个Q独立地是包含具有至少一个谷氨酰胺残基的肽序列的Q标签；
Ab是连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段；和
e是1至20的整数。
式(B)的连接蛋白-4抗体可以是如上文所述的式(A)的抗体-寡核苷酸缀合物的前体。因此，如式(A)的此前的方面中所描述的抗体的性质和实施方式可与式(B)抗体的性质和/或实施方式相同或不同。
在本方面的一些实施方式中，连接蛋白-4抗体或其片段是单克隆抗体或其片段。在某些实施方式中，连接蛋白-4抗体或其片段是Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、scFv、单一结构域、单一重链或单一轻链抗体或抗体片段。在其他实施方式中，连接蛋白-4抗体或其片段是人源化的、人的或嵌合抗体或其片段。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体和连接蛋白-4抗体缀合物包含Fc区。在其中连接蛋白-4抗体或连接蛋白-4抗体缀合物包含Fc区的某些实施方式中，Fc区是选自由以下组成的组的人Fc区：IgG1Fc区、IgG2 Fc区和IgG4 Fc区。
在本方面的某些实施方式中，Fc区是：
(a)包含L234A、L235A和/或G237A取代的人IgG1 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；
(b)包含A330S和/或P331S取代的人IgG2 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；或者
(c)包含S228P和/或L235E取代的人IgG4 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号。
在一些实施方式中，Fc区进一步包含N297A取代，根据EU索引对氨基酸位置编号。在其他实施方式中，Fc区进一步包含D265A取代，根据EU索引对氨基酸位置编号。在另外进一步的实施方式中，连接蛋白-4抗体包含人λ轻链。在其他实施方式中，连接蛋白-4抗体包含人κ轻链。
在一些实施方式中，至少一个Q标签连接至连接蛋白-4抗体的重链。在某些实施方式中，至少一个Q标签与连接蛋白-4抗体重链的C末端融合。在其他实施方式中，至少一个Q标签连接至连接蛋白-4抗体的轻链。在另外进一步的实施方式中，至少一个Q标签在Fc结构域内。
在本方面的一些实施方式中，连接蛋白-4抗体连接至从1至20个Q标签(Q)。在某些实施方式中，连接至连接蛋白-4抗体缀合物的Q标签数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20的整数。在某些其他实施方式中，1或2个Q标签连接至连接蛋白-4抗体或抗原结合片段。在另外其他实施方式中，连接至连接蛋白-4抗体缀合物的Q标签数是从1至10、从10至20、从5至10、从10至15、从15至20或从1至5的整数。
在本方面的另外进一步的实施方式中，其可以与任何前述实施方式组合，每个Q标签独立地包含或是选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO:39-55。在一些实施方式中，每个Q标签独立地包含或是选自由以下组成的组的肽序列：表16的肽序列。在本方面的其他实施方式中，每个Q标签独立地包含或是选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO:40-55。在另外其他实施方式中，每个Q标签独立地包含或是选自由以下组成的组的肽序列：SEQ IDNO:47-49。在一些实施方式中，Q标签包含LLQGG(SEQ ID NO:172)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:173)、RPQGF(SEQ ID NO:47)或RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。在本方面的一些实施方式中，每个Q独立地是包含肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)的Q标签。在某些实施方式中，包含肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)的每个Q标签选自由以下组成的组：RPQGF(SEQ ID NO:47)、RPQGFPP(SEQ ID NO:48)和RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。在某些实施方式中，每个Q标签独立地包含或是肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。
在一些实施方式中，本公开内容的连接蛋白-4抗体与药剂缀合。在一些实施方式中，药剂是细胞毒性药剂。示例性细胞毒性药剂描述在US 8,088,378 B2中，其内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，药剂是标签。
在一些实施方式中，药剂是调节免疫系统的部分。例如，所述部分可以靶向和/或调节在其表面上表达连接蛋白-4的细胞的功能，如调节表达连接蛋白-4的细胞的细胞信号转导通路的小分子，例如，IDO/TDO抑制剂、AhR抑制剂、精氨酸酶抑制剂、A2aR抑制剂、TLR激动剂、STING激动剂或Rig-1激动剂。在一些实施方式中，所述部分可以募集另一种大分子或细胞接近其表面上表达连接蛋白-4的细胞。在一些实施方式中，所述部分包含细胞因子，例如，IL2、IL7、IL-10、IL15或IFN。在一些实施方式中，所述部分(例如，小分子)调节细胞因子的活性，例如，IL2、IL7、IL-10、IL15或IFN。在一些实施方式中，所述部分包含癌症疫苗(包含，例如，DNA、RNA、肽或其他细胞组分)。
在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体是双特异性抗体。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体是多特异性抗体。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体是双特异性或多特异性抗体，其包含第一VL结构域和第一VH结构域，其特异性结合人连接蛋白-4，以及至少第二VL结构域和第二VH结构域，其特异性结合人连接蛋白-4以外的靶标。在一些实施方式中，连接蛋白-4抗体是与治疗剂(如寡核苷酸、CpG寡核苷酸或其他药剂)缀合的双特异性或多特异性抗体。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。例如，具有缺乏与抗体的Fc区连接的岩藻糖的成熟碳水化合物结构的抗体描述在US2003/0157108中。亦参见US2004/0093621。在WO 2003/011878和US 6,602,684中提及与抗体的Fc区连接的碳水化合物中具有二等分N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗体。在WO 1997/30087中报道了在与抗体的Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。关于与其Fc区连接的碳水化合物改变的抗体，亦参见WO 1998/58964和WO 1999/22764。关于具有经修饰的糖基化的抗原结合分子，亦参见US2005/0123546。
在某些实施方式中，糖基化变体包含Fc区，其中连接至Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖或具有减少的岩藻糖。此类变体与改善的ADCC功能相关。任选地，Fc区在其中进一步包含一个或多个改善ADCC的氨基酸取代，例如，Fc区的位置298、333和/或334处的取代(残基的EU编号)。与“去岩藻糖基化”、“非岩藻糖基化”、“无岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体相关的公开的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；Okazaki等，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括：缺乏蛋白岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US专利申请号US2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1,Adams等，特别是实施例11)；以及基因敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004))以及过表达β1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖转移酶III(GnT-III)和Golgiμ-甘露糖苷酶II(ManII)的细胞。用于生产去岩藻糖基化的抗体的其他方法可以包括在细胞系表达系统(瞬时或稳定)中在2-氟岩藻糖或5-炔基岩藻糖衍生物存在下表达(Okeley等，Appl.Biol.Sciences.110(14)5404-5409(2013))。
在一些实施方式中，相对于在提供抗体岩藻糖基化的细胞系(如哺乳动物细胞系，例如，野生型CHO细胞系或HEK293细胞系)中产生的相同抗体或抗体缀合物上岩藻糖的量，本公开内容的连接蛋白-4抗体或连接蛋白-4抗体缀合物具有减少的岩藻糖量。例如，抗体具有比如果由天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化模式的CHO细胞，例如，含有天然FUT8基因的CHO细胞)产生时岩藻糖的量更低。在某些实施方式中，本文提供的连接蛋白-4抗体是其中其上小于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％或约1％中的任一个的N-连接聚糖包含岩藻糖的抗体。在某些实施方式中，本文提供的连接蛋白-4抗体或抗体缀合物是其中其上的N-连接的聚糖中均不包含岩藻糖的抗体或抗体缀合物，即其中抗体完全无岩藻糖，或者没有岩藻糖或者是非岩藻糖基化或无岩藻糖基化的。岩藻糖的量可以通过计算在Asn297的糖链内岩藻糖相对于连接到Asn297上的所有糖结构(例如，复杂的、杂交的和高甘露糖结构)的总和的平均量来确定，例如通过MALDI-TOF质谱法测量，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸，即位置294和位置300之间。在一些实施方式中，抗体重链的至少一个或两个是非岩藻糖基化的。
IV通用寡核苷酸合成
一般方案：
实验细节：
用以下试剂和溶剂在MerMade 6或12上进行自动化寡核苷酸合成(1μmol规模)：
氧化剂-THF/吡啶/H2O中的0.02M I2(每个循环60s氧化)，
硫化试剂II-二噻唑衍生物/吡啶/乙腈(0.05M，在6:4吡啶:乙腈中)(每个循环60s)
去封闭-3％三氯乙酸(每个循环2×40s去封闭)，
封端混合物A-THF/2,6-二甲基吡啶/Ac2O(每个循环60s封端)，和
封端混合物B-THF中的16％甲基咪唑(每个循环60s封端)
标准寡核苷酸合成条件的例外如下：
-使用具有称为Uny-接头的非核苷接头的CpG支持物。
-在合成前，将所有2’-脱氧核糖-亚磷酰胺在100％无水乙腈中重悬至100mM，除了一些修饰的2’-脱氧-亚磷酰胺在THF/乙腈混合物(1:4)中溶解至100mM，这取决于起始材料的溶解度。
-用2.5倍摩尔过量的5-苄硫基-1H-四唑(BTT)进行亚磷酰胺激活。每次插入将激活的2’-脱氧核糖-亚磷酰胺偶联2×1分钟偶联，并且每次插入将修饰的亚磷酰胺偶联2×3分钟偶联。
-用在吡啶/乙腈(6:4)中的0.05M硫化试剂II进行骨架的硫化1min。
寡核苷酸去保护和纯化方案：
在自动化寡核苷酸合成后，将固体支持物和碱基保护基团(如A-Bz、C-Ac、G-iBu等)和磷酸三酯的甲酯在1mL AMA(甲醇中1:1比例的36％氨水和40％甲胺)中在室温下切割和去保护2h或更长时间，然后离心蒸发。
将粗寡核苷酸沉淀重悬于100μL的50％乙腈中，短暂加热至65℃并充分涡旋。
对于寡核苷酸纯化，将100μL粗寡核苷酸进样到RP-HPLC，使用以下缓冲液/梯度：
-缓冲液A＝50mM TEAA水溶液；
-缓冲液B＝90％乙腈；和
-流速＝1mL/min；
-梯度：
о0–2min(100％缓冲液A/0％缓冲液B)，
о2–42min(0％至60％缓冲液B)，和
о42–55min(60％至100％缓冲液B)。
DBCO缀合和纯化方案：
如本文所述，将DBCO NHS酯与粗2’-脱氧DMT-寡核苷酸缀合。将粗寡核苷酸沉淀悬浮于45μL DMSO中，短暂加热至65℃并充分涡旋。加入5μL DIPEA，然后加入预先溶解在DMSO(1M)中的DBCO-NHS酯(30当量)。使反应静置10分钟或直至通过MALDI证实产物形成。将总共80μL粗寡核苷酸样品进样到具有以下缓冲液/梯度的RP-HPLC上：
-缓冲液A＝50mM TEAA水溶液；
-缓冲液B＝90％乙腈
-流速＝1mL/min
-梯度：
о0–2min(90％缓冲液A/10％缓冲液B)
о2–42min(0％至60％缓冲液B)
о42–55min(60％至100％缓冲液B)。
在整个主RP-HPLC峰中，收集0.5mL级分并通过MALDI-TOF质谱分析以证实所需质量的存在。将质量选择的、纯化的级分冷冻并冻干。一旦干燥，将级分重新悬浮，与相应的级分合并，冷冻并冻干。
DMT切割：将冻干的沉淀悬浮于20μL的50％乙腈中并加入80μL乙酸，将样品在室温下静置1h，冷冻并冻干。将干燥的样品重新溶解于20％乙腈中，并通过NAP 10(SephadexTM-G25 DNA级)柱脱盐。收集，将纯级分冷冻并冻干以获得最终产物。
将寡核苷酸连接至接头部分的方法
Cu催化的点击反应
铜-THPTA复合物制备
将5mM的硫酸铜五水合物(CuSO4-5H2O)水溶液和10mM三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)水溶液以1:1(v/v)(1:2摩尔比)混合并在室温下静置1小时。将该复合物用于催化Huisgen环加成，例如，如以下的一般缀合方案中所示的。
一般程序(100nM规模)：
向1.7mL Eppendorf管中的710μL水和100μL叔丁醇(最终体积的10％)的溶液中加入60μL铜-THPTA复合物，然后加入50μL的2mM寡聚物溶液、60μL的20mM抗坏血酸钠水溶液和20μL的10mM靶向部分-叠氮化物溶液。充分混合后，使溶液在室温下静置1小时。通过凝胶分析证实反应完成。将反应混合物加入含有5-10倍摩尔过量的TAAcONa(树脂结合的EDTA钠盐)的螺旋盖小瓶中。将混合物搅拌1小时。然后通过illustraTMNapTM-10柱SephadexTM洗脱该混合物。然后将所得溶液冷冻并冻干过夜。
通过酰胺键连接：
通过酰胺化的缀合可以在本领域已知的酰胺化反应条件下进行。
参见例如，Aaronson等，Bioconjugate Chem.22:1723-1728,2011。
其中
每个q是0或1；
每个m是0至5的整数；
Z是O或S；
RO是与寡核苷酸中的核苷的键；
R是与H、寡核苷酸中的核苷、固体支持物或封端基团(例如，-(CH2)3-OH)的键；
每个R’独立地是H、–Q1–QA1、生物可逆的基团或非生物可逆的基团；
每个R”独立地是H、–Q1–QA–Q1–T、生物可逆的基团或非生物可逆的基团；
每个RA独立地是H或–ORC，其中RC是–Q1–QA1、生物可逆的基团或非生物可逆的基团；
每个RB独立地是H或–ORD，其中RD是–Q1–QA–Q2–T、生物可逆的基团或非生物可逆的基团；
其中
每个Q1独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价键合至QA或QA1，第二化合价是开放的，并且其余化合价(存在时)中的每一个独立地键合至辅助部分；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价键合至QA，第二化合价键合至T，并且其余化合价(存在时)中的每一个独立地键合至辅助部分；
QA是任选取代的C2-12杂亚烷基，其含有–C(O)–N(H)–或–N(H)–C(O)–；
QA1是-NHRN1或-COOR12，其中RN1是H、N-保护基团或任选取代的C1-6烷基，并且R12是H、任选取代的C1-6烷基或O-保护基团；和
T是连接部分，
条件是起始材料含有至少一个-Q1-QA1，并且产物含有-Q1-QA-Q2-T。
溶液相连接：
其中
m是从0至5的整数；
Z是O或S；
RO是与寡核苷酸中的核苷的键；
R是与H、寡核苷酸中的核苷、固体支持物或封端基团的键；
每个R’独立地是H、–Q1–NH2、生物可逆的基团或非生物可逆的基团；
每个R”独立地是H、–Q1–NH–CO–Q2–T、生物可逆的基团或非生物可逆的基团；
每个RA独立地是H或–ORC，其中RC是–Q1–NH2、生物可逆的基团或非生物可逆的基团；
每个RB独立地是H或–ORD，其中RD是–Q1–NH–CO–Q2–T、生物可逆的基团或非生物可逆的基团；
其中
每个Q1独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价键合至-NH-CO-或-NH2，第二化合价是开放的，并且其余化合价(存在时)中的每一个独立地键合至辅助部分；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价键合至-NH-CO-，第二化合价键合至T，并且其余化合价(存在时)中的每一个独立地键合至辅助部分；和
T是连接部分，
条件是起始材料含有-Q1-NH2，并且产物含有-Q1-NH-CO-Q2-T。支持物上连接：
其中
Z是O或S；
RO是与寡核苷酸中的核苷的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价键合至-NH-CO-，第二化合价键合至T，并且其余化合价(存在时)中的每一个独立地键合至辅助部分；和
T是连接部分。
其中
n是从1至8的整数；
A是O或–CH2–；
Z是O或S；
RO是与寡核苷酸中的核苷的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价键合至叠氮化物或三唑，第二化合价键合至T，并且其余化合价(存在时)中的每一个独立地键合至辅助部分；和
T是连接部分。
其中
n是从1至8的整数；
A是O或–CH2–；
Z是O或S；
RO是与寡核苷酸中的核苷的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价键合至叠氮化物或三唑，第二化合价键合至T，并且其余化合价(存在时)中的每一个独立地键合至辅助部分；和
T是连接部分。
其中
n是从1至8的整数；
A是O或–CH2–；
Z是O或S；
RO是与寡核苷酸中的核苷的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价键合至叠氮化物或三唑，第二化合价键合至T，并且其余化合价(存在时)中的每一个独立地键合至辅助部分；和
每个T独立地是连接部分。
磷酸三酯的Fmoc去保护的代表性实例：
使包括具有Fmoc保护的胺的磷酸三酯的寡核苷酸经受去保护条件，导致Fmoc去保护，而没有可观察到的磷酸三酯转化为磷酸二酯。
TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:176)
/>
DBCO-NHS与TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:176)缀合-代表性实例：
如质谱分析所证实的，DBCO-NHS与磷酸三酯中的氨基基团的缀合在室温下在10min内完成。
使用以下条件进行含有DBCO缀合基团的TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:176)的RP-HPLC纯化：
-缓冲液A＝50mM TEAA水溶液；
-缓冲液B＝90％乙腈；和
-流速＝1mL/min；
-梯度：
о0–2min(100％缓冲液A/0％缓冲液B)，
о2–22min(0％至100％缓冲液B)，和
о22–25min(100％缓冲液B)。
使用例如2’-修饰的核苷亚磷酰胺，如本文所述的那些，类似的程序可用于制备寡核苷酸。在国际专利申请PCT/US2015/034749中提供了这样的程序；PCT/US2015/034749中的二硫化物磷酸三酯寡核苷酸合成的公开内容通过引用并入本文。
V.缀合方法
本文提供了制备缀合物的方法，所述缀合物包含抗体或其抗原结合片段和如式(A)结构中所示的通过一个或多个Q-标签肽连接的一个或多个免疫调节寡核苷酸。在一些实施方式中，所述方法包括在足以诱导缀合(即CpG和Q标签之间的酰胺化反应)的条件下将包含至少一个具有至少一个暴露的谷氨酰胺残基的Q标签肽序列的连接蛋白-4抗体和寡核苷酸组合。在其他实施方式中，所述方法包括使包含至少一个具有至少一个暴露的谷氨酰胺残基的Q-标签肽序列的连接蛋白-4抗体和寡核苷酸在足以诱导缀合的化学条件下反应。在其他实施方式中，所述方法包括在足以诱导缀合的酶促条件下，例如用转谷氨酰胺酶，使包含至少一个具有至少一个暴露的谷氨酰胺残基的Q-标签肽序列的连接蛋白-4抗体和寡核苷酸反应。
转谷氨酰胺酶介导的缀合反应条件
在一个方面中，本文提供了一种制备式(A)缀合物的方法，包括将一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)与包含一个或多个谷氨酰胺残基的连接蛋白-4抗体组合。在一个方面中，本文提供了一种制备缀合物的方法，所述缀合物包含连接蛋白-4抗体或抗原结合片段(Ab)和一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中连接蛋白-4抗体或抗原结合片段与一个或多个包含氨基酸序列RPQGF(SEQ ID NO:47)的Q-标签肽(Q)连接，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与Q-标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)与Q-标签肽连接，如式(A)所示：
其中：
表示每个Q与连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或通过与谷氨酰胺残基的酰胺键连接至Q的接头部分；和
每个P独立地是免疫调节寡核苷酸；
所述方法包括在转谷氨酰胺酶存在下将式(B)化合物
其中Ab和Q是如上式(A)所定义的，并且e是从1至20的整数，
与一个或多个免疫调节寡核苷酸P接触，其中每个P独立地具有下式：
其中
X5’是5’末端核苷；
X3’是3’末端核苷；
YPTE是核苷间磷酸三酯；
Y3’是末端磷酸三酯；
每个XN独立地是核苷；
每个YN独立地是核苷间接头；
b和c各自独立地是1至25的整数；条件是b和c之和至少为5；和
L是包含末端胺的接头部分。
在另一个方面中，制备包含连接蛋白-4抗体或抗原结合片段(Ab)和一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)的缀合物的方法，其中所述连接蛋白-4抗体或抗原结合片段与一个或多个包含至少一个谷氨酰胺残基的Q-标签肽(Q)连接，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与Q-标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)与Q-标签肽连接，如式(A)所示，
其中：
表示每个Q与连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；/>
每个Q独立地是包含至少一个谷氨酰胺残基的Q标签肽；
每个L独立地是键或通过与谷氨酰胺残基的酰胺键连接至Q的接头部分；和
每个P独立地是免疫调节寡核苷酸；
所述方法包括在转谷氨酰胺酶存在下将式(B)化合物
其中Ab和Q是如对上式(A)所定义的，并且e是从1至20的整数，
与一个或多个免疫调节寡核苷酸P接触，其中每个寡核苷酸P独立地是式(C)或式(D)的免疫调节寡核苷酸。
在一些实施方式中，缀合物包含一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个或二十个或更多个Q-标签肽。在一些实施方式中，缀合物包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或二十个Q-标签肽。在一些实施方式中，缀合物具有2个Q标签肽。在一些实施方式中，缀合物包含一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个或二十个或更多个免疫调节寡核苷酸。在一些实施方式中，缀合物包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或二十个免疫调节寡核苷酸。在一些实施方式中，缀合物具有一个免疫调节寡核苷酸。
在另一个方面中，所述方法包括在转谷氨酰胺酶存在下，将式(C)化合物与包含一个或多个谷氨酰胺残基的式(B)抗体组合。在一些实施方式中，所述方法包括在转谷氨酰胺酶存在下，将式(D)的化合物与包含一个或多个谷氨酰胺残基的式(B)的抗体接触。在一些实施方式中，式(D)或式(D)的化合物的终浓度在约1-100μM的范围内。在一些实施方式中，包含抗体的Q标签的终浓度在约1-500μM的范围内。在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶的终浓度在约1-500μM的范围内。在一些实施方式中，转谷氨酰胺酶的终浓度在约1-50μM、约50-100μM、约100-150μM、约150-200μM、约200-250μM、约250-300μM、约300-400μM、约400-500μM、约100-125μM、约125-150μM、约150-175μM、约175-200μM、约200-225μM、约225-250μM、约250-275μM、约275-300μM、约300-325μM或约325-350μM的范围内。
在一些实施方式中，包含抗体的Q标签与式(C)或式(D)的化合物的比率在按重量计约1:1-250:1、约1:1-5:1、约5:1-10:1、约10:1-20:1、约20:1-30:1、约30:1-40:1、约40:1-50:1、约50:1-75:1、约75:1-100:1、约100:1-150:1、约150:1-200:1、约200:1-250:1、约1:1-25:1、约25:1-50:1、约50:1-75:1、约75:1-100:1或约100:1-250:1的范围中。在一些实施方式中，式(C)或式(D)的化合物与抗体的比率按摩尔浓度计为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约16:1、约17:1、约18:1或约20:1。
在一些实施方式中，包含抗体的Q标签和转谷氨酰胺酶的比率按重量计在约1:1-500:1、约1:1-5:1、约5:1-10:1、约10:1-20:1、约20:1-30:1、约30:1-40:1、约40:1-50:1、约50:1-75:1、约75:1-100:1、约100:1-150:1、约150:1-200:1、约200:1-250:1、约1:1-25:1、约25:1-50:1、约50:1-75:1、约75:1-100:1、约100:1-150:1、约150:1-200:1、约200:1-250:1、约250:1-300:1、约300:1-400:1或约400:1-500:1的范围内。在一些实施方式中，肽与转谷氨酰胺酶的比率按摩尔浓度计为约15:1、约16:1、约17:1、约18:1、约20:1、约21:1、约22:1、约23:1、约24:1、约25:1、约26:1、约27:1、约28:1、约29:1、约30:1、约31:1、约32:1、约33:1、约34:1、约35:1、约36:1、约37:1、约38:1、约39:1、约40:1、约41:1、约42:1、约43:1、约44:1、约45:1、约46:1、约47:1、约48:1、约49:1或约50:1。
在一些实施方式中，Q标签：CpG：转谷氨酰胺酶的比率为约1:1.3:10。在一些实施方式中，Q标签：CpG：转谷氨酰胺酶的比率为约1:1.5:10。在一些实施方式中，Q标签：CpG：转谷氨酰胺酶的比率为约1:1.3:15。
在一些实施方式中，反应在高于15℃、高于20℃、高于25℃、高于30℃、高于35℃、高于40℃、高于45℃或高于50℃下孵育。在一些实施方式中，反应在约室温下孵育。在一些实施方式中，将反应孵育至少10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时或60小时。
在一些实施方式中，本文所述的方法产生与肽相比大于约5％、大于约10％、大于约15％、大于约20％、大于约25％、大于约30％、大于约35％、大于约40％、大于约45％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约95％、大于约97％或大于约99％的式(A)化合物。
在一些实施方式中，反应的pH在约4-10的范围内。在一些实施方式中，反应的pH在约4-6、约6-8或约8-10的范围内。在一些实施方式中，反应的pH在约7-8的范围内。
在另一个方面中，可用于将连接部分连接到寡核苷酸的反应是本领域已知的，包括但不限于叠氮基和基于炔的缀合基团(例如，含有桥环碳-碳三键的任选取代的C6-16亚杂环基或任选取代的C8-16环炔基)之间的Hüssen环加成(金属催化的或无金属的)以形成三唑部分；亲二烯体和二烯/杂二烯之间的Diels-Alder反应；通过周环反应如烯反应的键形成；酰胺或硫代酰胺键形成；磺酰胺键形成(例如，与叠氮基化合物)；醇或酚烷基化(例如，Williamson烷基化)、缩合反应以形成肟、腙或氨基脲基团；通过亲核试剂(例如，胺和硫醇)的共轭加成反应；二硫键形成；以及在羰基处(例如，在激活的羧酸酯，如五氟苯基(PFP)酯或四氟苯基(TFP)酯处)或在亲电芳烃处(例如，在低聚氟化芳烃、氟苄腈基团或氟硝基苯基团处的SNAr)的亲核取代(例如，通过胺、硫醇或羟基亲核试剂)。
在某些实施方式中，连接反应是偶极环加成，并且缀合部分包括叠氮基、含有桥环碳-碳三键的任选取代的C6-16亚杂环基或任选取代的C8-16环炔基。针对相互互补性选择互补反应性基团和缀合基团。例如，在缀合基团和互补反应性基团中的一个中使用叠氮化物，而在缀合基团和互补反应性基团中的另一个中使用炔烃。
连接部分与寡核苷酸的连接
连接部分可以通过在寡核苷酸中的连接基团和与键合于连接部分的互补反应性基团之间形成键而与寡核苷酸连接。在某些实施方式中，连接部分被修饰以包括互补反应性基团。将此类互补反应性基团引入连接部分中的方法是本领域已知的。
在某些实施方式中，互补反应性基团是任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇、或其N-保护的部分、含有桥环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂环基(例如，/>)、1,2,4,5-四嗪基团(例如，)、任选取代的C8-16环炔基(例如，)、–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式-环辛烯基或降冰片烯基)或含有-COOR12或-CHO的任选取代的C1-16烷基；
其中：
RN1是H,N-保护基团或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地是H、任选取代的C1-6烷基或O-保护基团(例如，羧基保护基)；和
R13是卤素(例如，F)。
在某些实施方式中，互补反应性基团被保护直至缀合反应。例如，被保护的互补反应性基团可以包括-COORPGO或-NHRPGN，其中RPGO是O-保护基团(例如，羧基保护基)，且RPGN是N-保护基团。
VI.药物组合物
本发明的连接蛋白-4抗体和缀合物，如包含式(A)结构、式(B)的抗体和式(C)、(C’)、(C”)、(D)、(D’)和(D”)的免疫调节寡核苷酸，或前述任意的药学上可接受的盐，或其任何亚组的缀合物，可以配制成用于施用目的的各种药物形式。作为合适的组合物，可以引证通常用于全身施用药物的所有组合物。为了制备本发明的药物组合物，将作为活性成分的有效量的特定化合物(任选地以加成盐形式)与药学上可接受的载体混合，该载体可以根据施用所需的制剂形式采用多种形式。这些药物组合物以特别适合于口服、直肠、经皮或通过肠胃外注射施用的单位剂型是理想的。例如，在制备口服剂型的组合物时，可以使用任何常用的药用介质，在口服液体制剂，如悬浮液、糖浆、酏剂、乳液和溶液的情况下，例如水、二醇、油、醇等；或在粉剂、丸剂、胶囊和片剂的情况下，固体载体，如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于其易于施用，片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下使用固体药物载体。对于肠胃外组合物，载体通常包含无菌水(至少大部分)，尽管可以包括例如有助于溶解的其他成分。例如，可以制备其中载体包含盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水和葡萄糖溶液的混合物的注射溶液。还可以制备可注射悬浮液，在这种情况下可以使用适当的液体载体、悬浮剂等。还包括旨在在使用前不久转化为液体形式制剂的固体形式制剂。在适于经皮施用的组合物中，载体任选地包含渗透增强剂和/或合适的润湿剂，任选地与小比例的任何性质的合适添加剂组合，这些添加剂不会对皮肤引入显著的有害作用。本发明的化合物还可以使用任何本领域已知的递送系统以溶液、悬浮液或干粉的形式经由口腔吸入或吹入施用。
特别有利的是将上述药物组合物配制成单位剂型以便于施用和剂量均匀。如本文所用的单位剂型是指适合作为单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性成分以及所需的药物载体。此类单位剂型的实例是片剂(包括刻痕或包衣片剂)、胶囊、丸剂、栓剂、粉末包、干胶片剂、可注射溶液或悬浮液等，及其分离的多个单位剂型。
施用可以是，但不限于，静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、皮下(例如，通过植入装置)和实质内施用。在一些实施方式中，本文所述的药物组合物通过皮下注射施用。
可以使用本领域已知的递送技术将包含本文所述缀合物的药物组合物递送至细胞、细胞组、肿瘤、组织或受试者。通常，本领域公认的用于递送核酸-蛋白质缀合物(体外或体内)的任何合适的方法可适应用于本文所述的组合物。例如，递送可以通过局部施用(例如，直接注射、植入或局部施用)、全身施用或皮下、静脉内、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，心室内、实质内和鞘内)、肌内、透皮、气道(气溶胶)、鼻、口服、直肠或局部(包括颊和舌下)施用。在某些实施方式中，组合物通过皮下或静脉内输注或注射施用。
因此，在一些实施方式中，本文所述的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，本文所述的药物组合物可以配制用于向受试者施用。
如本文所用的，药物组合物或药物包括药理学有效量的至少一种所述治疗化合物或缀合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂(赋形剂)是有意包含在药物递送系统中的除活性药物成分(API，治疗产品)外的物质。赋形剂在预期剂量下不发挥或不旨在发挥治疗效果。赋形剂可以起到以下作用：a)在制造期间帮助药物递送系统的加工，b)保护、支持或增强API的稳定性、生物利用度或患者可接受性，c)帮助产品鉴别，和/或d)在储存或使用期间增强API递送的总体安全性、有效性的任何其他属性。
赋形剂包括但不限于：吸收增强剂、抗粘附剂、消泡剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、载体、包衣剂、着色剂、递送增强剂、递送聚合物、葡聚糖、右旋糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、调味剂、助流剂、湿润剂、润滑剂、油、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖、悬浮剂、持续释放基质、甜味剂、增稠剂、张度剂、媒剂、防水剂和润湿剂。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并且应该防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与以上列举的一种成分或其组合(如果需要)一起掺入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌介质中来制备分散体，所述无菌介质含有基础分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌过滤溶液来产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
适于关节内施用的制剂可以是药物的无菌水性制剂的形式，其可以是微晶形式，例如，水性微晶悬浮液的形式。脂质体制剂或可生物降解的聚合物系统也可用于提供用于关节内和眼部施用的药物。
活性化合物可以与保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述的。
化合物或缀合物可以配制成单位剂量形式的组合物，以便于施用和剂量均匀性。单位剂量形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含所需药物载体相关的经计算以产生与所需治疗效果的预定量的活性化合物。本公开的单位剂量形式的规格由活性化合物的独特特征和待实现的治疗效果以及复配用于治疗个体的这种活性化合物的领域中固有的限制决定并直接取决于这些因素。
药物组合物可含有药物组合物中常见的其它附加组分。此类附加的组分包括但不限于：止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂(例如，抗组胺剂、苯海拉明等)。
通常，活性化合物的有效量将在约0.1至约100mg/kg体重/天，例如约1.0至约50mg/kg体重/天的范围内。在一些实施方式中，活性化合物的有效量将在每剂量约0.25至约5mg/kg体重的范围内。在一些实施方式中，活性化合物的有效量将在每1-18周或1-6个月25-400mg的范围内。在一些实施方式中，活性化合物的有效量将在每4周或每一个月50-125mg的范围内。在一些实施方式中，活性成分的有效量将在每剂量约0.5至约3mg/kg体重的范围内。在一些实施方式中，活性成分的有效量将在每剂量约25-400mg的范围内。在一些实施方式中，活性成分的有效量将在每剂量约50-125mg的范围内。施用的量还可能取决于诸如患者的总体健康状态、递送的化合物的相对生物功效、药物的制剂、制剂中赋形剂的存在和类型以及施用途径的变量。此外，应当理解，所施用的初始剂量可以增加超过上述上限水平，以便快速达到所需的血液水平或组织水平，或者初始剂量可以小于最佳剂量。
为了治疗疾病或为了形成用于治疗疾病的药物或组合物，本文所述的包括化合物或缀合物的药物组合物可以与赋形剂或与第二治疗剂或治疗组合，所述第二治疗剂或治疗包括但不限于：第二或其他缀合物、小分子药物、抗体、抗体片段和/或疫苗。
将所述连接蛋白-4抗体或缀合物加入药学上可接受的赋形剂或佐剂中时，可以将其包装到试剂盒、容器、包装或分配器中。本文所述的药物组合物可以包装在预填充的注射器或小瓶中。
VII.试剂盒
本文还提供了包含上述缀合物的试剂盒。
在另一个方面中，试剂盒还包含包装插页，其包括但不限于关于制剂的制备和施用、制剂的副作用和任何其它相关信息的适当说明。说明书可以是任何合适的格式，包括但不限于印刷品、录像带、计算机可读盘、光盘或对于基于互联网的说明书的指引。
在另一个方面中，提供了用于治疗患有或易患本文所述病症的个体的试剂盒，其包含第一容器和使用的包装插页，所述第一容器包含本文公开的组合物或制剂的剂量。容器可以是本领域已知的并且适合于储存和递送静脉内制剂的那些容器的任何一种。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含第二容器，所述第二容器包含用于制备待施用于个体的制剂的药学上可接受的载体、稀释剂、辅剂等。
在另一个方面中，还可以提供试剂盒，其含有足够剂量的本文所述的组合物(包括其药物组合物)，以在延长的时间段内为个体提供有效的治疗，例如1-3天、1-5天、1周、2周、3周、4周、6周、8周、1个周期、2个周期、3个周期、4个周期、5个周期、6个周期、7个周期、8个周期或更长时间。
在一些实施方式中，试剂盒还可以包括多个剂量，并且可以以足以在药房(例如，医院药房和配制药房)中储存和使用的量包装。在某些实施方式中，试剂盒可包括至少一种如本文所公开的组合物的剂量。
VIII.治疗方法
本文还提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的连接蛋白-4抗体或缀合物。本文还提供了本文所述的连接蛋白-4抗体或缀合物在制备用于治疗需要用缀合物中的寡核苷酸治疗的患者的药物中的用途。还提供了如本文所述的连接蛋白-4抗体或缀合物，其用于治疗需要用连接蛋白-4抗体或缀合物中的寡核苷酸治疗的受试者的疾病或病症。还提供了用于治疗患者的如本文所述的连接蛋白-4抗体或缀合物，包括向患者施用有效量的连接蛋白-4抗体或缀合物。在一些实施方式中，受试者患有癌症或处于发生癌症的风险中。在一些实施方式中，疾病或病症是病毒感染。在一些实施方式中，疾病是由免疫系统病症引起的。
在如本文所述的治疗癌症的方法的一些实施方式中，用本文公开的方法治疗的癌症是实体肿瘤。在一些实施方式中，用本文公开的方法治疗的癌症是液体肿瘤。在一些实施方式中，用本文公开的方法治疗的癌症是实体肿瘤。在特定实施方式中，用本文公开的方法治疗的癌症是乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、头颈癌、黑素瘤、淋巴瘤或白血病。在一些实施方式中，癌症包括但不限于多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病如，例如α链病、γ链病和μ链病、良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织的癌症等。适用于本发明所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、体细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。在一些实施方式中，癌症本质上是上皮性的，并且包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方式中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其他实施方式中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以以各种其他方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、Brenner或未分化。在特定实施方式中，用本文公开的方法治疗的癌症选自套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、多发性黑素瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、毛细胞白血病(HCL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、骨骼肌淋巴瘤(SML)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、滤泡中心淋巴瘤(FCL)、结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈癌、乳腺癌、胰腺腺癌、成胶质细胞瘤(GBM)、前列腺癌、食管癌、肾细胞癌、肝癌、膀胱癌和胃癌组成的列表。
在一些实施方式中，本文提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物结合至连接蛋白-4，如包含连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段的CpG-Ab免疫缀合物，并且其中所治疗的疾病或病症是以连接蛋白-4过表达为特征的癌症。在一些实施方式中，此类癌症包括食道癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺腺癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、直肠癌和胆囊癌。在一些实施方式中，CpG-Ab免疫缀合物包含表2-6中的一个中列出的寡核苷酸序列或结构。
在一些实施方式中，治疗方法包括施用与存在于肿瘤细胞上的连接蛋白-4结合的CpG-Ab免疫缀合物(即，CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物)并且治疗导致肿瘤细胞的杀伤或损伤从而减少或抑制肿瘤的体积、大小和/或生长。在一些实施方式中，本文提供了在受试者中治疗疾病或病症的方法，其包括向由此需要的受试者施用有效量的本文所述的CpG-Ab免疫缀合物，其中CpG-Ab免疫缀合物结合至连接蛋白-4，如包含连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段的CpG-Ab免疫缀合物，并且其中治疗的所述疾病或病症是以表达连接蛋白-4的肿瘤细胞为特征的癌症。在一些实施方式中，治疗的所述疾病或病症是其中肿瘤细胞过表达连接蛋白-4的癌症。在一些实施方式中，治疗的所述疾病或病症是其中肿瘤细胞具有低水平连接蛋白-4表达的癌症。在一些实施方式中，治疗的所述疾病或病症是其中肿瘤细胞具有中等水平连接蛋白-4表达的癌症。在一些实施方式中，治疗的所述疾病或病症是其中肿瘤细胞对另一种连接蛋白-4定向疗法(如连接蛋白-4抗体-小分子药物缀合物)没有应答或具有较低应答的癌症。在一些实施方式中，治疗的所述疾病或病症是其中肿瘤细胞具有可检测的且低至中等水平的连接蛋白-4表达的癌症。在一些实施方式中，此类癌症包括皮肤黑色素瘤、肉瘤、肾癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、胸腺瘤、肝脏肝细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤以及低级别胶质瘤。
在一些实施方式中，用本文公开的方法治疗的癌症对至少一种免疫疗法具有抗性。在一些实施方式中，用本文公开的方法治疗的癌症对至少一种选自由以下组成的组的癌症疗法具有抗性：化疗、放疗、靶向疗法、疫苗疗法和CAR-T疗法。在一些实施方式中，治疗癌症的方法包括向患有癌症的受试者共同施用(i)治疗有效量的CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物；和(ii)当单独使用免疫治疗剂治疗癌症时，所治疗的癌症对免疫治疗剂显示出抗性或无应答。
在一些实施方式中，本文所述的治疗方法包括施用与连接蛋白-4结合的CpG-Ab免疫缀合物(CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物)组合一种或多种其他癌症疗法。在一些实施方式中，一种或多种其他癌症疗法可以是免疫疗法、癌症治疗剂(包括但不限于抗体和/或小分子抑制剂)、细胞疗法、癌症疫苗和化疗。
在特定实施方式中，本文提供的治疗方法包括治疗此前已使用或同时使用免疫检查点调节剂治疗的受试者。在一些实施方式中，免疫检查点调节剂是PD-1抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点调节剂是PD-L1抑制剂。特别地，在一些实施方式中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，PD-L1的抑制剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所治疗受试者的肿瘤或肿瘤细胞对免疫检查点调节剂有应答，并且用CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物治疗提高了肿瘤或肿瘤细胞对治疗的应答。在一些情况下，改善是肿瘤尺寸缩小、肿瘤或肿瘤细胞生长和/或肿瘤细胞转移减少。
在一些实施方式中，待治疗的癌症通过免疫检查点抑制剂疗法是有应答的(即，可以治疗)。在一些实施方式中，癌症对免疫检查点抑制剂疗法无应答(即，是难治性的或具有抗性的)。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂疗法包括PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂疗法包括PD-L1抑制剂，如抗PD-L1抗体。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂疗法包括CTLA-4抑制剂，如抗CTLA-4抗体。
在特定实施方式中，所治疗受试者的肿瘤或肿瘤细胞对免疫检查点调节剂(如抑制剂)无应答或应答较低，并且使用CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物的治疗改善肿瘤或肿瘤细胞对治疗的应答。在特定实施方式中，免疫检查点调节剂是PD-1的抑制剂。在特定实施方式中，免疫检查点调节剂是PD-L1的抑制剂。在一些实施方式中，治疗癌症的方法包括向患有癌症的受试者共施用(i)治疗有效量的CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物；和(ii)治疗有效量的PD-1抑制剂。在一些实施方式中，治疗癌症的方法包括向患有癌症的受试者共施用(i)治疗有效量的CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物；和(ii)治疗有效量的PD-L1抑制剂。特别地，在一些实施方式中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，治疗针对对PD-1或PD-L1抑制剂没有应答或具有抗性的受试者，并且使用结合连接蛋白-4CpG-Ab免疫缀合物对此类受试者治疗，如包含连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段的CpG-Ab免疫缀合物。在一些情况下，肿瘤或肿瘤细胞对共施用治疗的应答大于对仅施用任何单一药剂的应答。
示例性PD-L1抑制剂是本领域公知的，包括但不限于阿替利珠单抗单抗(Genentech)、阿维鲁单抗(/>EMD Serono)、德瓦鲁单抗(/>AstraZeneca)、KN035、CK-301、AUNP12、CA-170和BMS-986189。示例性PD-1抑制剂是本领域公知的，包括但不限于派姆单抗(/>Merck)、纳武单抗(Bristol Myers Squibb)、西米普利-rwlc(/>Regeneron/Sanofi)、多塔利单抗-gxly(/>GlaxoSmithKline)、JTX-4014、斯巴达珠单抗(PDR001)、卡瑞利珠单抗(SHR1210)、信迪利单抗(IBI308)、替雷利珠单抗(BGB-A317)、特瑞普利单抗(JS 001)、INCMGA00012、AMP-224和AMP-514。
在一些实施方式中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是此前癌症部分或完全缓解的受试者的癌症复发发作。在特定实施方式中，此前癌症是液体癌症(例如，血液癌症)，并且所预防或治疗的复发性癌症是液体肿瘤。在特定实施方式中，此前癌症是实体肿瘤癌症，并且所预防或治疗的复发性癌症是实体肿瘤。在特定实施方式中，此前癌症是液体肿瘤癌症，并且所预防或治疗的复发性癌症是实体肿瘤癌症。在特定实施方式中，此前癌症是实体肿瘤癌症，并且所预防或治疗的复发性癌症是液体肿瘤癌症。
在一些实施方式中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是受试者在受试者显示部分或完全缓解之后癌症复发的首次发作。在一些实施方式中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是受试者在受试者显示部分或完全缓解之后癌症复发的第二次发作。在一些实施方式中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是受试者在受试者显示部分或完全缓解之后癌症复发的第三次发作。在一些实施方式中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是受试者在受试者显示部分或完全缓解之后癌症复发发作之后的癌症复发的第三次发作。
在本文所述的方法和用途的一些实施方式中，其中施用CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物后，含CpG的免疫刺激寡核苷酸诸如在髓细胞中特异性地活化toll样受体9(TLR9)。在本文所述的方法和用途的一些实施方式中，施用CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物导致以下的一种或多种：树突状细胞活化、单核细胞活化、巨噬细胞对肿瘤吞噬作用增强和/或细胞因子分泌增强。
在本文所述的方法和用途的一些实施方式中，向个体施用CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物活化个体中的免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞和/或NK细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是NK细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞和NK细胞。
本文还提供了一种在个体中活化免疫细胞的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物。本文还提供了本文所述的CpG-连接蛋白-4-Ab免疫缀合物在制备用于在个体中活化免疫细胞的药物中的用途。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞和/或NK细胞。在一些实施方式中，活化个体中的免疫细胞在个体中治疗癌症。在一些实施方式中，癌症选自上文所述癌症的任一种。
在不受理论束缚的情况下，连接蛋白-4抗体寡核苷酸缀合物与肿瘤细胞上的连接蛋白-4结合，并在肿瘤微环境中富集连接蛋白-4抗体寡核苷酸缀合物，导致配体诱导的Fcγ受体与包括树突细胞在内的髓细胞的接合，触发Fc聚集，随后是Fc介导的信号转导和内化。内化后，免疫球蛋白复合物向内体的运输激活TLR9，触发促炎性细胞因子的分泌。在树突状细胞中，免疫球蛋白复合物与靶标的内化可能诱导肿瘤肽的加工和呈递。连接蛋白-4在肿瘤细胞上的结合也可以诱导靶细胞的吞噬作用，这也可能导致连接蛋白-4抗体-寡核苷酸缀合物的内化，触发内体中的TLR9激活。因此，肿瘤抗原和FcgR的共接合促进了TLR9激动剂向髓细胞的递送及其活化。
实施例
通过参考以下实施例将更好地理解本文公开的主题，所述实施例是作为本发明的示例而提供的，而不是作为限制。
材料
原型肽是内部制备的，但可以在定制肽供应商(例如，CPC Scientific)处购买。寡核苷酸是内部制备的或通过LGC制备的。在这些实施例中使用的转谷氨酰胺酶分离自各种轮枝链霉菌(Streptoverticillim)菌株(例如，Ajinomoto)。Q-标签mAb在SinoBiologicals或内部产生。
寡核苷酸的生产
寡核苷酸通常根据下面所示的固相合成方案制备，开始于用于寡核苷酸合成的固体支持物的初始去保护，然后将固体支持物与第一核苷酸偶联，硫醇化以得到硫代磷酸酯，并重复去保护和偶联以得到整个寡核苷酸序列。
下文描述了本文提供的寡核苷酸的一般合成。
去保护：将二甲氧基三苯甲基-1,3-丙二醇乙醇酸酯保护的受控孔径玻璃固体支持物(DMTO-C3-CPG，堆积密度0.26-0.36g/cc，负载30-40μmol/g)与甲苯中的3％二氯乙酸(v/v)在25℃下反应，得到去保护的CPG支持物。测量反应混合物的等分试样的UV吸收以鉴定反应终点(波长350nm，目标最小吸光度0.25OD，使用固定的观察命令设置)并确认二甲氧基三苯甲基保护基团的去除。
激活/偶联：在60％核苷酸浓度下激活剂5-乙硫基-1H-四唑(ACN中0.5M)存在下，通过在25℃下向含有去保护的CpG支持物的反应器中加入并混合所需的3’核苷酸(3当量)5分钟，使去保护的CpG支持物与用于3’末端的第一核苷酸亚磷酰胺前体偶联，用于待合成的相应寡核苷酸。
硫醇化/硫化：在偶联步骤后，通过加入在干ACN中的0.15MPolyorg Sulfa(3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮)，将加入的核苷酸前体的连接亚磷酸三酯部分硫醇化(或硫化)，以得到硫代磷酸酯。
加帽：硫化后，用两种加帽组合物(加帽组合物A：ACN中的20％N-甲基咪唑；加帽B组合物B：20％乙酸酐、30％吡啶、50％ACN)处理CpG支持物和连接的核苷酸以封闭未反应的核苷酸反应物。
重复合成：通过重复如上所述的去保护、激活/偶联、硫醇化/硫化和加帽步骤，使用溶液中的合适的亚磷酰胺前体，从3’末端到5’末端依次加入其余的核苷酸，以获得所需的保护形式的寡核苷酸序列。在偶联步骤期间，将所有亚磷酰胺前体与CPG支持物混合5分钟，除了dT-硫代亚磷酰胺，其混合15分钟。
用于合成的所选亚磷酰胺前体如下所示。用分别所示的溶剂和浓度在溶液中制备亚磷酰胺前体，以用于偶联步骤。
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从上述合成步骤获得的示例性Fmoc-保护的寡核苷酸化合物6.1a、6.2a和6.3a如下所示。下面进一步描述化合物6.1a的去保护、纯化和偶联以制备化合物6.1b。
Fmoc保护的、CPG支持的化合物6.1a
Fmoc保护的、CPG支持的化合物6.2a
Fmoc保护的、CPG支持的化合物6.3a
从上述合成获得的Fmoc-保护的、CPG-支持的寡核苷酸化合物6.1a同时从支持物上切割和通过使CPG支持物与20mM二硫苏糖醇在氢氧化铵：甲胺，1:1(v/v)中在室温下反应2小时去保护，以得到粗化合物6.1a。通过离子对反相HPLC(IP-RP-HPLC)纯化粗产物，并通过ESI-MS确认其身份。粗化合物6.1a通过HPLC纯化并脱盐。
随后化合物6.1a与O-[2-(Fmoc-氨基)-乙基]-O’-[3-(N-琥珀酰亚胺基氧基)-3-氧代丙基]聚乙二醇(Fmoc-N-酰胺基-dPEG24-NHS酯)在碳酸氢钠缓冲液中反应，以得到Fmoc保护的化合物6.1b。在室温下，使Fmoc保护的化合物6.1b与20mM二硫苏糖醇在氢氧化铵：甲胺，1:1(v/v)中反应2小时，以得到粗化合物6.1b。通过离子对反相HPLC(IP-RP-HPLC)纯化粗产物，并通过ESI-MS确认其身份。粗化合物6.1b通过HPLC纯化，脱盐并冻干，以得到纯化的寡核苷酸6.1b。
抗体的产生
根据制造商的手册，内部产生的抗体通常在Expi293系统(ThermoFisher)的悬浮培养物中表达。使用MabSelectLX色谱(GE)通过蛋白A捕获纯化表达的抗体，用0.1M柠檬酸盐(pH 3.3)洗脱，并在1X PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)的最终缓冲液组合物中透析。无岩藻糖基化抗体通常通过在Expi293系统中共表达化合物2-氟岩藻糖或5-烷基岩藻糖衍生物来产生。
通过mTG(微生物转谷氨酰胺酶)的一步缀合方法
具有序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)的Q-标签与抗体重链的C-末端遗传连接。为了进行缀合，首先将纯化的抗体(在重链的C末端含有工程化的Q标签)交换缓冲液到25mMTris、150mM NaCl pH8中。以1:1.3的摩尔比添加含Ab-Q-标签的部分和CpG，并在室温下与终浓度1％mTG(w/v)(Ajinomoto)一起孵育过夜。用于缀合的抗体的终浓度通常为～20-25μM。将混合物加载到在20％缓冲液B(40mM Tris，2M NaCl pH 8)和80％缓冲液A(40mM Tris，pH 8)中平衡的Q Sepharose HP(GE)上。用5倍柱体积的20％缓冲液B洗涤柱。用30倍柱体积的20％B至60％B的线性梯度实现分离。将DAR1峰级分(与一个CpG部分缀合的Q标签)合并并浓缩，然后使用S200(GE)进行凝胶过滤步骤。合并单体峰级分并浓缩。
CpG-核苷酸和抗体-CpG核苷酸缀合物的生物学评价
从Vitalant接收Trima残余物，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS,Gibco)1:4稀释。将稀释的血液分到两个管中，并用15mL Ficoll-Paque(GE Healthcare)稀释(underplayed)。将管以400×g离心30分钟。从界面收集PBMC并重悬于FACS缓冲液(具有0.5％牛血清白蛋白(Gibco)的PBS)中。根据制造商的方案，使用B细胞分离试剂盒II、人(Miltenyi Biotec)和LS柱(Miltenyi Biotec)通过负向选择纯化B细胞。
立即将PBMC铺板到完全RPMI(RPMI+10％FBS)中的96孔形式上(500K/孔)。在37℃、5％CO2下，将100nM至6.4pM的抗体和缀合的抗体以及1μM至64pM的CpG寡核苷酸的五倍连续稀释液添加至细胞48至96小时。通过以400×g离心5分钟使细胞沉淀，并在4℃下在PBS中1:4000稀释的可固定活力染料eFluor 780(Thermo Fisher)中染色。将细胞离心并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述FACS缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、用于B细胞测定的抗CD19、抗CD20、抗CD40、抗HLADR和抗CD80以及用于pDC测定的抗CD14、抗CD3、抗CD19、抗CD14、抗CD123、抗CD11c和抗CD86。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次，并在0.5％多聚甲醛中固定。向每个孔中加入CountBrightTM绝对计数珠(Thermo Fisher)以计数细胞数。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过FlowJo 10.7(Treestar)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群体进行门控来排除死细胞。在门控CD123+CD11c-细胞以鉴定pDC和门控CD19+、CD20+或CD19+CD20+细胞以鉴定B细胞之前，首先排除谱系特异性细胞(CD19、CD3、CD14)。
实施例1：人PBMC中游离免疫调节寡核苷酸(CpG)的活性
用游离CpG(SEQ ID NO:3和26-28)处理人PBMC以评价其各自的活性，如通过CD19阳性B细胞上的HLADR和CD40表达所观察到的(如图1A-1B所示)。与CpG(SEQ ID NO:3)相比，CpG(SEQ ID NO:26-28)都显示出增强的活性。
实施例2：免疫调节寡核苷酸的活性
测试了各种CpG寡核苷酸SEQ ID NO:3-25对B细胞的增殖和/或激活的影响。图2A-2C显示了单独的选择CpG的各自活性。所有测试的CpG寡核苷酸在孵育48小时后增强了B细胞的激活。如通过计数珠来计算绝对B细胞数和CD40表达所确定的，所有CpG增加了B细胞数和CD40表达。与CpG(SEQ ID NO:3)相比，选定数目的所测试CpG寡核苷酸显示出对B细胞增殖和激活的增强作用。
实施例3：转谷氨酰胺酶介导的缀合
使用与PEG化接头(-NH-C(＝O)-PEG23-NH2，结构如下所示)配位的寡核苷酸A(具有序列：tucgtcgtgacgtt，SEQ ID NO:1)和Q-标签肽序列SEQ ID NO:39-47和50-52测试了转谷氨酰胺酶介导的缀合。
在PBS中0.04nmol转谷氨酰胺酶的存在下，将2nmol Q-标签加入1nmol接头中。接头的终浓度为50μM。将反应保持在室温下，并在1小时时用8M甲酰胺淬灭。反应溶液使用具有Xbridge C18柱(4.6×150mm)的反相HPLC，使用溶剂A(水中50mM TEAA)和溶剂B(乙腈)，在60℃下10分钟内20％至60％的溶剂B梯度进行分析。或者，反应溶液使用具有Luna 3μC18柱(4.6×50mm)的反相HPLC，使用溶剂A(水中0.1％TFA)和溶剂B(乙腈中0.1％TFA)，在50℃下10分钟内10％至70％溶剂B的梯度进行分析。
图3显示了与各种Q-标签的转谷氨酰胺酶介导的缀合和肽脱酰胺的产率。RPQGF(SEQ ID NO:47)、RPQQF(SEQ ID NO:46)、RPRPQQF(SEQ ID NO:50)显示出高缀合物百分比和中等低的脱酰胺作用。
图4A-4B显示了由具有SEQ ID NO:39和47的Q-标签制备的两种缀合物随时间的缀合和去缀合。RPQGF(SEQ ID NO:47)在16小时的持续时间内测试的所有Q-标签：接头+CpG比率下具有较高的缀合百分比。此外，与LSLSPGLLQGG(SEQ ID NO:39)相比，RPQGF(SEQ IDNO:47)的去缀合速率也更慢。
实施例4：评价游离CpG对CD19+B细胞的CD40表达的活性
材料和方法
从Vitalant接收Trima残留物并用磷酸盐缓冲液(PBS,Gibco)以1:2稀释。将稀释的血液分成两个管并用15mL Ficoll-Paque(GE Healthcare)稀释。以400x g将管离心30分钟。从界面收集PBMC，在FACS缓冲液(含0.5％牛血清白蛋白(Gibco)的PBS)中重悬并洗涤。洗涤一次后，将PBMC重悬在完全RPMI(RPMI+10％FBS)中。
将PBMC立即铺板到完全RPMI中的96孔形式(500K/孔)上。在37℃下在5％CO2中，将从1μM至64pM的CpG寡核苷酸的五倍连续稀释液添加至细胞中，持续48小时。通过在400x g下离心五分钟使沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor780(Thermo Fisher)中染色。将细胞离心，并在FACS缓冲液中在4℃下染色30分钟，该缓冲液含有FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD20、抗CD40、抗HLADR和抗CD80。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定于0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(Treestar)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群门控排除死细胞。B细胞鉴定为CD19+CD20+细胞，并且通过中位荧光强度评估活化标记物的水平。
对于Ramos NFkb报告子测定，Ramos-Blue细胞NF-kB/AP-1报告子B淋巴细胞购自Invivogen。使细胞生长并保持在补充了2mM L-谷氨酰胺、10％FBS、100μg/mL Normacin、Pen-Strep、100μg/mL博莱霉素的完全DMEM中。对Ramos-Blue细胞进行刺激。简言之，在不具有抗生素的生长培养基中冲洗细胞。将细胞计数并以2x 106个细胞/mL的密度重悬在不具有选择抗生素的新鲜完全DMEM中。将1:5滴定的20μL的10μM CpG 7-7(7-7b；SEQ ID NO:35)、CpG 12070(SEQ ID NO:3)和ODN2006添加到平底96孔板中，添加180μL细胞悬液至1μM至64pM CpG的最终浓度。在5％CO2培养箱中在37℃下孵育培养板24h。在测定当天，在使用前将QB试剂和QB缓冲液解冻。通过在无菌玻璃瓶中将1mL QB试剂和1mL QB缓冲液添加至98mL无菌水中来制备Quanti-Blue溶液。每孔分配180μLQuanti-Blue溶液至新的平底96孔板中。接着将来自经处理的Ramos-Blue细胞的20μL上清液添加至96孔板中。接着孵育培养板6h。使用读板器(Molecular Devices)在OD655下测量光密度，并且用GraphPad Prism9.0对数据制表。
结果
将人PBMC用游离CpG处理以评估其各自的活性，通过CD19阳性B细胞上的CD40表达观察。如图5中所示，与CpG 12070(SEQ ID NO:3)相比，系列7CpG(SEQ ID NOS:29、30和32-36)全部均显示活性增强。
在NFkb报告子测定中，比较CpG寡聚物7-7、12070和ODN2006(5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’；SEQ ID NO:167)。如图6中所示，与12070和ODN2006相比，CpG 7-7显示出显著更高的活性。
实施例5：评估CpG对于来自不同供体的PBMC的活性
比较CpG寡聚物7-6、7-7和12070在来自三个不同供体系(D559、D804和D643)的PBMC细胞中的活性，如通过CD40表达观察的。使用与上述实施例4相同的方法进行CpG寡聚物活性评价。
结果显示，与12070相比，7-6和7-7的更高活性不取决于供体(图7A-7C)。
实施例6：5’溴2’脱氧尿苷和PEG连接对CpG活性的贡献
对于在人PBMC中评价CpG寡核苷酸，自Vitalant接收Trima残基并用磷酸盐缓冲液(PBS,Gibco)以1：4稀释。将稀释的血液分成两管并用15mL Ficoll-Paque(GE Healthcare)稀释。将管以400×g离心30分钟。从界面收集PBMC并重悬于FACS缓冲液(具有0.5％牛血清白蛋白(Gibco)的PBS)中。立即将PBMC铺板到完全RPMI(RPMI+10％FBS)中的96孔形式上(500K/孔)。在37℃、5％CO2下，将自1μM至64pM的CpG寡核苷酸的五倍连续稀释液添加至细胞中，持续48至96小时。细胞通过在400x g下离心五分钟沉淀，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(Thermo Fisher)中染色。将细胞离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，该缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD40和抗CD86。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在AttuneNxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(Treestar)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群门控排除死细胞。门控CD19+、CD20+或CD19+CD20+细胞以鉴定B细胞。使用GraphPad Prism 9.0对数据制表。
如图8中所示，在5’尿苷处无溴修饰的CpG寡核苷酸9-9和9-10活化CD86表达。这暗示溴修饰不是各个寡核苷酸的必需组分。
实施例7：抗连接蛋白-4抗体的产生
使用专有的人幼稚B细胞噬菌体文库来筛选抗人连接蛋白-4抗体。用于产生人幼稚噬菌体文库的方法如Clackson等，Nature 1991,352,624-628或Marks等，J.Mol.Biol.,1991,222:581-597中所描述。对于该人连接蛋白-4抗体发现程序，使用AcroBiosystems h连接蛋白4-ECD-His-Avi蛋白(目录号：NE4-H52H3)和h连接蛋白4ECD-6His-Avi蛋白构建体(TNT174；参见表19)来完成5轮噬菌体淘选。将最终富集的混合噬菌体克隆铺板，以获得单克隆。通过ELISA测定筛选扩增的噬菌体颗粒，并对靠前克隆进行测序和分析。
在室温下，将IMMULONTMELISA板(THERMO SCIENTIFICTM；目录号3855)与50μL/孔的含2μg/mL人连接蛋白-4胞外域(ECD)(Acrobiosystems；目录号NE4-H52H3)的磷酸盐缓冲液pH 7.4或含10％牛血清白蛋白(BSA)的PBS一起孵育过夜，用TBST(25mM Tris，0.15M NaCl，0.05％Tween-20，pH 7.5)洗涤，并在室温下用300μL/孔的含2％BSA的PBS封闭1小时。将板用TBST和50μL/孔的新鲜制备的噬菌体克隆培养物洗涤，以1:100稀释于含2％BSA的PBS+0.01％Tween-20中，并添加至包被有人连接蛋白-4的孔和包被有10％BSA的孔中，并在室温下孵育1小时。在100μL/孔、0.5μg/mL的稀释于含2％BSA的PBS+0.01％Tween-20中的抗M13噬菌体衣壳蛋白g8p抗体孵育1小时之前，将板用TBST洗涤。在用TBST洗涤后，将100μL/孔的含0.5μg/mL HRP缀合的山羊抗小鼠IgG的2％BSA/PBS+0.01％Tween-20添加至各孔中，并在室温下孵育1小时。各孔用TBST洗涤，并将100μL/孔的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺过氧化酶底物添加至板，持续约2-5分钟。反应用100μL/孔的0.16M硫酸终止，并参考570nm，使用读板器在450nm处测量所得光密度(O.D.)吸光度。
基于人连接蛋白-4包被的孔的O.D.除以BSA包被的孔的O.D.，将克隆分成四个层级。各层级为>10倍(176个克隆中的38个)、>5-10倍(176个克隆中的43个)、2-5倍(176个克隆中的62个)和小于2倍(176个克隆中的33个)。
对于>10倍效价的38个克隆进行测序。在序列分析之后，选择11个克隆。使用所选择可变结构域作为小鼠IgG2a抗体，产生全长重组单克隆抗体。在HEK293悬浮培养物中表达抗体，并且通过蛋白A捕获层析纯化，用0.1M柠檬酸盐(pH 3.3)洗脱，然后在1x PBS的最终缓冲组合物中透析。抗体(对于小鼠IgG2a构建体，分别称为TNT-188、TNT-189、TNT-190、TNT-191、TNT-192、TNT-193、TNT-194、TNT-195、TNT-196、TNT-197和TNT-198)的VL和VH序列总结在表7(VH结构域)和表8(VL结构域)中。亦产生所报道的连接蛋白-4抗体序列并称为TNT-153(VH和VL序列也在表7和表8中)。小鼠IgG2a序列的轻链和重链序列分别总结在表12和表13中。
相应抗体也经工程改造为具有人IgG1的全长抗体。人IgG1抗体称为TNT-201、TNT-202、TNT-203、TNT-204、TNT-205、TNT-206、TNT-207、TNT-208、TNT-209、TNT-210、TNT-211和TNT-212。VH和VL结构域分别总结在表7和表8中。轻链和重链序列分别总结在表14和表15中。
对于这些抗体中的每一个，根据Chothia、Kabat和IMGT的CDR鉴定分别总结在表9、表10和表11中。
实施例8：连接蛋白-4抗体的表征
连接蛋白-4抗体与连接蛋白-4结合的初始测试。通过表面等离子体共振(SPR)，使用Bio-Rad ProteOnTM，评估呈小鼠IgG2a形式的前述实施例中描述的连接蛋白-4抗体与人连接蛋白-4ECD(TNT-175)的结合。将生物素化蛋白A(15μg/mL)固定在NLC芯片表面。将30nM纯化mAb上清液稀释在PBS-T中，并捕获在蛋白A表面上。将人连接蛋白-4的连续稀释液注射至mAb包被的芯片上，并测试结合动力学。使用4：1v/v的IgG洗脱脂/4M NaCl再生芯片。结合数据总结在下表18中。
表18：与人连接蛋白-4的结合
| 抗体 | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) |
| TNT-188 | 2.17E+05 | 1.53E-03 | 7.03E-09 |
| TNT-189 | 8.32E+05 | 4.23E-03 | 5.09E-09 |
| TNT-190 | 2.65E+05 | 8.31E-03 | 3.14E-08 |
| TNT-191 | 2.29E+05 | 9.83E-04 | 4.30E-09 |
| TNT-192 | 3.22E+05 | 2.94E-03 | 9.14E-09 |
| TNT-193 | 2.24E+06 | 8.37E-03 | 3.73E-09 |
| TNT-194 | 3.92E+06 | 2.30E-03 | 5.85E-10 |
| TNT-195 | 9.30E+05 | 1.25E-03 | 1.34E-09 |
| TNT-196 | 1.62E+06 | 2.45E-02 | 1.52E-08 |
| TNT-197 | 7.80E+05 | 3.34E-03 | 4.28E-09 |
| TNT-198 | 6.84E+04 | 1.38E-03 | 2.02E-08 |
| TNT-153 | 1.05E+06 | 3.99E-03 | 3.80E-09 |
所有连接蛋白-4抗体均在30nM至0.5nM范围内与人连接蛋白-4结合。
对所选择连接蛋白-4抗体对人、小鼠和食蟹猴连接蛋白-4的进一步测试。对连接蛋白-4抗体进行额外评估以测量与人、小鼠和食蟹猴连接蛋白-4的结合。使用Biacore 8K(Cytiva,Marlborough,MA)来进一步表征连接蛋白-4单克隆抗体中的四者的结合。比较其对人连接蛋白-4-ECD(TNT-175)、小鼠连接蛋白-4-ECD(TNT-250)、人连接蛋白-4-IgV(TNT-252)结构域构建体和食蟹猴连接蛋白4-ECD(TNT-255)蛋白构建体的结合亲和力(对于构建体，参见表19)。
表19：蛋白构建体。
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所有实验均在25℃温度下且在HBS-EP+运行缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，150mMNaCl，3mM EDTA，0.05％Tween-20)中进行。通过在CM5上的胺偶合方法或通过蛋白A芯片捕获或通过抗小鼠多克隆抗体或抗人多克隆抗体捕获，将抗体捕获或固定在Biacore芯片上。视亲和力而定，使用从1nM至900nM的抗原蛋白的3x或5x连续稀释液，进行单周期动力学或多周期动力学。在Biacore Insight评价软件中，使用数据的双重参考减除处理和分析数据，并且接着使用用于每个样品的结合(Ka)、解离(Kd)和Rmax值的全局动力学速率常数，将其拟合至简单Langmuir结合模型。通过检查残差和统计学T值确定拟合质量，并且通过动力学速率常数的比率KD＝Kd/Ka推断平衡解离(或亲和力)常数。
TNT-212相比，所报道的连接蛋白-4抗体、TNT-207和TNT-208以更高亲和力与人连接蛋白-4ECD、人连接蛋白-4-IgV和食蟹猴连接蛋白-4ECD结合。对于人连接蛋白-4ECD和食蟹猴人连接蛋白-4ECD两者，TNT-210具有与TNT-212相当的结合亲和力。TNT-203、TNT-207、TNT-208和TNT-2120亦以115nM至6nM的不同亲和力结合小鼠连接蛋白-4ECD。未在目前分析格式中获得TNT-212与小鼠连接蛋白-4ECD结合的高品质动力学数据。结合结果概述在下表20中。
表20：抗体与连接蛋白-4蛋白的结合
将来自表20的四种连接蛋白-4抗体(TNT-203、TNT-207、TNT-208和TNT-210)与CpG7-7(7-7b；SEQ ID NO:35)缀合，并且缀合物以与未缀合的抗体相同的KD结合人连接蛋白-4ECD抗原(数据未显示)。这表明，CpG寡核苷酸与连接蛋白-4抗体的结合不会干扰连接蛋白-4抗体与连接蛋白-4的结合。
连接蛋白-4抗体的细胞结合。还评估了连接蛋白-4抗体的细胞结合。MNK74(连接蛋白-4阳性)和AGS(连接蛋白-4阴性)细胞获自ATCC，并且根据其方案培养。细胞用TrypLE(Gibco)分离并且通过在400x g下与FACS缓冲液(PBS+2％FBS)一起离心五分钟洗涤。将细胞重悬在FACS缓冲液中，在96孔形式中铺板(0.25e6/孔)，然后通过在400x g下离心五分钟沉淀。将细胞在4℃下在以1:4,000稀释在PBS中的可固定活力染料eFluor 506(eBioscience)中染色。将细胞离心并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭剂(MiltenyiBiotec)以及以下抗体中的每一个(TNT-188、TNT-189、TNT-190、TNT-191、TNT-192、TNT-193、TNT-194、TNT-195、TNT-196、TNT-197、TNT-198或TNT-153)。将细胞离心，在FACS缓冲液中洗涤一次并在4℃下用以1:400稀释于GACS缓冲液中的山羊F(ab’)2抗小鼠IgG APC(Southern Biotech)染色30分钟或用适当抗人IgG。将细胞离心，洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 506阴性群门控排除死细胞。通过阳性对照小鼠抗人连接蛋白-4-AF488(R&DSystems)确定连接蛋白4表达水平。通过中位荧光强度评估结合。
所测试的全部连接蛋白-4抗体(TNT-188至TNT-198和TNT-153)特异性结合表达人连接蛋白-4的MNK74细胞，并且不会结合不表达人连接蛋白-4的AGS细胞。结果总结在下表中。
表21：抗体与连接蛋白-4阳性细胞的结合
连接蛋白-4抗体的竞争实验。在4℃下，ELISA板用1mg/mL在PBS中的山羊抗小鼠IgG包被过夜。板用300μL ELISA洗涤缓冲液(25mM Tris，150mM NaCl，0.05％Tween20)洗涤3x，接着与1mg/mL捕获抗体(TNT-153和TNT-188至TNT-198，连接蛋白-4抗体作为小鼠IgG2a)在室温下孵育一小时。同时，将在2mg/mL下的各抗体(TNT-201-TNT212，连接蛋白-4抗体作为人IgG1)的预混合物在室温下在具有连接蛋白-4-ECD-6His-Avi(TNT-175)稀释液的稀释剂(具有0.5％BSA的PBS)中孵育一小时，从TNT-175与每种抗体的2:1摩尔比降至0.031:1摩尔比。作为阳性对照，连接蛋白-4在无预混合抗体的情况下以相同浓度稀释。每个板针对稀释剂仅分配两个孔作为阴性/背景对照。如前洗涤培养板，将50μL/孔的预混合物添加到各板中并孵育一小时。洗涤板，接着在室温下与以1:4,000稀释在稀释剂中的家兔抗6X HIS HRP孵育一小时。再次洗涤板，并在室温下与50μL/孔的ABTS底物孵育20分钟。在405nm处读板，导出数据并通过Excel进行分析。结合以归一化到背景的光密度(O.D.)值来衡量，并以最低连接蛋白-4稀释度下阳性对照的百分比来计算以获得最大分辨率。100％表示结合抗体连接蛋白-4复合物的能力，从而表示非阻断抗体，而0％表示未观察到结合，从而表示阻断抗体。
所有抗体均彼此抑制结合人连接蛋白-4的能力。阻断的程度与各抗体的解离速率(Kd 1/s)和总亲和力良好相关。具有较快解离速率的那些(如TNT-205)难以完全阻断自身。在预混合形式中，这些抗体可由较高亲和力捕获抗体启动(kicked off)。在评估捕获和预混取向两者中的结合时，没有连接蛋白-4抗体能够夹住并因此全部能够表征为彼此的阻断剂。结果总结在图10中。
实施例9：连接蛋白-4抗体的内化
根据生产厂商的方案，抗体TNT201-TNT212使用蛋白标记试剂盒(Invitrogen)用AlexaFluor-647标记。简言之，将含100-150μg抗体的碳酸氢钠缓冲液(pH 8.3)与反应性染料在轻柔搅拌下在室温下孵育1小时。通过体积排阻色谱，使用试剂盒中提供的纯化树脂和柱除去未掺入的染料。表达人连接蛋白-4的细胞T47D来源于ATCC并且根据其建议进行培养。细胞用TrypLE(Gibco)分离并通过用FACS缓冲液(具有1％BSA的PBS)在400x g下离心5分钟洗涤。将细胞重悬在FACS缓冲液中并等分在11个管中，各样品的一个管各自1mL，每管总共2百万个细胞。各管在4℃下用10μg经标记的TNT抗体染色60分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并且每个样品重悬在1mL FACS缓冲液中。将细胞在黑暗中保持在冰上，直至每个样品管100μL等分试样在5％CO2培养箱中在时间-3小时、-2小时、-1小时、-45分钟、-30分钟、-15分钟、-10分钟、-5分钟内化时转变为37℃，以使得所有时间点均在同时完成。在从培养箱移出后，将细胞用FACS缓冲液洗涤，然后再重悬于以23.9U/mL稀释在PBS(Gibco)中的100μL木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶来自papaya latex,Sigma)中，并在37℃下孵育30分钟。然后，洗涤细胞并在4℃下在以1:2000稀释在PBS(Gibco)中的可固定活力染料eFluor 506(eBioscience)中染色30分钟。细胞用FACS缓冲液再洗涤一次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor506阴性群门控排除死细胞。通过各时间点的中位荧光强度评估样品。在0分钟时间点的4℃样品用作“无内化”对照，并因此将其认为具有100％抗体-AlexaFluor-647定位在细胞表面上。因此，将内化的抗体-AlexaFluor-647计算为在4℃下与在37℃下表面定位抗体之间的差异，并表述为相对于4℃样品的值的百分比。
所有TNT抗体均呈现内化，除了TNT203，其显示极少至没有内化。最高内化水平是在TNT207、TNT210、TNT208和TNT202的情况下可见。TNT207似乎呈现比TNT212更高的内化速率。结果总结在下表22和图15中。
表22：连接蛋白-4抗体内化
| 抗体 | 内化％(在3小时) |
| TNT-201 | 14.5％ |
| TNT-202 | 23.0％ |
| TNT-203 | 1.5％ |
| TNT-204 | 14.3％ |
| TNT-205 | 15.0％ |
| TNT-207 | 37.8％ |
| TNT-208 | 18.4％ |
| TNT-209 | 15.3％ |
| TNT-210 | 21.1％ |
| TNT-211 | 9.5％ |
| TNT-212 | 31.1％ |
实施例10：连接蛋白-4抗体与CpG寡核苷酸的缀合
将具有序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)的缀合标签工程化至所有重组单克隆抗体重链表达构建体的C末端上。这使得CpG寡核苷酸能够与抗体的C末端缀合。所有DNA构建体通过ATUM(Menlo Park,CA,USA)进行密码子优化并合成。所有抗体均在Expi293表达系统(Life Technology,USA)中瞬时表达。对于与CpG寡核苷酸缀合，以5-20μM将蛋白A亲和层析纯化的连接蛋白-4抗体添加到缀合反应中，与1-10μg微生物转谷氨酰胺酶以适当摩尔比的CpG寡核苷酸与mAb在室温下孵育过夜。如果需要，通过体积排阻色谱或其他精制方法进一步纯化来自阴离子交换层析的适当DAR峰级分。最终抗体及其CpG缀合物在1X PBS pH 7.4中，以用于体外和体内测定。制备具有Q标签的人IgG1形式的抗体TNT-201至TNT-212中的每一个(即，分别在表14和表15中公开的轻链和重链)，并将其与各自CpG寡核苷酸缀合。连接蛋白-4缀合物及其名称的列表显示在表23中。TNT-347xx是与TLR8激动剂缀合的TNT-337抗体。TNT-381xx是与MMAE缀合的TNT-212抗体。
表23：连接蛋白-4缀合物列表
实施例11：通过连接蛋白-4抗体CpG缀合物活化单核细胞
从Vitalant接收Trima残留物并以1:2用PBS稀释。稀释的血液下面铺有15mLFicoll-Paque。将管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。紧接着将PBMC在完全RPMI中的96孔形式(0.5e6/孔)上铺板。以20:1(效应物：靶标)，将来自用CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记的DLD-1亲本或经转导以过度表达连接蛋白-4和GFP的DLD-1的肿瘤细胞(0.025E6/孔)添加至PBMC中。在37℃下，在5％CO2下，将从300nM至0.41nM的连接蛋白-4抗体-CpG缀合物的三倍连续稀释液添加至细胞中，持续18小时。通过在400xg下离心五分钟使沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(ThermoFisher)中染色。将细胞离心并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD326、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD19、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD40、抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群门控排除死细胞。单核细胞被鉴定为CD3-CD19-CD14+细胞。通过中位荧光强度评估CD14+单核细胞活化水平。
如图11中所示，在连接蛋白-4-CpG缀合物与连接蛋白-4阳性肿瘤细胞和人单核细胞接合后，在人单核细胞上存在CD86的稳健诱导。所测试抗体缀合物是TNT264a、TNT265a、TNT266a、TNT267a和TNT169a。在通常情况下，相对于连接蛋白-4阴性亲本DLD-1肿瘤细胞，所有CpG缀合物在连接蛋白-4阳性肿瘤细胞中测试时均显示更高活性。
实施例12：通过连接蛋白-4抗体-CpG缀合物活化树突状细胞
从Vitalant接收Trima残留物并以1:2用PBS稀释。稀释的血液下面铺有15mLFicoll-Paque(GE Healthcare)。将管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。紧接着将PBMC在完全RPMI中的96孔形式(0.5e6/孔)上铺板。以20:1(效应物：靶标)，将来自用CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记的DLD-1亲本或经转导以过度表达连接蛋白-4和GFP的DLD-1的肿瘤细胞(0.025E6/孔)添加至PBMC中。在37℃下，在5％CO2下，将从300nM至0.41nM的连接蛋白-4抗体-CpG缀合物的三倍连续稀释液添加至细胞中，持续18小时。通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(ThermoFisher)中染色。将细胞离心并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD326、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD19、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD40、抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在AttuneNxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群门控排除死细胞。将DC鉴定为CD3-CD19-CD14-CD56-HLADR+CD11c+细胞。通过中位荧光强度评估DCM活化水平。
如图12中所示，连接蛋白-4阳性肿瘤细胞和人DC的连接蛋白-4CpG缀合物接合显示稳健诱导CD40。所测试抗体缀合物是TNT264a、TNT265a、TNT266a、TNT267a和TNT169a。相反，在连接蛋白-4阴性肿瘤细胞的情况下，观察到有限至无CD40诱导。
实施例13：肿瘤吞噬作用的增强
根据生产厂商的方案，用Ficoll-Paque Plus(GE)和负向选择(单核细胞分离试剂盒II，Miltenyi Biotec)从Trima残留物(Vitalant)纯化人CD14+细胞。通过将100万个CD14+细胞接种至150mm组织培养皿(Corning)中的补充有10％FBS和50ng/mL MCSF(MiltenyiBiotec)的RPMI1640中，制备极化成M2表型的单核细胞来源的巨噬细胞。培养细胞7-11天。将DLD-1靶细胞转导以过表达连接蛋白-4和GFP。用TrypLE Select(Thermo Fisher)从培养板将贴壁细胞分离。在37℃下，在5％CO2下，将100,000个靶细胞和50,000个巨噬细胞与从1μM至1.37nM的CpG寡核苷酸或300nM至0.41nM的连接蛋白-4抗体缀合物的三倍连续稀释液，在超低连接U型底96孔板(Corning)中培养2小时。对于流式细胞术，将细胞在人FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)中孵育并用荧光染料标记的抗CD33和CD14的抗体(ThermoFisher)染色。为了从分析中消除巨噬细胞/靶细胞粘附，包括针对CD326的抗体(ThermoFisher)。此外，前向散射信号区域与高度的脉冲几何门控用于选择单细胞。将可固定活力染料eFluor780(Thermo Fisher)用于鉴定活细胞。在FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)上获取细胞，随后使用FlowJo 10.7软件(BD)进行分析。吞噬作用百分比表示CD326染色呈阴性且CFSE呈阳性的活CD33+CD14+巨噬细胞的百分比。
如图13中所示，具有连接蛋白-4CpG缀合物的巨噬细胞对DLD-1连接蛋白-4肿瘤细胞存在稳健的吞噬作用。所测试的缀合物是TNT264a、TNT265a、TNT266a、TNT267a和TNT169a。所有缀合物显示出实质上较高活性，而未缀合的CpG寡核苷酸(CpG 7-7)似乎不会引起可检测的吞噬作用。
实施例14：细胞因子分泌的增强
从Vitalant接收Trima残留物并以1:2用PBS稀释。稀释的血液下面铺有15mLFicoll-Paque(GE Healthcare)。将管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。紧接着将PBMC在96孔形式(0.5e6/孔)上的完全RPMI中铺板。以20:1(效应物：靶标)，将来自经转导以过度表达连接蛋白-4和GFP的DLD-1的肿瘤细胞(0.025E6/孔)添加至PBMC中。在37℃下，在5％CO2下，将从300nM至0.41nM的连接蛋白-4抗体缀合物的三倍连续稀释液添加至细胞中，持续72小时。通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并收集上清液以用于根据生产厂商的建议，使用BioLegend LEGENDplexTM人炎症嵌板1基于小珠的免疫测定来定量细胞因子。简言之，在添加细胞因子特异性捕获小珠之前，将上清液在测定缓冲液中铺板。在室温下孵育培养板2小时，然后洗涤两次，之后添加生物素化检测抗体持续1小时。在不洗涤的情况下，将PE缀合的链霉亲和素添加到培养板中，并在室温下孵育30分钟，然后洗涤两次，之后添加缓冲液。接着通过流式细胞术，使用AttuneNxT细胞仪(Thermofisher)处理测定板。数据用FlowJo 10.7软件(BD)分析，并使用GraphPad Prism制表。
如图14A-D中所示，数据表明对于IFNα2、IFNγ、IL6和IL10，在连接蛋白-4CpG缀合物接合连接蛋白-4阳性肿瘤细胞和PBMC后，细胞因子分泌增强。所测试抗体是TNT-203、TNT-207、TNT-208和TNT-210，并且所测试的其对应缀合物分别是TNT-264a、TNT-265a、TNT-266a和TNT-267a。在所有情况下，与其未缀合的抗体对应物相比，缀合物显示出显著增强。图14A-D中的数据表示为缀合物相对于对应的未缀合的连接蛋白-4抗体的活性倍数。
实施例15：连接蛋白-4抗体缀合物的抗肿瘤活性
通过逆转录病毒转导产生表达小鼠连接蛋白-4的MC38肿瘤细胞(MC38连接蛋白-4)，并且分选和扩增表达连接蛋白-4的细胞。在根据生产厂商方案植入与AF647(ThermoScientific)缀合的TNT208之前，评估在经转导的MC38肿瘤细胞中的连接蛋白-4表达(图16A)。在37℃和5％CO2下，在完全DMEM(DMEM+Glutamax+10％FBS(Gibco))中培养MC38连接蛋白-4小鼠结肠癌细胞。细胞用胰蛋白酶0.25％(Gibco)分离并用DMEM(Gibco)洗涤两次。以20E6/mL将细胞重悬在DMEM中并保持在冰上直至使用。将100μL悬浮细胞皮下植入6周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River)的右侧胁腹部。在植入4天后开始直至研究的持续时间，用卡尺测量肿瘤尺寸并记录，每周两次。肿瘤体积使用以下公式计算：(长度×宽度×宽度)/2。一旦肿瘤达到平均80mm3，大致在移植后4天，将小鼠按照肿瘤尺寸随机分组并开始处理。以1、3或10mg/kg，间隔3天，腹膜内施用呈小鼠IgG2a形式的连接蛋白-4抗体缀合物(TNT273a，其包含与CpG4523(SEQ ID NO:499)缀合的TNT153)3个剂量。根据IACUC批准的动物方案，对在研究期间任何时间肿瘤超过2,000mm3或显示出任何痛苦迹象的小鼠进行人道安乐死。CpG4523是tucgtcgtgacgtt-c3(SEQ ID NO:499)，其中碱基1-5通过硫代磷酸酯键连接，碱基5-6通过磷酸三酯键连接，碱基6-14通过硫代磷酸酯键连接，碱基2是碘-尿苷，以及碱基14被c3修饰。
如图16A中所示，在经转导的MC38肿瘤细胞上的连接蛋白-4表达不均匀(左峰表示未染色的细胞)。在图16B中，在MC38连接蛋白-4小鼠模型中，与未缀合的连接蛋白-4抗体(TNT153)相比，全身性施用连接蛋白-4抗体缀合物(TNT273a)显示出强效的剂量依赖性单一药剂活性。在3和10mg/kg下，分别在4只中的2只或5只中的3只小鼠中观察到肿瘤根除。表达变化水平连接蛋白-4表达的肿瘤的根除提示，连接蛋白-4抗体缀合物能够靶向一系列表达连接蛋白-4的肿瘤，包括表达低/中等水平连接蛋白-4的肿瘤。这能够通过触发可靶向表达低/中等水平连接蛋白-4的肿瘤细胞的免疫应答直接和/或间接发生。
实施例16：通过连接蛋白-4抗体缀合物活化T细胞
以1:2用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释Trima残留物(VITALANTTM)。稀释的血液下面铺有15mL Ficoll-Paque(GE Healthcare)，将管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。紧接着将PBMC在96孔形式(0.5E6个细胞/孔)上的完全RPMI中铺板。以20:1(效应物：靶标比率；约0.025E6个肿瘤细胞/孔)，将经转导以过度表达连接蛋白-4和GFP的DLD-1肿瘤细胞添加至PBMC中。将300nM至0.41nM的连接蛋白-4抗体缀合物的三倍连续稀释液添加至细胞中，并在37℃下、在5％CO2下孵育18小时。在孵育后，通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(Thermo Fisher)中染色。将细胞离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD19、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD40、抗CD86和抗CD69(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心，并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群进行门控以排除死细胞。T细胞被鉴定为CD3+细胞。通过中位荧光强度相对于背景的增加％评估T细胞的活化水平。
所测试的缀合物是TNT264a、TNT265a、TNT266a、TNT267a和TNT169a。如图17中所示，除了TNT169a以外的所有缀合物均触发在T细胞上CD69表达的稳健诱导。
实施例17：通过连接蛋白-4抗体缀合物活化NK细胞。
以1:2用PBS稀释Trima残留物(VITALANTTM)。稀释的血液下面铺有15mL Ficoll-Paque(GE Healthcare)，将管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI中。紧接着将PBMC在96孔形式(0.5E6个细胞/孔)上的完全RPMI1640中铺板。以20:1效应物：靶标比率(约0.025E6个肿瘤细胞/孔)，将经转导以过度表达连接蛋白-4和GFP的DLD-1肿瘤细胞添加至PBMC中。将300nM至0.41nM的连接蛋白-4抗体缀合物的三倍连续稀释液添加至细胞中，并在37℃下、在5％CO2下孵育18小时。在孵育后，通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(Thermo Fisher)中染色。将细胞离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色数分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD19、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD40、抗CD86和抗CD69(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心，并在FACS缓冲液中洗涤两次。接着使用转录因子固定/渗透浓缩物和稀释剂(eBioscience)处理细胞以用于细胞内染色。简言之，通过将1份固定/渗透浓缩物与3份固定渗透稀释剂混合，在新鲜固定缓冲液中孵育细胞。在4℃和避光下孵育样品30-60分钟。然后将样品在室温下在600x g离心5分钟。将沉淀重悬于1x渗透缓冲液中，随后进行两轮洗涤和在室温下在600x g下持续5分钟的离心。将沉淀重悬在100μL渗透缓冲液中并在室温下用抗IRF7染色60分钟。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7进行数据分析。通过在eFluor 780阴性群上门控排除死细胞。NK细胞被鉴定为CD56+CD3-细胞。通过中位荧光强度评估NK细胞活性水平。
所测试的缀合物是TNT264a、TNT265a、TNT266a、TNT267a和TNT169a。如图18中所示，除了TNT169a以外的所有缀合物均触发在NK细胞上CD69表达的稳健诱导。如图19中所示，所有缀合物均触发活化NK细胞的IRF7表达，除了TNT265a和TNT169a以外，其显示适度更少活化。
实施例18：连接蛋白-4抗体缀合物的抗肿瘤活性
通过逆转录病毒转导和分选连接蛋白-4表达产生表达小鼠连接蛋白-4的MC38肿瘤细胞(MC38连接蛋白-4)。在37℃、5％CO2下，在完全DMEM(DMEM+Glutamax+10％FBS)中培养MC38-连接蛋白-4细胞。细胞用0.25％胰蛋白酶(Gibco)分离并用DMEM洗涤两次。以20E6个细胞/mL将细胞重悬在DMEM中并保持在冰上直至使用。将100μL悬浮细胞皮下植入6周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River)的右侧胁腹部。在移植4天后开始直至研究的持续时间，用卡尺测量肿瘤尺寸并记录，每周两次。肿瘤体积使用下式计算：(长度×宽度×宽度)/2。一旦肿瘤达到平均70mm3，大致移植后4天，将小鼠按照肿瘤尺寸随机分组并开始处理。以3mg/kg，间隔3天，腹膜内施用呈小鼠IgG2a形式的连接蛋白-4抗体缀合物(TNT302a、TNT303a、TNT304a和TNT273a)3个剂量。根据IACUC批准的动物方案，对在任何时间肿瘤超出2,000mm3或呈现出任何痛苦迹象的小鼠进行人道安乐死。
所测试的缀合物是TNT302a、TNT303a、TNT304a和TNT237a。与抗体缀合的寡核苷酸CpG4523是tucgtcgtgacgtt-c3(SEQ ID NO:499)，其中碱基1-5通过硫代磷酸酯键连接，碱基5-6通过磷酸三酯键连接，碱基6-14通过硫代磷酸酯键连接，碱基2是碘-尿苷，以及碱基14被c3修饰。
如图20A和图20B所示，连接蛋白-4抗体缀合物在MC38连接蛋白-4小鼠模型中呈现强效单一药剂活性。如图20A中所示，TNT303a和TNT304a两者相对于TNT273a均呈现优越的单一药剂活性。在3mg/kg剂量下观察到肿瘤根除。例如，在最终时间点，5只用TNT304a处理的小鼠中的2只无肿瘤(TF 2/5)，和5只用TNT273a处理的小鼠中的1只无肿瘤(TF 1/5)。在另一项实验中并且如图20B中所示，TNT303a相较于TNT302a呈现优越活性，完全肿瘤根除，并且所有经处理的小鼠均无肿瘤(TF 5/5)。
实施例19：其他连接蛋白-4抗体的产生
使用由Kohler和Milstein(Nature,1975；256:495–497)描述的经改良的方案产生杂交瘤。简言之，对AMM-XKL转基因小鼠(Ablexis,California,United States)每周免疫接种50mg与内部TLR激动剂混合液混合的人连接蛋白-4ECD(称为TNT-175)，所述混合液由ODN1826、Poly(I:C)、雷西莫特和(单磷酰脂A)组成。免疫接种途径包括腹股沟、颈后、尾根部皮下以及跗关节和腹膜内。每月对小鼠抽血一次，直至达到所需滴度。收集并合并来自3只小鼠的脾脏和引流淋巴结的免疫细胞。使用小鼠CD138阳性选择试剂盒(STEMCELLTechnologies,Vancouver,Canada)，根据生产厂商的方案，从该细胞混合物分离表达CD138的细胞。使用如STEMCELL Technologies所描述的ECMTM2001电穿孔系统(BTX,Holliston,MA,United States)方法，将分离的细胞与小鼠骨髓瘤细胞(ATCC CRL2016TM)融合。将融合的细胞离心、重悬于与10mg/mL山羊抗小鼠IgG Fc FITC(JacksonImmuno,West Grove,PA,United States)混合的半固体次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)选择培养基(STEMCELLTechnologies,Vancouver,Canada)中，并铺板在NUNCTMOMNITRAYSTM(ThermoFisher,Waltham MA,United States)上。在37℃和7％CO2下孵育板一周。将板成像，并使用2集落选择器系统(Molecular Devices,San Jose,CA,United States)将荧光克隆挑选至培养基E(STEMCELL Technologies)中。在37℃和7％CO2下孵育挑选的克隆，直至汇合。
针对与人连接蛋白-4ECD(TNT-175)结合，通过直接ELISA筛选来自挑选的克隆的上清液。针对HIS标签反筛选阳性克隆，并针对与小鼠连接蛋白-4(TNT-250)的交叉反应性筛选阳性克隆。将阳性克隆再排列并通过SPR进一步表征。
使用修改的5’RACE方案扩增确证的杂交瘤克隆的可变区。简言之，使用PURELINKTMPro 96纯化试剂盒(Invitrogen,Waltham,MA,United States)，根据生产厂商的方案分离RNA。所有反应在设置期间均保持在冰上。使用MAXIMATMH Minus逆转录酶试剂盒(Thermo Fisher)，根据生产厂商的说明书，通过在可变小鼠重链和轻链的恒定结构域中添加基因特异性引物执行逆转录。通过末端脱氧核苷酸转移酶(Thermo Scientific)，根据生产厂商的说明书，利用锁定引物，将PolyA尾添加至合成的cDNA中。接下来，使用定位在重链或轻链区域的恒定结构域中的正向Oligo dT引物和巢式反向引物扩增可变区cDNA。扩增反应物包括1μL合成的cDNA、1μL 10μM正向引物、1μL 10μM反向引物、22μL H2O和25μLDreamTaq Green PCR主混合物(Thermo Scientific)。根据以下热循环仪条件进行PCR：1个循环(95℃持续2分钟)；30个循环(94℃持续30秒，56℃持续30秒，72℃持续1分钟)；随后1个循环(72℃持续10分钟)；和1个循环(4℃永久)。通过电泳，使用2％琼脂糖E-凝胶(Invitrogen)确证扩增子，并在UV光下可视化。扩增子使用MinElute 96UFPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化并且重悬于50μL分子级水(MilliQ)中。送出扩增子至Elim Labs(Hayward,CA)以用于用巢式反向测序引物进行Sanger测序。使用Geneious Biologics(Biomatters,Auckland,New Zealand)分析序列。鉴定并选择独特序列以用于进一步表征。
所选择的克隆包括称为以下的那些：TNT-317、TNT-318、TNT-320、TNT-321、TNT-322、TNT-323、TNT-324、TNT-327、TNT-328、TNT-330、TNT-331、TNT-332、TNT-333、TNT-334、TNT-335和TNT-336。VH、VL和CDR序列列于上表7-11中。
实施例20：抗体表征——亲和力测量和表位分组(binning)
本实施例比较了各实施例的连接蛋白-4抗体，并且确定其识别连接蛋白-4以及其与人、小鼠和食蟹猴连接蛋白-4结合的表位。
KD亲和力确定：所有实验均在25℃下，使用配备有S型传感器芯片的Biacore 8K高通量、高灵敏度SPR系统(Cytiva,Global Life Sciences Solutions USA LLC,Marlborough,MA)进行。运行缓冲液是10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％(v/v)Surfactant P20(HBS-EP+)。通过使连接蛋白-4-ECD在Biacore Series S蛋白A传感器芯片上的蛋白A捕获的抗连接蛋白-4抗体上流动，分析各种抗连接蛋白-4单克隆抗体与重组人连接蛋白-4-ECD-6xHis蛋白(TNT-175)的相互作用。在单循环动力学或多循环动力学模式中，以300nM或900nM的标称初始浓度进行3倍系列稀释，对连接蛋白-4分析物进样。监测结合时间120s，并在30μL/min流速下监测解离时间1800s。表面以30μL/min流速，用在pH 1.7下的10mM甘氨酸或在pH 1.6下的75nM磷酸再生，持续两个15s脉冲。所测试分析物是人连接蛋白-4ECD(TNT-175)、人连接蛋白-4IgV(TNT-252)、小鼠连接蛋白-4ECD(TNT-250)或小鼠连接蛋白-4ECD(TNT-176)以及食蟹猴连接蛋白-4ECD(TNT-255)。
数据用Biacore 8K评估软件3.0.12.15655版(Cytiva,Global Life SciencesSolutions USA LLC,Marlborough,MA)处理并分析。从来自流动池2的活性应答减去来自流动池1的参考应答，获得减除的数据(2-1)。然后，从参考减除的数据(2-1)减去来自最近的缓冲液空白进样的应答，得到双重参考数据。将这些双重参考数据拟合至具有质量迁移的简单1:1Langmuir结合模型，以确定表观结合(ka)和解离速率常数(kd)。然后，基于其比率，如(KD＝kd/ka)，计算表观平衡解离常数或亲和力常数。
表位分组：通过经由胺偶联方法将各种连接蛋白-4抗体固定在Biacore CM5芯片上作为配体，以及在溶液中使用300nM抗原人连接蛋白-4ECD(TNT-175)或300nM TNT-175加3μM竞争性抗体作为分析物，进行SPR分组实验。当仅在单独的人连接蛋白-4ECD存在下同时不存在高浓度的竞争性抗体下观察到阳性结合时，将配体抗体和竞争性抗体认为在相同分组中。
下表24显示了与人连接蛋白-4ECD、人连接蛋白-4IgV结构域、小鼠连接蛋白-4ECD和食蟹猴连接蛋白-4ECD的结合亲和力。另外，显示了表位分组结果。抗体针对人连接蛋白-4ECD的表观亲和力KD在～1nM至260nM。所有抗体均与人连接蛋白-4IgV结构域结合，除了TNT-317、TNT-318、TNT-322、TNT-323、TNT-328、TNT-331、TNT-332和TNT-333以外。所有抗体均与食蟹猴连接蛋白-4ECD结合，除了TNT-336以外。大部分抗体与小鼠连接蛋白-4ECD结合，除了TNT-317、TNT-318、TNT-320、TNT-321、TNT-322、TNT-323、TNT-324、TNT-327、TNT-328、TNT-330、TNT-331、TNT-332、TNT-333、TNT-334、TNT-335和TNT-336。
表24：连接蛋白-4抗体的亲和力和表位分组
实施例21：与人连接蛋白-4和人连接蛋白-1结合的细胞
本实施例显示了上文所述的抗体与各种表达连接蛋白-4的细胞系或表达连接蛋白-1的细胞系的结合。
连接蛋白-4抗体的细胞结合：连接蛋白-4阳性HT-1376、T47-D和SKBR3细胞获自ATCC，并且根据其方案培养。DLD-1经转导以过度表达连接蛋白-4和GFP，并且根据ATCC方案培养。细胞用TrypLE(Gibco)分离，并通过在400x g下与FACS缓冲液(磷酸缓冲盐水，Gibco+2％胎牛血清，Gibco)离心五分钟洗涤。将细胞重悬在FACS缓冲液中，在96孔形式(0.25e6/孔)中铺板，然后通过在400x g下离心五分钟沉淀。将细胞在4℃下在以1:2,000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 506(eBioscience)中染色。根据生产厂商的方案，使用蛋白标记试剂盒(Invitrogen)，用AlexaFluor-647(AF647)标记连接蛋白-4抗体。简言之，将含50μg抗体的PBS与反应性染料试剂在轻柔搅拌下在室温下孵育1小时。通过体积排阻色谱，使用试剂盒中提供的纯化树脂和柱去除未掺入的染料。将细胞离心并在4℃下在FACS缓冲液中染色60分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)以及AF647缀合的连接蛋白-4抗体。将细胞离心，用FACS缓冲液洗涤两次，并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 506阴性群门控排除死细胞。通过中位荧光强度评估结合。
所有连接蛋白-4抗体均与HT-1376、T47-D和SKBR3细胞系中的内源性表达的连接蛋白-4结合，除了TNT-318和TNT-325以外，其与其他抗体相比显示出更差的结合。SKBR3的结果如图21中所示。
在连接蛋白-1细胞上的连接蛋白-4活化特异性：连接蛋白-1阳性和连接蛋白-4阴性的MM1R细胞获自ATCC，并且根据其方案培养。连接蛋白-1阴性DLD-1经转导以过表达连接蛋白-4和GFP，并根据ATCC方案培养。Plateletpheresis Leukoreduction Chamber(LRS室)来自Vitalant，并用PBS以1:3稀释。稀释的血液下面铺有12mL Ficoll-Paque。管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。紧接着将PBMC铺板在96孔形式(0.5e6/孔)上的完全RPMI中。以20:1(效应物：靶标)，将来自用CellTraceCFSE(ThermoFisher)标记的MM1R或经转导以过表达连接蛋白-4和GFP的DLD-1的肿瘤细胞(0.025E6/孔)添加至PBMC中。在37℃下，在5％CO2下，将从300nM至0.41nM的单独连接蛋白-4抗体和抗体-CpG缀合物的三倍连续稀释液添加至细胞中，持续18小时。通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(ThermoFisher)中染色。将细胞离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD19、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD69、抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中，在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群进行门控排除死细胞。T细胞被鉴定为CD3+细胞，单核细胞被鉴定为CD3-CD19-CD14+细胞以及将树突状细胞(DC)鉴定为CD3-CD19-CD14-CD56-CD11C+HLADR+细胞。通过中位荧光强度评估T细胞、单核细胞和DC活性水平。
使用实施例10中描述的方法制备抗体-CpG缀合物。TNT-266a在连接蛋白-4阳性细胞(DLD-1)的活化中具有特异性，并且在连接蛋白-1阳性细胞(MM1R)中未观察到活化。如所预期的，在DLD-1和MM1R细胞系两者中，在裸抗体TNT-208的情况下未观察到活化。
实施例22：抗体内化
本实施例显示了连接蛋白-4抗体之间的内化比较。
首先使用内源性表达的连接蛋白-4T47D细胞系进行内化。然后，还使用外源性转导的连接蛋白-4DLD细胞测试抗体子集。根据生产厂商的方案，使用蛋白标记试剂盒(Invitrogen)，用AlexaFluor-647(AF647)标记称为以下的抗体：TNT-154、TNT-208、TNT-317、TNT-318、TNT-327、TNT-328、TNT-330、TNT-333和TNT-336。简言之，将含100μg抗体的PBS与反应性染料试剂在轻柔搅拌下在室温下孵育1小时。通过体积排阻色谱，使用试剂盒中提供的纯化树脂和柱去除未掺入的染料，表达人连接蛋白-4的细胞T47D来源于ATCC，并根据其建议培养。DLD-1经转导以过表达连接蛋白-4和GFP，并根据ATCC方案培养。细胞用TrypLE(Gibco)分离，并通过在400x g下与FACS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，Gibco+1％牛血清白蛋白，Gibco)离心五分钟洗涤。将细胞重悬在FACS缓冲液中并在4℃下用10μg标记的连接蛋白-4抗体染色60分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并且每个样品重悬在1mL FACS缓冲液中。将细胞在黑暗中保持在冰上，直至每个样品管100μL等分试样在5％CO2培养箱中在时间-3小时、-2小时、-1小时、-30分钟、-15分钟、-5和-0分钟内化时转变为37℃以使得所有时间点在同时完成。在从培养箱移出后，将细胞用FACS缓冲液洗涤，然后分成2个等分试样，其中一个重悬在100μL以23.9U/mL稀释于PBS(Gibco)中的木瓜蛋白酶(来自papaya latex,Sigma的木瓜蛋白酶)中，并且另一1/2重悬在100μL PBS中在37℃下孵育30分钟，然后，洗涤细胞并在4℃下在以1:2000稀释于PBS(Gibco)中的可固定活力染料eFluor 506(eBioscience)中染色30分钟。细胞用FACS缓冲液再洗涤一次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)上分析细胞，然后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor506阴性群进行门控排除死细胞。通过各时间点的中位荧光强度评估样品。将未与木瓜蛋白酶孵育的样品作为“无内化”对照，并因此将其视为具有100％抗体-AlexaFluor-647定位在细胞表面上。将与木瓜蛋白酶在37℃下孵育的来自-0分钟时间点的细胞用作阴性对照。内化的抗体表示为计算为木瓜蛋白酶切割的样品减去阴性对照相对于在37℃下表面定位的抗体减去阴性对照之间的差异的百分比。
结果显示在图22中。在两者细胞系(T47D和连接蛋白-4-DLD)的情况下，所有所测试连接蛋白-4抗体均以不同程度内化，除了TNT-318和TNT-336以外，其与其他抗体相比在T47D中显示出较差内化。
实施例23：使用连接蛋白-4抗体缀合物的免疫细胞活化
本实施例证实上文所述的某些连接蛋白-4抗体对免疫细胞的活化和活性与连接蛋白-4表达水平的相关性。
分别表达高、中和低水平连接蛋白-4的HT1376、OE19和H292细胞获自ATCC，并且根据其方案培养。DLD-1经转导以过表达连接蛋白-4和GFP，并根据ATCC方案培养。Plateletpheresis Leukoreduc tion Chamber(LRS室)来自Vitalant，并用PBS以1:3稀释。稀释的血液下面铺有12mL Ficoll-Paque。管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。肿瘤细胞(0.025E6/孔)用CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记并在96孔形式上在完全RPMI培养基中铺板。将从300nM至0.41nM的连接蛋白-4抗体缀合物的三倍连续稀释液添加到靶细胞中，并在37℃下孵育20分钟。以20:1(效应物：靶标)，将在完全RPMI中的新鲜分离的PBMC(0.5e6/孔)添加到各孔中，并在37℃下、在5％CO2下孵育18小时。通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(ThermoFisher)中染色。将细胞用FACS缓冲液洗涤1x，并离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD 11c、抗CD3、抗CD19、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD69、抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次，并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群进行门控排除死细胞。将T细胞鉴定为CD3+细胞，将单核细胞鉴定为CD3-CD19-CD14+细胞，将NK细胞鉴定为CD3-CD19-CD56+细胞以及将树突状细胞(DC)鉴定为CD 3-CD19-CD14-CD56-CD11C+HLADR+细胞。通过中位荧光强度评估T细胞、单核细胞、NK和DC活性水平。
结果显示在图23-27中。在使用具有变化范围的连接蛋白-4表达的4种癌细胞系(连接蛋白-4-DLD>>HT1376>OE19>H292)的PBMC共培养实验中评估连接蛋白-4-CpG缀合物对T细胞、NK、DC和单核细胞的活化。在所测试的4种细胞系中，对于先天性和适应性通路两者，基于所评估的免疫细胞，所有连接蛋白-4CpG缀合的抗体相对于培养基均具有增加的活化。在过表达连接蛋白-4的DLD-1细胞中，与其他缀合的抗体相比，TNT-266a的T细胞、NK细胞、单核细胞和DC的活化水平更高(图23)。有趣的是，在用OE19的共培养实验中，TNT266a、TNT349a、TNT350a和TNT351a之间的T、NK、单核细胞和DC的活化水平相当(图24)。在使用过表达连接蛋白-4的DLD-1细胞的共培养实验中的所有细胞类型(T、NK、单核细胞和DC)中，与TNT358a相比，TNT354a和TNT266a显示出适度更高的活化水平(图25)。有趣的是，在使用HT1376和H292两者的共培养实验中，与TNT-358a和TNT-266a相比，观察到TNT354a显示出更高的T、NK和DC活化水平(图26和图27)。
实施例24：免疫活化缀合物比较
本实施例考察了某些连接蛋白-4抗体的免疫活化机制。
与连接蛋白-4-TLR8缀合物比较。出于比较目的，合成TLR8激动剂(参见紧接着在下面的结构)用于与在293哺乳动物细胞系中瞬时表达的抗连接蛋白-4抗体(TNT-337)缀合。使用标准蛋白A纯化方法纯化抗体。通过在37℃下对抗体上的半胱氨酸进行TCEP还原1.5h，随后与6-10摩尔过量的具有马来酰胺部分的TLR8激动剂在室温下孵育3至6h，产生抗体-TLR8激动剂缀合物分子(称为TNT-347xx)。反应物通过L-半胱氨酸在室温下淬灭30min，然后使用Zeba旋转柱脱盐。基于MS分析，最终缀合物的DAR为2.5。
OE19细胞获自ATCC，并且根据其方案培养。Plateletpheresis LeukoreductionChamber(LRS室)来自Vitalant，并用PBS以1:3稀释。稀释的血液下面铺有12mL Ficoll-Paque。管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。肿瘤细胞(0.025E6/孔)用CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记并在96孔形式上在完全RPMI培养基中铺板。将从300nM至0.41nM的TNT-208、TNT-208-CpG缀合物、TNT-337和TNT-347xx的三倍连续稀释液添加到靶细胞中，并在37℃下孵育20分钟。以20:1(效应物：靶标)，将在完全RPMI中的新鲜分离的PBMC(0.5e6/孔)添加到各孔中，并在37℃下、在5％CO2下孵育18小时。通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(ThermoFisher)中染色。将细胞用FACS缓冲液洗涤1x，并离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD19、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD123、抗CD40、抗CD69、抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次，并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群进行门控排除死细胞。将T细胞鉴定为CD3+细胞，将单核细胞鉴定为CD3-CD19-CD14+细胞，将NK细胞鉴定为CD3-CD19-CD56+细胞，将浆细胞样树突状细胞(pDC)鉴定为CD3-CD19-CD56-CD11C-CD123+细胞以及将树突状细胞(DC)鉴定为CD3-CD19-CD14-CD56-CD11C+HLADR+细胞。通过中位荧光强度评估T细胞、单核细胞、NK、pDC和DC活性水平。
结果显示在图28中。在多种类型的骨髓谱系以及T和NK效应细胞中，在表达连接蛋白-4的OE19细胞中，与TNT-347xx TLR8-抗体缀合物相比，TNT-266a的活化水平更高。
与连接蛋白-4-抗体-MMAE缀合物比较。出于比较，产生连接蛋白-4定向抗体-药物缀合物(ADC)，其由通过蛋白酶可切割的顺丁烯二酰亚胺基己酰基缬氨酸-瓜氨酸接头而与小分子微管破坏剂单甲基奥瑞他汀E缀合的完全人抗连接蛋白-4IgG1κ单克隆抗体构成(本文中称为mc-vc-PAB-MMAE)。由ATUM(Newark,CA)合成抗连接蛋白-4抗体编码序列。通过在293哺乳动物细胞系中瞬时表达产生抗体TNT-212蛋白。使用标准蛋白A纯化方法纯化抗体。将vedotin接头有效负载与包含抗体的链间二硫键的链间半胱氨酸残基缀合，以产生药物与抗体之比约为3.8:1的产物。缀合的ADC命名为TNT-381xx。
通过逆转录病毒转导产生表达小鼠连接蛋白-4和GFP的MC38肿瘤细胞(MC38连接蛋白-4)，并且分选并扩增连接蛋白-4表达细胞。在37℃和5％CO2下，在完全DMEM(DMEM+Glutamax+10％FBS(Gibco))中培养MC38连接蛋白-4小鼠结肠癌细胞。细胞用胰蛋白酶0.25％(Gibco)分离并用DMEM(Gibco)洗涤两次。以20E6/mL将细胞重悬在DEME中并保持在冰上直至使用。将100μL悬浮的细胞皮下植入6周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River)的右侧胁腹部。在移植4天后开始直至研究的持续时间，用卡尺测量肿瘤尺寸并记录，每周两次。肿瘤体积使用下式计算：(长度×宽度×宽度)/2。一旦肿瘤达到平均73mm3，大致移植后4天，小鼠按肿瘤尺寸随机分组并开始处理。以10或3mg/kg，间隔3天，腹膜内施用TNT-348a3个剂量；以10mg/kg，间隔3天，类似地静脉内施用TNT-381xx 3个剂量。根据IACUC批准的动物方案，对在研究期间任何时间肿瘤超出2,000mm3或呈现出任何痛苦迹象的小鼠进行人道安乐死。
结果显示在图29中。在MC38连接蛋白-4小鼠模型中，全身性施用TNT-348a显示出强效单一药剂活性。在10和3mg/kg两者下的TNT-348a均呈现优于以10mg/kg单剂施用的TNT-381xx的单一药剂活性。
实施例25：非岩藻糖基化连接蛋白-4抗体缀合物
可以使用敲除、敲低技术(例如，miFuc technology)或在瞬时293哺乳动物细胞系中在2-氟岩藻糖化合物存在下表达，产生TNT-208的非岩藻糖基化形式。非岩藻糖基化的TNT-208抗体使用标准蛋白A纯化方法纯化，并按照相同一步缀合方法，使用实施例10中描述的mTG(微生物转谷氨酰胺酶)酶，与CpG 7-7缀合。与CpG7-7缀合的非岩藻糖基化的TNT-208抗体称为TNT-363a，而与CpG7-7缀合的岩藻糖基化的抗体(TNT-208)称为TNT-266a。
DLD-1经转导以过表达连接蛋白-4和GFP，并根据ATCC方案培养。Plateletpheresis Leukoreduction Chamber(LRS室)来自Vitalant，并用PBS以1:3稀释。稀释的血液下面铺有12mL Ficoll-Paque。管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。肿瘤细胞(0.025E6/孔)用CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记并在96孔形式上在完全RPMI培养基中铺板。将从300nM至0.41nM的TNT-266a和TNT-263a的三倍连续稀释液添加到靶细胞中，并在37℃下孵育20分钟。以20:1(效应物：靶标)，将在完全RPMI中的新鲜分离的PBMC(0.5e6/孔)添加到各孔中，并在37℃下、在5％CO2下孵育18小时。通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(ThermoFisher)中染色。将细胞用FACS缓冲液洗涤1x，并离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD19、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD69、抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次，并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群进行门控排除死细胞。将T细胞鉴定为CD3+细胞，将单核细胞鉴定为CD3-CD19-CD14+细胞，将NK细胞鉴定为CD3-CD19-CD56+细胞以及将树突状细胞(DC)鉴定为CD3-CD19-CD14-CD56-CD11C+HLADR+细胞。通过中位荧光强度评估T细胞、单核细胞、NK和DC活性水平。
结果显示在图30中。在过表达连接蛋白-4的DLD-1存在下，与非岩藻糖基化的连接蛋白-4CpG缀合抗体(TNT-363a)相比，非岩藻糖基化的连接蛋白-4CpG缀合抗体(TNT-266a)的T细胞和NK细胞活化略微增加，而观察到相当的单核细胞活化。与TNT-363a相比，观察到TNT-266a的DC活化略微增强。
实施例26：连接蛋白-4抗体活化B细胞
分别表达高至中至低水平连接蛋白-4的HT1376、OE19和H292细胞获自ATCC，并根据其方案培养。DLD-1经转导以过表达连接蛋白-4和GFP，并根据ATCC方案培养。Plateletpheresis Leukoreduction Chamber(LRS室)来自Vitalant，并用PBS以1:3稀释。稀释的血液下面铺有12mL Ficoll-Paque。管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％BSA的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS)中。肿瘤细胞(0.025E6/孔)用CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记并在96孔形式上在完全RPMI培养基中铺板。将从300nM至0.41nM的连接蛋白-4CpG-缀合的抗体的三倍连续稀释液添加到靶细胞中，并在37℃下孵育20分钟。以20:1(效应物：靶标)，将在完全RPMI中的新鲜分离的PBMC(0.5e6/孔)添加到各孔中，并在37℃下、在5％CO2下孵育18小时。通过在400x g下离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在以1:4000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(ThermoFisher)中染色。将细胞用FACS缓冲液洗涤1x，并离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD19和抗CD69(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次，并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群进行门控排除死细胞。将B细胞鉴定为CD19+细胞，并通过中位荧光强度评估B细胞活化水平。
结果显示在图31-32中。与单独培养基相比，所有连接蛋白-4CpG缀合的抗体均呈现B细胞活化。在表达连接蛋白-4的DLD-1中，与TNT-329a、TNT-350a和TNT-351a相比，TNT-266a的活化水平更高(图31)。有趣的是，在表达连接蛋白-4的DLD-1细胞和内源性细胞系(H292和HT1376)中，与TNT-266a相比，TNT-354a的B细胞活化水平显著增强(图32)。观察到的B细胞活化可能通过旁路和二级级联活化发生。
实施例27：连接蛋白-4抗体缀合物的记忆应答
通过逆转录病毒转导产生表达小鼠连接蛋白-4和GFP的MC38肿瘤细胞(MC38连接蛋白-4)，并且分选并扩增连接蛋白-4表达细胞。在37℃和5％CO2下，在完全DMEM(DMEM+Glutamax+10％FBS(Gibco))中培养MC38连接蛋白-4小鼠结肠癌细胞。细胞用胰蛋白酶0.25％(Gibco)分离并用DMEM(Gibco)洗涤两次。以20E6/mL将细胞重悬在DEME中并保持在冰上直至使用。将100μL悬浮的细胞皮下植入6周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River)的右侧胁腹部。在移植4天后开始直至研究的持续时间，用卡尺测量肿瘤尺寸并记录，每周两次。肿瘤体积使用下式计算：(长度×宽度×宽度)/2。一旦肿瘤达到平均60mm3，大致移植后4天，小鼠按肿瘤尺寸随机分组并开始处理。测试TNT-303a和TNT-304a。以3mg/kg，3天间隔，腹膜内施用缀合物3个剂量。初次肿瘤清除后100天，将100μL悬浮的MC38连接蛋白-4细胞(20E6/mL)皮下植入无肿瘤C57BL/6小鼠和年龄匹配的对照小鼠(Charles River)的胁腹部。根据IACUC配准的动物方案，对在研究期间任何时间肿瘤超出2,000mm3或呈现出任何痛苦迹象的小鼠进行人道安乐死。
结果显示在图33中。所测试的两种缀合物TNT-303a和TNT-304a均在MC38连接蛋白-4根除的小鼠中引起持久的抗肿瘤记忆应答。
实施例28：缀合物的抗肿瘤活性
在37℃和5％CO2下，在完全RPMI-1640(RPMI-1640+Glutamax+10％FBS(Gibco))中培养SKBR3腺癌细胞。细胞用胰蛋白酶0.25％(Gibco)分离，并用RPMI-1640(Gibco)洗涤两次。在最后一次洗涤之后，将细胞以50E6/mL重悬于1:1基质胶(Corning)：RPMI-1640中并保持在冰上直至使用。将100μL悬浮的细胞皮下植入免疫功能不全的6周龄雌性nu/nu小鼠(Charles River)的右侧胁腹部。在移植6天后开始直至研究的持续时间，用卡尺测量肿瘤尺寸并记录，每周两次。肿瘤体积使用下式计算：(长度×宽度×宽度)/2。一旦肿瘤达到平均86mm3，大致移植后6天，小鼠按肿瘤尺寸随机分组并开始处理。以3mg/kg，3天间隔，腹膜内施用呈人IgG1形式的连接蛋白-4抗体缀合物(TNT-372a、TNT-373a、TNT-374a和TNT-375a)3个剂量。根据IACUC配准的动物方案，对在研究期间任何时间肿瘤超出2,000mm3或呈现出任何痛苦迹象的小鼠进行人道安乐死。结果显示在图34中。在免疫功能不全的SKBR3小鼠模型中，全身性施用连接蛋白-4抗体缀合物显示出单一药剂活性。
实施例29：在免疫检查点抑制剂难治性模型中的抗肿瘤活性通过逆转录病毒转导产生表达小鼠连接蛋白-4的CT26肿瘤细胞(CT26连接蛋白-4)，并且分选并扩增中等和低连接蛋白-4表达细胞。通过逆转录病毒转导产生表达小鼠连接蛋白-4的EMT6肿瘤细胞(EMT6连接蛋白-4)，并且分选并扩增中等和低连接蛋白-4表达细胞。在37℃和5％CO2下，在完全RPMI-1640(RPMI-1640+Glutamax+10％FBS(Gibco))中培养CT26连接蛋白-4小鼠结肠癌细胞和EMT6连接蛋白-4小鼠乳腺癌细胞。细胞用胰蛋白酶0.25％(Gibco)分离，并用RPMI-1640(Gibco)洗涤两次。以20E6/mL将细胞重悬于RPMI-1640中并保持在冰上直至使用。将100μL悬浮的细胞皮下植入6周龄雌性Balb/c小鼠(Charles River)的右侧胁腹部。在移植5天后(对于EMT6连接蛋白-4)和移植7天后(对于CT26连接蛋白-4)开始，用卡尺测量肿瘤尺寸并记录，每周两次。肿瘤体积使用下式计算：(长度×宽度×宽度)/2。对于中等和低EMT6连接蛋白-4，一旦肿瘤达到平均75mm3，大致移植5天后，小鼠按肿瘤尺寸随机分组并开始处理。对于中等和低CT26连接蛋白-4，一旦肿瘤分别达到平均84mm3和73mm3，则小鼠按照肿瘤尺寸随机分组并开始处理。以3mg/kg，3天间隔，腹膜内施用缀合物3个剂量。根据IACUC配准的动物方案，对在研究期间任何时间肿瘤超出2,000mm3或呈现出任何痛苦迹象的小鼠进行人道安乐死。
在中等和低表达CT26和EMT6连接蛋白-4小鼠模型两者中，全身性施用缀合物均呈现单一药剂活性。结果显示在图35A(CT26模型)和图35B(EMT6模型；检查点抑制剂难治性模型)。
实施例30：使用增强的Fc结构域的抗肿瘤活性
通过逆转录病毒转导产生表达小鼠连接蛋白-4的CT26肿瘤细胞(CT26连接蛋白-4)，并且分选并扩增中等和低连接蛋白-4表达细胞。通过逆转录病毒转导产生表达小鼠连接蛋白-4的EMT6肿瘤细胞(EMT6连接蛋白-4)，并且分选并扩增中等和低连接蛋白-4表达细胞。在37℃和5％CO2下，在完全RPMI-1640(RPMI-1640+Glutamax+10％FBS(Gibco))中培养CT26连接蛋白-4小鼠结肠癌细胞和EMT6连接蛋白-4小鼠乳腺癌细胞。细胞用胰蛋白酶0.25％(Gibco)分离，并用RPMI-1640(Gibco)洗涤两次。以20E6/mL将细胞重悬于RPMI-1640中并保持在冰上直至使用。将100μL悬浮的细胞皮下植入6周龄雌性Balb/c小鼠(CharlesRiver)的右侧胁腹部。在移植5天后(对于EMT6连接蛋白-4)和移植7天后(对于CT26连接蛋白-4)开始，用卡尺测量肿瘤尺寸并记录，每周两次。肿瘤体积使用下式计算：(长度×宽度×宽度)/2。对于中等和低EMT6连接蛋白-4，一旦肿瘤达到平均75mm3，大致移植5天后，小鼠按肿瘤尺寸随机分组并开始处理。对于中等和低CT26连接蛋白-4，一旦肿瘤分别达到平均84mm3和73mm3，则小鼠按照肿瘤尺寸随机分组并开始处理。以3mg/kg，3天间隔，腹膜内施用TNT348a和TNT303a 3个剂量。根据IACUC配准的动物方案，对在研究期间任何时间肿瘤超出2,000mm3或呈现出任何痛苦迹象的小鼠进行人道安乐死。
结果显示在图36A(CT26模型)和图36B(EMT6模型；检查点抑制剂难治性模型)。与具有对小鼠FcγR的亲和力降低的Fc结构域的缀合物(TNT-348a)相比，具有增强的Fc结构域(对小鼠FcγR具有较高亲和力)的缀合物(TNT-303a)显示出强效和更高的活性。对于TNT-303a，分别在CPI难治性中等EMT6连接蛋白-4和低EMT6连接蛋白-4肿瘤模型中，在3mg/kg下，在5只小鼠中的5只和5只小鼠中的2只观察到肿瘤根除。
实施例31：DAR比较
通过逆转录病毒转导产生表达小鼠连接蛋白-4的EMT6肿瘤细胞(EMT6连接蛋白-4)，并且分选并扩增低连接蛋白-4表达细胞。在37℃和5％CO2下，在完全RPMI-1640(RPMI-1640+Glutamax+10％FBS(Gibco))中培养EMT6连接蛋白-4小鼠乳腺癌细胞。细胞用胰蛋白酶0.25％(Gibco)分离，并用RPMI-1640(Gibco)洗涤两次。以20E6/mL将细胞重悬于RPMI-1640中并保持在冰上直至使用。将100μL悬浮的细胞皮下植入6周龄雌性Balb/c小鼠(Charles River)的右侧胁腹部。对于EMT6连接蛋白-4，在移植后5天开始，用卡尺测量肿瘤尺寸并记录，每周两次。肿瘤体积使用下式计算：(长度×宽度×宽度)/2。对于低EMT6连接蛋白-4，一旦肿瘤达到平均75mm3，大致移植5天后，则小鼠按照肿瘤尺寸随机分组并开始处理。以3mg/kg，3天间隔，腹膜内施用具有1:1CpG与抗体比率(TNT-372a)或具有2:1CpG缀合与抗体比率(TNT-377b)的连接蛋白-4抗体-CpG缀合物3个剂量。根据IACUC配准的动物方案，对在研究期间任何时间肿瘤超出2,000mm3或呈现出任何痛苦迹象的小鼠进行人道安乐死。结果显示在图37中。与具有1:1比率的缀合物相比，具有2:1比率的缀合物显示出较低的功效。
实施例32：在高和低表达连接蛋白4的细胞系中非岩藻糖基化缀合物的活性
将高连接蛋白-4表达膀胱癌细胞系HT1376或低连接蛋白-4表达肺癌细胞系H292用300nM CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记，并紧接着在96孔形式上铺板(0.025E6/孔)。白细胞还原室(leukocyte reduction chamber)来自Vitalant，并用磷酸缓冲液盐(PBS，Gibco)以1:3稀释。稀释的血液下面铺有12mL Ficoll-Paque(GE Healthcare)。管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％牛血清白蛋白(Gibco)的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS，Gibco)中。紧接着以20:1(效应物：靶标)，将PBMC添加到铺板的肿瘤细胞中。在37℃下、在5％CO2下，将300nM非岩藻糖基化的连接蛋白-4CpG缀合物(TNT-385a)或岩藻糖基化的连接蛋白-4CpG缀合物(TNT-354a)或其各自未缀合的抗体对照添加到各孔中，持续18小时。细胞用TrypLE(ThermoFisher)分离、洗涤，并通过在400x g下离心五分钟沉淀，之后在4℃下在以1:5000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(Thermo Fisher)中染色60分钟。洗涤细胞，并离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色60分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD20、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD69和抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群进行门控排除死细胞。将B细胞鉴定为CD20+细胞。将单核细胞鉴定为CD20-CD3-CD14+细胞。将DC鉴定为CD3-CD19-CD14-CD56-HLADR+CD11c+细胞。通过中位荧光强度(MFI)评估活化水平，并且以CFSE阳性单核细胞％衡量吞噬作用。结果显示在图38中；活化和吞噬作用数据图示为连接蛋白-4CpG缀合物相对于各自连接蛋白-4抗体(未缀合)的活性倍数。在接合高和低连接蛋白-4阳性肿瘤细胞两者后，与对应岩藻糖基化的连接蛋白-4CpG缀合物(TNT-354a)相比，非岩藻糖基化的连接蛋白-4CpG缀合物(TNT-385a)显示出更高的活化(B细胞、单核细胞和DC)和吞噬作用。
实施例33：在高和低表达连接蛋白4细胞系中Fc变体的活性
将高连接蛋白-4表达膀胱癌细胞系HT1376或低连接蛋白-4表达肺癌细胞系H292用300nM CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记，并紧接着在96孔形式上铺板(0.025E6/孔)。白细胞还原室来自Vitalant，并用磷酸缓冲液盐(PBS，Gibco)以1:3稀释。稀释的血液下面铺有12mL Ficoll-Paque(GE Healthcare)。管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％牛血清白蛋白(Gibco)的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS，Gibco)中。紧接着以20:1(效应物：靶标)，将PBMC添加到铺板的肿瘤细胞中。将从1μM至0.2nM的岩藻糖基化的人IgG1连接蛋白-4CpG缀合物(TNT-415a)、岩藻糖基化的突变型人IgG1 G236A(TNT-416a)或其各自非岩藻糖基化的连接蛋白-4CpG缀合物(TNT-415a-AF，TNT-416a-AF)以及其各自单独抗体对照的四倍连续稀释液添加至细胞中。在37℃下、在5％CO2下孵育18小时之后，细胞用TrypLE(ThermoFisher)分离、洗涤，并通过在400x下离心五分钟沉淀，之后在4℃下以1:5000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(Thermo Fisher)中染色30分钟。洗涤细胞，并离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色60分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD20、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD69和抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群进行门控排除死细胞。将B细胞鉴定为CD20+细胞。将单核细胞鉴定为CD20-CD3-CD14+细胞。将DC鉴定为CD3-CD19-CD14-CD56-HLADR+CD11c+细胞。从在设定的采集体积内收集的事件确定细胞计数。
在所有缀合物的情况下，均观察到树突状细胞(DC)增殖。与各自未突变的Fc缀合物相比，G236A突变的Fc连接蛋白-4CpG缀合物(岩藻糖基化和非岩藻糖基化)导致更高水平的DC增殖。在单核细胞、NK细胞、T细胞和B细胞中未观察到活性差异。HT1376和H292中的DC增殖的结果显示在图39中，作为连接蛋白-4CpG缀合物相对于各自连接蛋白-4抗体对照的活性倍数。
实施例34：肿瘤杀伤活性
将低连接蛋白-4表达肺癌细胞系H292和极低连接蛋白-4表达前列腺癌细胞系PC3用300nM CellTrace CFSE(ThermoFisher)标记，并且紧接着在96孔形式上铺板(0.025E6/孔)。白细胞还原室来自Vitalant，并用磷酸缓冲液盐(PBS，Gibco)以1:3稀释。稀释的血液下面铺有12mL Ficoll-Paque(GE Healthcare)。管在400x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，重悬在FACS缓冲液(具有0.5％牛血清白蛋白(Gibco)的PBS)中并在其中洗涤。在一次洗涤之后，将PBMC重悬在完全RPMI1640(RPMI1640+10％FBS，Gibco)中。紧接着以20:1(效应物：靶标)，将PBMC添加到铺板的肿瘤细胞中。将从1μM至0.2nM的岩藻糖基化的人IgG1连接蛋白-4CpG缀合物(TNT-415a)、岩藻糖基化的突变型人IgG1 G236A(TNT-416a)、其各自非岩藻糖基化的连接蛋白-4CpG缀合物(TNT-415a-AF和TNT-416a-AF)以及其各自单独抗体(未与CpG缀合)对照的四倍连续稀释液添加至细胞中。在37℃下、在5％CO2下孵育18小时之后，细胞用TrypLE(ThermoFisher)分离、洗涤，并通过在400x下离心五分钟沉淀，之后在4℃下以1:5000稀释于PBS中的可固定活力染料eFluor 780(Thermo Fisher)中染色30分钟。洗涤细胞，并离心，并在4℃下在FACS缓冲液中染色60分钟，所述缓冲液含有FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)、抗CD14、抗CD11c、抗CD3、抗CD20、抗CD56、抗CD16、抗HLADR、抗CD69和抗CD86(ThermoFisher,Biolegend)。将细胞离心并在FACS缓冲液中洗涤两次并固定在0.5％多聚甲醛中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上获取设定采集体积内的细胞，随后通过Flowjo 10.7(BD)进行数据分析。通过CFSE+、FFC-高和SSC-高群鉴定靶癌细胞。通过对eFluor 780阴性群进行门控以将死细胞排除在靶细胞群之外，并且鉴定为活靶癌细胞％。将数据绘制为连接蛋白-4CpG缀合物相对于其各自连接蛋白-4抗体对照的倍数、
在所有缀合物的情况下，均观察到肿瘤细胞的细胞毒性。癌细胞活力的结果显示在图40中，作为连接蛋白-4CpG缀合物相对于各自连接蛋白-4抗体对照的活性倍数。
Claims (212)
1.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含至少一个谷氨酰胺残基，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示：
其中表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
其中每个P独立地是包含以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中
*和/>**表示所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点；
每个T1独立地是O或S；
每个T2是S-；
T3是基团其中/>表示与L的连接点，和其中/>#表示与所述寡核苷酸的其余部分的连接点；
Z是O或S；
U5’是–H或卤素；
R5’是-H或甲氧基；
Rc1是-H或甲氧基；
Rg1、Rg2、Rg3和Rg4是H；
R3’是甲氧基；
R1是-(CH2)3-OH；
R2是-H或甲基；和
n是从0至2的整数。
2.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中*和/>**表示所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点。
3.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是包含以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中*和/>**表示所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点。
4.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，
其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含氨基酸序列RPQGF(SEQ ID NO:47)，
并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示：
其中表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点。
5.一种缀合物，其包含抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含两条抗体轻链、两条抗体重链和两个Q标签肽，所述两个Q标签肽各自包含肽序列RPQGF(SEQ IDNO:47)；其中每个所述Q标签肽连接至所述抗体重链的一个的C末端；和其中所述Q标签肽的至少一个通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)与免疫调节寡核苷酸(P)连接，如图9A或图9B中所示。
6.一种缀合物，其包含抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段(Ab)、包含谷氨酰胺残基的至少一个Q标签肽序列和至少一个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述Q标签肽序列是天然存在的或合成的，并且其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签，其中至少一个Q标签肽序列选自由SEQ ID NO:39-55组成的组。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)结构域和重链可变区(VH)结构域，其中：
(a)所述VL结构域包含来自选自由以下组成的组的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列：SEQ ID NO:248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942和944，和所述VH结构域包含来自选自由以下组成的组的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列：SEQ ID NO:249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943和945；
(b)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:248的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:249的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(c)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:250的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:251的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(d)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:252的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:253的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(e)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:254的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:255的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(f)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:256的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:257的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(g)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:258的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:259的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(h)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:260的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:261的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(i)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:262的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:263的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(j)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:264的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:265的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(k)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:266的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ IDNO:267的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(l)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:268的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:269的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(m)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:270的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:271的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(n)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:900的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:901的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(o)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:902的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:903的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(p)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:904的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:905的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(q)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:906的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:907的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(r)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:908的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:909的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(s)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:910的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:911的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(t)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:912的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:913的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(u)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:914的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:915的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(v)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:916的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:917的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(w)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:918的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:919的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(x)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:920的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:921的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(y)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:922的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:923的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(z)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:924的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:925的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(aa)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:926的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:927的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(bb)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:928的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:929的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(cc)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:930的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:931的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(dd)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:932的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:933的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ee)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:934的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:935的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ff)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:936的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:937的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(gg)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:938的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:939的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(hh)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:940的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:941的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ii)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:942的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:943的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；或者
(jj)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:944的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:945的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中：
(a)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275、CDR-H2包含SEQ ID NO:276、CDR-H3包含SEQ IDNO:277、CDR-L1包含SEQ ID NO:272、CDR-L2包含SEQ ID NO:273和CDR-L3包含SEQ ID NO:274；
(b)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:293、CDR-H2包含SEQ ID NO:294、CDR-H3包含SEQ IDNO:295、CDR-L1包含SEQ ID NO:290、CDR-L2包含SEQ ID NO:291和CDR-L3包含SEQ ID NO:292；
(c)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:311、CDR-H2包含SEQ ID NO:312、CDR-H3包含SEQ IDNO:313、CDR-L1包含SEQ ID NO:308、CDR-L2包含SEQ ID NO:309和CDR-L3包含SEQ ID NO:310；
(d)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:329、CDR-H2包含SEQ ID NO:330、CDR-H3包含SEQ IDNO:331、CDR-L1包含SEQ ID NO:326、CDR-L2包含SEQ ID NO:327和CDR-L3包含SEQ ID NO:328；
(e)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:347、CDR-H2包含SEQ ID NO:348、CDR-H3包含SEQ IDNO:349、CDR-L1包含SEQ ID NO:344、CDR-L2包含SEQ ID NO:345和CDR-L3包含SEQ ID NO:346；
(f)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:365、CDR-H2包含SEQ ID NO:366、CDR-H3包含SEQ IDNO:367、CDR-L1包含SEQ ID NO:362、CDR-L2包含SEQ ID NO:363和CDR-L3包含SEQ ID NO:364；
(g)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:383、CDR-H2包含SEQ ID NO:384、CDR-H3包含SEQ IDNO:385、CDR-L1包含SEQ ID NO:380、CDR-L2包含SEQ ID NO:381和CDR-L3包含SEQ ID NO:382；
(h)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401、CDR-H2包含SEQ ID NO:402、CDR-H3包含SEQIDNO:403、CDR-L1包含SEQ ID NO:398、CDR-L2包含SEQ ID NO:399和CDR-L3包含SEQ IDNO:400；
(i)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:419、CDR-H2包含SEQ ID NO:420、CDR-H3包含SEQ IDNO:421、CDR-L1包含SEQ ID NO:416、CDR-L2包含SEQ ID NO:417和CDR-L3包含SEQ ID NO:418；
(j)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:437、CDR-H2包含SEQ ID NO:438、CDR-H3包含SEQ IDNO:439、CDR-L1包含SEQ ID NO:434、CDR-L2包含SEQ ID NO:435和CDR-L3包含SEQ ID NO:436；
(k)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:455、CDR-H2包含SEQ ID NO:456、CDR-H3包含SEQ IDNO:457、CDR-L1包含SEQ ID NO:452、CDR-L2包含SEQ ID NO:453和CDR-L3包含SEQ ID NO:454；
(l)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:281、CDR-H2包含SEQ ID NO:282、CDR-H3包含SEQ IDNO:283、CDR-L1包含SEQ ID NO:278、CDR-L2包含SEQ ID NO:279和CDR-L3包含SEQ ID NO:280；
(m)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:299、CDR-H2包含SEQ ID NO:300、CDR-H3包含SEQ IDNO:301、CDR-L1包含SEQ ID NO:296、CDR-L2包含SEQ ID NO:297和CDR-L3包含SEQ ID NO:298；
(n)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:317、CDR-H2包含SEQ ID NO:318、CDR-H3包含SEQ IDNO:319、CDR-L1包含SEQ ID NO:314、CDR-L2包含SEQ ID NO:315和CDR-L3包含SEQ ID NO:316；
(o)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:335、CDR-H2包含SEQ ID NO:336、CDR-H3包含SEQ IDNO:337、CDR-L1包含SEQ ID NO:332、CDR-L2包含SEQ ID NO:333和CDR-L3包含SEQ ID NO:334；
(p)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:353、CDR-H2包含SEQ ID NO:354、CDR-H3包含SEQ IDNO:355、CDR-L1包含SEQ ID NO:350、CDR-L2包含SEQ ID NO:351和CDR-L3包含SEQ ID NO:352；
(q)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:371、CDR-H2包含SEQ ID NO:372、CDR-H3包含SEQ IDNO:373、CDR-L1包含SEQ ID NO:368、CDR-L2包含SEQ ID NO:369和CDR-L3包含SEQ ID NO:370；
(r)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:389、CDR-H2包含SEQ ID NO:390、CDR-H3包含SEQ IDNO:391、CDR-L1包含SEQ ID NO:386、CDR-L2包含SEQ ID NO:387和CDR-L3包含SEQ ID NO:388；
(s)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:407、CDR-H2包含SEQ ID NO:408、CDR-H3包含SEQ IDNO:409、CDR-L1包含SEQ ID NO:404、CDR-L2包含SEQ ID NO:405和CDR-L3包含SEQ ID NO:406；
(t)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:425、CDR-H2包含SEQ ID NO:426、CDR-H3包含SEQ IDNO:427、CDR-L1包含SEQ ID NO:422、CDR-L2包含SEQ ID NO:423和CDR-L3包含SEQ ID NO:424；
(u)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:443、CDR-H2包含SEQ ID NO:444、CDR-H3包含SEQ IDNO:445、CDR-L1包含SEQ ID NO:440、CDR-L2包含SEQ ID NO:441和CDR-L3包含SEQ ID NO:442；
(v)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:461、CDR-H2包含SEQ ID NO:462、CDR-H3包含SEQ IDNO:463、CDR-L1包含SEQ ID NO:458、CDR-L2包含SEQ ID NO:459和CDR-L3包含SEQ ID NO:460；
(w)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:287、CDR-H2包含SEQ ID NO:288、CDR-H3包含SEQ IDNO:289、CDR-L1包含SEQ ID NO:284、CDR-L2包含SEQ ID NO:285和CDR-L3包含SEQ ID NO:286；
(x)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:305、CDR-H2包含SEQ ID NO:306、CDR-H3包含SEQ IDNO:307、CDR-L1包含SEQ ID NO:302、CDR-L2包含SEQ ID NO:303和CDR-L3包含SEQ ID NO:304；
(y)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:323、CDR-H2包含SEQ ID NO:324、CDR-H3包含SEQ IDNO:325、CDR-L1包含SEQ ID NO:320、CDR-L2包含SEQ ID NO:321和CDR-L3包含SEQ ID NO:322；
(z)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:341、CDR-H2包含SEQ ID NO:342、CDR-H3包含SEQ IDNO:343、CDR-L1包含SEQ ID NO:338、CDR-L2包含SEQ ID NO:339和CDR-L3包含SEQ ID NO:340；
(aa)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:359、CDR-H2包含SEQ ID NO:360、CDR-H3包含SEQ IDNO:361、CDR-L1包含SEQ ID NO:356、CDR-L2包含SEQ ID NO:357和CDR-L3包含SEQ ID NO:358；
(bb)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:377、CDR-H2包含SEQ ID NO:378、CDR-H3包含SEQ IDNO:379、CDR-L1包含SEQ ID NO:374、CDR-L2包含SEQ ID NO:375和CDR-L3包含SEQ ID NO:376；
(cc)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:395、CDR-H2包含SEQ ID NO:396、CDR-H3包含SEQ IDNO:397、CDR-L1包含SEQ ID NO:392、CDR-L2包含SEQ ID NO:393和CDR-L3包含SEQ ID NO:394；
(dd)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:413、CDR-H2包含SEQ ID NO:414、CDR-H3包含SEQ IDNO:415、CDR-L1包含SEQ ID NO:410、CDR-L2包含SEQ ID NO:411和CDR-L3包含SEQ ID NO:412；
(ee)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:431、CDR-H2包含SEQ ID NO:432、CDR-H3包含SEQ IDNO:433、CDR-L1包含SEQ ID NO:428、CDR-L2包含SEQ ID NO:429和CDR-L3包含SEQ ID NO:430；
(ff)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:449、CDR-H2包含SEQ ID NO:450、CDR-H3包含SEQ IDNO:451、CDR-L1包含SEQ ID NO:446、CDR-L2包含SEQ ID NO:447和CDR-L3包含SEQ ID NO:448；
(gg)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:467、CDR-H2包含SEQ ID NO:468、CDR-H3包含SEQ IDNO:469、CDR-L1包含SEQ ID NO:464、CDR-L2包含SEQ ID NO:465和CDR-L3包含SEQ ID NO:466；
(hh)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:479、CDR-H2包含SEQ ID NO:480、CDR-H3包含SEQ IDNO:481、CDR-L1包含SEQ ID NO:476、CDR-L2包含SEQ ID NO:477和CDR-L3包含SEQ ID NO:478；
(ii)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:485、CDR-H2包含SEQ ID NO:486、CDR-H3包含SEQ IDNO:487、CDR-L1包含SEQ ID NO:482、CDR-L2包含SEQ ID NO:483和CDR-L3包含SEQ ID NO:484；
(jj)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:473、CDR-H2包含SEQ ID NO:474、CDR-H3包含SEQ IDNO:475、CDR-L1包含SEQ ID NO:470、CDR-L2包含SEQ ID NO:471和CDR-L3包含SEQ ID NO:472；
(kk)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:562、CDR-L2包含SEQ ID NO:563和CDR-L3包含SEQIDNO:564，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:565、CDR-H2包含SEQ ID NO:566和CDR-H3包含SEQID NO:567；
(ll)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:580、CDR-L2包含SEQ ID NO:581和CDR-L3包含SEQID NO:582，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:583、CDR-H2包含SEQ ID NO:584和CDR-H3包含SEQID NO:585；
(mm)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:598、CDR-L2包含SEQ ID NO:599和CDR-L3包含SEQID NO:600，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:601、CDR-H2包含SEQ ID NO:602和CDR-H3包含SEQID NO:603；
(nn)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:616、CDR-L2包含SEQ ID NO:617和CDR-L3包含SEQID NO:618，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:619、CDR-H2包含SEQ ID NO:620和CDR-H3包含SEQID NO:621；
(oo)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:634、CDR-L2包含SEQ ID NO:635和CDR-L3包含SEQID NO:636，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:637、CDR-H2包含SEQ ID NO:638和CDR-H3包含SEQID NO:639；
(pp)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:652、CDR-L2包含SEQ ID NO:653和CDR-L3包含SEQID NO:654，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:655、CDR-H2包含SEQ ID NO:656和CDR-H3包含SEQID NO:657；
(qq)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:670、CDR-L2包含SEQ ID NO:671和CDR-L3包含SEQID NO:672，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:673、CDR-H2包含SEQ ID NO:674和CDR-H3包含SEQID NO:675；
(rr)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:688、CDR-L2包含SEQ ID NO:689和CDR-L3包含SEQID NO:690，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:691、CDR-H2包含SEQ ID NO:692和CDR-H3包含SEQID NO:693；
(ss)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:706、CDR-L2包含SEQ ID NO:707和CDR-L3包含SEQID NO:708，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:709、CDR-H2包含SEQ ID NO:710和CDR-H3包含SEQID NO:711；
(tt)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:724、CDR-L2包含SEQ ID NO:725和CDR-L3包含SEQID NO:726，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:727、CDR-H2包含SEQ ID NO:728和CDR-H3包含SEQID NO:729；
(uu)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:742、CDR-L2包含SEQ ID NO:743和CDR-L3包含SEQID NO:744，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:745、CDR-H2包含SEQ ID NO:746和CDR-H3包含SEQID NO:747；
(vv)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:760、CDR-L2包含SEQ ID NO:761和CDR-L3包含SEQID NO:762，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:763、CDR-H2包含SEQ ID NO:764和CDR-H3包含SEQID NO:765；
(ww)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:778、CDR-L2包含SEQ ID NO:779和CDR-L3包含SEQID NO:780，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:781、CDR-H2包含SEQ ID NO:782和CDR-H3包含SEQID NO:783；
(xx)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:796、CDR-L2包含SEQ ID NO:797和CDR-L3包含SEQID NO:798，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:799、CDR-H2包含SEQ ID NO:800和CDR-H3包含SEQID NO:801；
(yy)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:814、CDR-L2包含SEQ ID NO:815和CDR-L3包含SEQID NO:816，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:817、CDR-H2包含SEQ ID NO:818和CDR-H3包含SEQID NO:819；或者
(zz)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:832、CDR-L2包含SEQ ID NO:833和CDR-L3包含SEQID NO:834，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:835、CDR-H2包含SEQ ID NO:836和CDR-H3包含SEQID NO:837。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)结构域和重链可变区(VH)结构域，其中：
(a)所述VH结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943和945，和/或所述VL结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942和944；
(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO:248的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:249的序列；
(c)所述VL结构域包含SEQ ID NO:250的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:251的序列；
(d)所述VL结构域包含SEQ ID NO:252的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:253的序列；
(e)所述VL结构域包含SEQ ID NO:254的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:255的序列；
(f)所述VL结构域包含SEQ ID NO:256的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:257的序列；
(g)所述VL结构域包含SEQ ID NO:258的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:259的序列；
(h)所述VL结构域包含SEQ ID NO:260的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:261的序列；
(i)所述VL结构域包含SEQ ID NO:262的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:263的序列；
(j)所述VL结构域包含SEQ ID NO:264的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:265的序列；
(k)所述VL结构域包含SEQ ID NO:266的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:267的序列；
(l)所述VL结构域包含SEQ ID NO:268的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:269的序列；
(m)所述VL结构域包含SEQ ID NO:270的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:271的序列；
(n)所述VL结构域包含SEQ ID NO:900的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:901的序列；
(o)所述VL结构域包含SEQ ID NO:902的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:903的序列；
(p)所述VL结构域包含SEQ ID NO:904的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:905的序列；
(q)所述VL结构域包含SEQ ID NO:906的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:907的序列；
(r)所述VL结构域包含SEQ ID NO:908的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:909的序列；
(s)所述VL结构域包含SEQ ID NO:910的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:911的序列；
(t)所述VL结构域包含SEQ ID NO:912的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:913的序列；
(u)所述VL结构域包含SEQ ID NO:914的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:915的序列；
(v)所述VL结构域包含SEQ ID NO:916的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:917的序列；
(w)所述VL结构域包含SEQ ID NO:918的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:919的序列；
(x)所述VL结构域包含SEQ ID NO:920的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:921的序列；
(y)所述VL结构域包含SEQ ID NO:922的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:923的序列；
(z)所述VL结构域包含SEQ ID NO:924的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:925的序列；
(aa)所述VL结构域包含SEQ ID NO:926的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:927的序列；
(bb)所述VL结构域包含SEQ ID NO:928的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:929的序列；
(cc)所述VL结构域包含SEQ ID NO:930的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:931的序列；
(dd)所述VL结构域包含SEQ ID NO:932的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:933的序列；
(ee)所述VL结构域包含SEQ ID NO:934的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:935的序列；
(ff)所述VL结构域包含SEQ ID NO:936的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:937的序列；
(gg)所述VL结构域包含SEQ ID NO:938的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:939的序列；
(hh)所述VL结构域包含SEQ ID NO:940的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:941的序列；
(ii)所述VL结构域包含SEQ ID NO:942的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:943的序列；或者
(jj)所述VL结构域包含SEQ ID NO:944的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:945的序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的缀合物，其中所述抗体是Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、scFv、单一结构域、单一重链或单一轻链抗体或抗体片段。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的缀合物，其中所述抗体是人源化抗体、人抗体或嵌合抗体或其片段。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含Fc区。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述Fc区是选自由以下组成的组的人Fc区：IgG1 Fc区、IgG2 Fc区和IgG4 Fc区。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的缀合物，其中所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含降低与C1q结合的一个或多个氨基酸取代。
16.根据权利要求13或权利要求14所述的缀合物，其中所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含增加与C1q结合的一个或多个氨基酸取代。
17.根据权利要求13或权利要求14所述的缀合物，其中所述Fc区是显示出野生型补体激活的人Fc区。
18.根据权利要求13或权利要求14所述的缀合物，其中所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含增加补体激活的一个或多个氨基酸取代。
19.根据权利要求13或权利要求14所述的缀合物，其中所述Fc区是包含一个或多个氨基酸取代的人Fc区，与缺乏该氨基酸取代的人Fc区相比所述氨基酸取代降低效应子功能。
20.根据权利要求13-14或权利要求19所述的缀合物，其中所述Fc区是：
(a)包含L234A、L235A和/或G237A取代的人IgG1 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；
(b)包含A330S和/或P331S取代的人IgG2 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；或者
(c)包含S228P和/或L235E取代的人IgG4 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号。
21.根据权利要求13或权利要求14所述的缀合物，其中所述Fc区是野生型人IgG1 Fc区。
22.根据权利要求13或权利要求14所述的缀合物，其中所述Fc区是人IgG1 Fc区。
23.根据权利要求13、14或22所述的缀合物，其中所述Fc区已被工程化以改善效应子功能，任选地其中所述改善的效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
24.根据权利要求23所述的缀合物，其中所述Fc区已被工程化以显示出选自由以下组成的组的至少两种特征：改善的ADCC活性、改善的ADCP活性和改善的CDC活性。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的缀合物，其中所述Fc区包含取代G236A，其中氨基酸位置根据EU索引。
26.根据权利要求23或权利要求24所述的缀合物，其中所述Fc区包含取代G236A，其中氨基酸位置根据EU索引，并且所述Fc区是非岩藻糖基化的。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的缀合物，其中所述Fc区已被工程化以改善ADCC活性。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的缀合物，其中所述Fc区已被工程化以改善ADCP活性。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的缀合物，其中所述Fc区已被工程化以改善CDC活性。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的缀合物，其中所述抗体在所述Fc区中包含改善ADCC活性的至少一个氨基酸取代。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的缀合物，其中所述抗体在所述Fc区中包含改善ADCP活性的至少一个氨基酸取代。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的缀合物，其中所述抗体在所述Fc区中包含改善CDC活性的至少一个氨基酸取代。
33.根据权利要求23-32中任一项所述的缀合物，其中所述抗体的重链中的至少一个或至少两个是非岩藻糖基化的。
34.根据权利要求33所述的缀合物，其中所述抗体在具有α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中或在过表达β1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖转移酶III(GnT-III)的细胞系中生产，其中任选地所述细胞系是CHO细胞系。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的缀合物，其中所述抗体在表达系统中在存在2-氟岩藻糖化合物或5-炔基岩藻糖衍生物的条件下生产。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的缀合物，其中所述细胞系过表达Golgiμ-甘露糖苷酶II(ManII)，其中任选地，所述细胞系是CHO细胞系。
37.根据权利要求13-36中任一项所述的缀合物，其中所述Fc区包含N297A取代，氨基酸位置编号根据EU索引。
38.根据权利要求13-37中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物进一步包含与Fc区残基的Q295连接的免疫调节寡核苷酸P，如下式中所示，其中L是通过酰胺键连接至所述Fc区的Q295的接头部分。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含抗体重链恒定结构域，所述抗体重链恒定结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:92-107、111、112、178和494-497。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含人λ轻链。
41.根据权利要求1-39中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含人κ轻链。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含抗体轻链恒定结构域，所述抗体轻链恒定结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID No:108-110。
43.根据权利要求1-4和6-42中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链，和其中一个Q标签连接至所述抗体的一条或两条重链。
44.根据权利要求43所述的缀合物，其中所述Q标签融合至所述抗体的重链的C末端。
45.根据权利要求1-4和6-43中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链，和其中一个Q标签连接至所述抗体的一条或两条轻链。
46.根据权利要求1-4和6-43中任一项所述的缀合物，其中所述Q标签在所述Fc结构域内。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物诱导TLR9激活。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的缀合物，其中每个Q标签独立地包含肽序列，所述肽序列包含5至15个氨基酸残基。
49.根据权利要求1和7-48中任一项所述的缀合物，其中所述Q标签是天然存在的。
50.根据权利要求1和7-48中任一项所述的缀合物，其中每个Q标签的所述肽序列独立地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:39-55。
51.根据权利要求1和7-48中任一项所述的缀合物，其中所述Q标签包含肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)。
52.根据权利要求1至48中任一项所述的缀合物，其中每个Q标签独立地包含RPQGF(SEQID NO:47)、RPQGFPP(SEQ ID NO:48)或RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。
53.根据权利要求1至48中任一项所述的缀合物，其中每个Q标签独立地包含RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的缀合物，其中1或2个Q标签连接至所述抗体。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物具有1或2的DAR。
56.根据权利要求1和4-55中任一项所述的缀合物，其中所述接头L包含聚乙二醇部分。
57.根据权利要求1和4-56中任一项所述的缀合物，其中所述接头L是
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与T3的连接点，和/>表示与所述缀合物的其余部分的连接点。
58.根据权利要求57所述的缀合物，其中m是约20至约30。
59.根据权利要求57或权利要求58所述的缀合物，其中m是约24。
60.根据权利要求1和7-59中任一项所述的缀合物，其中Z是S。
61.根据权利要求1和7-59中任一项所述的缀合物，其中所述寡核苷酸P包含至少一对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。
62.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基1的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
63.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基2的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
64.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基3的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
65.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基5的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
66.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基6的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
67.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基7的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
68.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基8的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
69.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基9的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
70.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基10的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
71.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基11的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
72.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基12的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
73.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基13的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
74.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基14的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
75.根据权利要求61所述的缀合物，其中所述至少一对偕位T1和T2位于核苷残基15的3’位置处，其中T1是S和T2是S。
76.根据权利要求1和7-75中任一项所述的缀合物，其中所述寡核苷酸P包含至少两对偕位T1和T2，其中T1是S和T2是S-。
77.根据权利要求1和7-76中任一项所述的缀合物，其中R5’是H。
78.根据权利要求1和7-76中任一项所述的缀合物，其中R5’是甲氧基。
79.根据权利要求1和7-76中任一项所述的缀合物，其中Rc1是H。
80.根据权利要求1和7-76中任一项所述的缀合物，其中Rc1是甲氧基。
81.根据权利要求1和7-80中任一项所述的缀合物，其中R2是甲基。
82.根据权利要求1和7-80中任一项所述的缀合物，其中R2是H。
83.根据权利要求1和7-82中任一项所述的缀合物，其中U5’是溴。
84.根据权利要求1和7-82中任一项所述的缀合物，其中U5’是-H。
85.根据权利要求2-3和7-84中任一项所述的缀合物，其中m是从20至25的整数。
86.根据权利要求85所述的缀合物，其中m是24。
87.根据权利要求1和4-56中任一项所述的缀合物，其中每个P独立地包含选自表2、表3和表4的寡核苷酸。
88.根据权利要求1和4-56中任一项所述的缀合物，其中在所述缀合物中的每个(L)和(P)独立地包含选自表2、表5和表6的结构，任选地化合物7.6b或化合物7.7b。
89.根据权利要求1和4-56中任一项所述的缀合物，其中在所述缀合物中的每个(P)和(L)独立地包含选自SEQ ID NO:1-38和129-166的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸。
90.根据权利要求4-56中任一项所述的缀合物，其中每个免疫调节寡核苷酸P独立地是
其中
b和c各自独立地是从1至25的整数；条件是b和c之和至少是5；
*表示所述免疫调节寡核苷酸P与所述缀合物其余部分的连接点；
X5’是包含结构的5’末端核苷；
X3’是包含结构的3’末端核苷；
YPTE是包含结构的核苷间磷酸三酯，其中*表示与所述寡核苷酸的其余部分的连接点，和/>表示与所述接头L的连接点，或者，如果L不存在，则/>表示通过酰胺键与所述Q标签肽在所述谷氨酰胺残基处的连接点；
Y3’是包含结构的末端磷酸三酯；/>
每个XN独立地是包含结构的核苷；
每个YN独立地是包含结构的核苷间接头；
其中每个BN独立地是修饰的或未经修饰的核碱基；
每个RN独立地是-H或-O-C1-4-烷基，其中所述-O-C1-4-烷基的C1-4-烷基任选地进一步被-O-C1-C4-烷基取代；
B5’和B3’独立地是修饰的或未经修饰的核碱基；
R5’和R3’独立地是-H或-O-C1-C4-烷基，其中所述-O-C1-4-烷基的C1-4-烷基任选地进一步被-O-C1-4-烷基取代；
每个T1独立地是O或S；
每个T2独立地是O-或S-；和
T3是包含寡乙二醇部分的基团；和
R1是C1-4-亚烷基-羟基。
91.根据权利要求90所述的缀合物，其中b是3。
92.根据权利要求90或权利要求91所述的缀合物，其中：
(i)P包含至少一个修饰的核苷XN；
(ii)P具有至少一个修饰的核苷间接头YN，其中T1或T2中的至少一个是S；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的缀合物，其中P具有至少一个二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯核苷间接头。
94.根据权利要求90-93中任一项所述的缀合物，其中P包含0、1、2或3个二硫代磷酸酯核苷间接头。
95.根据权利要求90-94中任一项所述的缀合物，其中P包含选自由以下组成的组的修饰的核苷：2’-O-烷基核苷、2’-O-烷氧基烷基核苷、2’-脱氧核苷和核糖核苷。
96.根据权利要求95所述的缀合物，其中所述修饰的核苷选自由以下组成的组：5-溴-2’-O-甲基尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基尿苷、2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基胸苷、2’-O-甲基胞苷、2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷和8-氧代-7,8-二氢-2’-脱氧鸟苷。
97.根据权利要求90-96中任一项所述的缀合物，其中X5’是5-溴-2’-O-甲基尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基尿苷或2’-脱氧尿苷。
98.根据权利要求90-97中任一项所述的缀合物，其中Y3’或在X5’的3’位置处的YN包含未取代的或取代的硫代磷酸酯。
99.根据权利要求90-98中任一项所述的缀合物，其中YPTE是：
其中Z是O或S；d是从0至95的整数；所述结构右侧的两个*表示与所述寡核苷酸P中的相邻核苷XN的连接点，和所述结构左侧的/>表示与所述接头L的连接点。
100.根据权利要求90-98中任一项所述的缀合物，其中YPTE是：
其中Z是O或S；d是从0至95的整数；所述结构右侧的两个*表示与所述寡核苷酸P中的相邻核苷XN的连接点，和所述结构左侧的一个/>表示与所述接头L的连接点。
101.根据权利要求99或100所述的缀合物，其中Z是S。
102.根据权利要求99-101中任一项所述的缀合物，其中d是从1至25的整数。
103.根据权利要求90-102中任一项所述的缀合物，其中所述接头L包含聚乙二醇部分。
104.根据权利要求90-103中任一项所述的缀合物，其中所述接头L是
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与YPTE的连接点，和/>表示所述缀合物的其余部分的连接点。
105.根据权利要求1和4-104中任一项所述的缀合物，其中P包含一个或多个CpG位点。
106.根据权利要求1和4-105中任一项所述的缀合物，其中P包含至少3个CpG位点。
107.根据权利要求1-4和6-106中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含两条抗体轻链、两条抗体重链和两个Q标签肽；其中所述Q标签肽的每一个连接至所述抗体重链中的一个的C末端；和其中所述Q标签肽中的一个通过与所述Q标签肽的所述谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)与免疫调节寡核苷酸(P)连接。
108.根据权利要求1-107中任一项所述的缀合物，其中：
(a)所述抗体包含轻链，所述轻链含有选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ ID NO:236-247和1000-1022，和/或重链，所述重链含有重链序列和Q标签，其中所述重链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:224-235和1030-1065；
(b)所述抗体包含轻链，所述轻链包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ ID NO:236-247和1000-1022，和/或重链，所述重链包含选自由以下组成的组的重链序列：SEQ IDNO:1070-1117；
(c)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:224的重链；
(d)所述抗体包含含有SEQ ID NO:237的轻链和/或含有SEQ ID NO:225的重链；
(e)所述抗体包含含有SEQ ID NO:238的轻链和/或含有SEQ ID NO:226的重链；
(f)所述抗体包含含有SEQ ID NO:239的轻链和/或含有SEQ IDNO:227的重链；
(g)所述抗体包含含有SEQ ID NO:240的轻链和/或含有SEQ ID NO:228的重链；
(h)所述抗体包含含有SEQ ID NO:241的轻链和/或含有SEQ ID NO:229的重链；
(i)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:230的重链；
(j)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:231的重链；
(k)所述抗体包含含有SEQ ID NO:244的轻链和/或含有SEQ ID NO:232的重链；
(l)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:233的重链；
(m)所述抗体包含含有SEQ ID NO:246的轻链和/或含有SEQ ID NO:234的重链；
(n)所述抗体包含含有SEQ ID NO:247的轻链和/或含有SEQ ID NO:235的重链；
(o)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1000的轻链和/或含有SEQ ID NO:1030的重链；
(p)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和/或含有SEQ ID NO:1031的重链；
(q)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和/或含有SEQ ID NO:1032的重链；
(r)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和/或含有SEQ ID NO:1033的重链；
(s)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和/或含有SEQ ID NO:1034的重链；
(t)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和/或含有SEQ ID NO:1035的重链；
(u)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和/或含有SEQ ID NO:1036的重链；
(v)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1037的重链；
(w)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1038的重链；
(x)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和/或含有SEQ ID NO:1039的重链；
(y)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和/或含有SEQ ID NO:1040的重链；
(z)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和/或含有SEQ ID NO:1041的重链；
(aa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1042的重链；
(bb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和/或含有SEQ ID NO:1043的重链；
(cc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和/或含有SEQ ID NO:1044的重链；
(dd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和/或含有SEQ ID NO:1045的重链；
(ee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和/或含有SEQ ID NO:1046的重链；
(ff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1047的重链；
(gg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1048的重链；
(hh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1049的重链；
(ii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1050的重链；
(jj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1051的重链；
(kk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1052的重链；
(ll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1053的重链；
(mm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1054的重链；
(nn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1055的重链；
(oo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1056的重链；
(pp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1057的重链；
(qq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1058的重链；
(rr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1059的重链；
(ss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1060的重链；
(tt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1061的重链；
(uu)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1062的重链；
(vv)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1063的重链；
(ww)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1064的重链；
(xx)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1065的重链；
(yy)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1070的重链；
(zz)所述抗体包含含有SEQ ID NO:237的轻链和/或含有SEQ ID NO:1071的重链；
(aaa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:238的轻链和/或含有SEQ ID NO:1072的重链；
(bbb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:239的轻链和/或含有SEQ ID NO:1073的重链；
(ccc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:240的轻链和/或含有SEQ ID NO:1074的重链；
(ddd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:241的轻链和/或含有SEQ ID NO:1075的重链；
(eee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1076的重链；
(fff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1077的重链；
(ggg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:244的轻链和/或含有SEQ ID NO:1078的重链；
(hhh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1079的重链；
(iii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:246的轻链和/或含有SEQ ID NO:1080的重链；
(jjj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:247的轻链和/或含有SEQ ID NO:1081的重链；
(kkk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1000的轻链和/或含有SEQ ID NO:1082的重链；
(lll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和/或含有SEQ ID NO:1083的重链；
(mmm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和/或含有SEQ ID NO:1084的重链；
(nnn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和/或含有SEQ ID NO:1085的重链；
(ooo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和/或含有SEQ ID NO:1086的重链；
(ppp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和/或含有SEQ ID NO:1087的重链；
(qqq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和/或含有SEQ ID NO:1088的重链；
(rrr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1089的重链；
(sss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1090的重链；
(ttt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和/或含有SEQ ID NO:1091的重链；
(uuu)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和/或含有SEQ ID NO:1092的重链；
(vvv)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和/或含有SEQ ID NO:1093的重链；
(www)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1094的重链；
(xxx)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和/或含有SEQ ID NO:1095的重链；
(yyy)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和/或含有SEQ ID NO:1096的重链；
(zzz)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和/或含有SEQ ID NO:1097的重链；
(aaaa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和/或含有SEQ ID NO:1098的重链；
(bbbb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1099的重链；
(cccc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1100的重链；
(dddd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1101的重链；
(eeee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1102的重链；
(ffff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1103的重链；
(gggg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1104的重链；
(hhhh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1105的重链；
(iiii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1106的重链；
(jjjj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1107的重链；
(kkkk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1108的重链；
(llll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1109的重链；
(mmmm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1110的重链；
(nnnn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1111的重链；
(oooo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1112的重链；
(pppp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1113的重链；
(qqqq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1114的重链；
(rrrr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1115的重链；
(ssss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1116的重链；或者
(tttt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1117的重链。
109.一种与人连接蛋白-4特异性结合的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)结构域和重链可变区(VH)结构域，其中：
(a)所述VL结构域包含来自选自由以下组成的组的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列：SEQ ID NO:248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942和944，和所述VH结构域包含来自选自由以下组成的组的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列：SEQ ID NO:249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943和945；
(b)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:248的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:249的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(c)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:250的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:251的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(d)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:252的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:253的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(e)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:254的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:255的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(f)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:256的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:257的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(g)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:258的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:259的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(h)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:260的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:261的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(i)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:262的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:263的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(j)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:264的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:265的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(k)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:266的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:267的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(l)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:268的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:269的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(m)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:270的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ IDNO:271的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(n)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:900的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:901的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(o)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:902的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:903的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(p)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:904的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:905的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(q)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:906的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:907的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(r)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:908的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:909的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(s)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:910的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:911的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(t)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:912的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:913的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(u)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:914的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:915的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(v)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:916的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:917的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(w)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:918的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:919的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(x)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:920的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:921的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(y)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:922的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:923的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(z)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:924的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:925的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(aa)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:926的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:927的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(bb)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:928的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:929的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(cc)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:930的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:931的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(dd)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:932的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:933的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(ee)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:934的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:935的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(ff)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:936的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:937的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(gg)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:938的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:939的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(hh)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:940的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:941的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；
(ii)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:942的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:943的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；或者
(jj)所述VL结构域包含来自SEQ ID NO:944的VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列和所述VH结构域包含来自SEQ ID NO:945的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。
110.根据权利要求109所述的抗体，其中：
(a)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275、CDR-H2包含SEQ ID NO:276、CDR-H3包含SEQ IDNO:277、CDR-L1包含SEQ ID NO:272、CDR-L2包含SEQ ID NO:273和CDR-L3包含SEQ ID NO:274；
(b)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:293、CDR-H2包含SEQ ID NO:294、CDR-H3包含SEQ IDNO:295、CDR-L1包含SEQ ID NO:290、CDR-L2包含SEQ ID NO:291和CDR-L3包含SEQ ID NO:292；
(c)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:311、CDR-H2包含SEQ ID NO:312、CDR-H3包含SEQ IDNO:313、CDR-L1包含SEQ ID NO:308、CDR-L2包含SEQ ID NO:309和CDR-L3包含SEQ ID NO:310；
(d)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:329、CDR-H2包含SEQ ID NO:330、CDR-H3包含SEQ IDNO:331、CDR-L1包含SEQ ID NO:326、CDR-L2包含SEQ ID NO:327和CDR-L3包含SEQ ID NO:328；
(e)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:347、CDR-H2包含SEQ ID NO:348、CDR-H3包含SEQ IDNO:349、CDR-L1包含SEQ ID NO:344、CDR-L2包含SEQ ID NO:345和CDR-L3包含SEQ ID NO:346；
(f)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:365、CDR-H2包含SEQ ID NO:366、CDR-H3包含SEQ IDNO:367、CDR-L1包含SEQ ID NO:362、CDR-L2包含SEQ ID NO:363和CDR-L3包含SEQ ID NO:364；
(g)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:383、CDR-H2包含SEQ ID NO:384、CDR-H3包含SEQ IDNO:385、CDR-L1包含SEQ ID NO:380、CDR-L2包含SEQ ID NO:381和CDR-L3包含SEQ ID NO:382；
(h)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401、CDR-H2包含SEQ ID NO:402、CDR-H3包含SEQ IDNO:403、CDR-L1包含SEQ ID NO:398、CDR-L2包含SEQ ID NO:399和CDR-L3包含SEQ ID NO:400；
(i)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:419、CDR-H2包含SEQ ID NO:420、CDR-H3包含SEQ IDNO:421、CDR-L1包含SEQ ID NO:416、CDR-L2包含SEQ ID NO:417和CDR-L3包含SEQ ID NO:418；
(j)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:437、CDR-H2包含SEQ ID NO:438、CDR-H3包含SEQ IDNO:439、CDR-L1包含SEQ ID NO:434、CDR-L2包含SEQ ID NO:435和CDR-L3包含SEQ ID NO:436；
(k)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:455、CDR-H2包含SEQ ID NO:456、CDR-H3包含SEQ IDNO:457、CDR-L1包含SEQ ID NO:452、CDR-L2包含SEQ ID NO:453和CDR-L3包含SEQ ID NO:454；
(l)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:281、CDR-H2包含SEQ ID NO:282、CDR-H3包含SEQ IDNO:283、CDR-L1包含SEQ ID NO:278、CDR-L2包含SEQ ID NO:279和CDR-L3包含SEQ ID NO:280；
(m)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:299、CDR-H2包含SEQ ID NO:300、CDR-H3包含SEQ IDNO:301、CDR-L1包含SEQ ID NO:296、CDR-L2包含SEQ ID NO:297和CDR-L3包含SEQ ID NO:298；
(n)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:317、CDR-H2包含SEQ ID NO:318、CDR-H3包含SEQ IDNO:319、CDR-L1包含SEQ ID NO:314、CDR-L2包含SEQ ID NO:315和CDR-L3包含SEQ ID NO:316；
(o)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:335、CDR-H2包含SEQ ID NO:336、CDR-H3包含SEQ IDNO:337、CDR-L1包含SEQ ID NO:332、CDR-L2包含SEQ ID NO:333和CDR-L3包含SEQ ID NO:334；
(p)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:353、CDR-H2包含SEQ ID NO:354、CDR-H3包含SEQ IDNO:355、CDR-L1包含SEQ ID NO:350、CDR-L2包含SEQ ID NO:351和CDR-L3包含SEQ ID NO:352；
(q)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:371、CDR-H2包含SEQ ID NO:372、CDR-H3包含SEQ IDNO:373、CDR-L1包含SEQ ID NO:368、CDR-L2包含SEQ ID NO:369和CDR-L3包含SEQ ID NO:370；
(r)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:389、CDR-H2包含SEQ ID NO:390、CDR-H3包含SEQ IDNO:391、CDR-L1包含SEQ ID NO:386、CDR-L2包含SEQ ID NO:387和CDR-L3包含SEQ ID NO:388；
(s)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:407、CDR-H2包含SEQ ID NO:408、CDR-H3包含SEQ IDNO:409、CDR-L1包含SEQ ID NO:404、CDR-L2包含SEQ ID NO:405和CDR-L3包含SEQ ID NO:406；
(t)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:425、CDR-H2包含SEQ ID NO:426、CDR-H3包含SEQ IDNO:427、CDR-L1包含SEQ ID NO:422、CDR-L2包含SEQ ID NO:423和CDR-L3包含SEQ ID NO:424；
(u)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:443、CDR-H2包含SEQ ID NO:444、CDR-H3包含SEQIDNO:445、CDR-L1包含SEQ ID NO:440、CDR-L2包含SEQ ID NO:441和CDR-L3包含SEQ IDNO:442；
(v)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:461、CDR-H2包含SEQ ID NO:462、CDR-H3包含SEQ IDNO:463、CDR-L1包含SEQ ID NO:458、CDR-L2包含SEQ ID NO:459和CDR-L3包含SEQ ID NO:460；
(w)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:287、CDR-H2包含SEQ ID NO:288、CDR-H3包含SEQ IDNO:289、CDR-L1包含SEQ ID NO:284、CDR-L2包含SEQ ID NO:285和CDR-L3包含SEQ ID NO:286；
(x)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:305、CDR-H2包含SEQ ID NO:306、CDR-H3包含SEQ IDNO:307、CDR-L1包含SEQ ID NO:302、CDR-L2包含SEQ ID NO:303和CDR-L3包含SEQ ID NO:304；
(y)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:323、CDR-H2包含SEQ ID NO:324、CDR-H3包含SEQ IDNO:325、CDR-L1包含SEQ ID NO:320、CDR-L2包含SEQ ID NO:321和CDR-L3包含SEQ ID NO:322；
(z)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:341、CDR-H2包含SEQ ID NO:342、CDR-H3包含SEQ IDNO:343、CDR-L1包含SEQ ID NO:338、CDR-L2包含SEQ ID NO:339和CDR-L3包含SEQ ID NO:340；
(aa)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:359、CDR-H2包含SEQ ID NO:360、CDR-H3包含SEQ IDNO:361、CDR-L1包含SEQ ID NO:356、CDR-L2包含SEQ ID NO:357和CDR-L3包含SEQ ID NO:358；
(bb)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:377、CDR-H2包含SEQ ID NO:378、CDR-H3包含SEQ IDNO:379、CDR-L1包含SEQ ID NO:374、CDR-L2包含SEQ ID NO:375和CDR-L3包含SEQ ID NO:376；
(cc)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:395、CDR-H2包含SEQ ID NO:396、CDR-H3包含SEQ IDNO:397、CDR-L1包含SEQ ID NO:392、CDR-L2包含SEQ ID NO:393和CDR-L3包含SEQ ID NO:394；
(dd)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:413、CDR-H2包含SEQ ID NO:414、CDR-H3包含SEQ IDNO:415、CDR-L1包含SEQ ID NO:410、CDR-L2包含SEQ ID NO:411和CDR-L3包含SEQ ID NO:412；
(ee)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:431、CDR-H2包含SEQ ID NO:432、CDR-H3包含SEQ IDNO:433、CDR-L1包含SEQ ID NO:428、CDR-L2包含SEQ ID NO:429和CDR-L3包含SEQ ID NO:430；
(ff)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:449、CDR-H2包含SEQ ID NO:450、CDR-H3包含SEQ IDNO:451、CDR-L1包含SEQ ID NO:446、CDR-L2包含SEQ ID NO:447和CDR-L3包含SEQ ID NO:448；
(gg)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:467、CDR-H2包含SEQ ID NO:468、CDR-H3包含SEQ IDNO:469、CDR-L1包含SEQ ID NO:464、CDR-L2包含SEQ ID NO:465和CDR-L3包含SEQ ID NO:466；
(hh)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:479、CDR-H2包含SEQ ID NO:480、CDR-H3包含SEQ IDNO:481、CDR-L1包含SEQ ID NO:476、CDR-L2包含SEQ ID NO:477和CDR-L3包含SEQ ID NO:478；
(ii)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:485、CDR-H2包含SEQ ID NO:486、CDR-H3包含SEQ IDNO:487、CDR-L1包含SEQ ID NO:482、CDR-L2包含SEQ ID NO:483和CDR-L3包含SEQ ID NO:484；
(jj)所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:473、CDR-H2包含SEQ ID NO:474、CDR-H3包含SEQ IDNO:475、CDR-L1包含SEQ ID NO:470、CDR-L2包含SEQ ID NO:471和CDR-L3包含SEQ ID NO:472；
(kk)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:562、CDR-L2包含SEQ ID NO:563和CDR-L3包含SEQID NO:564，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:565、CDR-H2包含SEQ ID NO:566和CDR-H3包含SEQID NO:567；
(ll)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:580、CDR-L2包含SEQ ID NO:581和CDR-L3包含SEQID NO:582，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:583、CDR-H2包含SEQ ID NO:584和CDR-H3包含SEQID NO:585；
(mm)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:598、CDR-L2包含SEQ ID NO:599和CDR-L3包含SEQID NO:600，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:601、CDR-H2包含SEQ ID NO:602和CDR-H3包含SEQID NO:603；
(nn)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:616、CDR-L2包含SEQ ID NO:617和CDR-L3包含SEQID NO:618，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:619、CDR-H2包含SEQ ID NO:620和CDR-H3包含SEQID NO:621；
(oo)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:634、CDR-L2包含SEQ ID NO:635和CDR-L3包含SEQID NO:636，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:637、CDR-H2包含SEQ ID NO:638和CDR-H3包含SEQID NO:639；
(pp)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:652、CDR-L2包含SEQ ID NO:653和CDR-L3包含SEQID NO:654，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:655、CDR-H2包含SEQ ID NO:656和CDR-H3包含SEQID NO:657；
(qq)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:670、CDR-L2包含SEQ ID NO:671和CDR-L3包含SEQID NO:672，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:673、CDR-H2包含SEQ ID NO:674和CDR-H3包含SEQID NO:675；
(rr)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:688、CDR-L2包含SEQ ID NO:689和CDR-L3包含SEQID NO:690，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:691、CDR-H2包含SEQ IDNO:692和CDR-H3包含SEQID NO:693；
(ss)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:706、CDR-L2包含SEQ ID NO:707和CDR-L3包含SEQID NO:708，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:709、CDR-H2包含SEQ ID NO:710和CDR-H3包含SEQID NO:711；
(tt)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:724、CDR-L2包含SEQ ID NO:725和CDR-L3包含SEQID NO:726，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:727、CDR-H2包含SEQ ID NO:728和CDR-H3包含SEQID NO:729；
(uu)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:742、CDR-L2包含SEQ ID NO:743和CDR-L3包含SEQID NO:744，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:745、CDR-H2包含SEQ ID NO:746和CDR-H3包含SEQID NO:747；
(vv)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:760、CDR-L2包含SEQ ID NO:761和CDR-L3包含SEQID NO:762，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:763、CDR-H2包含SEQ ID NO:764和CDR-H3包含SEQID NO:765；
(ww)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:778、CDR-L2包含SEQ ID NO:779和CDR-L3包含SEQID NO:780，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:781、CDR-H2包含SEQ ID NO:782和CDR-H3包含SEQID NO:783；
(xx)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:796、CDR-L2包含SEQ ID NO:797和CDR-L3包含SEQIDNO:798，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:799、CDR-H2包含SEQ ID NO:800和CDR-H3包含SEQID NO:801；
(yy)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:814、CDR-L2包含SEQ ID NO:815和CDR-L3包含SEQID NO:816，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:817、CDR-H2包含SEQ ID NO:818和CDR-H3包含SEQID NO:819；或者
(zz)所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:832、CDR-L2包含SEQ ID NO:833和CDR-L3包含SEQID NO:834，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:835、CDR-H2包含SEQ ID NO:836和CDR-H3包含SEQID NO:837。
111.根据权利要求109或权利要求110所述的抗体，其中：
(a)所述VH结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943和945，和/或所述VL结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942和944；
(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO:248的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:249的序列；
(c)所述VL结构域包含SEQ ID NO:250的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:251的序列；
(d)所述VL结构域包含SEQ ID NO:252的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:253的序列；
(e)所述VL结构域包含SEQ ID NO:254的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:255的序列；
(f)所述VL结构域包含SEQ ID NO:256的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:257的序列；
(g)所述VL结构域包含SEQ ID NO:258的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:259的序列；
(h)所述VL结构域包含SEQ ID NO:260的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:261的序列；
(i)所述VL结构域包含SEQ ID NO:262的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:263的序列；
(j)所述VL结构域包含SEQ ID NO:264的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:265的序列；
(k)所述VL结构域包含SEQ ID NO:266的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:267的序列；
(l)所述VL结构域包含SEQ ID NO:268的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:269的序列；
(m)所述VL结构域包含SEQ ID NO:270的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:271的序列；
(n)所述VL结构域包含SEQ ID NO:900的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:901的序列；
(o)所述VL结构域包含SEQ ID NO:902的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:903的序列；
(p)所述VL结构域包含SEQ ID NO:904的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:905的序列；
(q)所述VL结构域包含SEQ ID NO:906的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:907的序列；
(r)所述VL结构域包含SEQ ID NO:908的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:909的序列；
(s)所述VL结构域包含SEQ ID NO:910的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:911的序列；
(t)所述VL结构域包含SEQ ID NO:912的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:913的序列；
(u)所述VL结构域包含SEQ ID NO:914的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:915的序列；
(v)所述VL结构域包含SEQ ID NO:916的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:917的序列；
(w)所述VL结构域包含SEQ ID NO:918的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:919的序列；
(x)所述VL结构域包含SEQ ID NO:920的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:921的序列；
(y)所述VL结构域包含SEQ ID NO:922的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:923的序列；
(z)所述VL结构域包含SEQ ID NO:924的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:925的序列；
(aa)所述VL结构域包含SEQ ID NO:926的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:927的序列；
(bb)所述VL结构域包含SEQ ID NO:928的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:929的序列；
(cc)所述VL结构域包含SEQ ID NO:930的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:931的序列；
(dd)所述VL结构域包含SEQ ID NO:932的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:933的序列；
(ee)所述VL结构域包含SEQ ID NO:934的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:935的序列；
(ff)所述VL结构域包含SEQ ID NO:936的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:937的序列；
(gg)所述VL结构域包含SEQ ID NO:938的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:939的序列；
(hh)所述VL结构域包含SEQ ID NO:940的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:941的序列；
(ii)所述VL结构域包含SEQ ID NO:942的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:943的序列；或者
(jj)所述VL结构域包含SEQ ID NO:944的序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO:945的序列。
112.根据权利要求109-111中任一项所述的抗体，其中所述抗体连接至一个或多个包含至少一个谷氨酰胺残基的Q标签肽(Q)。
113.根据权利要求112所述的抗体，其中所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链，以及其中一个Q标签连接至所述抗体的一条或两条重链。
114.根据权利要求112所述的抗体，其中所述Q标签融合至所述抗体的所述重链的C末端。
115.根据权利要求112-114中任一项所述的抗体，其中每个Q标签独立地包含含有5至15个氨基酸残基的肽序列。
116.根据权利要求112-115中任一项所述的抗体，其中所述Q标签是天然存在的。
117.根据权利要求112-115中任一项所述的抗体，其中每个Q标签的肽序列独立地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:39-55。
118.根据权利要求112-115中任一项所述的抗体，其中所述Q标签包含肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)。
119.根据权利要求112-115中任一项所述的抗体，其中每个Q标签独立地包含RPQGF(SEQ ID NO:47)、RPQGFPP(SEQ ID NO:48)或RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)。
120.根据权利要求109-119中任一项所述的抗体，其中1或2个Q标签连接至所述抗体。
121.根据权利要求109-120中任一项所述的抗体，其中所述抗体进一步包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID No:92-107、111、112、178和494-497。
122.根据权利要求109-121中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、scFv、单一结构域、单一重链或单一轻链抗体或抗体片段。
123.根据权利要求109-119中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含Fc区。
124.根据权利要求123所述的抗体，其中所述Fc区是选自由以下组成的组的人Fc区：IgG1 Fc区、IgG2 Fc区和IgG4 Fc区。
125.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含降低与C1q结合的一个或多个氨基酸取代。
126.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含增加与C1q结合的一个或多个氨基酸取代。
127.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是显示出野生型补体激活的人Fc区。
128.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含增加补体激活的一个或多个氨基酸取代。
129.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是人Fc区，所述人Fc区包含一个或多个氨基酸取代并且显示出与C1q的野生型结合。
130.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是包含一个或多个氨基酸取代的人Fc区，与缺乏该氨基酸取代的人Fc区相比所述一个或多个氨基酸取代降低效应子功能。
131.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是：
(a)包含L234A、L235A和/或G237A取代的人IgG1 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；
(b)包含A330S和/或P331S取代的人IgG2 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号；或者
(c)包含S228P和/或L235E取代的人IgG4 Fc区，根据EU索引对氨基酸位置编号。
132.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区进一步包含N297A取代，根据EU索引对氨基酸位置编号。
133.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是野生型人IgG1 Fc区。
134.根据权利要求123或权利要求124所述的抗体，其中所述Fc区是人IgG1 Fc区，所述人IgG1 Fc区已被工程化以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
135.根据权利要求123-124或133-134中任一项所述的抗体，其中所述抗体的两条重链的至少一个或两个是非岩藻糖基化的。
136.根据权利要求135所述的抗体，其中所述抗体在具有α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中生产。
137.根据权利要求135或权利要求136所述的抗体，其中所述抗体在过表达β1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖转移酶III(GnT-III)的细胞系中生产。
138.根据权利要求136或权利要求137所述的抗体，其中所述细胞系另外过表达Golgiμ-甘露糖苷酶II(ManII)。
139.根据权利要求134-138中任一项所述的抗体，其中所述抗体在所述Fc区中包含改善ADCC活性的至少一个氨基酸取代。
140.根据权利要求123-124或134-139中任一项所述的抗体，其中所述抗体在所述Fc区中包含改善ADCP活性的至少一个氨基酸取代。
141.根据权利要求123-124或134-140中任一项所述的抗体，其中所述抗体在所述Fc区中包含改善CDC活性的至少一个氨基酸取代。
142.根据权利要求123-124或134-141中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包含取代G236A，其中根据EU索引编号。
143.根据权利要求123-124或134-141中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包含取代G236A，其中根据EU索引编号，并且所述Fc区是非岩藻糖基化的。
144.根据权利要求109-143中任一项所述的抗体，其中：
(a)所述抗体包含轻链，所述轻链包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ ID NO:236-247和1000-1022，和/或重链，所述重链包含重链序列和Q标签，其中所述重链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:224-235和1030-1065；
(b)所述抗体包含轻链，所述轻链包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ ID NO:236-247和1000-1022，和/或重链，所述重链包含选自由以下组成的组的重链序列：SEQ IDNO:1070-1117；
(c)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:224的重链；
(d)所述抗体包含含有SEQ ID NO:237的轻链和/或含有SEQ ID NO:225的重链；
(e)所述抗体包含含有SEQ ID NO:238的轻链和/或含有SEQ ID NO:226的重链；
(f)所述抗体包含含有SEQ ID NO:239的轻链和/或含有SEQ ID NO:227的重链；
(g)所述抗体包含含有SEQ ID NO:240的轻链和/或含有SEQ ID NO:228的重链；
(h)所述抗体包含含有SEQ ID NO:241的轻链和/或含有SEQ ID NO:229的重链；
(i)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:230的重链；
(j)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:231的重链；
(k)所述抗体包含含有SEQ ID NO:244的轻链和/或含有SEQ ID NO:232的重链；
(l)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ IDNO:233的重链；
(m)所述抗体包含含有SEQ ID NO:246的轻链和/或含有SEQ ID NO:234的重链；
(n)所述抗体包含含有SEQ ID NO:247的轻链和/或含有SEQ ID NO:235的重链；
(o)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1000的轻链和/或含有SEQ ID NO:1030的重链；
(p)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和/或含有SEQ ID NO:1031的重链；
(q)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和/或含有SEQ ID NO:1032的重链；
(r)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和/或含有SEQ ID NO:1033的重链；
(s)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和/或含有SEQ ID NO:1034的重链；
(t)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和/或含有SEQ ID NO:1035的重链；
(u)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和/或含有SEQ ID NO:1036的重链；
(v)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1037的重链；
(w)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1038的重链；
(x)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和/或含有SEQ ID NO:1039的重链；
(y)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和/或含有SEQ ID NO:1040的重链；
(z)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和/或含有SEQ ID NO:1041的重链；
(aa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1042的重链；
(bb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和/或含有SEQ ID NO:1043的重链；
(cc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和/或含有SEQ ID NO:1044的重链；
(dd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和/或含有SEQ ID NO:1045的重链；
(ee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和/或含有SEQ ID NO:1046的重链；
(ff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1047的重链；
(gg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1048的重链；
(hh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1049的重链；
(ii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1050的重链；
(jj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1051的重链；
(kk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1052的重链；
(ll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1053的重链；
(mm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1054的重链；
(nn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1055的重链；
(oo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1056的重链；
(pp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1057的重链；
(qq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1058的重链；
(rr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1059的重链；
(ss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1060的重链；
(tt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1061的重链；
(uu)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1062的重链；
(vv)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1063的重链；
(ww)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1064的重链；
(xx)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1065的重链；
(yy)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1070的重链；
(zz)所述抗体包含含有SEQ ID NO:237的轻链和/或含有SEQ ID NO:1071的重链；
(aaa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:238的轻链和/或含有SEQ ID NO:1072的重链；
(bbb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:239的轻链和/或含有SEQ ID NO:1073的重链；
(ccc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:240的轻链和/或含有SEQ ID NO:1074的重链；
(ddd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:241的轻链和/或含有SEQ ID NO:1075的重链；
(eee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1076的重链；
(fff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1077的重链；
(ggg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:244的轻链和/或含有SEQ ID NO:1078的重链；
(hhh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1079的重链；
(iii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:246的轻链和/或含有SEQ ID NO:1080的重链；
(jjj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:247的轻链和/或含有SEQ ID NO:1081的重链；
(kkk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1000的轻链和/或含有SEQ ID NO:1082的重链；
(lll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1001的轻链和/或含有SEQ ID NO:1083的重链；
(mmm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1002的轻链和/或含有SEQ ID NO:1084的重链；
(nnn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1003的轻链和/或含有SEQ ID NO:1085的重链；
(ooo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1004的轻链和/或含有SEQ ID NO:1086的重链；
(ppp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1005的轻链和/或含有SEQ ID NO:1087的重链；
(qqq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1006的轻链和/或含有SEQ ID NO:1088的重链；
(rrr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1089的重链；
(sss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1090的重链；
(ttt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1009的轻链和/或含有SEQ ID NO:1091的重链；
(uuu)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1010的轻链和/或含有SEQ ID NO:1092的重链；
(vvv)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1011的轻链和/或含有SEQ ID NO:1093的重链；
(www)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1094的重链；
(xxx)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1013的轻链和/或含有SEQ ID NO:1095的重链；
(yyy)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1014的轻链和/或含有SEQ ID NO:1096的重链；
(zzz)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1015的轻链和/或含有SEQ ID NO:1097的重链；
(aaaa)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1016的轻链和/或含有SEQ ID NO:1098的重链；
(bbbb)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1099的重链；
(cccc)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1100的重链；
(dddd)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1101的重链；
(eeee)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1102的重链；
(ffff)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1103的重链；
(gggg)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1104的重链；
(hhhh)所述抗体包含含有SEQ ID NO:236的轻链和/或含有SEQ ID NO:1105的重链；
(iiii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:242的轻链和/或含有SEQ ID NO:1106的重链；
(jjjj)所述抗体包含含有SEQ ID NO:243的轻链和/或含有SEQ ID NO:1107的重链；
(kkkk)所述抗体包含含有SEQ ID NO:245的轻链和/或含有SEQ ID NO:1108的重链；
(llll)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1007的轻链和/或含有SEQ ID NO:1109的重链；
(mmmm)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1008的轻链和/或含有SEQ ID NO:1110的重链；
(nnnn)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1012的轻链和/或含有SEQ ID NO:1111的重链；
(oooo)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1017的轻链和/或含有SEQ ID NO:1112的重链；
(pppp)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1018的轻链和/或含有SEQ ID NO:1113的重链；
(qqqq)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1019的轻链和/或含有SEQ ID NO:1114的重链；
(rrrr)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1020的轻链和/或含有SEQ ID NO:1115的重链；
(ssss)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1021的轻链和/或含有SEQ ID NO:1116的重链；或者
(tttt)所述抗体包含含有SEQ ID NO:1022的轻链和/或含有SEQ ID NO:1117的重链。
145.根据权利要求109-144中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性或多特异性抗体，其至少包含第二VL结构域和第二VH结构域，其中所述第二VL结构域和第二VH结构域特异性结合与人连接蛋白-4不同的靶标。
146.一种制备缀合物的方法，所述缀合物包含(i)特异性结合人连接蛋白-4的抗体或其抗原结合片段(Ab)和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，所述Q标签肽包含氨基酸序列RPQGF(SEQ ID NO:47)，以及其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示，
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点；
每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGF(SEQ ID NO:47)；
每个L独立地是键或通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与Q连接的接头部分；和
每个P独立地是免疫调节寡核苷酸；
该方法包括在转谷氨酰胺酶存在的条件下使式(B)化合物
其中Ab和Q如上文针对式(A)所定义，且e是从1至20的整数，
与一个或多个免疫调节寡核苷酸P接触，其中每个P独立地：
(i)具有下式：
其中
X5’是5’末端核苷；
X3’是3’末端核苷；
YPTE是核苷间磷酸三酯；
Y3’是末端磷酸三酯；
每个XN独立地是核苷；
每个YN独立地是核苷间接头；
b和c各自独立地是从1至25的整数；条件是b和c的总和至少是5；和
L是包含末端胺的接头部分；或者
(ii)是式(C)或(D)的免疫调节寡核苷酸。
147.根据权利要求146所述的方法，其中每个免疫调节寡核苷酸独立地是式(C)或式(D)的寡核苷酸：其选自表4和表6的寡核苷酸。
148.根据权利要求146或权利要求147所述的方法，其中所述抗体是根据权利要求109-145中任一项所述的抗体。
149.根据权利要求146-148中任一项所述的方法，其进一步包含将DAR为1的缀合物与游离寡核苷酸、未缀合的抗体和DAR为2的缀合物分离。
150.一种缀合物，其包含与药剂缀合的权利要求109-145中任一项所述的抗体。
151.根据权利要求150所述的缀合物，其中所述药剂是标签。
152.根据权利要求150所述的缀合物，其中所述药剂是细胞毒性药剂。
153.根据权利要求150所述的缀合物，其中所述药剂是调节免疫系统的部分。
154.根据权利要求153所述的缀合物，其中所述部分选自由以下组成的组：IDO/TDO抑制剂、AhR抑制剂、精氨酸酶抑制剂、A2aR抑制剂、TLR激动剂、STING激动剂和Rig-1激动剂。
155.根据权利要求153所述的缀合物，其中所述部分包含细胞因子。
156.根据权利要求155所述的缀合物，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL2、IL7、IL10、IL15或IFN。
157.根据权利要求153所述的缀合物，其中所述部分调节细胞因子的活性。
158.根据权利要求157所述的缀合物，其中所述部分调节IL2、IL7、IL10、IL15或干扰素的活性。
159.根据权利要求153所述的缀合物，其中所述部分包含癌症疫苗。
160.根据权利要求109-145中任一项所述的抗体或者权利要求150或权利要求153所述的缀合物，其中所述抗体连接至根据表3-6的修饰的寡核苷酸结构的任一个的修饰的寡核苷酸结构。
161.一种药物组合物，其包含权利要求1-108或150-160中任一项所述的缀合物或者权利要求109-145或160中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
162.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽，和其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中*和/>**表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:276的序列、CDR-H3包含SEQ ID NO:277的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:272的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:273的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:274的序列。
163.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，和其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中*和/>**表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:402的序列、CDR-H3包含SEQ ID NO:403的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:398的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:399的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:400的序列。
164.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，和其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中*和/>**表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:679的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:680的序列、CDR-H3包含SEQ ID NO:681的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:676的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:677的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:678的序列。
165.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，和其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中*和/>**表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点；/>
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:275的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:276的序列、CDR-H3包含SEQ ID NO:277的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:272的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:273的序列和CDR-L3包含SEQ IDNO:274的序列。
166.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，和其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
/>
其中*和/>**表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:401的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:402的序列、CDR-H3包含SEQ ID NO:403的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:398的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:399的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:400的序列。
167.一种缀合物，其包含(i)抗连接蛋白-4抗体或其抗原结合片段和(ii)一个或多个免疫调节寡核苷酸(P)，其中所述抗体或抗原结合片段连接至一个或多个Q标签肽(Q)，和其中每个免疫调节寡核苷酸通过与所述Q标签肽的谷氨酰胺残基的酰胺键和接头(L)连接至Q标签肽，如式(A)中所示
其中：
表示每个Q与所述抗体或其抗原结合片段(Ab)的连接点每个Q独立地包含Q标签肽序列RPQGFGPP(SEQ ID NO:49)；
每个L独立地是键或接头部分
其中m是范围从约0至约50的整数，和其中表示与P的连接点，和/>表示与通过与所述谷氨酰胺残基的酰胺键与连接于Q的所述缀合物的其余部分的连接点；和
每个P独立地是具有以下结构的免疫调节寡核苷酸
其中*和/>**表示在所述寡核苷酸内的连接点，和其中/>表示与所述接头L的连接点；
其中所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和所述VL结构域包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:679的序列、CDR-H2包含SEQ ID NO:680的序列、CDR-H3包含SEQ ID NO:681的序列、CDR-L1包含SEQ ID NO:676的序列、CDR-L2包含SEQ ID NO:677的序列和CDR-L3包含SEQ ID NO:678的序列。
168.根据权利要求162或权利要求165所述的缀合物，其中所述抗体包含(a)含有SEQID NO:935的重链可变区(VH)结构域和含有SEQ ID NO:934的轻链可变区(VL)结构域；(b)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1047，和包含SEQ ID NO:1017的轻链；(c)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1060，和包含SEQID NO:1017的轻链；(d)包含SEQ ID NO:1099的重链和包含SEQ ID NO:1017的轻链；或者(e)包含SEQ ID NO:1112的重链和包含SEQ ID NO:1017的轻链。
169.根据权利要求163或166所述的缀合物，其中所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO:937的重链可变区(VH)结构域和含有SEQ ID NO:936的轻链可变区(VL)结构域；(b)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1048，和包含SEQ ID NO:1018的轻链；(c)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1061，和包含SEQ ID NO:1018的轻链；(d)包含SEQ ID NO:1100的重链和包含SEQ ID NO:1018的轻链；或者(e)包含SEQID NO:1113的重链和包含SEQ ID NO:1018的轻链。
170.根据权利要求164或167所述的缀合物，其中所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO:939的重链可变区(VH)结构域和含有SEQ ID NO:938的轻链可变区(VL)结构域；(b)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1049，和包含SEQ ID NO:1019的轻链；(c)包含重链序列和Q标签的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:1062，和包含SEQ ID NO:1019的轻链；(d)包含SEQ ID NO:1101的重链和包含SEQ ID NO:1019的轻链；或者(e)包含SEQID NO:1114的重链和包含SEQ ID NO:1019的轻链。
171.根据权利要求162-170中任一项所述的缀合物，其中m是从约20至约30。
172.根据权利要求162-171中任一项所述的缀合物，其中m是约24或m是24。
173.根据权利要求162-170中任一项所述的缀合物，其中L包含聚乙二醇部分。
174.根据权利要求173所述的缀合物，其中所述聚乙二醇部分包含约24个乙二醇单元或包含24个乙二醇单元。
175.根据权利要求162-164或权利要求168-170中任一项所述的缀合物，其中在所述缀合物中的每个(P)和(L)独立地包含SEQ ID NO:35的修饰的寡核苷酸。
176.根据权利要求165-170中任一项所述的缀合物，其中在所述缀合物中的每个(P)和(L)独立地包含SEQ ID NO:9的修饰的寡核苷酸。
177.根据权利要求162-176中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含Fc区。
178.根据权利要求177所述的缀合物，其中所述Fc区是人IgG1Fc区。
179.根据权利要求177或权利要求178所述的缀合物，其中所述Fc区是非岩藻糖基化的。
180.根据权利要求177或权利要求178所述的缀合物，其中所述Fc区包含取代G236A，其中根据EU索引编号。
181.根据权利要求177或权利要求178所述的缀合物，其中所述Fc区包含取代G236A，其中根据EU索引编号，并且Fc区是非岩藻糖基化的。
182.根据权利要求162-181中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物的DAR是1或2。
183.一种药物组合物，其包含权利要求162-182中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
184.一种治疗癌症的方法，其包括向个体施用有效量的根据权利要求1-108、150-160或162-182中任一项所述的缀合物或者根据权利要求109-145或160中任一项所述的抗体或者权利要求161或权利要求183所述的药物组合物。
185.根据权利要求184所述的方法，其中与所述癌症来源的正常细胞相比，癌肿瘤细胞过表达连接蛋白-4。
186.根据权利要求184所述的方法，其中与所述癌症来源的正常细胞相比，癌肿瘤细胞表达正常或中等水平的连接蛋白-4。
187.根据权利要求184所述的方法，其中与所述癌症来源的正常细胞相比，癌肿瘤细胞表达低水平的连接蛋白-4。
188.根据权利要求184-187中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用至少一种其他癌症治疗剂。
189.根据权利要求188所述的方法，其中所述至少一种其他癌症治疗剂包含化学治疗剂、免疫治疗剂、小分子抑制剂(SMQ)、治疗性抗体或癌症疫苗。
190.根据权利要求184-189中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体癌症。
191.根据权利要求184-189中任一项所述的方法，其中所述癌症是液体肿瘤。
192.根据权利要求184-189中任一项所述的方法，其中所述癌症是食道癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺腺癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、直肠癌或胆囊癌。
193.根据权利要求184-192中任一项所述的方法，其中施用所述缀合物或所述药物组合物活化T细胞、树突状细胞、单核细胞和/或NK细胞。
194.一种在个体中活化免疫细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1-108、150-160或162-182中任一项所述的缀合物或者包含权利要求1-108、150-160或162-182中任一项所述的缀合物的权利要求161或权利要求183所述的药物组合物，其中施用所述缀合物或所述药物组合物活化T细胞、树突状细胞、单核细胞和/或NK细胞。
195.根据权利要求194所述的方法，其中所述个体患有癌症。
196.根据权利要求194或权利要求195所述的方法，其中所述方法进一步包括施用至少一种其他癌症治疗剂。
197.根据权利要求196所述的方法，其中所述至少一种其他癌症治疗剂包含化学治疗剂、免疫治疗剂、小分子抑制剂(SMQ)、治疗性抗体或癌症疫苗。
198.根据权利要求195-197中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体癌症。
199.根据权利要求195-197中任一项所述的方法，其中所述癌症是液体肿瘤。
200.根据权利要求195-197中任一项所述的方法，其中所述癌症是食道癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺腺癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、直肠癌或胆囊癌。
201.根据权利要求195-200中任一项所述的方法，其中所述癌症是免疫检查点抑制剂疗法难治性的。
202.根据权利要求201所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂疗法包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
203.一种治疗肿瘤或肿瘤细胞的方法，其包括施用有效量的根据权利要求1-108、150-160、162-182中任一项所述的缀合物，根据权利要求109-145中任一项所述的抗体或者权利要求161或权利要求183所述的药物组合物。
204.根据权利要求203所述的方法，其中治疗所述肿瘤或肿瘤细胞包括杀死所述肿瘤或肿瘤细胞、诱导所述肿瘤或肿瘤细胞的细胞毒性、降低或抑制所述肿瘤或肿瘤细胞的活力、抑制所述肿瘤或肿瘤细胞生长、抑制所述肿瘤或肿瘤细胞建立、抑制或降低所述肿瘤或肿瘤细胞转移、缩小所述肿瘤的尺寸或者激活针对所述肿瘤或肿瘤细胞的免疫应答。
205.一种核酸，其编码权利要求1-108、150-160或162-182中任一项所述的缀合物的抗体，或者权利要求109-145或160中任一项所述的抗体。
206.一种载体，其包含权利要求205所述的核酸。
207.根据权利要求206所述的载体，其是表达载体。
208.一种宿主细胞，其包含权利要求206或权利要求207所述的载体。
209.根据权利要求208所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞或细菌细胞。
210.根据权利要求209所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，其是CHO细胞。
211.一种生产权利要求109-145中任一项所述的抗体的方法，其包括在所述宿主细胞中表达所述抗体的条件下，培养权利要求208-210中任一项所述的宿主细胞。
212.根据权利要求211所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞中分离和/或纯化所述抗体。
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