CN117821494A - 向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用，或在培育具有耐盐性能的转基因植物中的应用；所述向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明通过分子克隆技术在植物细胞或种子中过量表达向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，可以获得耐盐性能优于野生型植株的转基因植物，这有利于在盐胁迫下提高植物的出苗率和成苗率，以及缩短出苗时间，提高植株成活率。本发明为改造或培育其他耐盐的向日葵等农作物新品种提供了理论依据和基因来源，有助于从根源上提高农作物的耐盐性能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用。
背景技术
土壤盐渍化是制约农业发展的主要因素之一，可造成离子毒害和渗透胁迫，严重影响植物的品质与产量。盐渍土中含有的盐类主要有氯化钠、硫酸钠、碳酸氢钠、硫酸镁等，在很大程度上限制了农业生产的可持续发展，盐碱地利用改良面临巨大的挑战。随着耕地面积不断减少、人口不断增加，研究作物的耐盐机理，培育耐盐作物品种，是改良和开发利用盐碱地的重要措施。
种子萌发是指具有生活力的种子通过休眠或解除休眠后，在适当条件下，形成正常幼苗的过程，也是植物生长周期中抗逆性最弱的一个阶段。种子萌发主要是由内部条件和外部环境共同调控。在种子外部，盐分胁迫作为一种常见的逆境因子，盐度的增加会显著影响种子的吸水萌发能力，通常会延迟和降低种子萌发，高浓度盐分对种子萌发的影响主要归因于盐诱导的萌发介质渗透势降低，从而抑制种子对水分的吸收，使Na+聚集而降低酶活性，同时种子胚乳内淀粉的水解也受到抑制，不仅影响根系的外部形态构建，还会使根系的解剖结构发生改变，如根冠、伸长、成熟、分生区等各部分都会受到不同程度的影响。
向日葵(Helianthus annuusL.)属菊科向日葵属的一年生草本植物，是我国种植的主要油料作物之一，也是饲草和能源作物，具有一定的耐盐能力，在盐碱地的开发利用中潜力巨大。但由于向日葵的耐盐性有限，当土壤的盐碱度超过向日葵的忍耐范围时，尤其是在向日葵的种子萌发期受到盐胁迫时，会直接影响种子发芽出苗，导致种子萌发明显延迟、出苗率降低，呼吸作用受到损害，光合作用被抑制，植株的生长受到严重阻碍，产量下降，种仁含油量降低。因此，使用基因工程技术对向日葵进行改良，以期提高其耐盐能力，培育出耐盐的向日葵品系也是一个可行之道，具有重要的经济与应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，来源于向日葵(HelianthusannuusL.)，在向日葵维生素E和质体醌的生物合成中发挥关键作用，其基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由2879个核苷酸组成，基因编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，由1356个核苷酸组成。
SEQ ID NO.1：
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TGGGGAACGTGCCGGAGCTAGCTCCAGCGGTGGACTATGTGAAATCTTTCA
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ATACCGATGAACGAGCCAGTGTACGGGACGAAGAGGAAGAGTCAGATACA
GACGTATTTGGAGCATAATGAAGGGGCTGGGGTGCAGCATTTGGCGTTGGC
TAGTGAGGATATATTTAGGACTTTGAGAGAGATGAGGAAACGGAGTGGGGT
TGGGGGGTTTGAGTTTATGCCGTCTCCGCCACCTACTTATTATAGGAATTTG
AAGAGTCGAGCGGGCGATGTGTTGTCGGATGAGCAGATTAAGGAGTGTGA
AGAGTTGGGGATATTGGTGGATAGAGATGATCAGGGGACTTTGCTTCAGAT
TTTTACTAAGCCTGTGGGTGATAGGTATGTTGTTATCTTGATCAATGCAATTT
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GCATACATTAAAAGAAGACCGTTACAAGAATGGCAAACATAAATGAGTTTA
TACTTGTCATCCTAGATTGCATTCAAGATTCTTGTTGGGATTGTAGTATGTGG
TTCTTAGGCTGCTCGGTATGGCCCGTCCTCAGCCCCGGCACCGGCGTCACC
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GACGTCCAGGACGATCCAAAACAGGTGGGCCCCTCTCTTTCTTCTCGGTGC
CGGCTCCGTCACCCCATCACCCCCCCCCCCCCCGGTCTTCATCCCGTCACCA
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CAAGGCATTTAACGATGAGGCTTTTATAAGCGAGACACGTAGTATAAAAATA
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AGGCGCGCTTCTGGATAAGCCTCGGCAATAGAGCATGAACCCCCTTCACAA
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CGTTTTGTAATGGATAATTTGTTTCCTGGTGTCACAATTATCATTTCTTTATTG
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TAAATCTATTGAGGAATATGAGAAGACACTTGAAGCAAGAAGCACCACTGC
TGCTGCATAAATGAGATCTTAAAAATTAAAATCTTATGATTATGTATGTATCT
GTGGATTCTATACAAAACAGATCCTGAAAATATATGGTATCAACTTCATAATA
AGATATGTAACGCGTTATGTATCTCATGATCGATCATCAATGTATTTGTCTATT
TTTATGTTGC
SEQ ID NO.2：
ATGGGAACGGAAGCTACCGTCGCCGCCGTCGTCGCCGGAGATGAATCCGAT
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AACCCCATGTCGGACAAATTCACCGTCAAAAACTTCCACCACATCGAGTTC
TGGTGCTCCGACGCCACCAACACCGCCCGCCGCTTCTCCTGGGGCCTCGG
CATGCCCATCATCTTCAAATCCGATCTCTCCACCGGCAACTCCACCCACGCC
TCCTATCTCCTCCGCTCCGGCCACCTCAACTTCCTCTTCACCGCCCCTTATT
CCCCCTCCATCTCCCCCACCACCACCACCGCTTCCATCCCCACCTTCTCCCA
CTCCGCCTCCCGCCACTTCACCGCTACCCACGGTCTCGCCGTCCGCGCCAT
CGCCGTTGAAGTCGAAGACGCCGAAACCGCCTTCGCCGTTAGCGTCGCTA
ACGGCGCCAAACCCTCGTCTCCCCCAGTCACCCTCGGTCACAACGACGTC
GTGTTGTCAGAAGTTAAATTATACGGCGACGTCGTTTTGCGTTATGTTAGTT
ACAAAAATAATACTAATAACAATAATAACAATGATAATGATAATTATATATTTT
TGCCTGGATTTGAAGCTATGGACAAAACGTCGTCGTTTCAGGAGCTAGACT
ACGGCATCCGCCGGCTCGATCACGCGGTGGGGAACGTGCCGGAGCTAGCT
CCAGCGGTGGACTATGTGAAATCTTTCACCGGGTTTCACGAGTTCGCTGAG
TTCACTGCTGAGGACGTTGGAACGAGTGAAAGCGGGCTCAACTCGGTGGT
TTTAGCGTGTAACAGTGAGATGGTTTTGATACCGATGAACGAGCCAGTGTA
CGGGACGAAGAGGAAGAGTCAGATACAGACGTATTTGGAGCATAATGAAG
GGGCTGGGGTGCAGCATTTGGCGTTGGCTAGTGAGGATATATTTAGGACTTT
GAGAGAGATGAGGAAACGGAGTGGGGTTGGGGGGTTTGAGTTTATGCCGT
CTCCGCCACCTACTTATTATAGGAATTTGAAGAGTCGAGCGGGCGATGTGTT
GTCGGATGAGCAGATTAAGGAGTGTGAAGAGTTGGGGATATTGGTGGATAG
AGATGATCAGGGGACTTTGCTTCAGATTTTTACTAAGCCTGTGGGTGATAGG
CCGACGATATTCATAGAGATAATACAAAGAGTAGGGTGCATGGTAAAGGAT
GATGAAGGAAAGGTGCAGCAGAAGGCAGGGTGTGGAGGGTTTGGCAAAG
GGAACTTCTCGGAGCTTTTTAAATCTATTGAGGAATATGAGAAGACACTTG
AAGCAAGAAGCACCACTGCTGCTGCATAA
向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQID NO.3所示，由451个氨基酸残基组成。
SEQ ID NO.3：
MGTEATVAAVVAGDESDHPTSAFKLVGFKNFIRTNPMSDKFTVKNFHHIEFWC
SDATNTARRFSWGLGMPIIFKSDLSTGNSTHASYLLRSGHLNFLFTAPYSPSISP
TTTTASIPTFSHSASRHFTATHGLAVRAIAVEVEDAETAFAVSVANGAKPSSPPV
TLGHNDVVLSEVKLYGDVVLRYVSYKNNTNNNNNNDNDNYIFLPGFEAMDK
TSSFQELDYGIRRLDHAVGNVPELAPAVDYVKSFTGFHEFAEFTAEDVGTSESG
LNSVVLACNSEMVLIPMNEPVYGTKRKSQIQTYLEHNEGAGVQHLALASEDI
FRTLREMRKRSGVGGFEFMPSPPPTYYRNLKSRAGDVLSDEQIKECEELGILV
DRDDQGTLLQIFTKPVGDRPTIFIEIIQRVGCMVKDDEGKVQQKAGCGGFGKG
NFSELFKSIEEYEKTLEARSTTAAA
向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用，或在培育具有耐盐性能的转基因植物中的应用。
上述应用，在具体应用时，将含有向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD的表达载体导入植物细胞或种子，使向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD过表达，从而获得稳定可遗传的耐盐转基因植株。
所述过表达基因序列为：向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD基因的CDS全长序列，共1356bp。
进一步地，还包括收集所述稳定可遗传的耐盐转基因植株的种子，再用所述种子繁育获得后代种子，通过测序验证获得纯合的过表达的后代种子长成的植株。
所述测序验证的方法是，提取上述纯合的过表达的后代种子长成的植株的基因组DNA，并用688-seq-F和CD3-OCS-seqR引物进行PCR扩增并测序：
688-seq-F：GGGATGACGCACAATCCCAC，
CD3-OCS-seq-R：GAATGAACCGAAACCGGCGG。
一种植物表达载体，其含有上述向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD。
一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述植物表达载体，或其基因组中插入了向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD。
所述遗传工程化的宿主细胞的构建方法，是将上述植物表达载体导入宿主细胞中，使植物表达载体/向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD在宿主细胞中有效表达。
上述植物表达载体、遗传工程化宿主细胞在培育具有耐盐性能的转基因植物(耐盐性能优于野生型植株)中的应用。所述植物包括拟南芥、向日葵。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明将向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，数据显示，转基因拟南芥在盐胁迫下的萌发率显著高于野生型拟南芥，表明向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD能够显著提高转基因植物在萌发期的耐盐性；
2、本发明通过分子克隆技术在植物细胞或种子中过量表达向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，可以获得耐盐性能优于野生型植株的转基因植物，这有利于在盐胁迫下提高植物的出苗率和成苗率，以及缩短出苗时间，提高植株成活率。本发明为改造或培育其他耐盐的向日葵等农作物新品种提供了理论依据和基因来源，有助于从根源上提高农作物的耐盐性能。
附图说明
图1A 688-HaHPPD农杆菌菌落鉴定，B拟南芥过表达株系DNA鉴定。
图2用测序引物688-seq-F的测序峰图。
图3用测序引物CD3-OCS-seq-R的测序峰图。
图4采用不同测序引物(688-seq-F和CD3-OCS-seq-R)的测序示意图。
图5参考序列与测序序列比对图；图中sbjct表示NCBI网站上的参考序列，Query-表示转基因体系的测序序列，A图中Query表示用测序引物688-seq-F所测得的序列，B图中Query表示用测序引物CD3-OCS-seq-R所测得的序列。
图6转基因拟南芥RNA鉴定。
图7转基因拟南芥Western Blot电泳图。
图8转基因拟南芥的耐盐表型：图中Col表示野生型拟南芥，OE-8、OE-10为转基因拟南芥。
图9A正常情况下的萌发统计折线图，B 150mM NaCl处理下的萌发统计折线图；图中Col为野生型拟南芥，OE-8、OE-10为转基因拟南芥；****P<0.0001,***P<0.001，具有差异。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但是实施例具体细节仅为了说明本发明，并不代表本发明构思下全部技术方法。因此不应理解为对本发明总的技术方案限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂与药品，实验均设置三次重复以上，结果取平均值。
表1实施例中采用的引物名称及序列
实施例1：过表达HaHPPD基因的转基因拟南芥的构建
一、HaHPPD表达载体(688-HaHPPD)的构建
1、目的基因的获得：
以向日葵cDNA为模板、引物HaHPPD-F和HaHPPD-R进行PCR扩增，胶回收纯化，从而获得HaHPPD基因片段；PCR反应体系如表2所示。
表2PCR反应体系(50μL)：
PCR反应程序设定为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环；72℃彻底延伸5min。
2.用BamHI酶切688表达载体，并进行胶回收纯化，用于后续的重组反应；利用重组法构建688-HaHPPD表达载体，配好重组体系后置于金属浴50℃，反应15min。酶切体系如表3所示，重组体系如表4所示。
表3酶切体系(30μL)
表4重组体系(5μL)：
3.质粒转化：
将上述重组产物转入50μL大肠杆菌感受态细胞，轻弹混合后冰上静30min，42℃热激45s，冰上静置2min；加入500μL LB培养基，37℃，200rpm，孵育1h后涂在LB+Kana的固体培养基上，倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。挑取单克隆菌液PCR，鉴定成功后用(Vazyme)试剂盒提质粒，用引物688-seq-F和CD3-OCS-seq-R进行测序，测序结果如图5所示，HaHPPD基因测序序列基本与参考序列吻合，表明HaHPPD基因表达载体构建成功，即获得表达载体688-HaHPPD；随后将表达载体转入农杆菌GV3101中，用于后续的遗传转化。
二、拟南芥的遗传转化
将构建成功的688-HaHPPD质粒转化农杆菌，挑取单克隆菌落PCR鉴定，如图1A所示，挑取阳性克隆接种到3mL LB培养基(含有Kan和rif抗生素)中，28℃，200rpm，过夜培养，次日转100mL LB培养基(含有Kan和rif抗生素)中扩大培养至菌液OD600＝0.6-0.8，然后4000rpm，20min，收菌；用侵染Buffer(1/2MS+10％蔗糖+400μL Silwet-77)重悬菌并调OD600＝0.8-1.0，得到侵染菌液。在侵染前将生长一个月的拟南芥多余果荚剪去，保留部分拟南芥花。侵染时将拟南芥花浸入上述侵染菌液中静置15s；暗培养1d，然后转于正常培养条件(光照16h、黑暗8h)，培养至植物成熟并混收种子；去除果荚后将种子置于37℃烘干，用75％乙醇涮洗2min，84消毒液消毒5min，ddH2O涮洗5～6遍后，4℃春化3d后将种子点在带有Basta抗性的MS培养基上筛选阳性苗。
三、转基因拟南芥的鉴定
用CTAB法提取不同株系拟南芥叶片的基因组DNA，以HaHPPD的特异性引物(HaHPPD-CDS-F和HaHPPD-CDS-R)进行PCR扩增，扩增程序如下：94℃预变性4min；94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环；最后再72℃延伸5min，16℃，5min。
实施例2：过表达HaHPPD基因的转基因拟南芥萌发期的耐盐实验
本发明所用生长实验的流程为：以野生型拟南芥(Col)和转基因拟南芥为实验材料，随机挑选取适宜阳性株系种子，37℃烘2-3天，接着用75％乙醇和84消毒液对野生型和转基因拟南芥种子进行灭菌，然后加1mL ddH2O置于4℃春化3d后分别点在1/2MS竖直培养基和添加150mM NaCl的1/2MS竖直培养基上观察萌发状态(图8A)，每个Line各5粒种子且3个重复。同时在MS培养基和添加150mM NaCl的MS培养基上观察种子萌发率(图8B)，24℃，光照16h/黑暗8h，每个Line各65-70粒种子，重复3次。观察并在生长4-7天后分别拍照记录表型(图8)和统计萌发率(图9)，其中野生型拟南芥平均萌发率11％，转基因拟南芥OE-8、OE-10的平均萌发率分别为95％、97％，转基因拟南芥的平均萌发率皆高于野生型拟南芥，且都具有显著差异。
实验表明，表明在正常情况下，野生型拟南芥和转基因拟南芥的萌发率没有差异；在150mM NaCl处理的盐胁迫条件下，过表达HaHPPD基因的转基因拟南芥的萌发率明显高于野生型拟南芥，这有利于在盐胁迫下提高植物的出苗率和成苗率，以及缩短出苗时间，提高植株存活率。
Claims (10)
1.向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用，或在培育具有耐盐性能的转基因植物中的应用，所述向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用，或在培育具有耐盐性能的转基因植物中的应用，所述向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体应用时，将含有向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD的表达载体导入植物细胞或种子，使向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD过表达，从而获得稳定可遗传的耐盐转基因植株。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，还包括收集所述稳定可遗传的耐盐转基因植株的种子，再用所述种子繁育获得后代种子，通过测序验证获得纯合的过表达的后代种子长成的植株。
5.植物表达载体，其含有向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，所述向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其含有权利要求5所述的植物表达载体，或其基因组中插入了向日葵对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因HaHPPD。
7.权利要求5所述的植物表达载体在培育具有耐盐性能的转基因植物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转基因植物的耐盐性能优于野生型植株。
9.权利要求6所述的遗传工程化的宿主细胞在培育具有耐盐性能的转基因植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述转基因植物的耐盐性能优于野生型植株。
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