CN117821452A - 一种反义寡核苷酸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种反义寡核苷酸及其应用。本申请的反义寡核苷酸以核仁小分子RNA SNORA13为靶点，通过与靶基因互补结合，激活Rnase H降解靶基因，抑制癌细胞中SNORA13表达。本申请的反义寡核苷酸，能够显著降低癌细胞中的SNORA13表达，抑制癌细胞增殖，抑制肿瘤的转移侵袭，从而有效的预防和/或治疗多种癌症。本申请为肿瘤的预防和/或治疗提供了一种新的靶点和方案。
Description
技术领域
本申请涉及反义寡核苷酸技术领域，特别是涉及一种反义寡核苷酸及其应用。
背景技术
癌症是当今人类主要死亡原因之一，是仅次于心脏病的第二大死因。现有的癌症治疗还是以癌症部位切除并辅以放疗、化疗和靶向药物治疗为主。以结直肠癌为例，大多数患者接受结肠或直肠的切除手术，辅助以放疗或者化疗，对身体影响较大，部分结直肠癌患者的肿瘤有特定的分子谱，可以使用靶向药物和免疫治疗。常规治疗方法会对结直肠癌患者有多种副作用。传统的化疗和放疗治疗肿瘤副作用很大，在清除肿瘤的同时损伤大量正常组织细胞，破坏人体免疫功能；因此需要有针对性地抑制清除肿瘤的治疗策略。
利用肿瘤特异表达的蛋白或者RNA进行靶向给药是一种特异性的治疗癌症的方法，相对传统化疗和放疗，它更有针对性，效率更高且造成的副作用更少。由于对蛋白靶点有特殊结构要求，目前小分子化药和抗体药物可靶向的人体蛋白仅有数百个；小核酸药物直接作用于基因表达调控层面，能针对难以成药的特殊蛋白靶点实现突破，有望攻克尚无药物治疗的疾病，具有候选靶点丰富的优点，因此其潜在可治疗适应症更为广泛。并且小核酸药物还具有研发周期短、临床开发成功率高、体内毒性低，药效时间长等诸多优点。
核仁小分子RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)是长度60-300nt的非编码RNA，涉及RNA修饰和加工，目前发现的超过2000个，已鉴定的超过700个。最早鉴定出的snoRNA主要作用是对rRNA的碱基进行修饰，C/D box snoRNA通过碱基互补作用参与rRNA特定位点的2'-O-甲基化修饰，H/ACA box snoRNA则对rRNA特定位点U进行假尿苷修饰。由于rRNA和核糖体加工成熟以及蛋白合成密切相关，因此提示snoRNA的异常可能对细胞的核糖体成熟、蛋白合成有一定影响。虽然越来越多的数据表明snoRNA是癌症进展和转移的重要因子；但是，将snoRNA作为肿瘤治疗靶点的研究相对较少，并且在众多的snoRNA中并非全部都能够作为肿瘤治疗靶点。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的以snoRNA为靶点的反义寡核苷酸及其应用。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的第一方面公开了一种反义寡核苷酸(ASO)，该反义寡核苷酸以核仁小分子RNA SNORA13为靶点。
需要说明的是，本申请研究发现，核仁小分子RNA SNORA13在多种肿瘤中显著高表达，包括膀胱尿路上皮癌、胆管癌、结肠癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌、直肠腺癌、胃癌、神经胶质瘤和乳腺癌等，且与部分癌症预后相关。更进一步的，研究发现，用ASO干涉SNORA13表达，能显著降低细胞SNORA13的表达，同时，能够在体外和体内抑制细胞的增殖；利用沉默SNORA13的反义寡核苷酸所制备的药物，能有效用于预防和/或治疗多种癌症。因此，本申请特别提出以核仁小分子RNASNORA13为靶点的反义寡核苷酸。
还需要说明的是，本申请的反义寡核苷酸，通过与靶基因SNORA13互补结合，激活Rnase H降解靶基因，能够有效抑制癌细胞中SNORA13的表达，从而抑制肿瘤的转移侵袭，起到癌症预防和/或治疗的效果。
本申请的一种实现方式中，本申请的反义寡核苷酸的核酸序列为Seq ID No.1至Seq ID No.10所示序列中的至少一组序列。
需要说明的是，Seq ID No.1至Seq ID No.10所示序列的反义寡核苷酸只是本申请的一种实现方式中具体设计的，并经过验证，能够有效抑制SNORA13表达的反义寡核苷酸；在本申请发明构思下，不排除还可以针对SNORA13设计更多的反义寡核苷酸。
可以理解，本申请的关键在于以核仁小分子RNA SNORA13为靶点的反义寡核苷酸，至于常规的对反义寡核苷酸的各种修饰，可以参考现有技术，例如，可以对本申请的反义寡核苷酸进行常规的胆固醇修饰，使其可以不依赖转染试剂，直接使用，在此不做具体限定。
本申请的一种实现方式中，Seq ID No.1至Seq ID No.10所示序列的反义寡核苷酸，其作用于核仁小分子RNA SNORA13的靶序列依序为Seq ID No.11至Seq ID No.20所示序列。
本申请的第二方面公开了本申请的反义寡核苷酸在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
需要说明的是，本申请的反义寡核苷酸能够有效抑制SNORA13表达，从而抑制肿瘤的转移侵袭，具有癌症预防和/或治疗的效果；因此，可以用于制备抑制肿瘤的药物，用于预防和/或治疗癌症。
本申请的一种实现方式中，本申请的应用包括，通过反义寡核苷酸与靶基因互补结合，激活Rnase H降解靶基因，抑制肿瘤。
本申请的一种实现方式中，本申请的应用包括，采用反义寡核苷酸抑制癌细胞中SNORA13的表达，阻碍肿瘤转移。
本申请的一种实现方式中，肿瘤包括膀胱尿路上皮癌、胆管癌、结肠癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌、直肠腺癌、胃癌、神经胶质瘤和乳腺癌。
本申请的第三方面公开了一种药物组合物，包括本申请的反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。
可以理解，本申请药物组合物的关键在于本申请的反义寡核苷酸，至于药学上可接受的载体、佐剂或媒介物可以参考现有技术，在此不做具体限定。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的反义寡核苷酸，能够显著降低癌细胞中的SNORA13表达，抑制癌细胞增殖，抑制肿瘤的转移侵袭，从而有效的预防和/或治疗多种癌症。本申请为肿瘤的预防和/或治疗提供了一种新的靶点和方案。
附图说明
图1是本申请实施例中SNORA13在肿瘤中表达量的分析结果图；
图2是本申请实施例中10条ASO在SNORA13二级结构上的位置示意图；
图3至图11依序为本申请实施例中结肠癌细胞系HCT116、HT29和RKO，肾透明细胞癌细胞系Caki-1和A498，神经胶质瘤细胞系U251、肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系BT549和MDA-MB-231转染ASO1和ASO2后SNORA13的表达水平检测结果；
图12至图20依序为本申请实施例中结肠癌细胞系HCT116、HT29和RKO，肾透明细胞癌细胞系Caki-1和A498，神经胶质瘤细胞系U251、肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系BT549和MDA-MB-231转染ASO1和ASO2后细胞的增殖曲线；
图21是本申请实施例中结肠癌细胞系HCT116、HT29、RKO和对应正常上皮细胞系NCM460的SNORA13表达水平检测结果；
图22是本申请实施例中结肠癌细胞系HCT116接种裸鼠皮下后瘤内注射ASO2后第15天拍照观察皮下肿瘤体积结果；
图23是本申请实施例中结肠癌细胞系HCT116接种裸鼠皮下后瘤内注射ASO2后15内测量的肿瘤体积结果；
图24是本申请实施例中结肠癌细胞系HCT116接种裸鼠皮下后瘤内注射ASO2后第15天检测的肿瘤重量结果。
具体实施方式
本申请从现有众多的核仁小分子RNA中，通过生物信息学分析和研究发现，核仁小分子RNA SNORA13在多种肿瘤中显著高表达，进一步研究发现，用ASO干涉SNORA13表达，能显著降低癌细胞SNORA13的表达，能够在体外和体内抑制癌细胞的增殖，能够用于预防和/或治疗多种癌症。
基于以上研究和认识，本申请创造性的提出采用以核仁小分子RNA SNORA13为靶点的反义寡核苷酸预防和/或治疗包括膀胱尿路上皮癌、胆管癌、结肠癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌、直肠腺癌、胃癌、神经胶质瘤和乳腺癌等在内的多种癌症。本申请为癌症的预防和/或治疗提供了一种新的靶点和方案。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。以下实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下可以省略，或者可以由其他试剂盒、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。以下实施方式中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施方式中，所使用的材料、试剂或仪器等，如无特别说明，均可从商业途径购买获得。
实施例
一、生物信息学分析SNORA13在癌症中的表达和相关预后情况
1.癌症表达量差异分析
在TCGA数据库中下载所有癌症的基因表达数据和临床数据，对于基因表达数据，进行癌旁正常组织和癌组织的分组，剔除未检测到SNORA13表达量的样本，分析筛选后所有样本中SNORA13的表达量，用t检验对癌旁正常组织和癌组织的SNORA13的表达量进行显著性差异统计分析。
2.癌症生存预后分析
获得下载数据中所有癌症样本的临床数据，按照SNNORA13表达量的分布情况，将每种癌症分为高表达和低表达SNORA13这2组，结合临床数据中的生存数据，使用Kaplan-Meier生存分析模型，对所有癌症中高、低表达SNORA13的两组进行生存分析。
3.分析结果
结果如图1所示，SNORA13同癌旁正常组织相比，在12种癌症组织中显著上调，包括膀胱尿路上皮癌、胆管癌、结肠癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌、直肠腺癌和胃癌。并且，研究显示，神经胶质瘤和乳腺癌两种癌症中也是高表达SNORA13。
二、靶向SNORA13的ASO设计：
本研究针对SNORA13设计了10条反义寡核苷酸(ASO)，10条反义寡核苷酸的序列依序为Seq ID No.1至Seq ID No.10所示序列；并设计了一条与ASO序列碱基数相同的一段靶向非人类基因组的ASO序列作为阴性对照，即NC组，阴性对照的序列依序为Seq ID No.25。反义寡核苷酸序列及其靶标序列如表1所示，所有ASO由锐博生物科技有限公司(广州)合成。
表1反义寡核苷酸
使用RNAstructure 6.2软件进行SNORA13二级结构的预测并绘图，将10条设计的ASO互补区域投射到SNORA13二级结构图上，如图2所示，10条ASO基本上覆盖了SNORA13大部分的区域。
三、ASO对多种癌细胞系SNORA13表达和细胞生长的影响
1.实验方法
(1)细胞ASO转染
细胞汇合度在70％的时候开始转染，转染试剂使用Lipofectamine 3000(购自Invitrogen)，ASO为无菌ddH2O稀释成20μM的母液，根据制造商的说明，将等体积量Lipofectamine 3000和ASO分别同opti-MEM(购自Gibco)混合，5分钟后再将所有试剂混合，15分钟后加入培养的细胞中。
本例分别采用ASO1和ASO2，分别对结肠癌细胞系HCT116、HT29和RKO，肾透明细胞癌细胞系Caki-1和A498，肺癌细胞系A549，神经胶质瘤细胞系U251，乳腺癌细胞系BT549和乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行了ASO转染。
(2)细胞活力测定
使用CCK-8试剂盒(购自全式金)测定细胞活力，根据制造商说明，将CCK-8试剂加入96孔板培养的细胞中，每100μL体积加入10μL CCK-8，避光孵育，孵育完成后在酶标仪上检测450nm波长处的OD值，计算细胞增殖速率。
(3)qRT-PCR分析
使用TRIzol试剂(购自Invitrogen)从细胞中提取总RNA，使用反转录试剂ReverTraAce qPCR RT Master Mix(购自TOYOBO)合成cDNA。根据制造商的说明，使用PerfectStart Green qPCR SuperMix(购自全式金)进行基因扩增，在实时荧光定量PCR系统上进行qRT-PCR，并使用2-ΔΔCT方法计算相对基因表达。采用U3作为内参。PCR扩增引物包括SNORA13 forward和SNORA13 reverse，U3内参的引物包括U3 forward和U3 reverse。SNORA13 forward为Seq ID No.21所示序列，SNORA13 reverse为Seq ID No.22所示序列，U3 forward为Seq ID No.23所示序列，U3 reverse为Seq ID No.24所示序列。
Seq ID No.21：AGCCTTTGTGTTGCCCATT
Seq ID No.22：GCAGCTCCTACACCAAAGGTAT
Seq ID No.23：CCACGAGGAAGAGAGGTAGC
Seq ID No.24：CACTCAGACCGCGTTCTCTC
荧光实时定量PCR反应，取八联管，按照每孔10μL反应体系，包括：0.5μL的cDNA，5μL的2×SYBR Green Mix，0.5μL浓度为10mmol/L的上游引物、0.5μL浓度为10mmol/L的下游引物，3.5μL的ddH2O。
每组进行4个孔的平行复孔。样品添加完成后上机，进行实时荧光定量PCR扩增检测。
设定程序：95℃预变性1分钟，之后进入40次循环：95℃变性15秒、60℃退火延伸45s，在退火延伸的过程中收集荧光信号。待反映结束后导出每个孔的Ct值进行计算。
2.实验结果
(1)使用qPCR分析转染ASO1和ASO2之后各癌细胞系中SNORA13表达水平变化，表达水平的结果如图3至图11所示。图3至图11的结果显示，通过对比转染ASO组和阴性对照组(NC)的SNORA13表达量，可以看到ASO干扰SNORA13之后，结肠癌细胞系HCT116，HT29和RKO，肾透明细胞癌细胞系Caki-1和A498，肺癌细胞系A549，神经胶质瘤细胞系U251，乳腺癌细胞系BT549和MDA-MB-231的SNORA13表达量都有显著的下降。其中阴性对照组，即NC组，为与ASO序列碱基数相同的一段靶向非人类基因组的ASO序列。
(2)使用CCK-8检测转染ASO到多种癌细胞系后96h的细胞活力情况，细胞增殖曲线结果见图12至图20。图12至图20的结果显示，通过对比转染ASO1、ASO2和阴性对照组的增殖曲线，可以看到通过ASO干扰SNORA13表达可以显著降低9个不同癌细胞系的细胞活力，影响细胞生长增殖。
此外，本实验采用Seq ID No.1至Seq ID No.10所示序列的10条反义寡核苷酸，分别对膀胱尿路上皮癌、胆管癌、头颈鳞状细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌、直肠腺癌和胃癌细胞进行ASO转染试验。结果显示，10条反义寡核苷酸都能够干扰SNORA13在这些癌症细胞中的表达，只是对不同细胞的干扰效果存在差异，例如，在肝癌细胞系Huh7和HEP3B中，ASO6、ASO7和ASO8的效果显著优于其他反义寡核苷酸。
四、ASO抑制结肠癌细胞系体外和体内生长
1.结肠癌细胞系体外实验
体外细胞实验方法同“(1)细胞ASO转染”。本例分别采用ASO2和ASO8，分别对结肠癌细胞系HCT116、结肠癌细胞系HT29、结肠癌细胞系RKO和正常结肠上皮细胞系NCM460进行了ASO转染。
采用“(3)qRT-PCR分析”相同的方法，对没有进行转染的结肠癌细胞系HCT116、结肠癌细胞系HT29、结肠癌细胞系RKO和正常结肠上皮细胞系NCM460的SNORA13表达水平进行检测，结果如图21所示。图21的结果显示，同正常结肠上皮细胞NCM460相比肠癌细胞系HCT116、HT29和RKO的SNORA13水平明显更高。
使用CCK-8检测转染ASO到上述细胞后96h的细胞活力情况。结果显示，通过对比转染ASO2、ASO8和阴性对照组的增殖曲线，可以看到通过ASO干扰SNORA13表达可以显著降低结肠癌细胞系的细胞活力，影响细胞生长增殖，尤其是ASO2作用更强，而对正常结肠上皮细胞系NCM460的生长增殖基本没有影响。
2.结肠癌细胞系小鼠实验
小鼠实验均以ASO2为例进行。在Balb/c雌性4周龄裸鼠(购自维通利华)中以结肠癌细胞系HCT116细胞为小鼠移植瘤模型验证ASO药物的抑制肿瘤效果，在接种细胞HCT116后的第10天开始进行ASO治疗，以瘤内注射给药。具体方法如下：
(1)小鼠移植瘤模型的制备
检测不同癌细胞转染ASO之后的SNORA13抑制率和增殖活性，发现HCT116抑制率最高且增殖抑制最显著，因此以HCT116作为小鼠移植瘤模型。
将2×106个HCT116细胞接种注射到Balb/c nude小鼠左下肢背部皮下，共15只小鼠，分三组，每组5只小鼠，构建小鼠移植瘤模型。
(2)药物注射
ASO2组：以第一天注射HCT116细胞记作第一天，开在注射HCT116细胞的第10天，开始注射ASO2溶液，每只小鼠于移植瘤周围皮下注射10nmol，注射体积为50μL，每隔2天注射一次，共注射5次。
ASO2溶液的溶质为ASO2，ASO2的浓度为(200μM)，溶剂为浓度0.2nmol/μL的灭菌PBS缓冲液。
ASO-NC组：以第一天注射HCT116细胞记作第一天，在注射HCT116细胞的第10天，开始注射ASO-NC溶液，每只小鼠于移植瘤周围皮下注射10nmol，注射体积为50μL，每隔2天注射一次，共注射5次。
ASO-NC溶液的溶质为ASO-NC，溶剂浓度为0.2nmol/μL的灭菌PBS缓冲液。ASO-NC为经过相同修饰的靶向非人类基因组的ASO，浓度与ASO2相同，均为200μM。
PBS组：以第一天注射HCT116细胞记作第一天，在注射HCT116细胞的第10天，开始注射PBS溶液，每只小鼠于移植瘤周围皮下注射，注射体积为50μL，每隔2天注射一次，共注射5次。
(3)检测
以第一次注射ASO2溶液标记为第0天，每隔2天测量皮下移植瘤体积，即分别测量第3天、第6天、第9天、第12天、第15天的皮下移植瘤体积；并在接种注射ASO2后第15天结束实验。处死小鼠后，取皮下肿瘤组织，拍照观察肿瘤大小、检测肿瘤重量。
肿瘤体积表型：
第15天拍照观察皮下肿瘤体积结果如图22所示，可以看出，PBS组和ASO-NC组肿瘤体积明显大于ASO2组的肿瘤。
肿瘤体积：
15天内监测肿瘤体积结果如图23所示，同PBS组和ASO-NC组相比，注射ASO2组小鼠的肿瘤体积增殖速度显著降低。
肿瘤重量：
第15天检测肿瘤重量结果如图24所示，可以看出，与对照ASO-NC组相比，ASO2组小鼠的肿瘤重量显著减少。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (8)
1.一种反义寡核苷酸，其特征在于：所述反义寡核苷酸以核仁小分子RNA SNORA13为靶点。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于：所述反义寡核苷酸的核酸序列为Seq ID No.1至Seq ID No.10所示序列中的至少一组序列。
3.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其特征在于：Seq ID No.1至Seq IDNo.10所示序列的反义寡核苷酸，其作用于核仁小分子RNA SNORA13的靶序列依序为Seq ID No.11至Seq ID No.20所示序列。
4.权利要求1-3任一项所述的反义寡核苷酸在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用包括，通过所述反义寡核苷酸与靶基因互补结合，激活Rnase H降解靶基因，抑制肿瘤。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用包括，采用所述反义寡核苷酸抑制癌细胞中SNORA13的表达，阻碍肿瘤转移。
7.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括膀胱尿路上皮癌、胆管癌、结肠癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌、直肠腺癌、胃癌、神经胶质瘤和乳腺癌。
8.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1-3任一项所述的反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。
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