CN117821437A - 一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法及其应用 - Google Patents

一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法及其应用，所述方法包括：将含有纤维二糖差向异构酶编码基因的重组基因工程菌超声破碎、离心得到粗酶液，加入甘油、海藻糖和谷氨酸形成待固定酶液，与经过预处理的氨基树脂接触，获得固定化酶；纤维二糖差向异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2本发明在避免酶分子严重失活的情况下成功将重组纤维二糖差向异构酶固定在氨基树脂表面，制得的固定化酶催化乳果糖合成时无需添加任何试剂，产品产率与纯度高，副产物少，简化了乳果糖的精制工艺，不仅能够实现对乳果糖的高转化率，还能同时降低依匹乳糖的含量至允许比例，有利于工业应用。

Description

一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法及其应用
技术领域
本发明属于酶催化领域，具体涉及一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法及其在微生物催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用。
背景技术
乳果糖是D-半乳糖和D-果糖通过β-1,4糖苷键连接生成的功能性二糖，甜度约为蔗糖的48％～62％。研究表明，乳果糖的β-糖苷键不能被哺乳动物体内的消化酶水解，因此无法被人体吸收，但可以促进肠道内双歧杆菌等益生菌生长，抑制有害微生物的生长，有效地保证了胃肠道生态系统的平衡，可有效地缓解便秘，提高免疫力；乳果糖能够维持血糖和胰岛素水平，可用作药物辅助治疗糖尿病；可降低肝脑患者的血氨浓度，缓解肝病患者病情。
乳果糖的生产方法主要有化学异构法和生物酶转化法。目前商业化的乳果糖主要是在碱性条件下通过化学异构乳糖法制备。化学法制备乳果糖不仅副产物高，还给后续分离纯化带来困难，另外酸碱的使用也会给生产带来安全的风险和环境污染。
生物酶转化法生产乳果糖相比较于化学法生产的反应条件温和，不需要添加大量的化学试剂，不需要考虑金属离子的分离问题，同时在生产中不会造成环境污染，产品更容易为市场所接受。目前生物酶法主要有β-半乳糖苷酶和纤维二糖差向异构酶。β-半乳糖苷酶以乳糖和果糖作为底物，将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，之后通过转糖苷功能使半乳糖基团通过缩合果糖形成乳果糖，终产物一般包括乳果糖、葡萄糖、半乳糖、果糖和乳糖，乳果糖的得率较低，杂糖多，分离纯化难度大，成本较高，工业化潜力不高。纤维二糖差向异构酶(CEase)能够以乳糖为唯一底物，催化β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖残基异构化为果糖残基从而生成乳果糖，是目前最高效的乳果糖生产用酶。纤维二糖差向异构酶在催化转化反应时会产生一定比例的依匹乳糖，依匹乳糖与乳果糖含量的比值一般为0.20～0.26，中国药典规定依匹乳糖含量要低于10％，因此，降低依匹乳糖含量是应用纤维二糖差向异构酶法亟待解决的问题。
现有技术中降低依匹乳糖含量的方法主要有提高反应温度、在反应体系中加入硼酸、精制发酵液等。但提高反应温度可以提高乳果糖的产率，但仅依靠提高反应温度，目前酶法生产乳果糖的依匹乳糖含量仍达不到药典规定的标准(含量低于10％)，因此仍需结合其他手段来降低依匹乳糖含量；而硼是禁止在食品中添加的成分，精制的手段则增加了生产程序，导致生产成本增加。基于上述原因，目前的酶法生产乳果糖尚未实现大规模工业化。
此外，生物酶转化法常采用游离酶作为催化剂，存在难以回收、难以分离且热稳定性较差等问题，会显著增加生产成本。利用固定化技术将酶固定在载体上，可增强酶的使用和储存稳定性，达到生物催化剂循环利用，易于分离纯化，简化后处理工艺，降低生产。
酶的固定化包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。共价结合法是以共价结合方式将酶固定到一个合适的载体，该法的连接强度较高，可使酶在固定化体系中漏出更少，保证固定化酶具有良好的操作稳定性。但共价结合法固定化反应较激烈，会造成酶活性下降，因此酶固定化载体和方法选择尤为重要。
发明内容
针对上述现有技术的问题，本发明提供一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法及其应用，不仅能够实现对乳果糖的高转化率，还能同时降低依匹乳糖的含量至允许比例，有利于工业应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法，包括如下步骤：
(1)制备待固定酶液：将含有纤维二糖差向异构酶编码基因的重组基因工程菌超声破碎、离心得到粗酶液，向所述粗酶液中加入甘油、海藻糖和谷氨酸，混匀，形成待固定酶液；所述甘油的终浓度150～300g/L，所述海藻糖的终浓度15～25g/L，所述谷氨酸的终浓度40～60g/L；
所述纤维二糖差向异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
(2)对氨基树脂进行预处理；
(3)酶的固定化：步骤(2)中预处理后的氨基树脂与步骤(1)得到的待固定酶液接触12～24h，优选为16h，之后洗涤，获得纤维二糖差向异构酶固定化酶；所述待固定酶液与所述氨基树脂的体积质量比为3～9mL/g。
优选的，步骤(1)中所述重组基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌。
优选的，步骤(1)中所述粗酶液的制备方法为：将所述重组基因工程菌经诱导培养后收集湿菌体，将湿菌体重悬于pH6.0～7.0的缓冲溶液中，超声破碎后收集上清液，即得所述粗酶液。
优选的，所述缓冲溶液为NaH2PO4-Na2HPO4或PBS缓冲溶液。更优选为pH6.5的PBS缓冲溶液。
优选的，步骤(2)中所述预处理的方法为：将氨基树脂按照质量体积比1:10的比例加入0.1M pH8.0的缓冲溶液中，在25℃，pH7.0～8.5范围内水浴搅拌1～1.5h后过滤抽干，再将滤饼按照质量体积比1:5的比例加入2％wt，pH7.8～8.2的戊二醛磷酸缓冲液中，25℃搅拌1h，过滤、用去离子水洗涤至水清，之后去除氨基树脂表面的水。
优选的，步骤(3)中，将所述氨基树脂与所述待固定酶液在25～28℃条件下接触。
优选的，步骤(3)中所述的洗涤的方法为，先用2％的NaCl溶液洗涤，再用去离子水洗涤。
优选的，步骤(3)中所述的体积质量比为7mL/g。
优选的，所述氨基树脂为氨基树脂EVX。氨基树脂EVX为现有技术，可购自西安蓝晓科技有限公司。
本发明还提供上述方法获得的纤维二糖差向异构酶固定化酶在制备乳果糖中的应用，包括如下步骤：
以所述纤维二糖差向异构酶固定化酶为催化剂，以乳糖为催化底物，在75～85℃，优选82℃、pH6.0～7.0，优选pH6.5下转化。
优选的，所述应用还包括转化后在12000rpm、4℃离心10min，抽滤回收固定化酶的步骤。
通过HPLC检测，采用本发明制得的纤维二糖差向异构酶固定化酶，得到的乳果糖含量为350.5g/L，纤维二糖差向异构酶固定化酶催化乳糖生成乳果糖产率为70.1％，依匹乳糖产率为8.1％。
与现有技术相比较，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明制备的纤维二糖差向异构酶固定化酶具有明显的优势，固定化酶的最适酶反应温度较游离酶提高了7℃，底物乳糖浓度提高至500g/L，乳果糖产率最高达到70.5％，乳果糖产率高的同时依匹乳糖的产率仅为8.1％，远远低于中国药典所允许的比例。
(2)本发明首次在纤维二糖差向异构酶固定化过程中采用海藻糖作为酶蛋白活性中心的保护剂，使固定化酶具有较高的活性和稳定性。海藻糖性质稳定，具有耐热耐酸特性，协同多羟基化合物甘油和谷氨酸，通过提高酶蛋白溶液的粘度、增加表面张力及与酶蛋白发生共价作用，稳定酶蛋白质的三维结构，从而保护酶蛋白质分子的活性中心，避免了固定化过程中酶分子严重失活的情况下成功地将纤维二糖差向异构酶固定在吸附树脂载体上，大大提高了酶的使用次数，连续使用30批次以上，酶活仍能稳定保持在70％以上，极大降低了生产成本。
(3)本发明制备的纤维二糖差向异构酶固定化酶相比游离酶，解决了酶蛋白分子在转化液中残留过高的问题，大幅度降低乳果糖中蛋白质含量。
附图说明
图1为纤维二糖差向异构酶固定化酶催化乳糖转化乳果糖的高效液相色谱检测图。
具体实施方式
实施例1
(1)氨基型树脂的预处理：
分别取10g氨基型树脂载体(分别为EVX、HFA、EPHA、HA、EP(N))置于锥形瓶中，加入0.1M、pH8.0的缓冲液100mL，25℃恒温缓慢摇动15min后，测pH，维持pH在7.0～8.5范围内，继续缓慢摇动至1h后过滤抽干。向上一步处理的载体中加入50mL、2％wt的戊二醛磷酸缓冲液(pH7.8～8.2)，25℃恒温摇床缓慢摇动1h，过滤，滤饼用去离子水洗涤至水清。将获得的载体浸泡在去离子水中，4℃下保存。
2％wt的戊二醛磷酸缓冲液配置方法为：40mL戊二醛(50％wt)，960mL水，K2HPO44.76g,溶解后用KH2PO4调节pH至7.8～8.2。
(2)阴离子交换树脂的预处理：
分别取10g阴离子交换树脂(D301)装入玻璃柱中，用1M NaCl溶液过柱转型4～6bv，然后用大量去离子水冲洗，至流出液的电导率和pH与进口去离子水接近，过滤。向滤饼中加入0.1M、pH8.0的缓冲液100mL，恒温25℃摇床缓慢摇动15min后，测pH，维持pH在7.8～8.0范围内，继续慢摇至1h后过滤、滤饼用去离子水洗涤至水清，浸泡在去离子水中4℃下保存。
(3)环氧树脂的预处理：
分别取10g环氧基树脂(分别为LX-1000EPF、LX-1000HFA)，用去离子水洗涤至水清，过滤，滤饼浸泡在去离子水中4℃下保存。
实施例2
(1)纤维二糖差向异构酶基因工程菌的构建：
所述纤维二糖差向异构酶是将基因库中来源于Rhodothermusmarinus的纤维二糖差向异构酶的(GenBank:编号：WP_161542036.1)的基因序列经密码子优化后得到，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。按SEQ ID NO.1进行全基因合成，合成的基因在N端融合His-tag标签，并连接在表达载体pET-28a上，得到重组质粒pET28a-CE。
将重组质粒pET28a-CE转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pET28a-CE的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-CE。
(2)将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-CE接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，于37℃，200rpm下培养10-12h，再按6％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的液体发酵培养基中发酵，于37℃，250rpm下培养至OD6006～8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h，发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得纤维二糖差向异构酶基因工程菌湿菌体。
LB液体培养基配方(g/L)：蛋白胨20，酵母粉15，NaCl 10。
液体发酵培养基配方(g/L)：蛋白胨16，酵母粉10，NaCl 5，甘油1。
实施例3
(1)纤维二糖差向异构酶粗酶液的制备：
将实施例2获得的湿菌体按1:8的比例悬浮于pH6.5 PBS缓冲液中，利用超声波破碎，释放细胞内酶蛋白，破碎程序为：破碎时间2s，间隔时间2s，功率为650W，总破碎时间为20min。破碎过程维持冰浴条件。破碎后将粗酶液在离心机经12000rpm，20min，离心后取上清液，即为纤维二糖差向异构酶粗酶液。
实施例4
酶活检测：
取100g/L的乳糖溶液9mL，75℃下预热至恒温，加入0.5mL酶液，混合均匀，在70℃、200rpm的水浴摇床中反应30min，沸水浴20min终止异构化反应，在12000rpm、4℃离心10min，取上清液，0.22μm有机膜过滤，用HPLC检测乳果糖含量。
酶活定义：每分钟催化产生1μmoL乳果糖所需的酶量，即为1个酶活力单位，用U表示。
实施例5
将实施例3制备的纤维二糖差向异构酶粗酶液，加入终浓度200g/L的甘油、20g/L海藻糖和50g/L谷氨酸，混匀，形成待固定酶液。
分别称取10g实施例1预处理的树脂，用滤纸吸去表面游离水，按照树脂和待固定酶液的用量比例为1g:7mL，量取待固定酶液依次加入装有氨基树脂EVX、HFA、EPHA、HA、EP(N)、阴离子交换树脂D301和环氧树脂LX-1000EPF、LX-1000HFA的锥形瓶中，25～28℃恒温缓慢摇动12～24h，得到固定化酶。
将固定化酶过滤抽干，用依次用2％的NaCl溶液和去离子水洗涤，用滤纸吸去表面游离水。
分别取100g/L的乳糖溶液10mL(80℃下预热至恒温)，各加入1g上述不同的固定化酶，混合均匀，80℃、200rpm的恒温水浴摇床中反应30min，灭酶，过滤，采用实施例4的方法测定酶活。由表1可以看出氨基型树脂EVX显著优于其他类型树脂或同类型的其他氨基树脂。
表1不同树脂固定化纤维二糖差向异构酶的相对酶活
树脂型号 相对酶活(％)
EVX 75.32
HFA 41.31
EPHA 45.34
HA 52.87
EP(N) 49.48
D301 3.42
LX-1000EPF 0
LX-1000HFA 0
实施例6
酶添加量对酶活的影响：
取10g实施例1预处理得到的氨基树脂-EVX，用滤纸吸去表面游离水，置于具塞锥形瓶中，按照每克树脂加入3mL、5mL、7mL和9mL待固定酶液的比例加入树脂中，25～28℃恒温缓慢摇动12～24h。将固定化树脂过滤抽干，依次采用2％的NaCl溶液和去离子水洗涤，滤纸吸去表面游离水。取100g/L的乳糖溶液10mL，加入1g固定化酶，混合均匀，在80℃、200rpm的水浴摇床中反应30min，灭酶，过滤，采用实施例4方法测定酶活。由表2可以看出1g树脂中加入5mL的酶液时相对酶活最大。
表2不同酶量对纤维二糖差向异构酶酶活的影响
每克树脂载酶量(mL) 相对酶活(％)
3 68.19
5 78.03
7 74.81
9 67.95
实施例7
固定化时间：
取10g实施例1预处理得到的氨基树脂-EVX，用滤纸吸去表面游离水，置于具塞锥形瓶中，按照每克树脂固定5mL待固定酶液的比例，取一定的体积待固定酶液加入盛有树脂的锥形瓶中，25～28℃恒温水浴摇床缓慢摇动12h、14h、16h、18h、20h，将固定化的树脂抽滤，依次采用2％的NaCl溶液和去离子水多次洗涤抽滤，滤纸吸去表面游离水。取100g/L的乳糖溶液10mL，80℃下预热至恒温，加入1g固定化酶，混合均匀，在80℃、200rpm的水浴摇床中反应30min后，在12000rpm、4℃离心10min，取上清液灭酶、过滤，采用实施例4方法测定酶活。从表3可以固定化时间在16h相对酶活最高。
表3固定化时间对酶活的影响
固定化时间(h) 相对酶活(％)
12 60.82
14 68.27
16 74.68
18 74.41
20 70.15
实施例8
纤维二糖差向异构酶固定化酶的操作稳定性：
取300g/L的乳糖溶液10mL，80℃下预热至恒温，加入实施例7中固定化16h得到的固定化酶1g，混合均匀，在pH7.4，82℃、200rpm的水浴摇床中反应30min后，在12000rpm、4℃离心10min，取上清液灭酶、过滤，采用实施例4方法测定酶活。固定化酶连续操作30次相对酶活保持在70％以上。
实施例9
纤维二糖差向异构酶固定化酶制备乳果糖：
反应总体系100mL，500g/L乳糖(用pH6.5磷酸盐缓冲溶液配置)，固定化酶10g。在75℃、200rpm的水浴摇床中反应8h后，在12000rpm、4℃离心10min，抽滤回收固定化酶，取上清液灭酶、过滤，通过HPLC检测乳果糖含量为350.5g/L，固定化纤维二糖差向异构酶催化乳糖生成乳果糖产率为70.1％，依匹乳糖产率为8.1％。

Claims (10)

1.一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备待固定酶液：将含有纤维二糖差向异构酶编码基因的重组基因工程菌超声破碎、离心得到粗酶液，向所述粗酶液中加入甘油、海藻糖和谷氨酸，混匀，形成待固定酶液；所述甘油的终浓度150～300g/L，所述海藻糖的终浓度15～25g/L，所述谷氨酸的终浓度40～60g/L；
所述纤维二糖差向异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
（2）对氨基树脂进行预处理；
（3）酶的固定化：步骤（2）中预处理后的氨基树脂与步骤（1）得到的待固定酶液接触12~24h，优选为16h，之后洗涤，获得纤维二糖差向异构酶固定化酶；所述待固定酶液与所述氨基树脂的体积质量比为3～9mL/g。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述重组基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述粗酶液的制备方法为：将所述重组基因工程菌经诱导培养后收集湿菌体，将湿菌体重悬于pH6.0~7.0的缓冲溶液中，超声破碎后收集上清液，即得所述粗酶液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为NaH2PO4-Na2HPO4或PBS缓冲溶液；优选为pH6.5 PBS缓冲溶液。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述预处理的方法为：将氨基树脂按照质量体积比1:10的比例加入0.1M pH8.0的缓冲溶液中，在25℃，pH7.0～8.5范围内水浴搅拌1～1.5 h后过滤抽干，再将滤饼按照质量体积比1:5的比例加入2%wt，pH7.8~8.2的戊二醛磷酸缓冲液中，25℃搅拌1 h，过滤、用去离子水洗涤至水清，之后去除氨基树脂表面的水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，将所述氨基树脂与所述待固定酶液在25～28℃条件下接触。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的洗涤的方法为，先用2%的NaCl溶液洗涤，再用去离子水洗涤。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的体积质量比为7mL/g。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基树脂为氨基树脂EVX。
10.权利要求1-9任一所述的方法获得的纤维二糖差向异构酶固定化酶在制备乳果糖中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
以所述纤维二糖差向异构酶固定化酶为催化剂，以乳糖为催化底物，在75～85℃、pH6.0～7.0下转化，优选为在82℃、pH6.5下转化。
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