CN117835995A - 用于治疗慢性龈口炎的间充质干细胞 - Google Patents

用于治疗慢性龈口炎的间充质干细胞 Download PDF

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CN117835995A CN202280056151.1A CN202280056151A CN117835995A CN 117835995 A CN117835995 A CN 117835995A CN 202280056151 A CN202280056151 A CN 202280056151A CN 117835995 A CN117835995 A CN 117835995A
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C·比尔茨
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Abstract

本发明涉及间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其用于治疗对象、优选地猫科动物和犬科动物的慢性龈口炎(CGS)。在第二方面，本发明涉及MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其在对象、优选地在被诊断有或患有慢性龈口炎的猫科动物和犬科动物中的CGS炎症反应的急性和/或慢性阶段期间用作免疫调节剂。在最后一个方面，本发明涉及包含源自外周血的MSC的药物组合物。

Description

用于治疗慢性龈口炎的间充质干细胞
技术领域
本发明涉及用于在对象、优选地犬科动物和猫科动物中治疗慢性牙龈造口炎的间充质干细胞。
背景技术
猫科动物或犬科动物慢性龈口炎(CGS)是一种严重的特发性炎症性口腔疾病，其特征是牙龈、颊粘膜和尾部口腔粘膜严重炎症。该疾病影响大约0.7-10％的一般猫群。CGS在犬类患者中的发病率也不断增加。CGS的病因尚不清楚，但有人认为微生物因素和先天免疫反应的改变可能在这种疾病的发病机制中发挥重要作用。从组织学角度来看，猫或狗的损伤特征是淋巴细胞(主要是效应T细胞和B细胞)炎症。这种病症会导致疼痛的粘膜病变，从而显著降低生活质量。临床症状各不相同，包括疼痛、中度至重度口腔不适、食欲不振、体重减轻、梳理次数减少和多涎。
到目前为止，还没有针对猫科动物或犬科动物慢性龈口炎(CGS)100％有效的治疗方法，这可能会导致一些受影响的猫和狗被安乐死。大约70％的猫对由全部或部分拔牙组成的标准治疗有反应。剩下的30％对拔牙没有反应，需要终生接受抗生素、皮质类固醇和其他止痛药物治疗。在这些难治性情况下，可以考虑使用抗炎或免疫调节疗法进行治疗。
MSC抑制T细胞增殖和刺激T细胞无反应性的能力表明MSC治疗对于CGS的治疗非常有希望。
因此，间充质干细胞(MSC)因其免疫调节特性而被提议作为CGS治疗的潜在替代方案，其可以抑制CGS的炎症过程，在很短的时间内减缓其进展，甚至导致持续性损伤的逆转。几项研究调查了它们治疗慢性龈口炎的安全性和有效性，并显示了非常有趣的结果。
这些研究大多数使用源自脂肪组织或骨髓(BM)的自体MSC。然而，在某些情况下，使用同种异体或异种MSC是更有利的选择，因为它们可以严格选择健康和高质量的干细胞供体。它们允许生产即用型产品，避免从每个患者身上侵入性采集和耗时的MSC培养。由于猫科动物和犬科动物MSC的培养能力相对较低，因此可以有利地使用异种(例如人或马)MSC，特别是用于商业应用，例如用于治疗犬科动物和猫科动物的慢性龈口炎。此外，异种MSC不含可传播的物种特异性病原体。
同样，从骨髓中提取MSC是一种侵入性且高风险的方法。脂肪组织作为MSC的来源是一种更安全的替代方案，但仍然具有侵入性。
在某些情况下，使用天然MSC是一个有利的选择，因为它们允许生产即用型产品，只需最少的制造和处理，从而降低生产成本。
本领域仍然需要改进MSC的使用，以减缓猫和狗家庭中OA的疾病进展和/或甚至逆转OA的病理状况。本发明旨在解决上述缺点中的至少一个。
发明内容
本发明及其实施方案用于提供针对一个或多个上述缺点的解决方案。为此，本发明涉及根据权利要求1所述的间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其用于治疗对象、优选地猫科动物和犬科动物的慢性龈口炎。在实施方案中，所述MSC源自血液，优选外周血。在实施方案中，所述MSC是静脉内施用的。在实施方案中，所述MSC是天然MSC。在实施方案中，所施用的所述MSC是异种MSC。用于本发明用途的MSC的优选实施方案在权利要求2-19中任一项中示出。
在第二方面，本发明涉及根据权利要求20所述的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其在诊断有或患有慢性龈口炎的猫科动物和犬科动物的CGS炎症反应的急性和/或慢性期期间用作免疫调节剂。
在第三方面，本发明涉及根据权利要求21所述的用于静脉内施用的药物组合物，其包含天然外周血来源的MSC，所述MSC是动物来源的并且存在于无菌液体中。
通过从血液(优选地外周血)中得到MSC，可以使用非侵入性以及无痛的来源来分离MSC。通过这种方式，可以简单以及安全地收集MSC。
附图说明
图1显示了在使用伴刀豆球蛋白A刺激的猫外周血单个核细胞(PBMC)的混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，根据本发明的一个实施方案，在十只健康猫静脉内注射300.000个ePB-MSC之前(第0天，T0)和之后(第6周，T3)的平均PBMC增殖。
图2显示了根据本发明的一个实施方案，在IV注射包含在低葡萄糖DMEM中的2-5×105个放射性标记的ePB-MSC的组合物(体积为1ml)之后，在患有猫科动物CGS的猫中在不同时间点测得的放射性。将组合物静脉内注射到头静脉后，可以看到肺、肾和膀胱。另外，在IV注射组合物后10分钟和6小时观察到口腔水平处的放射性吸收(箭头)。
发明详述
本发明涉及用于治疗猫科动物和犬科动物的慢性龈口炎的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC可以源自血液，优选地外周血。源自血液的MSC与源自骨髓和脂肪组织的MSC表现出相似的形态。然而，通过从外周血中提取MSC，可以使用非侵入性以及无痛的来源来分离MSC。通过这种方式，可以简单以及安全地收集MSC。
定义
除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术术语和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
如本文所用，以下术语具有以下含义：
除非上下文另有明确规定，否则本文中使用的“a”、“an”和“the”既指单数也指复数。例如，“a compartment”是指一个或多个区室。
此处所用的“约”指的是可测量值，如参数、量、持续时间等，是指包含特定值的+/-20％或更小，优选+/-10％或更小，更优选+/-5％或更小，甚至更优选+/-1％或更小，还更优选+/-0.1％或更小的变化，到目前为止，这样的变化适合于在所公开的发明中执行。然而，应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体公开。
此处使用的“包含”(“Comprise”、“comprising”、“comprises”和“comprised of”)和与“包括”(“include”、“including”、“includes”)或“含有”(“contain”、“containing”、“contains”)同义，并且是包括性或开放式术语，其规定了所跟随的内容的存在，例如组分，并且不排除或避免本领域已知或其中公开的附加的、未列举的组件、特征、元件、构件、步骤的存在。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似元件，而不一定用于描述先后顺序或时间顺序，除非另有说明。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文所描述的本发明的实施方案能够以除本文所描述或图示之外的其他顺序操作。
通过端点对数值范围的引用包括该范围内包含的所有数字和分数，以及所引用的端点。
尽管术语“一个或多个”或“至少一个”，例如一组成员中的一个或更多或至少一个成员，本身是明确的，但通过进一步的例证，该术语包括对所述成员中的任何一个或所述成员的任何两个或更多个的引用，例如，所述成员的≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等，直至所有所述成员。
除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术术语和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括说明书中使用的术语的定义，以更好地理解本发明的教导。此处使用的术语或定义仅用于帮助理解本发明。
在整个说明书中，对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着结合实施方案描述的特定特点、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在本说明书的各个地方的出现不一定都指同一实施方案，而是可以指同一实施方案。此外，特定的特点、结构或特性可以以任何合适的方式组合，如本领域技术人员从本公开中，在一个或多个实施方案中显而易见的。此外，虽然本文所述的一些实施方案包括一些但不包括其他实施方案中包括的其他特征，但不同实施方案的特征的组合应在本发明的范围内，并形成不同的实施方案，如本领域技术人员所理解的。例如，在以下权利要求中，任何要求保护的实施方案都可以以任何组合使用。
术语“间充质干细胞”或“MSC”是指表达一组特定表面抗原并可分化为各种细胞类型的多能自我更新细胞，包括但不限于体外培养或体内存在的脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。
术语“分离”是指从细胞培养物或生物样品(如血液)中对细胞进行物理鉴定和分离，这可以通过应用适当的细胞生物学技术来进行，这些技术要么基于对细胞培养物的检查，要么基于与标准品相对应的细胞的表征(以及在可能和需要的情况下进行物理分离)，或根据抗原的存在/不存在和/或细胞大小对细胞进行自动分选(例如通过FACS)。在一些实施方案中，术语“分离”("isolating")或“分离”("isolation")可包括进一步的细胞物理分离和/或定量步骤，特别是通过进行流式细胞术。
本文中使用的术语“体外”表示身体以外或身体的外部。此处使用的术语“体外”应理解为包括“离体”("ex vivo")。术语“离体”通常指从体内移除并在体外(例如，在培养容器或生物反应器中)维持或繁殖的组织或细胞。
术语“传代”(passage)或“传代”(passaging)在本领域中是常见的，指的是将培养的(间充质干)细胞从培养底物上分离和解离以及培养的(间充质干)细胞彼此分离和解离。为了简单起见，在贴壁培养条件下第一次生长细胞后进行的传代通常称为“第一次传代”(或传代1，P1)。细胞可以传代至少一次，优选两次或多次。传代1之后的每个传代都用增加1的数字表示，例如传代2、3、4、5或P1、P2、P3、P4、P5等。
术语“细胞培养基”或“细胞培养基质”或“培养基”是指包含可用于细胞的维持或生长的营养物质的含水液体或凝胶状物质。细胞培养基可以含有血清或无血清。细胞培养基可以包含生长因子或补充生长因子。
本文所用的术语“生长因子”是指一种生物活性物质，其影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移，并可能单独或在被其他物质调节时影响生物体的发育、形态和功能变化。生长因子通常可以通过作为配体与细胞中存在的受体(例如，表面或细胞内受体)结合而起作用。
在本上下文中，MSC的“自体”施用是指来自供体的MSC被施用给受体，其中受体和供体都是相同的。
在本上下文中，MSC的“同种异体”施用是指将供体的MSC施用给受体，其中受体和供体都属于同一物种，但不是同一个。
本上下文中MSC的“异种”施用是指来自供体的MSC被施用给受体，其中受体和供体来自不同物种。
在本发明的上下文中，“天然MSC”(Native MSC)是指未暴露于刺激环境(如炎症介质)的MSC。如本文所用，“炎性环境”或“炎症状况”是指以(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子增加；和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的减少为特征的状态或状况。
术语“抗炎”、“抗炎症”和“免疫抑制”，“免疫抑制的”是指以局部炎症(如但不限于热、疼痛、肿胀、发红和功能丧失)的至少一种迹象减少和/或以全身状态变化为特征的任何状态或状况，所述全身状态变化的特征是(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子的减少；和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的增加。
本发明的“群体倍增时间”或“PDT”将通过以下公式计算：PDT＝T/(ln(Nf/Ni)/ln(2))，其中T是达到80％汇合的细胞培养时间(以天为单位)，Nf是细胞脱附后的最终细胞数，其中Ni是时间点0时的初始细胞数。
术语“抗凝血剂”是指一种可以抑制血液凝固的组合物。本发明中使用的抗凝剂的实例包括EDTA或肝素。
本发明中的术语“血沉棕黄层”应理解为未凝固血液的级分，优选地通过密度梯度离心获得，其中该级分富含白细胞和血小板。
术语“相间血液”(blood-inter-phase)应理解为血液的级分，优选地通过密度梯度获得，位于主要由红细胞和多形核细胞组成的底部级分和主要由血浆组成的上部级分之间。相间血液是血液单个核细胞(BMC)的来源，包含单核细胞、淋巴细胞和MSC。
本文中使用的术语“悬浮直径”被理解为细胞在悬浮液中的平均直径。测量直径的方法在本领域中是已知的。可能的方法是流式细胞术、共聚焦显微术、图像细胞仪或本领域中已知的其他方法。
术语“治疗有效量”是指对减轻症状或改善疾病状况有效的化合物或组合物的最小量或浓度。
术语“治疗”是指减少或防止病理状况或病症发展或进展的治疗、预防或防止性措施。
“慢性龈口炎”(CGS)是一种严重的特发性炎症性口腔疾病，其特征是牙龈、颊粘膜和尾部口腔粘膜严重炎症，影响猫和狗等，特别是约0.7-10％的一般猫种群。CGS的病因尚不清楚，但有人认为微生物因素和先天免疫反应的改变可能在这种病症的发病机制中发挥重要作用。从组织学角度来看，猫和狗的损伤的特点是淋巴细胞炎症，主要是效应T细胞和B细胞。这种病症会导致痛苦的粘膜病变，从而显著降低生活质量。临床症状各不相同，包括疼痛、中度至重度口腔不适、食欲不振、体重减轻、梳理减少和多涎。
术语“患者”、“对象”、“动物”或“哺乳动物”可互换使用，指的是待治疗的哺乳动物对象。优选地，哺乳动物是猫科动物或犬科动物，例如分别是猫或狗。
本发明中的“猫科(feline)”或“猫科动物(felines)”是指猫科(Felidae)的猫。这个家族的成员也被称为猫科的动物(felid)。现存的猫科分为两个亚科：豹亚科(Pantherinae)和猫亚科(Felinae)。豹亚科包括五个豹属(Panthera)和两个云豹属(Neofelis)的种，而猫亚科包括10个属中的其他34个种，其中包括家猫、猎豹、薮猫(serval)、猞猁和美洲狮。
本发明中的“犬科(canine)”或“犬科动物(canines)”是指犬科(Canidae)的类狗食肉动物。这个家庭的成员被称为犬科的动物(canid)。犬科中有三个亚科，分别是已灭绝的Borophaginae亚科和Hesperocyoninae亚科，以及现存的犬亚科(Caninae)。犬亚科被称为犬科动物，包括家养狗、狼、狐狸、郊狼、豺狼和其他现存和已灭绝的物种。
“混合淋巴细胞反应(MLR)”测定法传统上用于研究外部试剂是否刺激或抑制T细胞增殖。通过使用MLR测定，可以研究MSC的免疫调节特性。对于这种MLR测定，应答T细胞用荧光染料标记，当其暴露于特定的光频率时，荧光染料会亮起绿色。然后用植物促分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激这些应答T细胞以诱导或刺激增殖。ConA是一种不依赖抗原的促分裂原，可作为替代T细胞刺激物。这种凝集素经常在T细胞刺激实验中用作抗原呈递细胞的替代物。伴刀豆球蛋白A与细胞表面的糖蛋白不可逆地结合，使T细胞增殖。这是一种快速刺激转录因子和细胞因子产生的方法。当T细胞开始分裂时，染料会分布在其子细胞上，因此染料会随着每次细胞分裂而连续稀释。因此，可以通过观察颜色的减少来测量T细胞的增殖量。因此，为了研究MSC的免疫调节特性，将这些MSC添加到受刺激的应答T细胞中，并共同孵育几天。包括适当的阳性和阴性对照，以查看测试是否成功进行。在孵育期结束时，使用流式细胞术测量T细胞增殖量，从而能够观察MSC是否抑制T细胞增殖。
描述
由于其免疫调节特性，间充质干细胞已被提议用于治疗炎症相关疾病。这些免疫调节特性可以抑制猫科动物和犬科动物慢性龈口炎(CGS)等的过度炎症过程，在很短的时间内减缓其进展，甚至导致持续损伤的逆转。先前的研究调查了它们在治疗对象中的安全性和有效性，特别是在治疗猫科动物和犬科动物慢性龈口炎方面，并显示出非常有趣的结果。这些研究大多数使用源自脂肪组织或骨髓(BM)的自体MSC。
在第一方面，本发明涉及间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其用于治疗对象、优选地猫科动物和犬科动物的慢性龈口炎(CGS)或作为用于治疗对象，优选地猫科动物和犬科动物的CGS的方法，或用于制备用于治疗对象，优选地猫科动物和犬科动物的CGS的药物。
所述猫科动物可以是猫科的任何猫，优选地猫亚科的猫，更优选地家猫(Feliscatus)。所述犬科动物可以是犬科的任何狗样食肉动物，优选地犬亚科，更优选地家犬(Canis familiaris)。
在一个实施方案中，所述用于所述用途的MSC是天然的。这种天然MSC尚未首先在体外暴露于刺激剂，例如炎性介质或炎性环境。这种炎性环境是指以(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子的增加；和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的减少为特征的状态或病况。使用天然MSC有时是一个有利的选择，因为它们允许生产即用型产品，生产和处理最小化，从而降低生产成本。
优选地，MSC的细胞大小在10μm至100μm之间，更优选地在15μm至80μm之间、更优选地在20μm至75μm之间、更加优选地在25μm至50μm之间。在一个实施方案中，根据本发明使用的MSC是通过过滤系统按大小选择的，其中使用40μm过滤器使细胞通过双重过滤步骤过滤。优选两个或更多个过滤步骤。后者提供了大量的单细胞并避免了细胞聚集体的存在。这种细胞聚集体在通过冷冻保存细胞的过程中可能导致细胞死亡，并且都可能对细胞的进一步下游应用产生影响。例如，当静脉内施用时，细胞聚集体可能会增加发生毛细血管栓塞的风险。
之前发表的大多数研究都使用源自脂肪组织或骨髓(BM)的自体或同种异体MSC。
根据本发明使用的MSC可以来源于各种组织或体液，特别是来自血液、骨髓、脂肪组织或羊膜组织。据报道，MSC的骨髓采集与出血、慢性疼痛、神经血管损伤甚至死亡有关。脂肪组织作为MSC的来源被认为是一种更安全的选择。然而，从脂肪组织中采集MSC仍然需要在供体动物身上切开，因此这仍然是一种侵入性手术。来源于血液的MSC显示出与来源于骨髓和脂肪组织的MSC相似的形态。因此，优选地，MSC来源于血液，包括但不限于脐带血和外周血。更优选地，MSC来源于外周血。血液不仅是一种无创以及无痛的来源，而且采集简单以及安全，因此易于获取并且之后倾向于较少的并发症。MSC或包含MSC的血液可以来源于所有哺乳动物，包括但不限于人类、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物、伴侣动物和实验动物，例如小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、马、猪和灵长类动物，例如猴子和猿；尤其是马、人、猫、狗、啮齿动物等。在一个实施方案中，所述的来源是马。特别地，MSC可以来源于外周血，优选地马的外周血，其允许每年多次MSC采集，而供体动物的不适或病态最小。
在某些情况下，使用同种异体或异种MSC是更有利的选择，因为它们提供了健康和高质量干细胞供体的严格选择。它们允许生产现成的产品，避免了从每个患者身上侵入性地采集和耗时地培养MSC。由于与例如马或人MSC相比，猫和犬MSC的培养能力相对较低，异种(例如人或马)MSC的使用优选高于同种异体猫或犬MSC，特别是对于商业应用，例如用于治疗猫和犬GCS。
因此，在特定实施方案中，本发明的MSC可用于对对象进行同种异体或异种施用。如前所述，同种异体或异种使用允许更好地控制MSC的质量，因为可以筛选不同的供体，并且可以选择最佳供体。后者在制备功能性MSC方面是必不可少的。这与自体使用MSC形成对比，因为在这种情况下，更难确保细胞的质量。尽管如此，自体使用可能也有它的好处。在一种情况下，分离血液MSC，使用来自供体的血液，该供体后来也是分离的MSC的受体。在另一种情况下，使用来自供体的血液，其中供体优选地与从供体的血液中分离的MSC的受体具有相同的家庭、性别或种族。特别是，将对这些供体进行常见的当前可传播疾病或病理学测试，以避免这些病理或疾病通过干细胞水平传播的风险。优选地，供体/供体动物被隔离。当使用供体马时，例如可以对其进行以下病理学、病毒或寄生虫的测试：马传染性贫血(EIA)、马鼻肺炎(EHV-1、EHV-4)、马病毒性动脉炎(EVA)、西尼罗河病毒(WNV)、非洲马疾病(AHS)、马锥虫病(锥虫属)、马梨浆虫病、马鼻疽(锤骨、马鼻疽)、马流感、莱姆病(LB)(伯氏疏螺旋体，莱姆病)。
在一个实施方案中，用于本发明的MSC的特征可在于以下标志物中的一种或多种的存在/被测量为阳性：CD29、CD44、CD90、CD105、波形蛋白、纤连蛋白、Ki67、CK18或其任何组合。在另一个实施方案中，用于本发明的MSC的特征可在于间充质标志物CD29、CD44和CD90的存在。通过后者，可以分析所获得的MSC的纯度，并可以确定MSC的百分比。
CD29是由整联蛋白β1基因编码的细胞表面受体，其中该受体与其他蛋白质形成复合物，以调节配体结合时的生理活性。CD44抗原是一种参与细胞-细胞相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。此外，CD44是透明质酸的受体，也可以与其他配体如骨桥蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶(MMPs)相互作用。CD90抗原是一种保守的细胞表面蛋白，被认为是干细胞(如MSC)的标志物。本发明的MSC对CD29/CD44/CD90呈三阳性，使本领域技术人员能够快速而明确地选择MSC，并提供了对进一步下游应用感兴趣的MSC生物学特性。
在一个实施方案中，用于本发明的MSC的特征在于不存在主要组织相容性复合体(MHC)II类分子/主要组织相容性复合体(MHC)II类分子测量为阴性，优选地所有目前已知的MHC II类分子，将所述细胞分类为可用于哺乳动物细胞疗法(如猫或狗细胞疗法)的细胞。即使MSC部分分化，MSC对MHC II类分子仍呈阴性。可以使用流式细胞术进行检测MHC II分子的存在或不存在以及量化其表达。
在另一个和进一步的实施方案中，MSC对CD45抗原(造血细胞的标志物)的测量为阴性。
在一个实施方案中，MSC对MHC II类分子和CD45测量均为阴性。
在一个特别优选的实施方案中，用于本发明的MSC对间充质标志物CD29、CD44和CD90测量为阳性，对MHC II类分子和CD45测量为阴性。
MSC通常在其表面表达MHC I类抗原。在一个特定实施方案中，用于本发明的MSC具有低水平或检测不到的MHC I类标志物。在最优选的实施方案中，所述MSC对MHC II类标志物测量为阴性，并且具有低水平或检测不到的MHC I类标志物，其中所述细胞表现出极低的免疫原性表型。为了本发明的目的，所述低水平应理解为小于表达所述MHC I或MHC II的总细胞的25％，更优选小于15％。可以使用流式细胞术进行检测MHC I和MHC II分子的存在或不存在以及量化其表达。
MSC的这些免疫特性限制了受体免疫系统在细胞移植后识别和排斥细胞，优选地同种异体或异种细胞的能力。MSC产生的调节免疫反应的因子，以及它们在局部刺激下分化为适当细胞类型的能力，使它们成为细胞疗法所需的干细胞。
在一个实施方案中，用于本发明的MSC在炎性环境或状况下存在时分泌免疫调节性前列腺素E2细胞因子。
炎性环境或状况的特征是血液中免疫细胞的募集。炎症介质包括前列腺素、炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-15、趋化因子如IL-8和其他炎性蛋白如TNF-α和IFN-γ。这些介质主要由单核细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞产生，在炎症部位募集白细胞，随后刺激刺激性和抑制性相互作用的复杂网络，同时破坏和治愈炎症过程中的组织。
前列腺素E2(PgE2)是前列腺素家族的一个亚型。PgE2是由膜磷脂释放的花生四烯酸(AA)通过连续的酶促反应合成的。环加氧酶-2(COX-2)被称为前列腺素内过氧化物酶合酶，将AA转化为前列腺素H2(PgH2)，而PgE2合酶将PgH2异构化为PgE2。作为一种限速酶，COX-2响应生理条件控制PgE2的合成，所述生理条件包括生长因子、炎性细胞因子和肿瘤启动子的刺激。
在一个特定的实施方案中，存在于炎性环境中的所述MSC分泌浓度在103至106皮克/ml之间的可溶性免疫因子前列腺素E2(PgE2)，以诱导或刺激MSC调节的免疫抑制。
MSC在这些特定浓度范围内的PgE2分泌刺激体外抗炎过程，并且与它们分化为适当细胞类型的能力一起使它们成为细胞移植所需要的。
在优选实施方案中，用于本发明的用途的MSC测量：
-间充质标志物CD29、CD44和CD90呈阳性；
-包含在由波形蛋白、纤连蛋白、Ki67或其组合组成的组中的一种或多种标志物呈阳性；
-MHC II类分子呈阴性；
-造血标志物CD45呈阴性，以及
-优选地具有低水平或检测不到水平的MHC I类分子，其中所述低水平应理解为低于表达MHC I的总细胞的25％，更优选低于15％。
在最优选的实施方案中，用于本发明的用途的MSC测量：
-间充质标志物CD29、CD44和CD90呈阳性；
-包含在由波形蛋白、纤连蛋白、Ki67或其组合组成的组中的一种或多种标志物呈阳性；
-MHC II类分子呈阴性；
-造血标志物CD45呈阴性；和
-优选地具有低水平或检测不到水平的MHC I类分子，其中所述低水平应理解为小于表达MHC I的总细胞的25％，更优选小于15％，
其中当存在于炎性环境或状况中时，所述细胞分泌的免疫调节性PgE2细胞因子的浓度范围在103至106皮克/ml之间。
在另一个或进一步的实施方案中，当存在于炎性环境或状况中时，并与具有相同特征但不经受所述炎性环境或状况的MSC进行比较，根据本发明用于所述用途的MSC具有选自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合的至少一种分子的分泌的增加，并且IL-1的分泌减少。
在优选的实施方案中，当存在于炎性环境或状况中时，MSC具有IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合中的至少一种分子的增加的分泌，以及IL-1的减少的分泌。可以与具有与上述相同特征但不受所述炎性环境或状况影响的间充质干细胞进行比较。
优选地，MSC具有与两种或更多种上述因子组合的PgE2的增加的分泌。
PgE2、IL-6、IL-10、TGF-β和NO有助于抑制如T细胞和B细胞等主要免疫细胞群的增殖和功能。此外，MSC在其表面表达低水平的MHC I类分子和/或对MHC II类分子呈阴性，从而逃避免疫原性反应。此外，目前的MSC可以通过增加上述因子的分泌来抑制白细胞的增殖，再次有助于避免宿主的免疫原性反应。
在另一个或进一步的实施方案中，在外周血单个核细胞(PBMC)存在的情况下，分离的MSC刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的分泌和/或抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-13或其组合的分泌。在另一个或进一步的实施方案中，MSC在PBMC存在的情况下抑制TGF-β1的分泌。
在炎性环境中，MSC分泌多种调节宿主免疫反应的因子。此外，MSC具有诱导或刺激选自PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的一种或多种因子分泌的刺激作用。除了MSC在炎性环境中对PBMC的刺激作用外，MSC还对PBMC分泌具有抑制作用，导致一种或多种选自TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β1、IL-13或其组合的因子减少。MSC在炎性环境中具有调节作用，可用于治疗各种类型疾病，特别是免疫系统病症。
通常，文献中发表的任何用于鉴定和表征特定细胞类型的细胞标志物(例如间充质、肝、造血、上皮、内皮标志物)或具有特定定位(例如细胞内、细胞表面或分泌的)的细胞标志物的技术都可被认为适合于表征MSC。此类技术可分为两类：一类是允许在分析过程中保持细胞完整性的技术，另一类是基于使用此类细胞产生的提取物(包括蛋白质、核酸、膜等)的技术。在鉴定这些标志物并将其测量为阳性或阴性的技术中，优选免疫细胞化学或细胞培养基的分析，因为这些技术即使在低量细胞的情况下也允许标志物检测，而不会破坏它们(如在蛋白质印迹或流式细胞术的情况下)。
可以使用MLR测定法来测定MSC的免疫调节特性。对于这种MLR测定，应答T细胞用荧光染料标记，当其暴露于特定的光频率时，荧光染料会亮起绿色。然后用植物促分裂原(ConA)刺激这些应答T细胞以诱导或刺激增殖。当T细胞开始分裂时，染料会分布在其子细胞上，因此染料会随着每次细胞分裂而连续稀释。因此，可以通过观察颜色的减少来测量T细胞的增殖量。因此，为了研究MSC的免疫调节特性，将这些MSC添加到受刺激的应答T细胞中，并共同孵育几天。包括适当的阳性和阴性对照，以查看测试是否成功进行。在孵育期结束时，使用流式细胞术测量T细胞增殖量，使我们能够观察MSC是否抑制T细胞增殖。
MSC的相关生物学特征可以通过使用诸如流式细胞术、免疫细胞化学、质谱、凝胶电泳、免疫测定法(例如免疫印迹、蛋白质印迹、免疫沉淀、ELISA)、核酸扩增(例如实时RT-PCR)、酶活性、组学技术(蛋白质组学、脂质组学、糖组学、翻译组学、转录组学、代谢组学)和/或其他生物活性的技术来鉴定。
本发明的MSC可通过本领域已知的任何标准方案衍生。在一个实施方案中，所述MSC可通过方法获得，其中所述MSC从血液或血相分离，并且其中所述细胞在基础培养基(优选地低葡萄糖培养基)中培养和扩增。
本领域已知的基础培养基制剂包括但不限于Eagle基本必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α改良的基本必需培养基(alpha-MEM)、基本基础培养基(BME)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、基本改良的Eagle培养基(EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth's 10MB 752/1或Williams培养基E，及其修改和/或组合。上述基础培养基的组成在本领域中通常是已知的，并且根据培养的细胞的需要改变或调节培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的范围内。优选的基础培养基制剂可以是商业上可获得的那些制剂之一，例如DMEM，据报道其可维持MSC的体外培养，并且包括生长因子的混合物以使其适当生长、增殖、维持所需标志物和/或生物活性，或长期储存。
这种基础培养基制剂含有哺乳动物细胞发育所必需的成分，这些成分本身是已知的。通过说明而非限制，这些成分可包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P以及可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲剂(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸盐例如丙酮酸钠、乙酸盐例如乙酸钠)等。还显而易见的是，许多培养基可以作为含有或不含有丙酮酸钠的低葡萄糖制剂获得。
用于从血液或血相分离MSC并培养和扩增所述细胞的方法是本领域已知的并且例如描述于WO2014053418或WO2014053420中。
在一个实施方案中，这种用于从血液或血相分离MSC并在低葡萄糖培养基中培养和扩增所述细胞的方法可以包括以下步骤：
a)在涂有抗凝剂的样品瓶中收集来自供体的一份或多份血液样品；
b)离心血液样品以获得三相分布，包括血浆相、血沉棕黄层和红细胞相；
c)收集血沉棕黄层并将其上样到密度梯度上；
d)收集由步骤c)的密度梯度获得的相间血液；
e)通过离心从相间血液分离MSC；
f)在培养物中接种2.5x105/cm2和5x105/cm2之间的MSC，并将其保存在补充有地塞米松、抗生素和血清的低葡萄糖生长培养基中。
在一个实施方案中，可以向MSC补充抗凝剂。非限制性例子是EDTA或肝素。
接种数量对于最终获得可接受浓度的纯的且有活力的MSC群至关重要，因为接种太密会导致扩增过程中大量细胞死亡，并且MSC群不均匀，而过于分散的接种将导致MSC集落形成很少或没有形成，所以不能或几乎不可能扩增，或者会花费太多时间。在这两种情况下，细胞的活力都会受到负面影响。
在本发明的一个优选实施方案中，MSC具有高细胞活力，其中至少90％、更优选地至少95％、最优选地100％的所述细胞是有活力的。
相间血液是血液单个核细胞(BMC)的来源，包括单核细胞、淋巴细胞和间充质干细胞(MSC)。优选地，淋巴细胞在37℃下被洗掉，而单核细胞在缺乏维持其存活所需的细胞因子的情况下在2周内死亡。这样，MSC就被纯化了。从相间血液中分离MSC优选地通过相间血液的离心来进行，之后用合适的缓冲液例如磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀至少一次。
在进一步的实施方案中，本发明的MSC对于单核细胞和巨噬细胞是阴性的，两者都在0％和7.5％之间的范围内。
特别地，间充质细胞在生长培养基中保存至少2周。优选地，使用含有1％地塞米松的生长培养基，因为MSC的具体特征保留在所述培养基中。
最短2周(14天)、优选地3周(21天)后，培养瓶中将可见MSC集落。在随后的步骤g)中，将至少6×103干细胞/cm2转移至含有低葡萄糖、血清和抗生素的扩增培养基中，以扩增MSC。优选地，MSC的扩增将在最少五次细胞传代中发生。这样就可以获得足够的细胞。优选地，细胞在70％至80％汇合时分裂。MSC在培养中最多可维持50代。此后，就会出现活力丧失、衰老或突变形成的风险。
在另一个实施方案中，MSC扩增期间每次传代之间的群体倍增时间(PDT)应当在胰蛋白酶消化后0.7天至3天之间。MSC扩增期间每次传代之间的所述PDT优选地在胰蛋白酶消化后0.7至2.5天之间。
在一个优选的实施方案中，根据本发明用于所述用途的MSC具有纺锤形形态。本发明的MSC的形态表征将该细胞分类为细长的成纤维细胞样纺锤形细胞。这种类型的细胞与其他具有小型自我更新细胞的MSC群体不同，这些小型自我更新细胞大多呈三角形或星形细胞形状，与具有大的、立方体或扁平的图案，并具有突出的细胞核的MSC群体也不同。具有该特定形态特征以及生物标记物的MSC的选择使得本领域技术人员能够分离本发明的MSC。本领域技术人员可以使用相差显微镜容易地进行细胞的形态学分析。此外，MSC的大小和粒度可以使用流式细胞术中的前向和侧向散射图或本领域技术人员已知的其他技术来评估。
在另一个或进一步优选的实施方案中，MSC具有10μm至100μm之间的悬浮直径。用于本发明的MSC是根据大小/悬浮直径来选择的。优选地，MSC的细胞大小为10至100μm，更优选地15至80μm，更优选地20至75μm，更优选地25至50μm之间。优选地，通过过滤步骤进行基于细胞大小的细胞选择。例如，通过过滤系统按大小选择细胞浓度范围为每毫升103至107个MSC的MSC，其中所述细胞优选地在低葡萄糖DMEM培养基中稀释，其中细胞经过双重过滤步骤使用40μm过滤器过滤。优选双重或多重过滤步骤。后者提供大量的单细胞群体并避免细胞聚集体的存在。此类细胞聚集体可能在细胞冷冻保存期间导致细胞死亡，并且都可能对细胞的进一步下游应用产生影响。例如，静脉内施用时，细胞聚集体可能会增加发生毛细血管栓塞的风险。
在一个实施方案中，所述组合物中的所述治疗有效量的MSC在105–107MSC之间。
在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的MSC被配制用于通过静脉内注射或输注的方式在对象中施用。
在一个实施方案中，每次静脉内注射或输注施用治疗有效量的MSC，优选地每次注射或输注包含105至107个所述MSC的剂量。优选地，MSC通过静脉内注射施用。
在一个实施方案中，将治疗有效量的MSC施用于对象，优选地施用于猫科动物或犬科动物患者，优选地施用每个患者105-107个MSC的剂量。在一个实施方案中，施用单次剂量。
对对象产生治疗益处的最小治疗有效剂量是每次施用至少105个MSC。优选地，每次施用通过静脉内注射并且每次施用包含105到5x105个之间的MSC，其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的。
在一个实施方案中，所述MSC施用至少两次、至少三次、至少四次、至少五次，优选地间隔施用。
在另一个或进一步的实施方案中，治疗进一步包括：多次施用MSC或包含MSC的组合物，例如多次静脉内施用每个对象，优选地每只猫科动物或犬科动物患者105–107个MSC的剂量，其中所述多次剂量在不同时间点施用，包括但不限于以下一个或多个时间点：间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔7天(1周)、间隔2周、间隔3周、间隔4周、间隔5周、间隔6周、间隔7周、间隔8周、间隔3个月、间隔6个月、间隔9个月和/或间隔1年。优选地，每次剂量间隔至少2周、更优选地间隔至少3周、甚至更优选地间隔至少4周、最优选地间隔至少6周施用。
在一个实施方案中，所述组合物包含存在于无菌液体中的所述MSC。这种无菌液体的非限制性例子是基本必需培养基(MEM)，例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。所述无菌液体对于静脉内施用(例如通过注射或输注)于哺乳动物患者应当是安全的。
作为非限制性实例，所述无菌液体是基本必需培养基，例如基础培养基。本领域已知的基础培养基制剂包括但不限于Eagle基本必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α改良的基本必需培养基(alpha-MEM)、基本基础培养基(BME)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、基本改良的Eagle培养基(EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth's 10MB 752/1或Williams培养基E，及其修改和/或组合。上述基础培养基的组成在本领域中通常是已知的，并且根据培养的细胞的需要改变或调节培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的范围内。优选的基础培养基制剂可以是商业上可获得的那些制剂之一，例如DMEM，据报道其可维持MSC的体外培养，并且包括生长因子的混合物以使其适当生长、增殖、维持所需标志物和/或生物活性，或长期储存。
这种基础培养基制剂含有哺乳动物细胞发育所必需的成分，这些成分本身是已知的。通过说明而非限制，这些成分可包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P以及可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲剂(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸盐，例如丙酮酸钠、乙酸盐，例如乙酸钠)等。还显而易见的是，许多培养基可以作为含有或不含有丙酮酸钠的低葡萄糖制剂获得。
优选地，所述组合物包含至少75％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少85％、最优选地至少90％的单细胞，并且其中所述单细胞具有10μm至100μm之间，更优选地在15μm与80μm之间，更优选地在20μm与75μm之间，更优选地在25μm与50μm之间的悬浮直径。如前所述，细胞的直径及其单细胞性质对于任何下游应用(例如静脉内注射)并且对于细胞的活力都至关重要。
优选地，所述组合物包含至少90％的MSC，更优选地它将包含至少95％的MSC，更优选地至少99％，最优选地100％的MSC。
包含MSC的无菌液体形式的组合物的体积和浓度优选地适合于静脉内注射。在一个实施方案中，药物组合物可以以无菌液体的形式施用于动物，所述无菌液体在最终调整后包含浓度为105–107个细胞/mL的MSC。
在一个实施方案中，每次静脉内注射或输注施用治疗有效量的MSC，优选地每次注射或输注包含105至107个所述MSC的剂量。
在一个实施方案中，药物组合物包含每mL所述组合物105-107个MSC、优选地每mL所述组合物105至106个MSC、更优选地每mL所述组合物105-5×105个MSC的治疗有效量的MSC。
在一个实施方案中，所述组合物的一个剂量具有约0.5至5ml、优选约0.5至5ml、优选地约0.5至3ml、优选地约0.5至2ml、更优选地约0.5至1.5ml、最优选地约1ml的体积。在另一个或进一步的实施方案中，所述组合物的一个剂量具有最大约5ml、优选地最大约4ml、更优选地最大约3ml、更优选地最大约2ml的体积，最优选地，所述体积为约1ml。该量适合静脉内施用。
所述剂量可以配制在小瓶或预装注射器中。
在一个实施方案中，每次注射向患者施用的组合物的体积根据患者的体重进行调整。在另一个实施方案中，每位患者施用105–107个MSC、优选地105-106个MSC、更优选地105-5x105个MSC、最优选地3x105个MSC的固定剂量。
发明人还发现，特别有效的治疗通过包含至少两个剂量的如上所述的任何实施方案中所用的MSC或所用的药物组合物的给药方案来实现。
因此，另一个实施方案涉及药物组合物，其用于治疗对象，优选地猫科动物和犬科动物的骨关节炎，其中：
-治疗包括施用(优选地静脉内)第一量的所述组合物的步骤，所述量包含每位患者105–107个MSC的总剂量，以及
-治疗还包括施用(优选地静脉内)第二量的所述组合物的步骤，所述第二个量包含105–107个MSC的第二总剂量，其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的，并且
其中所述第二剂量在第一量后1天、第一量后2天、第一量后3天、第一量后4天、第一量后5天、第一量后6天、第一量后7天(1周)、第一量后2周、第一量后3周、第一量后4周、第一量后5周、第一量后6周、第一量后7周、第一量后8周、第一量后3个月、第一量后6个月、9个月，和/或第一量后1年施用。优选地，每个剂量在第一量之后至少2周、更优选地在第一量之后至少3周、甚至更优选地在第一量之后至少4周、最优选地在第一量之后至少6周施用。
在一个实施方案中，所述第二剂量与第一剂量相同。在另一个实施方案中，所述第二剂量低于第一剂量。在又一个实施方案中，所述第二剂量高于第一剂量。
在一个实施方案中，可以向所述患者施用第三、第四和/或甚至第五量的所述组合物，优选地静脉内施用，其中所述第三、第四和/或第五量包括第三、第四和/或第五105–107个MSC的总剂量，其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的。
在一个实施方案中，可以向所述患者施用第六或更多量的所述组合物，优选地静脉内施用，其中所述第六或更多量包含第六或更多105–107个MSC的总剂量，其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的。
CGS导致痛苦的口腔粘膜病变，显著降低生活质量，并且通常需要长期免疫抑制治疗，并具有显著的相关风险和副作用。在被诊断有或患有慢性龈口炎的对象，例如猫科动物和犬科动物中，存在口腔炎性病变，其中口腔上皮和上皮下基质通过主要由淋巴细胞、浆细胞和嗜中性粒细胞组成的混合炎症浸润而扩张。经常观察到口腔炎性病变表面上皮的溃疡。通常，残余的表面上皮是增生的，具有多个延伸至下方基质深处的网状钉。免疫组织化学显示，CD3+T细胞存在于上皮和上皮下间质内，而CD20+B细胞仅限于口腔炎症病变的上皮下基质。病变最常见于口腔尾侧腭舌皱襞附近，并沿着颊粘膜和牙龈粘膜延伸穿过粘膜牙龈界处。
在一个实施方案中，MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物用于治疗对象，例如诊断有或患有慢性龈口炎的猫科动物和犬科动物中的口腔炎性病变。
口腔炎性病变的治疗包括预防、减少、缓解、改善和/或逆转对象(例如患有慢性龈口炎或有患慢性龈口炎风险的猫科动物或犬科动物)的口腔炎症。
口腔炎性病变的治疗还指使用本领域已知的任何方法以可测量的量抑制或阻抑对象中口腔炎症的一种或多种症状(例如，目视检查口腔中，例如，上颌颊粘膜、下颌颊粘膜、上颌附着牙龈、下颌附着牙龈、磨牙唾液腺、腭舌皱襞外侧区域、口咽组织、舌和/或舌下组织的炎性病变的改善)、对象血液标记物的变化和行为变化(例如，食欲、吃固体食物的能力、仪容仪表、社交能力、活动水平、体重增加、表现出舒适感的增加)。如果口腔炎症的一种或多种症状的可测量参数相比于施用MSC之前的一种或多种症状的可测量参数减少至少约10％、>20％、>30％、>50％、80％或100％，则该口腔炎症的一种或多种症状得到治疗。在一些实施方案中，与施用MSC前一种或多种症状的可测量参数相比，该一种或多种症状的可测量参数被抑制或阻抑、减少或降低至少约1倍、2倍、3倍、4倍或更多倍。
适合治疗的患者包括有患病风险但未表现出症状的个体，以及目前表现出口腔炎症症状的患者。
为了预防的目的，对象可以是无症状的，但具有发展口腔炎症或口腔炎性病症例如CGS的风险或倾向。在这种情况下，施用MSC可以预防或延迟疾病的发作或口腔炎症进展到疾病的后期阶段，和/或减轻疾病一旦出现的严重程度。
在一个实施方案中，使用病变评分方案，例如猫科动物的口腔炎疾病活动指数(SDAI)或犬科动物的溃疡性口腔炎疾病活动指数(CUSDAI，参见表1)来评估所述口腔炎性病变的严重程度。
表1：用于确定犬科动物溃疡性口腔炎疾病活动指数(CUSDAI)的评分系统。
口腔炎疾病活动指数是一种半定量评分表，其用于根据口腔炎症参数对疾病的严重程度进行分级，并根据主人报告的参数对生活质量进行分级。下面提供了口腔炎疾病活动指数的标准，这些单独标准的总和得出的最高分数为30分。
标准“食欲”：3＝只吃糊状食物，或仅在手喂时吃，2＝自己吃湿食物；不能吃干粮，1＝吃湿粮和干粮，但少于正常量，0＝正常饮食。
标准“活动水平”：3＝对人或其他宠物不感兴趣，大部分时间都在睡觉，2＝活动水平低，但在与人或其他宠物接触时会偶尔玩耍，1＝自发但不频繁地玩耍，0＝正常活动水平(顽皮和活跃)。
标准“梳洗行为”：3＝不梳洗，2＝偶尔梳洗，但不在“病前”水平，1＝过度梳洗，0＝正常梳洗。
标准“感知舒适度”：0-3级，0表示最舒适以及
3是最痛苦的，猫目前的舒适度排名。
标准“体重”：0＝增重>0.5kg，1＝增重>0.25kg但<0.5kg，2＝增重<0.25kg，3＝体重减轻(与最近就诊相比)。
标准“口腔部位炎症”：0＝无，1＝轻度，2＝中度，3＝重度。炎症在口腔的多个位置进行评分。
类似的评分方案，即犬科动物溃疡性口腔炎疾病活动指数(CUSDAI)，可用于根据口腔溃疡程度和生活质量，根据主人报告的参数，对犬科动物的疾病严重程度进行分级。该评分方案可获得的最高总分为32分。
在一个实施方案中，所述猫科动物或犬科动物在施用MSC或包含MSC的药物组合物之前具有至少5的病变评分。在一个实施方案中，在一次或多次施用MSC或包含MSC的药物组合物后的3个月内，所述病变评分具有至少20％的相对降低。
大约70％的猫对当前CGS护理标准有反应，即完全或接近全口拔牙，其要么完全解决(28.4％)，要么显著改善(39％)。然而，由于全口或接近全口拔牙是一种侵入性手术，会给猫科动物带来痛苦和疼痛，因此需要能够在不进行侵入性和痛苦的手术的情况下减轻症状的治疗。
此外，其余30％的猫对拔牙没有反应(难治性FGCS)。这些猫与患有口腔炎性疾病(包括OLP、天疱疮和类天疱疮)的人类一样，需要终生接受抗生素、皮质类固醇和止痛药治疗。与上述人类口腔粘膜疾病一样，患有CGS的猫无法治愈，也没有疾病自发消退的报道。由于CGS具有使患者衰弱的性质，对治疗没有反应的严重受影响的猫通常会被安乐死。
类似地，在患有CGS的犬科动物中，如果不适感严重并且主人不能或不愿意刷牙，则可能需要拔除与病变相关的所有牙齿，以去除积聚牙菌斑的接触表面。虽然这可能有助于控制病变，但它并不能治愈，因为口腔粘膜表面(包括舌头)会形成牙菌斑。在某些完全拔牙的情况下，狗由于对斑块的过度免疫反应而继续出现病变。
在一个实施方案中，MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物作为一线治疗用于治疗猫科动物或犬科动物的慢性龈口炎(CGS)。这样，患有CGS的猫科动物或犬科动物就可以免受拔牙过程的痛苦。在另一个实施方案中，MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物用于治疗猫科动物或犬科动物的难治性慢性龈口炎(CGS)，例如，当拔除猫科动物或犬科动物的一颗或多颗牙齿后，与CGS相关的症状没有明显改善。通过施用MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，可以减轻、缓解、改善和/或逆转患有(难治性)CGS的猫科动物或犬科动物的口腔炎症的一种或多种症状。
CGS的病因仍然难以捉摸，但被认为是由于宿主免疫系统对继发于潜在口腔疾病或临床/亚临床病毒感染的慢性口腔抗原刺激反应不当所致。组织学过程始终涉及主要由活化的效应T细胞和B细胞进行的组织浸润，并偏向Th1表型。
在第二方面，本发明涉及MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其在对象、优选在诊断有或患有慢性龈口炎的猫科动物或犬科动物的CGS炎症反应期间用作免疫调节剂。
在一个实施方案中，MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物通过抑制或阻抑淋巴细胞增殖而起到免疫调节剂的作用。淋巴细胞增殖的抑制或阻抑可依赖于可溶性介质以及间充质干细胞和淋巴细胞之间的直接接触。例如，MSC分泌的可溶性免疫因子前列腺素E2(PgE2)与淋巴细胞细胞周期停滞和/或淋巴细胞凋亡的启动有关。根据本发明的MSC的功能，施用MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物后的临床改善与对象例如猫科动物或犬科动物口腔中T和B细胞炎症的组织病理学消退相关。
在最后一个方面，本发明涉及包含外周血来源的MSC的特定药物组合物。所述组合物包含源自天然外周血的MSC，所述MSC是源自动物的，优选地源自哺乳动物的，并且以每mL所述组合物105–107个MSC之间的浓度存在于无菌液体中，其中所述组合物的一个剂量具有约0.5至5ml的体积，其中所述MSC对间充质标志物CD29、CD44和CD90测量呈阳性，对MHC II类分子和CD45测量呈阴性，并且其中所述MSC具有在10μm和100μm之间的悬浮直径。
在一个实施方案中，所述药物组合物是静脉内施用的。在一个优选的实施方案中，所述MSC是源自马的。
在一个实施方案中，所述组合物的所述一个剂量的体积为约0.5至5ml，优选地约0.5至5ml，优选地约0.5至3ml，优选地约0.5至2ml，更优选地约0.5至1.5ml，最优选地约1ml。在另一个或进一步的实施方案中，所述组合物的一个剂量具有最大约5ml、优选地最大约4ml、更优选地最大约3ml、更优选地最大约2ml的体积，最优选地所述体积为约1ml。该量适合静脉内施用。
在另一个或进一步优选的实施方案中，MSC具有15至80μm、更优选20至75μm、更优选25至50μm的悬浮直径。
本领域普通技术人员将理解，如上所述用于治疗对象例如猫科动物和犬科动物的慢性龈口炎的MSC或药物组合物的方面的要素，或者用作免疫调节剂的MSC或药物组合物的方面的要素，回溯至本发明的药物组合物方面。因此，本发明的所有方面都是相关的。在如上所述的一个方面中描述的所有特征和优点可以涉及这些方面中的任何一个，即使它们是结合特定方面来描述的。
根据本发明使用的MSC或包含MSC的药物组合物，可能与如上所述的其他组分一起，将优选地被冷冻，以便允许长期保存MSC或组合物。优选地，MSC或组合物将在低温且恒定的温度，例如低于-20℃的温度下冷冻。这些条件允许保存MSC或组合物，并且使MSC能够保持它们的生物学和形态学特征，以及它们在储存期间和解冻后的高细胞活力。
在更优选的实施方案中，根据本发明使用的MSC或包含MSC的药物组合物可以在-80℃的最高温度下(任选地在液氮中)储存至少6个月。MSC冷冻的一个关键因素是低温培养基，特别是包含DMSO的培养基。DMSO可防止冷冻过程中培养基中冰晶的形成，但高浓度时可能对细胞有毒。在优选实施方案，冷冻剂中DMSO的浓度高达20％，更优选地高达15％，更优选地DMSO浓度包含10％。低温培养基还包含低葡萄糖培养基，例如低葡萄糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
然后，根据本发明使用的MSC或包含MSC的药物组合物优选地在施用前在室温附近的温度下解冻，优选地在20℃至37℃之间的温度下，更优选地在25℃和37℃之间的温度下，并且在最多20分钟、优选地最多10分钟、更优选地最多5分钟的时间跨度内。
此外，MSC或组合物优选地在解冻后2分钟内施用，以保护MSC的活力。
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明，这些实施例进一步说明本发明，并且不旨在也不应解释为限制本发明的范围。
实施例
现在将参考以下实施例进一步举例说明本发明。本发明决不限于所给出的实施例。
实施例1：健康猫中的混合淋巴细胞反应(MLR)
设置：
为了研究猫中ePB(马外周血来源)-MSC的免疫调节特性，对10只健康猫进行静脉内(IV)注射组合物，该组合物在低葡萄糖DMEM和10％DMSO中包含3x105个ePB-MSC，体积为1ml，根据本发明的实施方案，在三个时间点(T0、T1和T2)进行注射，每次注射之间间隔2周。这10只健康的猫(4只雄性和6只雌性)属于不同品种，具体是欧洲短毛猫、欧洲长毛猫和缅因猫，平均年龄为6±4岁。
ePB-MSC的分离与培养
根据先前描述的方法，ePB-MSC是从自一匹供体马的颈静脉采集的静脉血中分离的。在培养ePB-MSC之前，如Broeckx等人2012所述，测试血清中是否存在多种可传播疾病。随后，根据良好生产规范(GMP)指南，在GMP认证的生产场所培养干细胞，直到传代(P)5，并对其活力、形态、细胞表面标志物的存在和群体倍增时间进行表征。特定细胞表面标志物的存在(分化簇CD29、CD44和CD90)和不存在(主要组织相容性复合体(MHC)II和CD45)的评估通过使用流式细胞术完成，如前所述(Spaas等人，2013)。然而，详细的表达和分泌模式先前已在WO2020/182935中描述。
使用锥虫蓝评估细胞活力。然后，将细胞进一步培养至P10，用胰蛋白酶消化并以最终浓度300,000个细胞/mL重悬于含有10％二甲基亚砜(DMSO)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)低葡萄糖中。ePB-MSC在-80℃下储存在冷冻小瓶中，直到进一步使用。通过不存在需氧细菌、厌氧细菌、真菌、内毒素和支原体来测试最终产品的无菌性。
研究
所有猫每天都会由看护人检查，并在第0天(T0)、第2周(T1)、第4周(T2)和第6周(T3)由兽医进行全面体检，包括评估直肠温度、心率、呼吸频率、粘膜外观和毛细血管再充盈时间，以及血液学和生化分析。
此外，在T0(治疗施用前)和T3(最后一次(第三次)治疗后两周)用每只猫的新鲜外周血单个核细胞(PBMC)进行改良混合淋巴细胞反应(MLR)。该测定研究ePB-MSC的免疫调节(通过刺激的PBMC)特性。为了刺激PBMC，将它们与伴刀豆球蛋白A(ConA)共同孵育。
在T0、T1和T2，一般体检后，给猫静脉内注射3x105个ePB-MSC。在手掌中解冻冷冻管后，检查内容物的透明度和澄清度，并立即使用22Gi.v.导管注射细胞悬液。
在MLR测定过程中，通过将这些细胞与伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的猫PBMC共孵育四天并评估猫PBMC的增殖来研究ePB-MSC的免疫调节特性。未刺激的猫PBMC或刺激的猫PBMC分别用作阴性和阳性对照。因此，使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯7-氨基放线菌素D(CFSE-7AAD)标记的流式细胞术评估PBMC增殖(％)。该测定在所有猫的治疗前后进行。
为此，将每只猫的猫静脉血收集到EDTA采血管中，用HBSS稀释，并在等量的Percoll密度梯度上分层。在Percoll上离心后，收集含有PBMC的界面。将PBMC洗涤3次。接下来，将每只猫的PBMC浓度调整为每毫升1x106个细胞。然后，每mL PBMC细胞悬浮液使用1μLCFSE溶液，用CFSE标记PBMC。将CFSE标记的PBMC洗涤并重悬于MLR培养基(DMEM，补充有20％FBS、1％AB/AM(抗生素/抗真菌剂)和1％BME(β-巯基乙醇)100x)中，最终浓度为2x106个PBMC/mL。然后，将ConA溶液添加到除阴性对照样品之外的板的所有孔中。最后，将指定猫的PBMC添加到相关孔中。孵育4天后，将所有样品转移至FACS管中，离心并用7-AAD染色以进行流式细胞术分析。
结果：
在两个时间点(T0和T3)，与相关阴性对照(T0：3.4±2.7％，T3：4.9±1.3％)相比，与刺激的猫PBMC共培养的ePB-MSC的增殖(T0：12.6±10％，T3：26.2±9.8％)显著更高(p值分别＝0.05和0.008)。然而，共培养物的增殖在基线时(79.7±4.7％)(p值＝0.008)和治疗后(83.2±5.7％)(p值＝0.008)显著低于阳性对照。与基线(12.6±10％)相比，治疗后(26.2±9.8％)ePB-MSC与刺激的猫PBMC的共培养物中，平均PBMC增殖没有显著差异(p值＝0.017)(图1)。
结论：
目前的研究结果证实了ePB-MSC对猫PBMC的免疫调节特性。这表明异种ePB-MSC可用于猫的治疗。
实施例2：健康狗在用ePB-MSC治疗之前和之后的混合淋巴细胞反应(MLR)：
设置：
为了研究狗中ePB(马外周血衍生的)-MSC的免疫调节特性，对12只健康狗进行静脉内(IV)注射组合物，该组合物包含在低葡萄糖DMEM和10％DMSO中的3x105个ePB-MSC，体积为1ml，根据本发明的实施方案，在三个时间点(T0、T1和T2)注射，每次注射之间间隔2周。
ePB-MSC的分离和培养如上文实施例1中所述进行。
研究
所有狗每天都由看护人检查，并在第0天(T0)、第2周(T1)、第4周(T2)和第6周(T3)由兽医进行全面体检，包括直肠温度、心率、呼吸频率、粘膜外观和毛细血管再充盈时间，以及血液学和生化分析。
此外，在T0(治疗施用前)和T3(最后一次(第三次)治疗后两周)用每只狗的新鲜外周血单个核细胞(PBMC)进行改良混合淋巴细胞反应(MLR)。该测定研究ePB-MSC的免疫调节(通过刺激的PBMC)特性。为了刺激PBMC，将它们与伴刀豆球蛋白A(ConA)共同孵育。
在T0、T1和T2，一般体检后，给狗静脉内注射3x105个ePB-MSC。在手掌中解冻冷冻管后，检查内容物的透明度和澄清度，并立即使用22Gi.v.导管注射细胞悬液。
在MLR测定过程中，通过将这些细胞与伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的狗PBMC共孵育四天并评估狗PBMC的增殖来研究ePB-MSC的免疫调节特性。未刺激的狗PBMC或刺激的狗PBMC分别用作阴性和阳性对照。因此，使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯7-氨基放线菌素D(CFSE-7AAD)标记的流式细胞术评估PBMC增殖(％)。该测定在所有狗的治疗前后进行。
为此，将每只狗的狗静脉血收集到EDTA采血管中，用HBSS稀释，并在等量的Percoll密度梯度上分层。在Percoll上离心后，收集含有PBMC的界面。将PBMC洗涤3次。接下来，将每只狗的PBMC浓度调整为每毫升1x106个细胞。然后，每mL PBMC细胞悬浮液使用1μLCFSE溶液，用CFSE标记PBMC。将CFSE标记的PBMC洗涤并重悬于MLR培养基(DMEM，补充有20％FBS、1％AB/AM(抗生素/抗真菌剂)和1％BME(β-巯基乙醇)100x)中，最终浓度为2x106个PBMC/mL。然后，将ConA溶液添加到除阴性对照样品之外的板的所有孔中。最后，将指定狗的PBMC添加到相关孔中。孵育4天后，将所有样品转移至FACS管中，离心并用7-AAD染色以进行流式细胞术分析。
结果：
在两个时间点(T0和T3)，与相关阴性对照相比，与刺激的狗PBMC共培养的ePB-MSC的增殖显著更高。然而，共培养物的增殖在基线时和治疗后显著低于阳性对照。与基线相比，治疗后ePB-MSC与刺激的狗PBMC的共培养物中，平均PBMC增殖没有显著差异。
结论：
目前的研究结果证实了ePB-MSC对狗PBMC的免疫调节特性。这表明异种ePB-MSC可用于狗的治疗。
实施例3：评估马外周血来源的间充质干细胞在猫慢性龈口炎(fCGS)中的安全性 和有效性的临床可行性研究
设置：
为了研究ePB(马外周血来源的)-MSC在静脉内(IV)施用后治疗fCGS的临床安全性和功效，根据本发明的实施方案，对四只患有fCGS的猫进行IV注射在DMEM低葡萄糖和10％DMSO培养基中的本发明的3x105个ePB-MSC的组合物，体积为1ml。MSC用99mTc标记。所有猫每天都会由看护人检查，并在第0天、第1天、第14天和第15天由兽医进行全面体检。研究开始5个月后，兽医通过电话联系猫的饲养员，对动物进行随访。
在第0天，根据研究者评分的口腔炎症病变的严重程度以及看护者对猫的食欲、活动水平、梳理行为和口腔舒适度的感知来计算口腔炎疾病活动指数(SDAI)。SDAI评分范围从0(无疾病)到30(严重疾病)。
结果：
计算出猫在第0天的平均SDAI得分为11.5。在研究的第14天，四分之三的猫的临床改善至少为20％。此外，研究期间没有记录任何不良事件。第一次注射5个月后，3只猫的生活质量与研究前相比有所改善。第四只猫在研究的第14天没有表现出临床改善，由于对治疗无反应且病情恶化，不得不被安乐死。然而，这只猫的口腔区域干细胞水平的生物分布最低，而在其他3只对治疗有成功反应的猫中，看到MSC在口腔区域有明显的生物分布。
实施例4：评估马外周血来源的间充质干细胞治疗犬慢性龈口炎(CGS)的安全性和 有效性的临床可行性研究
设置：
为了研究静脉内(IV)施用ePB(马外周血源性)-MSC治疗犬CGS后的临床安全性和有效性，根据本发明的实施方案，对患有CGS的犬进行IV注射3x105个本发明ePB-MSC在低葡萄糖DMEM和10％DMSO培养基中的组合物，体积1ml。MSC用99mTc标记。所有狗每天都会由看护人检查，并在第0天、第1天、第14天和第15天由兽医进行全面体检。研究开始5个月后，兽医通过电话联系狗的饲养员，对动物进行随访。
在第0天，根据研究者评分的口腔病变严重程度、体重减轻、疼痛评分以及看护者对食欲的感知来计算犬溃疡性口炎疾病活动指数(CUSDAI)。CUSDAI评分范围为0(无疾病)到32(严重疾病)。
结果：
平均CUSDAI评分是在第0天为狗计算的。在研究第14天，可见大多数狗的临床改善百分比。此外，研究期间没有记录任何不良事件。第一次注射后5个月，与研究前相比，大多数狗的生活质量有所改善。
实施例5：患有猫慢性龈口炎(fCGS)的猫中ePB-MSC的生物分布研究
设置：
这是一项初步研究，旨在评估将马外周血来源的间充质干细胞(ePB-MSC)静脉内(IV)注射到患有猫慢性龈口炎(fCGS)的猫的头静脉后的生物分布。对于该研究，根据本发明的实施方案，向四只猫注射包含在低葡萄糖DMEM中的2-5x105个放射性标记的ePB-MSC的组合物，体积为1ml。猫接受包含99mTc标记的ePB-MSC的1ml组合物的IV注射。使用双头伽马相机对整个身体的ePB-MSC分布进行主观评估。第一次采集在注射放射性化合物后一小时内开始。接下来，在施用安慰剂对照和标记的ePB-MSC后6小时和24小时进行一次全身扫描。
结果：
静脉内注射99mTc标记的ePB-MSC会导致肺、肝、口腔、肾脏和膀胱的放射性吸收(图2)。
结论：
本研究描述了通过放射性的闪烁扫描评估测量的患有慢性龈口炎的猫的静脉内施用的生物分布。结果显示，对患有fCGS的猫进行静脉内注射后，ePB-MSC会回到口腔中的炎症区域。这进一步支持了ePB-MSC在fCGS治疗中的用途，并为它们在fCGS治疗中的作用模式提供了更多洞察。
实施例6：患有慢性龈口炎(CGS)的狗中ePB-MSC的生物分布研究
设置：
这是一项初步研究，旨在评估将马外周血来源的间充质干细胞(ePB-MSC)静脉内(IV)注射到患有犬慢性龈口炎(CGS)的犬的头静脉后的生物分布。对于该研究，根据本发明的实施方案，向四只狗注射包含在低葡萄糖DMEM中的2-5×105个放射性标记的ePB-MSC的组合物，体积为1ml。狗接受包含99mTc标记的ePB-MSC的1ml组合物的IV注射。使用双头伽马相机对整个身体的ePB-MSC分布进行主观评估。第一次采集在注射放射性化合物后一小时内开始。接下来，在施用安慰剂对照和标记的ePB-MSC后6小时和24小时进行一次全身扫描。
结果：
静脉内注射99mTc标记的ePB-MSC会导致肺、肝、口腔、肾脏和膀胱的放射性吸收。
结论：
本研究描述了通过放射性闪烁扫描评估测量的患有慢性龈口炎的狗的静脉内施用的生物分布。结果显示，对患有CGS的狗进行静脉内注射后，ePB-MSC会返回到口腔中的炎症区域。这进一步支持了ePB-MSC在犬科动物CGS治疗中的用途，并为其治疗CGS的作用模式提供了更多洞察。
本发明决不限于实施例中描述的和/或附图中所示的实施方案。相反，根据本发明的方法可以以许多不同的方式实现而不背离本发明的范围。

Claims (21)

1.间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，用于在对象，优选地猫科动物和犬科动物中治疗慢性龈口炎(CGS)。
2.根据权利要求1用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是天然的。
3.根据前述权利要求1-2任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC源自血液，优选地源自外周血。
4.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是同种异体或异种MSC，优选地异种MSC。
5.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是源自动物的，优选地是源自哺乳动物的，更优选地是源自马的。
6.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是静脉内施用的。
7.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中对每个对象施用105-107个MSC的剂量。
8.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中施用单剂量。
9.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中施用多个剂量，每个剂量在不同时间点施用。
10.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述组合物的一个剂量具有最大约5ml的体积，优选地所述体积为约1ml。
11.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC对于MHC II类分子和/或CD45测量为阴性。
12.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC对于间充质标志物CD29、CD44和CD90测量为阳性，并且对于MHC II类分子和CD45测量为阴性。
13.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC当存在于炎性环境或状况中时分泌免疫调节性前列腺素E2细胞因子。
14.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中当存在于炎性环境或状况中并且与具有相同特征但未经受所述炎性环境或状况的细胞相比时，所述MSC具有至少一种选自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合的分子的分泌增加；和/或IL-1的分泌减少。
15.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中当存在PBMC时，所述MSC刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的表达和/或当存在PBMC时，所述MSC抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β、IL-13或其组合的分泌。
16.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC存在于无菌液体中。
17.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述治疗是在被诊断有或患有慢性龈口炎的猫科动物和犬科动物中治疗口腔炎症病变，并且其中通过使用评分方案，例如猫科动物中的口腔炎疾病活动指数(SDAI)评分方案或犬科动物中的犬溃疡性口腔炎疾病活动指数(CUSDAI)评分方案来计算病变评分来评估所述病变的严重程度。
18.根据权利要求17用于所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述猫科动物或犬科动物在施用所述MSC或所述包含MSC的药物组合物之前具有至少5的病变评分，并且其中所述病变评分在施用一次或多次所述MSC或所述包含MSC的药物组合物之后的3个月的时间内在至少35％的经治疗的猫科动物或犬科动物中具有至少20％的相对减少。
19.根据前述权利要求17-18中任一项用于所述用途的MSC，其中所述口腔炎症病变对于先前的治疗是难治的，其中所述先前的治疗包括从所述犬科动物或猫科动物的口腔中拔出一颗或多颗牙齿。
20.一种MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其在诊断有或患有慢性龈口炎的对象、优选猫科动物和犬科动物的CGS炎症反应期间用作免疫调节剂。
21.包含源自外周血的MSC的药物组合物，所述MSC是源自动物的，优选地是源自哺乳动物的，并且以每mL所述组合物105-107个MSC之间的浓度存在于无菌液体中，其中一个剂量的所述组合物具有约0.5至5ml的体积，其中所述MSC对于间充质标志物CD29、CD44和CD90测量是阳性的，并且对于MHC II类分子和CD45测量是阴性的，并且其中所述MSC具有在10μm和100μm之间的悬浮直径。
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