CN117813394A - 带有暗猝灭剂的流通池 - Google Patents
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Abstract
示例性流通池包括具有表面的基底。该流通池还包括附接到基底表面的至少一部分的聚合物水凝胶，其中该聚合物水凝胶包含暗猝灭剂。该流通池还包括附接到该聚合物水凝胶的至少一个引物组。
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背景技术
许多生物感测和扩增方法利用基于荧光的技术。例如，基因测序的合成测序方法在其操作中采用荧光信号。更具体地，在合成测序方法中，合成新生链，并且经由从附接的荧光团发射荧光信号来光学检测每种单体(例如核苷酸)向生长链的添加。因为模板链指导新生链的合成，人们可根据在合成期间添加到生长链的一系列核苷酸单体推断出模板DNA的序列。
发明内容
本文公开了包括基底和包含暗猝灭剂的聚合物水凝胶的流通池。在测序期间，非特异性结合的全功能核苷酸(例如，其包括荧光团)可对测序读取贡献背景噪声。非特异性结合的全功能核苷酸是不掺入新生链中，而是在聚合物水凝胶表面处被捕集或在聚合物水凝胶表面处的溶液中游离的那些核苷酸。来自非特异性结合的全功能核苷酸的信号可有害地妨碍来自掺入的全功能核苷酸的信号，使得后者的信号难以容易地分辨。包含暗猝灭剂可至少降低背景信号并且因此降低背景强度。背景强度的降低增加了信噪比(SNR)，这使得掺入的全功能核苷酸信号能够被容易地分辨。
本文所述的聚合物水凝胶和暗猝灭剂还可用于利用荧光作为检测机制的任何传感器(聚合酶链反应传感器(PCR)、其它生物传感器等)中。在本文所公开示例中的一些示例中，聚合物水凝胶和暗猝灭剂用作安全特征物，例如以确保传感器与适当的分析系统结合使用。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1示出将暗猝灭剂附接到聚合物水凝胶的可裂解的连接分子的不同示例的化学结构的示意图；
图2示出将暗猝灭剂附接到聚合物水凝胶的不可裂解的连接分子的示例的化学结构的示意图；
图3A是流通池的示例的顶视图；
图3B至图3D是流通池的流动通道的架构的不同示例的放大视图和局部剖面图；
图4A至图4D是在本文所公开的流通池的一些示例中使用的引物组的不同示例的示意图；
图5是示出改善流通池中的信噪比的方法的示例的流程图；
图6是示出暗猝灭剂对非特异性结合的荧光团的影响的示意图；
图7A和图7B是一起示出暗猝灭剂对测序流通池的节距为500nm的凹入部内的荧光的局部发射的影响的柱形图；并且
图8A和图8B是一起示出暗猝灭剂对测序流通池的节距为700nm的凹入部内的荧光的局部发射的影响的柱形图。
具体实施方式
本文所公开的流通池和其它荧光传感器的示例包括包含暗猝灭剂的聚合物水凝胶。包含暗猝灭剂可至少降低背景信号，并且因此降低背景强度，该背景信号是由含有荧光团并且非特异性地结合于聚合物水凝胶的表面处的感兴趣的分子引起的。非特异性结合的感兴趣的分子可被捕集在聚合物水凝胶的表面处或该表面附近的溶液中，而不是被掺入新生链中或以其它方式被捕获物质多价螯合。在本文所述的各种示例中，暗猝灭剂定位在非特异性结合的感兴趣的分子的“信号猝灭接近度”内。“信号猝灭接近度”意指暗猝灭剂和非特异性结合的感兴趣的分子彼此足够靠近(例如，对于一些暗猝灭剂和感兴趣的光学活性分子，在4nm或更小的范围内)，使得来自这些分子的背景信号被猝灭。猝灭背景信号增加了信噪比(SNR)，这使得并入的或以其它方式多价螯合的感兴趣的分子的信号能够被容易地分辨。作为一个示例，较低背景噪声使得能够更准确地调用碱基，这继而实现较长的测序运行。
定义
应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
术语包含、包括、容纳和这些术语的各种形式彼此同义，并且意在是同样宽泛的。
如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可进行反应的流动通道、用于将试剂递送到流动通道的入口以及用于从流动通道中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，流通池适于检测在该流通池中发生的反应。例如，流通池可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。
如本文所用，“流动通道”或“通道”可为限定在两个粘结部件之间的区域，该区域可选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可以限定在两个图案化结构之间，并且因此可以与这些图案化结构的表面化学物质流体连通。在一些示例中，流动通道可以限定在图案化结构与盖之间，并且因此可以与图案化结构的表面化学物质流体连通。
“图案化结构”可指单层基底或包括基座载体和定位在基座载体上的树脂层的多层基底。单层基底或多层基底的树脂层可具有图案形式的表面化学物质，例如在凹入部中，或以其它方式定位在单层基底或多层基底的树脂层上。表面化学物质可具有聚合物水凝胶和附接到其的至少一个引物组的引物(例如，用于文库模板捕获和扩增)。在一些示例中，单层基底或多层基底已暴露于图案化技术(例如，蚀刻、光刻等)，以便产生表面化学物质的图案。然而，术语“图案化结构”不旨在暗示必须使用此类图案化技术来生成该图案。例如，图案化结构可以是其上具有聚合物水凝胶的图案的基本上平坦的表面。
术语“基底”是指可在其上引入表面化学物质的单层基座载体或包括在其上带有树脂层的基座载体的多层结构。
如本文所用，“聚合物水凝胶”或“聚合物水凝胶垫”或“水凝胶垫”或“垫”是指包含任何凝胶(例如，水凝胶)材料，该材料在吸收液体时可溶胀且在移除液体(例如，通过干燥)时可收缩。聚合物水凝胶可以施加在流通池基底的至少一部分上方。聚合物水凝胶可包含可附接到引物或引物组的官能团。聚合物水凝胶可以作为垫施加，或者可定位在限定于基底中的凹入部的一部分内，或者可定位在限定于基底中的泳道的一部分内。聚合物水凝胶垫依靠于基本上平坦的基底表面上，并且因此看起来从该基底表面突出。应当理解，“水凝胶垫”、“聚合物水凝胶垫”、“聚合物垫”和“垫”在本文中可互换使用。聚合物水凝胶可包含通过可裂解的连接分子可移除地附接，或掺入其主链中，或通过连接分子共价附接，或通过非共价结合对非共价附接的暗猝灭剂。
如本文所用，“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA)。本文称为扩增引物的一些引物用作模板扩增和簇生成的起点。本文称为测序引物的其它引物用作DNA合成的起点。引物的5'末端可被修饰以便于与聚合物的官能团进行偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包含多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即在核糖中缺少存在于2'位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可为嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子键合到嘧啶的N-1原子或嘌呤的N-9原子。核苷酸可以是单磷酸或包括若干磷酸基团的多磷酸(例如，三磷酸(即，γ磷酸)、四磷酸、五磷酸、六磷酸等)。核酸类似物可具有改变的磷酸主链、糖或核碱基中的任一者。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物，诸如肽核酸(PNA)、取代磷酸主链的膦酸酯修饰的核苷酸等。
如本文所用，“全功能核苷酸”是指具有附接到其的至少一个荧光团的核苷酸。掺入的全功能核苷酸是具有键合到模板链的氢的那些核苷酸。非特异性结合的全功能核苷酸是不掺入新生链中，而是结合到聚合物水凝胶的那些核苷酸。
术语“暗猝灭剂”是指吸收来自荧光团的发射能量(光)并且随后将所吸收的能量作为热而不是作为荧光信号耗散的非荧光染料。
“信噪比”是指在测序方法期间检测到的靶标荧光信号的量与在测序方法期间检测到的背景荧光的量的比率。
术语“背景荧光”或“噪声”是指由非靶源产生的信号，该信号可由在聚合物水凝胶的表面处或在水凝胶表面附近的溶液中捕集的非特异性结合的全功能核苷酸所贡献。术语“背景荧光”还可以封装由基底(例如多层基底的树脂层)产生的不期望的信号。
术语“可裂解的连接分子”是指与酶或其它反应物反应以裂解或切掉分子的一部分并且由此从分子的整体结构上切除特定官能团的分子。
“丙烯酰胺单体”是具有结构的单体或包含丙烯酰胺基团的单体。包含丙烯酰胺基团的单体的示例包括叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺：
和N-异丙基丙烯酰胺：
可使用其它丙烯酰胺单体。
如本文所用，“捕获物质”是指附接到流通池表面的一部分或附接到荧光传感器表面的一部分的材料，该荧光传感器表面附接感兴趣的分子(例如，文库片段、分析物等)。在本文所述的流通池中，引物或引物用作捕获物质。在其它传感器中，捕获物质可以是PCR引物、受体等。
如本文所用，术语“凹入部”是指基底表面中的离散凹面特征部，该特征部具有至少部分地被基底表面的空隙区域包围的表面开口。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，凹入部可以是一个孔或两个互连的孔。凹入部还可具有更复杂的结构，诸如脊、台阶特征部等。
如本文所用，术语“空隙区域”是指例如分离凹入部(凹面区域)的基底表面的区域。例如，间隙区域可将阵列的一个凹入部与阵列的另一个凹入部分开。彼此分开的两个凹入部可以是离散的，即彼此缺乏物理接触。在许多示例中，空隙区域是连续的，而凹入部是离散的，例如，如限定在其它连续表面中的多个凹入部的情况。在其他示例中，间隙区域和特征部是离散的，例如，由相应间隙区域分开的沟槽形状的多个凹入部的情况就是如此。由空隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与凹入部的表面材料不同的表面材料。例如，凹入部可具有在其中附接的聚合物水凝胶和引物组，并且空隙区域可不含聚合物水凝胶和引物组。
如本文所用，术语“附接”是指两个事物直接或间接地彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键附接到聚合物水凝胶。“共价键”的特征在于原子之间共享电子对。“非共价键”是不涉及共享电子对的物理键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
术语顶部、底部、下部、上部、上等在本文中用于描述流通池或其它荧光传感器和/或流通池或其它荧光传感器的各个部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。
术语第一、第二等也并非意在暗示特定的取向或顺序，而是用于将一个部件与另一个部件区分开来。
如本文所用，术语“活化”是指在单层基座载体的表面或多层基底的最外层处产生反应性基团的过程。活化可以使用硅烷化或等离子体灰化来完成。虽然附图没有描绘等离子体灰化产生的单独的硅烷化层或-OH基团，但是应当理解活化在活化的支持物或层的表面处产生硅烷化层或-OH基团以将聚合物水凝胶共价附接到下面的载体或层。
如本文所用，“醛”是包含具有结构-CHO的官能团的有机化合物，其包括羰基中心(即，碳以双键键合到氧)，其中碳原子也键合到氢和R基团，诸如烷基或其它侧链。醛的通式结构是：
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子。典型的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为一个示例，名称“C1-4烷基”指示烷基链中存在一至四个碳原子，即烷基链选自由以下项组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
如本文所用，“炔烃”或“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、薁基和蒽基。
“胺”或“氨基”官能团是指-NRaRb基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢(例如)、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环，如本文所定义。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N3。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系主链中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基团可具有3至20个碳原子。碳环基环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。
如本文所用，术语“羧酸”或“羧基”是指-COOH。
如本文所用，“亚环烷基”是指完全饱和的碳环或环系，其通过两个连接点连接到分子的其余部分。
如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。示例包括环己烯基或环己烯以及降冰片烯基或降冰片烯。同样如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。一个示例为环辛炔。另一个示例为双环壬炔。同样如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，术语“沉积”是指任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、流动通过涂覆(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。
当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“环氧”(也称为缩水甘油基或环氧乙烷基团)是指
如本文所用，“杂芳基”是指在环主链中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可具有5-18个环成员。
如本文所用，“杂环”意指在环主链中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。在环系中，杂原子可存在于非芳族环或芳族环中。杂环基团可具有3至20个环成员(即，构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)。在一些示例中，杂原子是O、N或S。
如本文所用，术语“肼”或“肼基”是指-NHNH2基团。
如本文所用，术语“腙”或“肼基”是指基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环，如本文所定义。
如本文所用，“羟基(hydroxy或hydroxyl)”是指-OH基团。
如本文所用，“腈氧化物”意指“RaC≡N+O-”基团，其中Ra在本文定义。制备腈氧化物的示例包括通过用氯酰胺-T处理或通过碱基在酰亚胺氯[RC(CI)＝NOH]上的作用或通过羟胺与醛之间的反应由醛肟原位生成。
如本文所用，“硝酮”是指基团，其中R1、R2和R3可以是本文所定义的Ra基团和Rb基团中的任一者，不同的是R3不是氢(H)。
在一些示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料直接位于另一个部件或材料上。当一个直接在另一个上时，两个彼此接触。
在其它示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料间接位于另一个部件或材料上。所谓间接地，表示间隙或另外的部件或材料可位于两个部件或材料之间。
“硫醇”官能团是指-SH。
如本文所用，术语“四嗪”和“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可为任选取代的。
如本文所用，“四唑”是指包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可为任选取代的。
应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同此类值或子范围被明确列举一样。例如，约400nm至约1μm(1000nm)的范围应被解释为不仅包括明确列举的约400nm至约1μm的限值，而且包括单个值，诸如约708nm、约945.5nm等，以及子范围，诸如约425nm至约825nm、约550nm至约940nm等。另外，当利用“约”和/或“基本上”来描述值时，它们意在涵盖与该值的微小变化(高达+/-10％)。
聚合物水凝胶和暗猝灭剂
在本文所公开的示例中，聚合物水凝胶包含暗猝灭剂。通常，聚合物水凝胶具有通过可裂解的连接分子可移除地附接的暗猝灭剂，或聚合物水凝胶具有掺入其主链中的暗猝灭剂，或暗猝灭剂通过连接分子共价附接到聚合物水凝胶。在一些示例中，暗猝灭剂可通过发夹寡核苷酸或DNA折纸附接到聚合物水凝胶。
在一个示例中，聚合物水凝胶包括丙烯酰胺共聚物。在该示例中，丙烯酰胺共聚物具有结构(I)：
其中：
RA选自由以下项组成的组：叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的炔烃、卤素、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
RB为H或任选取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自由H和任选取代的烷基组成的组；
-(CH2)p-中的每个能够任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；并且
m为在1至100,000范围内的整数。
由结构(I)表示的丙烯酰胺共聚物的一个具体示例是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺，PAZAM。
本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
丙烯酰胺共聚物的分子量可以在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可以为约312kDa。
在一些示例中，丙烯酰胺共聚物是线型聚合物。在一些其他的示例中，丙烯酰胺共聚物为轻度交联聚合物。
在一些示例中，凝胶材料可以是结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺替换。在另一示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用替换，其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基(而不是H，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括/>其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。
作为聚合物水凝胶的另一个示例，结构(I)中重复出现的“n”特征可用包括具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替换：
其中R1为H或C1-C6烷基；R2为H或C1-C6烷基；L为包括直链的连接基，其具有2至20个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选的取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选的取代基；A为带有附接到N的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个含碳环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。作为又一个示例，该凝胶材料可以包括结构(III)和(IV)各自的重复单元：
其中R1a、R2a、R1b和R2b中的每一者独立地选自氢、任选取代的烷基或任选取代的苯基；R3a和R3b中的每一者独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的苯基或任选取代的C7-C14芳烷基；并且L1和L2中的每一者独立地选自任选取代的亚烷基接头或任选取代的杂亚烷基接头。
在另一示例中，聚合物水凝胶可以是直链或支链的共聚物，该共聚物包含具有以下结构的第一丙烯酰胺单体：
其中R1和R2独立地选自由以下项组成的组：烷基、烷基氨基、烷基酰胺基、烷硫基、芳基、二醇和它们的任选取代的变体；和具有以下结构的第二丙烯酰胺单体：
其中R3为氢或烷基；R4为氢或烷基；L为包括直链的接头，所述直链具有2至20个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选的取代基；A为具有结构的N取代的酰胺，其中R5为氢或烷基；E为直链，所述直链具有1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选的取代基；并且Z为任选的含氮杂环。
在又一个示例中，使用硝基氧介导的聚合形成丙烯酰胺共聚物，并且因此至少一些共聚物链具有烷氧基胺端基。在共聚物链中，术语“烷氧基胺端基”是指休眠种-ONR1R2，其中R1和R2中的每一者可以相同或不同，并且可独立地为直链或支链烷基或环结构，并且其中氧原子附接到共聚物链的其余部分。在一些示例中，还可以将烷氧基胺引入到一些重复出现的丙烯酰胺单体中，例如在结构(I)的位置RA处。因此，在一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基；并且在另一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基和至少一些侧链中的烷氧基胺基团。
应当理解，可以使用其它分子来形成聚合物水凝胶，只要它们能够被期望的化学物质(例如，引物)官能化即可。用于聚合物水凝胶的合适材料的一些示例包括官能化硅烷，诸如降冰片烯硅烷、叠氮硅烷、炔烃官能化硅烷、胺官能化硅烷、马来酰亚胺硅烷，或者具有可以分别附接期望的化学物质的官能团的任何其它硅烷。
用于聚合物水凝胶的合适的材料的其它示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。用于聚合物水凝胶的合适的材料的其它示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括树枝状体(例如，多臂或星形聚合物)。例如，单体(例如，丙烯酰胺等)可以无规或嵌段方式掺入到树枝状体的支链(臂)中。
如前所提及的，本文所公开的聚合物水凝胶包含暗猝灭剂。可以使用能够被包含在聚合物水凝胶中(例如，在聚合物水凝胶主链中，经由接头附接等)并且能够猝灭期望的荧光源的任何暗猝灭剂。暗猝灭剂可以是任何黑洞猝灭剂，包括来自BiosearchTechnologies的系列中的那些，例如，/>0(猝灭430nm-520nm)、/>1(猝灭480nm-580nm)、/>2(猝灭560nm-670nm)和/>3(猝灭620nm-730nm)。这些分子的发射猝灭部分(例如，偶氮系统周围的取代的环)可用于3’、内部和/或5’修饰，这使得可聚合基团(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)或连接分子能够附接到其。在本文所述的一个示例中，暗猝灭剂选自由以下项组成的组：二甲基氨基偶氮苯磺酸、4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(即，5’-BHQ-1亚磷酰胺)、4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(即，5’-BHQ-2亚磷酰胺)、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(即，BHQ-1-dT)、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(即，BHQ-2-dT)以及它们的组合。在这些特定示例情况下，二甲基氨基偶氮苯磺酸适合与非寡核苷酸连接分子一起使用，而亚磷酰胺封端的示例适合与寡核苷酸连接分子一起使用。
在一个示例中，聚合物水凝胶具有通过可裂解的连接分子可移除地附接的暗猝灭剂。“可移除地附接”意指暗猝灭剂可通过裂解剂从聚合物水凝胶移除，该裂解剂使可裂解的连接分子裂解。
在一些示例中，可裂解的连接分子能够共价附接。能够共价附接的可裂解的连接分子的示例在图1中以附图标号16A、16B、16C示出。在这些示例中，可裂解的连接分子16A、16B、16C包含在一个端部处附接至聚合物水凝胶42的官能团的官能团，在另一端部处附接至暗猝灭剂44的官能团的官能团，以及裂解位点22。在图1所示出的示例中，炔烃官能团存在于可裂解的连接分子的一个端部处，并且可附接至聚合物水凝胶42的叠氮化物官能团。暗猝灭剂44的发射猝灭部分包含可附接到可裂解的连接分子16A、16B、16C的羰基的官能团。可裂解的连接分子16A包含邻位二醇裂解位点22，该二醇裂解位点可经由暴露于高碘酸钠而裂解。可裂解的连接分子16B包含酯裂解位点22’，该位点可经由碱而裂解。可裂解的连接分子16C包含O-叠氮甲基裂解位点22”，其可经由膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))而裂解。
在其它示例中，可裂解的连接分子包含非共价结合对。非共价结合对的示例包含NiNTA(镍-次氮基三乙酸)配体和组氨酸标签，或链霉亲和素或抗生物素蛋白和生物素，或spytag和spycatcher。作为一个具体示例，链霉亲和素或抗生物素蛋白附接到暗猝灭剂44的端部，并且生物素附接到聚合物水凝胶42。作为另一具体示例，生物素附接到暗猝灭剂44的端部，并且链霉亲和素或抗生物素蛋白附接到聚合物水凝胶42。在这些具体示例中，如果/当期望移除暗猝灭剂44时，可使用热甲酰胺作为裂解剂。也可以使用链霉亲和素或抗生物素蛋白和生物素之外的其它蛋白质结合机制。
当生物素附接到聚合物水凝胶42时，生物素本身可以通过接头(诸如生物素-PEG4-炔烃或DBCO-S-S-PEG3-生物素(后者包含可裂解的二硫键))附接到聚合物水凝胶42。当生物素接头包含二硫键时，当暴露于还原剂(诸如TCEP(三(2-羧乙基)膦)或DTT(二硫苏糖醇))时，其可被移除。这些类型的还原剂可用于一些测序操作中，并且因此当暗猝灭剂44将用于SNR降低时，此种类型的生物素接头可能是不期望的。另选地，当暗猝灭剂44用作荧光传感器中的安全特征物时，完全移除非共价结合对(例如，生物素)的聚合物水凝胶42结合部分可能是期望的。因此，在这些情况下，包含二硫键的生物素接头可能是期望的。
在其中暗猝灭剂44用于降低SNR的一些示例中，可裂解的连接分子的长度被选择，使得暗猝灭剂44在聚合物水凝胶42的表面的信号猝灭接近度内，在掺入的或以其它方式多价螯合的感兴趣的分子的光学检测期间，非特异性结合的感兴趣的分子可以位于该聚合物水凝胶的表面的信号猝灭接近度内。在一个示例中，可裂解的连接分子的长度在约0.25nm至约8nm的范围内。在另一个示例中，可裂解的连接分子的长度在约0.5nm至约4nm的范围内。
在其中暗猝灭剂44用作安全特征物的其它示例中，可裂解的连接分子的长度被选择，使得暗猝灭剂44在距附接到聚合物水凝胶42的引物的3’端部或距附接到聚合物水凝胶42的另一捕获物质为预定距离的信号猝灭接近度内。该预定距离部分地取决于感兴趣的分子的长度，因为暗猝灭剂44在掺入期间抑制感兴趣的分子的发射。在一些情况下，该距离还可取决于聚合物水凝胶42所位于的凹入部的深度。在其中待测序的文库片段包含50个核苷酸(碱基对)至550个核苷酸(碱基对)的示例中，可裂解的连接分子可具有约20nm至约500nm范围内的长度。
在其它示例中，聚合物水凝胶42具有掺入其主链中的暗猝灭剂44。在该示例中，结构(I)(或其任何变体)将掺入暗猝灭剂44作为附加的单体单元。在这些情况下，本文所公开的暗猝灭剂44的发射猝灭部分可用可聚合基团(诸如丙烯酰胺或丙烯酸酯)改性。作为示例，本文所述的示例中的任何亚磷酰胺基团可被丙烯酰胺基团替换，该丙烯酰胺基团可与本文所述的其它单体共聚合。含有单体单元的暗猝灭剂44的一个具体示例是：/>
在这些示例中的一些示例中，暗猝灭剂44相对于聚合物水凝胶42中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
暗猝灭剂44掺入聚合物水凝胶42主链中将暗猝灭剂44置于聚合物水凝胶表面处，并且因此在水凝胶表面的信号猝灭接近度内，在掺入或以其它方式多价螯合的感兴趣的分子的光学检测期间，非特异性结合的感兴趣的分子可位于该水凝胶表面的信号猝灭接近度内。
在其它示例中，暗猝灭剂44通过连接分子附接到聚合物水凝胶42。在这些示例中，能够共价附接的连接分子可以是可裂解的(其示例在本文中描述为带有可裂解的连接分子)或不可裂解的。
不可裂解的连接分子的示例以图2的附图标号24示出。在该示例中，不可裂解的连接分子24包含在一个端部处附接至聚合物水凝胶42的官能团的官能团，和在另一端部处附接至暗猝灭剂44的官能团的官能团。不可裂解的连接分子24不包含裂解位点22。
在一些示例中，连接分子为非寡核苷酸接头，并且连接分子相对于聚合物水凝胶42中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。约0.5％至100％的附接的连接分子可具有附接至其的暗猝灭剂44。非寡核苷酸接头的示例可包含式—((CH2)2O)n—的间隔基团(其中n为2与50之间的整数)、碳链、聚醚、肽接头、聚酰胺接头、双环[6.1.0]壬炔等等。作为一个示例，本文所公开的暗猝灭剂44的发射猝灭部分可用双环[6.1.0]壬炔改性，其可共价附接到聚合物水凝胶42的叠氮化物。双环[6.1.0]壬炔改性的暗猝灭剂44的一个具体示例为：
在这些示例中的其它示例，连接分子是寡核苷酸接头，聚合物水凝胶42包含多个官能团，该官能团附接到寡核苷酸接头，并且寡核苷酸接头以足以占据该多个官能团的约0.5％至约50％的量存在。在一个示例中，可以附接寡核苷酸接头的聚合物水凝胶42的官能团可以是叠氮化物或胺或本文针对结构(I)所述的RA基团中的任一基团。合适的寡核苷酸接头的示例具有10个核苷酸或更少。在其中引物将附接到聚合物水凝胶42的示例中，应当理解寡核苷酸接头与引物或附接到引物的核酸接头不具有相同的序列。核酸接头的一个示例是聚T间隔区，然而也可以使用其它核苷酸。在一个示例中，间隔区是6T至10T间隔区。
连接分子的长度被选择，使得暗猝灭剂44在聚合物水凝胶42的表面的信号猝灭接近度内，在掺入的或以其它方式多价螯合的感兴趣的分子的光学检测期间，非特异性结合的感兴趣的分子可以位于该聚合物水凝胶的表面的信号猝灭接近度内。在一个示例中，连接分子的长度在约0.25nm至约8nm的范围内。在另一个示例中，连接分子的长度在约0.5nm至约4nm的范围内。
在本文所述的一些示例中，暗猝灭剂44通过发夹寡核苷酸(即，HP寡聚物)或DNA折纸附接到聚合物水凝胶42。发夹寡核苷酸或DNA折纸的一个端部具有附接到聚合物水凝胶42的官能团，并且发夹寡核苷酸或DNA折纸的另一端部具有附接到暗猝灭剂44的官能团。这些附接机制中的每一附接机制可用于SNR降低或作为安全特征物。
当用于SNR降低时，发夹寡核苷酸的重叠区域被选择为短的，使得当链被完全延伸时(例如，在测序或其它检测操作开始时)，发夹寡核苷酸的端部处的暗猝灭剂44在聚合物水凝胶42的表面的信号猝灭接近度内。当用作安全特征物时，发夹寡核苷酸的重叠区域被选择为长的，使得当链被完全延伸时(例如，在测序或其它检测操作开始时)，发夹寡核苷酸的端部处的暗猝灭剂44在其被掺入新生链或以其它方式被捕获时，在感兴趣的分子的信号猝灭接近度内。
DNA折纸结构可商购获得，长度在约10nm至约100nm的范围内。当用于降低SNR时，DNA折纸结构的长度被选择，使得暗猝灭剂44在聚合物水凝胶42的表面的信号猝灭接近度内。当用作安全特征物时，DNA折纸结构的长度被选择，使得在DNA折纸结构的端部处的暗猝灭剂44在其掺入新生链中或以其它方式被捕获时在感兴趣的分子的信号猝灭接近度内。
暗猝灭剂44的任何示例可被选择以在约400nm到约670nm范围内的一个或多个波长处表现出吸收。
用于聚合物水凝胶42的水凝胶材料可使用任何合适的共聚过程(诸如硝基氧介导的聚合(NMP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合、原子转移自由基聚合(ATRP)等)形成。当暗猝灭剂44被掺入聚合物水凝胶主链中时，含有暗猝灭剂44的单体可用于聚合过程中以形成共聚物。当暗猝灭剂44经由接头或结合对附接到聚合物水凝胶42时，暗猝灭剂44可以聚合后接枝到聚合物水凝胶42。
流通池
其中可使用聚合物水凝胶42和暗猝灭剂44的一个应用是作为流通池表面化学物质的一部分。
本文所述的流通池的一个示例通常包括具有表面和附接到基底表面的至少一部分的聚合物水凝胶42的基底和附接到聚合物水凝胶42的至少一个引物组，聚合物水凝胶42包含暗猝灭剂44。
流通池10的一个示例在图3A中以顶视图示出。流通池10可包括粘结在一起的两个图案化结构，或者粘结到盖(盖未示出)的一个图案化结构。流动通道12位于两个图案化结构之间或者在一个图案化结构与盖之间。图3A所示的示例性流通池10包括八个流动通道12。虽然图3A中示出了八个流动通道12，但是应当理解，流通池10中可包括任何数量的流动通道12(例如，单个流动通道12、四个流动通道12，等等)。每个流动通道12可以与流动通道12彼此隔离，使得引入流动通道12中的流体不会流到相邻的流动通道12中。引入流动通道12中的流体的一些示例可以引入反应组分(例如，DNA样品、聚合酶、测序引物、核苷酸等)、洗涤溶液、解封闭剂等。
每个流动通道12与入口和出口(未示出)流体连通。每个流动通道12的入口和出口可以定位在流通池10的相对端部处。相应流动通道12的入口和出口可以另选地沿流动通道12的长度和宽度定位在能够实现所需流体流动的任何位置。
入口允许将流体引入到流动通道12中，并且出口允许从流动通道12中引出流体。入口和出口中的每一者与流体控制系统(包括例如，储器、泵、阀、废物容器等)流体连接，该流体控制系统控制流体引入和排出。
流动通道12至少部分地由图案化结构限定。图案化结构可以包括基底(诸如单层基座载体36(如图3B所示))，或者包括基座载体36和在基座载体36上的至少一个其它层34的多层结构33(如图3C和图3D所示)。
合适的单层基座载体36的示例包括环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的/>)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(Ta2O5)或其它钽氧化物(TaOx)、氧化铪(HfO2)、碳、金属、无机玻璃等。
多层结构33的示例包括基座载体36和在基座载体上的至少一个其它层34。多层结构33的一些示例包含玻璃或硅作为基座载体36，该基座载体在表面处带有氧化钽(例如，五氧化二钽或另一种氧化钽(TaOx))或另一种陶瓷氧化物的涂层34。多层结构33的其它示例包括基座载体36(例如，玻璃、硅、五氧化二钽，或任何其它基座载体材料)和作为另一层34的图案化树脂。应当理解，可以选择性地沉积或者沉积并图案化以形成凹入部40和空隙区域52(参见图3C)的任何材料可以用作图案化树脂。
作为图案化树脂的一个示例，可以经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷将无机氧化物选择性地施加到基座载体36。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta2O5)、氧化铝(例如AI2O3)、氧化硅(例如SiO2)、氧化铪(例如HfO2)等。
作为图案化树脂的另一个示例，可将聚合物树脂施加到基座载体36，然后进行图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷树脂的树脂、不基于多面体低聚倍半硅氧烷的环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的)以及它们的组合。
如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”(作为从Hybrid Plastics可商购获得)是指作为二氧化硅(SiO2)和有机硅(R2SiO)之间的杂交中间体(例如，RSiO1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是如Kehagias等人在MicroelectronicEngineering第86卷(2009年)第776-778页中所述的，该文献以引用方式全文并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RsiO3/2]n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。POSS的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。
在示例中，单个基座载体36(无论是单独使用还是作为多层结构33的一部分使用)可以是直径范围为约2mm至约300mm(例如，约200mm至约300mm)的圆形片材、面板、晶片、管芯等，或者可以是其最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材、面板、晶片、管芯等。例如，裸片的宽度范围可为约0.1mm至约10mm。虽然已经提供了示例性尺寸，但是应当理解，可使用具有任何合适尺寸的单个基座载体。
在一个示例中，流动通道12具有大致矩形的构型(例如，带弯曲端部，如图3A所示)。流动通道12的长度和宽度可被选择，使得流通池10的基座载体36或多层结构33的一部分将流动通道12包围，并且可用于附接到盖(未示出)或另一个图案化结构。
当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道12的壁的单独材料(未示出)时，流动通道12的深度可以小到单层厚。对于其它示例，流动通道12的深度可为约1pm、约10pm、约50pm、约100pm或更大。在一个示例中，深度可在约10pm至约100pm的范围内。在另一个示例中，深度可在约10pm至约30pm的范围内。在又一个示例中，深度为约5pm或更小。应当理解的是，流动通道12的深度可大于、小于上文指定的值，或者介于这些值之间。
图3B、图3C和图3D示出流动通道12内的架构的示例。
图3B中所示的架构是图案化结构的一个示例。在该示例中，将聚合物水凝胶42(以及在一些情况下，如参考图4A至图4D进一步讨论的42A、42B)作为多个垫48施加至基底表面，其中该多个垫48中的每个垫通过空隙区域52与该多个垫48中的彼此隔离。垫48定位在限定于单层基座载体36中的泳道50内。虽然图3B中所示的基底为单层基座载体36，但是应理解，可使用多层结构33(其中垫48将形成于限定于另一层34中的泳道50中)。
可使用聚合物水凝胶42(包含暗猝灭剂44)的任何示例，并且可经由本文所述的技术形成这些聚合物水凝胶。在图3B中所示的示例中，沉积聚合物水凝胶42以形成隔离的垫48。可以使用掩蔽沉积技术来选择性地施加聚合物水凝胶42。在产生聚合物水凝胶垫48之前，可以选择性地活化单层基座载体36的表面，然后可以选择性地向其施加混合物(包括聚合物水凝胶42和暗猝灭剂44)。在一个示例中，可使用可利用或可不利用掩模的选择性沉积工艺将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在单层基座载体36的表面上。在另一个示例中，可选择性地将单层基座载体36暴露于等离子体灰化，以产生可以附着到聚合物水凝胶42的表面活化剂(例如，-OH基团)。然后可使用任何合适的沉积技术(诸如喷涂、旋涂、泡涂、浸涂等)涂覆聚合物水凝胶42，其中水凝胶42仅附接到活化的部分。
图3C中所示的架构是图案化结构的另一个示例。在这些示例中，流通池10包括限定在基底表面中的多个凹入部40，该多个凹入部通过空隙区域52彼此隔离。该多个凹入部40中的每个凹入部具有施加于其中的聚合物水凝胶42。该图案化结构的基底为带有限定在层34中的凹入部40的多层结构33。虽然图3C中所示的基底为多层结构33，但是应当理解，可以使用单层基座载体36(其中凹入部40将形成在限定于单层基座载体36中的泳道50中)。
可使用任何合适的图案化技术(诸如光刻、纳米压印光刻(NIL)、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等)来形成凹入部40。
凹入部40提供用于聚合物水凝胶42的指定区域。可使用聚合物水凝胶42(包含暗猝灭剂44)的任何示例，并且可经由本文所述的技术形成这些聚合物水凝胶。
为了将聚合物水凝胶42引入凹入部40中，可产生聚合物水凝胶42(其包含暗猝灭剂44)的混合物，并且然后将其施加到多层结构33。在一个示例中，聚合物水凝胶42可存在于与水的或与乙醇和水的混合物中。然后可使用旋涂或者浸渍或浸涂或者正压或负压下材料流或者另一种合适的技术将混合物施加到基底表面。这些类型的技术将聚合物水凝胶42毯覆式地沉积在凹入部40中和在空隙区域52上。可使用其它选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将聚合物水凝胶42特定地沉积在凹入部40中而不是沉积在空隙区域52上。
在一些示例中，可活化层34的表面(包括凹入部40)，并且然后可向其施加混合物(包括聚合物水凝胶42)。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其它沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在层34的表面上。在另一个示例中，可将层34暴露于等离子体灰化，以产生可以附着到聚合物水凝胶42的表面活化剂(例如，-OH基团)。
根据聚合物水凝胶42的化学物质，可将所施加的混合物暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。
然后可执行抛光，以便从空隙区域52中移除聚合物水凝胶42，同时使在凹入部40中的表面上的聚合物水凝胶42至少基本上完整。该抛光过程可以用化学浆料(包含例如研磨剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该化学浆料可以从空隙区域52去除聚合物水凝胶42，而不会对这些区域52处的下面的基底造成有害影响。另选地，可利用不包括磨料颗粒的溶液执行抛光。
化学浆料可用于化学机械抛光系统(包括抛光头/抛光垫或其它抛光工具)中以抛光空隙区域52的表面。抛光头/抛光垫或其它抛光工具能够对可能存在于空隙区域52上方的聚合物水凝胶42进行抛光，同时使凹入部40中的聚合物水凝胶42至少基本上完整。作为一个示例，抛光头可为Strasbaugh ViPRR II抛光头。
清洁和干燥过程可在抛光之后进行。清洁过程可利用水浴和超声处理。水浴可维持在约22℃至约30℃范围内的相对较低的温度。干燥过程可包括旋转干燥，或通过另一种合适技术进行的干燥。
可以设想该多个垫48或凹入部40和空隙区域52的许多不同的布局，包括规则图案、重复图案和不规则图案。在一个示例中，该多个垫48和/或凹入部40和空隙区域52被设置以形成六边形网格，用于紧密填充和提高密度。其它布局可包括例如矩形布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以是呈行和列的x-y格式。在一些其它示例中，布局或图案可为该多个垫48或凹入部40和空隙区域52的重复布置。在其它示例中，布局或图案可为该多个垫48或凹入部40和空隙区域52的随机布置。
布局或图案可以关于限定区域中的该多个垫48或凹入部40的密度(数量)来表征。例如，该多个垫48或凹入部40可以约2百万个/mm2的密度存在。可将密度调谐到不同的密度，包括例如约100个/mm2、约1,000个/mm2、约100,000个/mm2、约1百万个/mm2、约2百万个/mm2、约5百万个/mm2、约1千万个/mm2、约5千万个/mm2或更大或更小的密度。还应当理解，该密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间，或者可以使用其它密度(在给定范围之外)。作为示例，高密度阵列可以被表征为分离小于约100nm的该多个垫48和/或凹入部40，中密度阵列可以被表征为具有分离约400nm至约1μm的该多个垫48和/或凹入部40，并且低密度阵列可以被表征为具有分离大于约1μm的该多个垫48和/或凹入部40。
该多个垫48和/或凹入部40的布局或图案还可以或另选地按以下方面来表征：平均节距，或者从一个聚合物水凝胶垫48和/或凹入部40的中心到相邻的聚合物水凝胶垫48和/或凹入部40的中心的间距(中心到中心间距)，或者从该多个垫48和/或凹入部40中一者的右侧边缘到相邻的垫48和/或凹入部40的左侧边缘的间距(边缘到边缘间距)。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.15μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。特定图案的平均节距可介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在一个示例中，凹入部40具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。
每个聚合物水凝胶垫48的大小可以通过其顶表面面积、高度和/或直径(当垫48为圆形时)和/或长度和宽度来表征。在一个示例中，顶表面面积可以在约1x10-3μm2至约100μm2的范围内，例如，为约1x10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、至少约10μm2或更大或更小。又如，高度可以在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。再如，直径或长度和宽度中的每一者可以在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。
每个凹入部40的大小可通过其体积、开口面积、深度和/或直径(当凹入部40为圆形时)和/或长度和宽度来表征。例如，体积可以在约1x10-3μm3至约100μm3的范围内，例如，为约1x10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3或更大或更小。又如，开口面积可以在约1x10-3μm2至约100μm2的范围内，例如，为约1x10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、至少约10μm2或更大或更小。又如，深度可以在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。又如，深度可以在约0.1pm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。再如，直径或长度和宽度中的每一者可以在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。
图3B和图3C中的架构可包括限定空隙状区域的边缘区域14，该间隙状区域延伸流动通道12的长度并且将一个流动通道12与相邻的流动通道12分离。边缘区域14提供其中两个非图案化结构可以彼此附接或者其中一个非图案化结构可以附接到盖(未示出)的粘结区域。
图3B和图3C中的架构包括引物组，该引物组包括两个引物47、47’。引物47、47’附接到聚合物水凝胶42。
在该示例中，引物47、47’是用于顺序配对端部测序的两种不同引物。作为示例，引物组47、47’可包括P5引物和P7引物、P15引物和P7引物、或本文所述的PA引物、PB引物、PC引物和PD引物的任何组合。例如，第二引物组47、47’可包括任何两种PA、PB、PC和PD引物，或者一种PA引物和一种PB、PC或引物PD的任何组合，或者一种PB引物和一种PC或PD引物的任何组合，或者一种PC引物和一种PD引物的任何组合。
P5引物和P7引物的示例用在由Illumina Inc.销售的商用流通池的表面上，用于例如在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、ISEQTM、GENOME ANALYZERTM和其它仪器平台上进行测序。P5引物是：
P5:5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(SEQ.ID.NO.1)
P7引物可以是以下中的任一种：
P7#1:5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGAnAT(SEQ.ID.NO.2)
P7#2:5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACnAGAT(SEQ.ID.NO.3)
其中“n”是每个序列中的8-氧代鸟嘌呤。
P15引物是：
P15:5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGAGAnCTACAC(SEQ.ID.NO.4)
其中“n”是烯丙基-T。
上述其他引物(PA-PD)包括：
PA 5’→3’
GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG(SEQ.ID.NO.5)
PB 5’→3’
CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT(SEQ.ID.NO.6)
PC 5’→3’
ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT(SEQ.ID.NO.7)
PD 5’→3’
GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC(SEQ.ID.NO.8)
虽然PA-PD的示例性序列中未示出，但是应当理解，这些引物中的任一者可在链中的任何点处包括裂解位点，诸如尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T(或另一烯丙基-核苷酸)等。
本文所公开的这些引物中的每一者还可在引物序列的5'端处包含polyT序列。在一些示例中，polyT区包含2个T碱基至20个T碱基。作为具体示例，polyT区可包含3、4、5、6、7或10个T碱基。
每个引物的5’端部还可包含接头(例如，参考图4B和图4D描述的72、72’)。可使用包含末端炔烃基团或可附接到聚合物水凝胶42的表面官能团的另一个合适末端官能团的任何接头72、72’。在一个示例中，引物用己炔基终止。
在一些示例中，引物47、47’可以预接枝到聚合物水凝胶42。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。在其它示例中，引物47、47’未预接枝到聚合物水凝胶42。在这些示例中，引物47、47’可在将到聚合物水凝胶42施加到凹入部40之后接枝。
当在施加聚合物水凝胶42之后进行接枝时，可以使用任何合适的接枝技术来实现接枝。作为示例，接枝可以通过以下方式来实现：流通式沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配，或通过另一种合适的方法。这些示例性技术中的每一者可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包含引物47、47’，水，缓冲液和催化剂。利用任一种接枝方法，引物47、47’附接到聚合物水凝胶42的反应性基团，并且对空隙区域52不具有亲和力。
图3D中所示的架构是非图案化结构。虽然图3D中所示的基底是多层结构33(包括基座载体36和另一层34)，但是应当理解，非图案化结构的基底可以是单层基座载体36或多层结构33。在该示例中，泳道50被限定在单层基座载体36的表面中或由边缘区域14包围的多层结构33的表面中。可使用任何合适的图案化技术(诸如光刻、纳米压印光刻(NIL)、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等)来形成泳道50。
泳道50提供用于聚合物水凝胶42的指定区域。边缘区域14提供其中两个非图案化结构可以彼此附接或者其中一个非图案化结构可以附接到盖的粘结区域。因此，在该示例中，流通池的表面是非图案化的，并且聚合物水凝胶42定位在非图案化表面的泳道50内。
聚合物水凝胶42与下面的单层基座载体36或多层结构33的附接可以通过共价键来进行。在一些情况下，单层基座载体36或多层结构33可以首先活化，例如，通过硅烷化或等离子体灰化来活化。共价连接有助于在流通池10的整个寿命中在各种用途期间将引物47、47’维持在期望的区域中。
应当理解，在这些示例中，聚合物水凝胶42包含暗猝灭剂44。聚合物水凝胶42的任何示例均可用于非图案化结构中。如参考图3C所述，可将聚合物水凝胶42施加到泳道50。如果使用沉积和抛光技术，则抛光将从边缘区域14移除聚合物水凝胶42。
在这些示例中，聚合物水凝胶42包含附接到其的引物47、47’。在一些示例中，引物47、47’可以预接枝到聚合物水凝胶42。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。在其它示例中，引物47、47’未预接枝到聚合物水凝胶42。在这些示例中，引物47、47’可在将到聚合物水凝胶42施加到泳道50之后接枝。可使用本文所述的任何合适的技术进行接枝。
在图3B至图3D中所示的任何架构中，聚合物水凝胶42可被配置为附接两个不同的引物组，这些引物组的示例参考图4A至图4D示出和描述。为了附接两个不同的引物组，可将聚合物水凝胶42分成两个不同的区域42A、42B，如图4A至图4D中所示。在一个示例中，聚合物水凝胶42在整个区域42A、42B中是化学上相同的，并且可以使用合适的技术将相应的引物组固定到相应的区域42A、42B。合适的技术的示例可包括使用光致抗蚀剂来对一个区域42A进行图案化且接着对另一区域42B进行图案化、其它掩蔽技术等。在另一个示例中，聚合物水凝胶42的区域42A、42B是化学上不同的(例如，包括用于相应的引物组附接的不同官能团)，并且本文所公开的任何技术可用于将相应的引物组固定在相应的聚合物水凝胶区域42A、42B。在本文所公开的其它示例中，聚合物水凝胶42的相应样品可具有预接枝到其的相应的引物组，并且因此聚合物水凝胶42的区域42A、42B的固定化学性质可相同或不同。
参考图4A至图4D示出和描述的该两个不同引物组30A、32A或30B、32B或30C、32C或30D、32D中的每一者都是相关的，其中一组包括不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物，并且另一组包括可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物。这些引物组30A、32A或30B、32B或30C、32C或30D、32D允许单个模板链(即文库片段)被扩增并跨两个引物组30A、32A或30B、32B或30C、32C或30D、32D成簇，并且由于在组30A、32A或30B、32B或30C、32C或30D、32D的相对引物上存在的裂解基团，还使得能够在相邻的聚合物水凝胶区域42A、42B上产生正向链和反向链。这些引物组30A、32A或30B、32B或30C、32C或30D、32D现在将参考图4A、图4B、图4C和图4D讨论。
图4A至图4D示出克附接到聚合物水凝胶42的引物组30A、32A或30B、32B或30C、32C或30D、32D的不同构型。
第一引物组30A、30B、30C和30D中的每一者包括不可裂解的第一引物60或60’和可裂解的第二引物62或62’；第二引物组32A、32B、32C和32D中的每一者包括可裂解的第一引物64或64’和不可裂解的第二引物66或66’。
不可裂解的第一引物60或60’和可裂解的第二引物62或62’是寡核苷酸对，例如，其中不可裂解的第一引物60或60’是正向扩增引物，而可裂解的第二引物62或62’是反向扩增引物，或者其中可裂解的第二引物62或62’是正向扩增引物，而不可裂解的第一引物60或60’是反向扩增引物。在第一引物组30A、30B、30C和30D的每个示例中，可裂解的第二引物62或62’包括裂解位点70，而不可裂解的第一引物60或60’不包括裂解位点70。
可裂解的第一引物64或64’和不可裂解的第二引物66或66’也是寡核苷酸对，例如，其中可裂解的第一引物64或64’是正向扩增引物，而不可裂解的第二引物66或66’是反向扩增引物，或者其中不可裂解的第二引物66或66’是正向扩增引物，而可裂解的第一引物64或64’是反向扩增引物。在第二引物组32A、32B、32C和32D的每个示例中，可裂解的第一引物64或64’包括裂解位点70’，而不可裂解的第二引物66或66’不包括裂解位点70’。
应当理解，第一引物组30A、30B、30C和30D的不可裂解的第一引物60或60’和第二引物组32A、32B、32C和32D的可裂解的第一引物64或64’具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是正向扩增引物)，不同的是可裂解的第一引物64或64’包括整合到核苷酸序列中或整合到与核苷酸序列附接的接头72’中的裂解位点70’。类似地，第一引物组30A、30B、30C和30D的可裂解的第二引物62或62’和第二引物组32A、32B、32C和32D的不可裂解的第二引物66或66’具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是反向扩增引物)，不同的是可裂解的第二引物62或62’包括整合到核苷酸序列中或整合到与核苷酸序列附接的接头72中的裂解位点70。
应当理解，当第一引物60和64或60’和64’是正向扩增引物时，第二引物62和66或62’和66’是反向引物，反之亦然。
不可裂解的引物60、66或60'、66'可以是具有用于捕获和/或扩增目的的通用序列的任何引物，诸如P5和P7引物或者PA、PD、PC、PD引物的任何组合(例如，PA和PB、或PA和PD，等等)。在一些示例中，P5引物和P7引物是不可裂解的引物60、66或60’、66’，因为它们不包括裂解位点70、70’(例如，“U”和“n”分别从SEQ.ID.NOS.1和2中所示的序列移除)。应当理解，任何合适的通用序列均可以用作不可裂解的引物60、66或60’、66’。
可裂解的引物62、64或62’、64’的示例包括P5和P7引物或其它通用序列引物(例如，PA、PB、PC、PD引物)，其中相应的裂解位点70、70’掺入相应的核酸序列中(例如，图4A和图4C)，或掺入将可裂解的引物62、64或62’、64’附接到相应的聚合物水凝胶区域42A、42B的接头72’、72中(图4B和图4D)。合适的裂解位点70、70’的示例包括酶促可裂解的核碱基或化学可裂解的核碱基、经修饰的核碱基，或者接头(例如，核碱基之间的接头)，如本文所述。
每个引物组30A和32A或30B和32B或30C和32C或30D和32D附接到聚合物水凝胶42的相应的区域42A、42B。如本文所述，聚合物水凝胶42可包括可与相应的引物60、62或60’、62’或64、66或64’、66’选择性地反应的不同区域42A、42B内的不同官能团，或者可包括相同的官能团并且相应的引物60、62或60’、62’或64、66或64’、66’可经由合适的方法顺序附接。
虽然在图4A至图4D中未示出，但是应当理解，引物组30A、30B、30C、30D或32A、32B、32C或32D中的一者或两者还可包括用于捕获文库模板接种分子的PX引物。作为一个示例，PX可包括在引物组30A、30B、30C、30D中，但不包括在引物组32A、32B、32C或32D中。作为另一个示例，PX可包括在引物组30A、30B、30C、30D中，并且包括在引物组32A、32B、32C或32D中。当使用泳道50时，可能期望在区域42A、42B的界面附近沿着泳道50的长度将PX引物间隔开。PX基序的密度应为相对低的(例如，1个PX引物在1个凹入部40中)，以便使每个垫48、凹入部40内或沿着泳道50内的聚合物水凝胶42的区域42A、42B的长度的多克隆性最小化。
PX捕获引物可以是：
PX 5’→3’
AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG(SEQ.ID.NO.9)
cPX(PX’)5’→3’
CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT(SEQ.ID.NO.10)
图4A至图4D示出附接到聚合物水凝胶42的区域42A、42B的引物组30A、32A、30B、32B、30C、32C和30D、32D的不同构型。更具体地，图4A至图4D示出可以使用的引物60、62或60’、62’和64、66或64’、66’的不同构型。
在图4A所示的示例中，引物组30A和32A的引物60、62和64、66直接附接到区域42A、42B，例如，无需接头72、72’。聚合物水凝胶42的区域42,A具有可将末端基团固定在引物60、62的5’端部处的表面官能团。类似地，聚合物水凝胶42的区域42,B具有可将末端基团固定在引物64、66的5’端部处的表面官能团。区域42,A和引物60、62之间的固定化学物质与区域42,B和引物64、66之间的固定化学物质可以是不同的，使得引物60、62或64、66选择性地附接到聚合物水凝胶42的期望区域42A、42B。另选地，引物60、62或64、66可经由本文所公开的方法中的一些方法进行预接枝或顺序施加。
同样在图4A所示的示例中，可裂解的引物62、64各自的裂解位点70、70’掺入引物的序列中。在该示例中，相同类型的裂解位点70、70’用于相应引物组30A、32A的可裂解的引物62、64中。作为一个示例，裂解位点70、70’是尿嘧啶碱基，并且可裂解的引物62、64是P5U和P7U。尿嘧啶碱基或其它裂解位点也可掺入PA、PB、PC和PD引物中的任一种以产生可裂解的引物62、64。在该示例中，寡核苷酸对60、62的不可裂解的引物60可以是P7，并且寡核苷酸对64、66的不可裂解的引物66可以是P5。因此，在该示例中，第一引物组30A包括P7、P5U，并且第二引物组32A包括P5、P7U。引物组30A、32A具有相反的直链化化学物质，其在扩增、簇产生和直链化之后，允许在一个区域42,B上形成正向模板链，并且在另一个区域42,A上形成反向链。
在图4B所示的示例中，引物组30B和32B的引物60’、62’和64’、66’附接到聚合物水凝胶42的区域42A、42B(例如，通过接头72、72')。区域42A、42B包含相应的官能团，并且相应的接头72、72’的末端能够共价附接到相应的官能团。因此，区域42A可具有可将接头72固定在引物60’、62’的5’端部处的表面官能团。类似地，区域42B可具有可将接头72’固定在引物64’、66’的5’端部处的表面官能团。区域42A和接头72的固定化学物质与区域42B和接头72’的固定化学物质可以是不同的，使得引物60’、62’或64’、66’选择性地附接到聚合物水凝胶42的期望区域42A、42B。另选地，引物60’、62’或64’、66’可经由本文所公开的方法中的一些方法进行预接枝或顺序施加。
合适接头72、72’的示例可以包括核酸接头(例如，10个核苷酸或更少)，或者非核酸接头，诸如聚乙二醇链、烷基基团或碳链、具有邻二醇的脂肪族接头、肽接头，等等。核酸接头的一个示例是聚T间隔区，但是也可以使用其它核苷酸。在一个示例中，间隔区是6T至10T间隔区。以下是核苷酸的一些示例，包括具有末端炔烃基团的非核酸接头(其中B是核碱基并且“寡核苷酸”是引物)：
在图4B所示的示例中，引物60’、64’具有相同的序列(例如，P5)以及相同或不同的接头72、72’。引物60’是不可裂解的，而引物64’包括掺入接头72’中的裂解位点70’。同样在该示例中，引物62’、66’具有相同的序列(例如，P7)以及相同或不同的接头72、72’。引物66’是不可裂解的，而引物62’包括掺入接头72中的裂解位点70。相同类型的裂解位点70、70’用于可裂解的引物62’、64’各自的接头72、72’中。作为一个示例，裂解位点70、70’可以是掺入核酸接头72、72’中的尿嘧啶碱基。引物组30B、32B具有相反的直链化化学物质，其在扩增、簇产生和直链化之后，允许在一个区域42A上形成正向模板链，并且在另一个区域42B上形成反向链。
图4C所示的示例类似于图4A所示的示例，不同的是不同类型的裂解位点70、74用于相应引物组30C、32C的可裂解的引物62、64中。例如，可使用两种不同的酶可裂解位点，可使用两种不同的化学可裂解位点，或者可使用一种酶可裂解位点和一种化学可裂解位点。可以在相应可裂解的引物62、64中使用的不同裂解位点70、74的示例包括下列物质的任何组合：邻二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤。
图4D所示的示例类似于图4B所示的示例，不同的是不同类型的裂解位点70、74用于与相应引物组30D、32D的可裂解的引物62’、64’附接的接头72、72’中。可以在与可裂解的引物62’、64’附接的相应接头72、72’中使用的不同裂解位点70、74的示例包括下列物质的任何组合：邻二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤。
在使用引物47、47’，或引物组30A、32A、30B、32B、30C、32C和30D、32D的任何示例中，引物47、47’或60、62和64、66或60’、62’和64’、66’与聚合物水凝胶42的附接使引物47、47’或60、62和64、66或60’、62’和64’、66’的模板特异性部分自由地与其同源模板退火，而3'羟基自由地用于引物延伸。
在本文所公开的流通池10的示例中的每个示例中，包含暗猝灭剂44的聚合物水凝胶42和至少一个引物组(例如，引物47、47’或引物组30A、32A、30B、32B、30C、32C和30D、32D)构成图案化或非图案化结构的表面化学物质，并且因此构成流通池10的一个表面。因此，在一些示例中，流通池表面化学物质由包含暗猝灭剂44的聚合物水凝胶42和附接到聚合物水凝胶42的至少一个引物组(例如，引物47、47’或引物组30A、32A、30B、32B、30C、32C和30D、32D)组成。本文所公开的聚合物水凝胶42、暗猝灭剂44和该至少一个引物组(例如，引物47、47’或引物组30A、32A、30B、32B、30C、32C和30D、32D)的任何示例可构成表面化学物质。
其它荧光传感器
聚合物水凝胶42和暗猝灭剂44可用作其它类型的荧光传感器中的表面化学物质的一部分。
此种其它类型的荧光传感器的一个示例为PCR传感器。在PCR传感器中，聚合物水凝胶42和暗猝灭剂44构成基底表面的至少一部分，并且用于PCR的引物将附接到其。在这些示例中，PCR引物充当待扩增的DNA模板链的捕获物质。
此种其它类型的荧光传感器的另一个示例为分析物检测传感器。在分析物检测传感器中，聚合物水凝胶42和暗猝灭剂44构成基底表面的至少一部分，并且用于分析物检测传感器中的捕获物质将附接到其。在这些示例中，捕获物质可以是分析物的受体，并且分析物可以是荧光团或具有附接到其的荧光团。分析物(例如，蛋白质)的捕获可能与发射猝灭相关联。
在又一个示例中，暗猝灭剂44附接到聚合物水凝胶42或引物47、47’。聚合物水凝胶42的该示例还具有经由附加的引物或其它拴系件(例如，聚合接头等)附接到其的受体或配体。受体或配体能够捕获靶蛋白。在一些情况下，靶蛋白还可具有附接到其的核酸序列，该核酸序列包括待扩增和测序以用于蛋白质鉴定的鉴定区域(例如，条形码区域)。在其它情况下，可将包括鉴定区域(待扩增和测序的区域)的配体引入流通池并结合到靶蛋白。在这些情况中的任一种情况下，暗猝灭剂44的存在猝灭发射。如此，可以引入移除暗猝灭剂的试剂。试剂可以在扩增鉴定区域之前、作为扩增试剂的一部分、或在进行扩增之后引入。因此，来自捕获在聚合物水凝胶42上的蛋白质的信号转导是信号恢复的形式，因为暗猝灭剂44在测序之前被移除。
用于改善信噪比的方法
本文还公开了一种改善检测荧光的传感器中的信噪比的方法。方法100的示例在图5中示出。方法100的示例包括将聚合物水凝胶42附接到基底的表面的至少一部分，聚合物水凝胶42包含暗猝灭剂44(以附图标号102示出)，并且将至少一种捕获物质附接到聚合物水凝胶42(以附图标号104示出)。
本文公开的任何流通池10和其它荧光传感器可使用方法100来制备。当在传感操作中利用流通池和其它荧光传感器时，信噪比(SNR)由于暗猝灭剂44猝灭非特异性结合的完全官能化的核苷酸的信号而降低。
现在参考图6，示意性地示出利用流通池10的一个示例的合成测序感测操作的一个示例。虽然图6中示出的流通池10包括多层结构33(包括基座载体36和另一层34)，但是应当理解，也可以使用单层基座载体36。在该示例中，示出流通池10的单个凹入部40，其中聚合物水凝胶42被施加在凹入部40内。同样在该示例中，暗猝灭剂44经由本文所述的连接分子的任何示例附接到聚合物水凝胶42，该连接分子共同显示在附图标号88处。另选地，可将暗猝灭剂44掺入聚合物水凝胶42的主链中。引物47、47’还附接到聚合物水凝胶42。
在测序期间，可以使用固定在聚合物水凝胶42上的扩增引物47、47’在凹入部40中形成待测序的模板链90。在模板链形成开始时，可由任何核酸样品(例如，DNA样品或RNA样品)制备文库片段/模板。DNA核酸样品可被片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的DNA片段。RNA核酸样品可用于合成互补DNA(cDNA)，并且cDNA可被片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的cDNA片段。在制备期间，可将接头添加到任何片段的末端。通过减少循环扩增，可在衔接子中引入不同的基序，诸如测序引物结合位点、索引，以及与扩增引物47、47’互补的区域。在一些示例中，来自单个核酸样品的片段具有添加至其的相同接头。最终文库模板包括DNA或cDNA片段和两端的接头。DNA或cDNA片段代表最终文库模板的待测序部分。
可将多个文库模板引入到流通池10中。将多个文库模板与例如固定在聚合物水凝胶42上的两种类型的扩增引物47、47’中的一种杂交。
然后可执行簇生成。在簇产生的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶82通过3’延伸从杂交引物复制文库模板。使初始文库模板变性，保留固定在聚合物水凝胶42上的拷贝。等温桥扩增或一些其它形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物47、47杂交，并且聚合酶82复制所复制的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物47、47’杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在使用引物47、47’的一个示例中，通过特异性碱基裂解移除反义链，留下正向模板链。虽然图6中示出单个模板链90，但成簇导致固定在聚合物水凝胶42上的几个模板链90的形成。成簇的该示例称为桥扩增，并且是可执行的扩增的一个示例。应当理解，可使用其他扩增技术，诸如排除扩增(Examp)工作流程(Illumina Inc.)。
然后可引入与模板链90的序列的互补部分杂交的测序引物92。该测序引物92使模板链90准备好使用掺入混合物进行测序。
掺入混合物可包括多种全功能核苷酸80、聚合酶82和液体载体。掺入混合物的液体载体可以是水和/或离子盐缓冲液，诸如毫摩尔至摩尔浓度的柠檬酸盐溶液、氯化钠、氯化钾、磷酸盐缓冲盐水等，和其它缓冲液，诸如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)。液体载体还可包括旨在用于掺入反应的催化金属，诸如Mg2+、Mn2+、Ca2+等。可使用单一催化金属或催化金属的组合，并且总量可在约0.01mM至约100mM的范围内。
全功能核苷酸80(FFN 80)包括核苷酸、附接到该核苷酸的糖的3’OH封端基团和附接到该核苷酸的碱基的荧光团84。FFN 80的核苷酸可以是本文所述的任何核苷酸。
FFN 80的核苷酸还包括附接到其的3’OH封端基团。3’OH封端基团可连接到核苷酸中糖分子的3’氧原子。3’OH封端基团可以是仅允许在每个测序循环中发生单碱基掺入的可逆终止剂。可逆终止剂会阻止附加的碱基掺入与模板链90互补的新生链94中。这使得能够检测和识别单个掺入的碱基。随后可移除3’OH封端基团，使得能够在每个模板链90处发生附加的测序循环。不同的3’OH封端基团的示例包括3'-ONH2可逆终止剂、3'-O-烯丙基可逆终止剂(即，—CH＝CHCH2)和3'-O-叠氮甲基可逆终止剂(即，—CH2N3)。其它合适的可逆终止剂包括邻硝基苄基醚、烷基邻硝基苄基碳酸酯、酯部分、其它烯丙基部分、缩醛(例如，叔丁氧基-乙氧基)、MOM(—CH2OCH3)部分、2,4-二硝基苯亚磺酰基、四氢呋喃醚、3’磷酸、醚、-F、-H2、-OCH3、-N3、-HCOCH3和2-硝基苯碳酸酯。
FFN 80的核苷酸还包括附接到核苷酸的碱基的荧光团84。荧光团84可以是任何光学可检测部分，包括发光部分、化学发光部分、荧光部分、荧光底物部分、发色部分和/或发色底物部分。合适的光学可检测部分的一些示例包括荧光素标记、罗丹明标记、花菁标记(例如，Cy3、Cy5等)和家族的荧光染料以及其它荧光和荧光底物染料)。
荧光团84可使用任何合适的接头分子附接到核苷酸的碱基。在一个示例中，接头分子是式—((CH2)2O)n—的间隔基团，其中n为介于2与50之间的整数。接头分子包括切割位点(图6中未示出)。当可裂解的连接分子用于附接暗猝灭剂44时，用于可裂解的连接分子和用于将荧光团84附接到FFN 80的接头分子的裂解化学物质是正交的，使得在光学检测之后FFN 80的移除也不移除暗猝灭剂44。
在一个示例中，掺入混合物包括不同的FFN 80的混合物，其包括不同的碱基，例如A、T、G、C(以及U或I)。对于不同的FFN 80，也可能期望使用不同类型的荧光团84。例如，荧光团84可被选择，使得每个荧光团84吸收激发辐射和/或发射与其它荧光团84可区别的波长的荧光。此类可区别的类似物提供了同时监测不同荧光团84在同一反应混合物中存在的能力。在一些示例中，掺入混合物中的四种FFN 80中的一者可不包括荧光团84，而其它三种FFN 80可包括不同的荧光团84。
可使用可接受全功能核苷酸80并且可成功地将全功能核苷酸80的碱基沿着模板链90掺入到新生链中的任何聚合酶82。示例性聚合酶包括来自家族A的那些聚合酶，诸如Bsu聚合酶、Bst聚合酶、Taq聚合酶、T7聚合酶和许多其它聚合酶；来自家族B和B2的聚合酶，诸如Phi29聚合酶和其他高度加工性聚合酶(家族B2)、Pfu聚合酶(家族B)、KOD聚合酶(家族B)、9oN(家族B)和许多其他聚合酶；来自家族C的聚合酶，诸如大肠杆菌DNA Pol III，以及许多其他来自家族D的聚合酶，诸如激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)DNA Pol II和许多其他聚合酶；来自家族X的聚合酶，诸如DNA Polμ、DNA Polβ、DNA Polσ和许多其它聚合酶。
在该示例性方法中，掺入混合物的任何示例例如经由入口被引入到流通池10中。当掺入混合物被引入到流通池10中时，该混合物进入流动通道12，并且接触其中存在模板链90的表面化学物质。
允许掺入混合物在流通池10中孵育，并且FFN 80通过聚合酶82沿着模板链90掺入到新生链94中。如图6所示，在掺入期间，FFN 80中的一者通过相应的聚合酶82掺入到延伸一个测序引物92并与一条模板链90互补的一条新生链94中。以模板链依赖性方式进行掺入，并且因此添加到新生链94中的FFN 80的顺序和类型的检测可用于确定模板链90的序列。在单个测序循环期间，在跨凹入部40(或泳道50的垫48)的模板链90中的至少一些模版链中发生掺入。因此，在跨流通池10的模板链90中的至少一些模板链中，相应的聚合酶82通过掺入混合物中的FFN 80中的一者延伸杂交的测序引物92。
掺入的FFN 80包括由于存在3’OH封端基团而引起的可逆终止特性，一旦已添加FFN 80，就终止新生链94上的进一步的测序引物延伸。
在孵育和掺入期望的时间之后，可以在洗涤循环期间从流通池10中移除包括至少一些未掺入的FFN 80的掺入混合物。洗涤循环可以涉及流通技术，其中洗涤溶液(例如，缓冲液)(例如，通过泵或其他合适的机构)被引导进入、通过、然后离开流动通道12。
即使在洗涤循环之后，一些FFN 80也可能被非特异性地结合，如在附图标号80’处所示。非特异性结合的FFN 80不掺入到新生链94中，而是结合到聚合物水凝胶42的表面或位于聚合物水凝胶42的表面附近的溶液中。
在不进行进一步掺入的情况下，可通过成像事件检测最近掺入的FFN 80。在成像事件期间，照明系统(未示出)可向含有表面化学物质的流通池表面提供激发光。掺入的FFN80的荧光团84响应于激发光而发射光信号。非特异性结合的FFN 80’的荧光团84也响应于激发光而发射光信号。然而，非特异性结合的FFN 80’的信号可以被猝灭，因为暗猝灭剂44被保持在非特异性结合的FFN 80’的荧光团84的信号猝灭接近度内。随着来自非特异性结合的FFN 80’的信号的降低，成像事件的信噪比得到改善。
在进行成像之后，接着可以将裂解混合物引入到流通池10中。在该示例中，裂解混合物能够i)从掺入的FFN 80中移除3’OH封端基团，以及ii)从FFN 80中裂解荧光团84。裂解混合物中3’OH封端基团和合适的解封剂/组分的示例可包括：可通过碱水解移除的酯部分；可用NaI、三甲基氯硅烷和Na2S2O3或用Hg(II)的丙酮/水溶液移除的烯丙基部分；可用膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))裂解的叠氮甲基；可用酸性条件裂解的缩醛，诸如叔丁氧基-乙氧基；可用LiBF4和CH3CN/H2O裂解的MOM(—CH2OCH3)部分；可用亲核试剂诸如苯硫酚和硫代硫酸盐裂解的2,4-二硝基苯亚磺酰基；可用Ag(I)或Hg(II)裂解的四氢呋喃基醚；以及可被磷酸酶(例如多核苷酸激酶)裂解的3'磷酸。裂解混合物中合适的荧光团裂解剂/组分的示例可包括：可裂解邻位二醇的高碘酸钠；可以裂解叠氮甲基键的膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))；可裂解烯丙基的钯和THP；可裂解酯部分的碱基；或任何其它合适的裂解剂。
洗涤可在各种流体递送步骤之间发生。然后可将测序循环重复n次以使测序引物92延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。在这些示例中，可使用配对末端测序，其中对正向链进行测序并将其移除，然后构建反向链并对其进行测序。
同时配对末端测序可与引物组30A、32A或30B、32B或30C、32C或30D、32D一起使用。在同时配对末端测序的情况下，在成簇期间，在聚合物水凝胶42的一个区域42A、42B上产生正向链，并且在聚合物水凝胶42的另一区域42B、42A上产生反向链。掺入同时发生在两个区域42A、42B处被测序的模版链90的相应新生链94处，并且非特异性结合的FFN 80’可存在于两个区域42A、42B处。在这些示例中，非特异性结合的FFN 80’的信号可以被猝灭，因为相应暗猝灭剂44被保持在区域42A、42B中每一者中的非特异性结合的FFN 80’的荧光团84的信号猝灭接近度内。随着来自非特异性结合的FFN 80’的信号的降低，成像事件的信噪比得到改善。
安全方法
本文所公开的聚合物水凝胶42和暗猝灭剂44还可用作检测荧光的传感器中的安全特征物。在该示例性方法中，暗猝灭剂44经由本文所公开的可裂解的连接分子的示例附接到聚合物水凝胶42。可裂解的连接分子的长度使得其可猝灭掺入新生链中的FFN 80的信号，或在捕获物处多价螯合的其它感兴趣的分子的信号，从而防止信号被容易地分辨。在这些示例中，将可裂解的连接分子的合适的裂解剂添加到传感器中，以便在可以进行分析之前移除暗猝灭剂44。合适的裂解剂的示例包括用于裂解二硫化物的TCEP、用于可光裂解部分(诸如PC生物素-PEG3-炔烃)的紫外光、或用于接头(诸如BCN-PEG3-VC-PFP酯)的酶、或用于裂解肽的蛋白酶。此种类型的安全特征物可以防止流通池10和其它传感器被用于没有专门配置为与流通池10和其它传感器一起使用的设备中。
作为安全特征物的一个示例，可裂解的连接分子为生物素-链霉亲和素结合对。在该示例中，DBCO-S-S-PEG3-生物素可附接到聚合物水凝胶42，并且链霉亲和素可附接到暗猝灭剂44。链霉亲和素还非共价地附接到生物素。当流通池10被插入到正在使用的测序系统中时，测序系统确定流通池10是否是用于测序系统的适当流通池10。在一个示例中，流通池10包括可由测序系统识别的条形码。如果测序系统将流通池10识别为正确的，则系统将提示用户(例如，经由用户界面)引入裂解剂。在一个示例中，甲酰胺可用于移除链霉亲和素和附接的暗猝灭剂44。在另一个示例中，可以使用还原剂(例如，TCEP、DTT等)来裂解生物素的二硫键，这还会移除链霉亲和素和附接的暗猝灭剂44。然后可将流通池10暴露于洗涤循环，并且可如本文所述进行测序。如果测序系统将流通池10识别为不正确的，则系统将提示用户(例如，经由用户界面)移除流通池10。如果用户试图进行测序，则暗猝灭剂44将抑制掺入的核苷酸的信号。
作为安全特征物的另一个示例，可裂解的连接分子物可裂解的生物素，诸如DBCO-S-S-PEG3-生物素。在该示例中，暗猝灭剂44附接到生物素。当流通池10被插入到正在使用的测序系统中时，测序系统确定流通池10是否是用于测序系统的适当流通池10。如果测序系统将流通池10识别为正确的，则系统将提示用户(例如，经由用户界面)引入裂解剂。在该示例中，可使用还原剂来裂解生物素接头的二硫键。然后可将流通池10暴露于洗涤循环，并且可如本文所述进行测序。如果测序系统将流通池10识别为不正确的，则系统将提示用户(例如，经由用户界面)移除流通池10。如果用户试图进行测序，则暗猝灭剂将抑制掺入的核苷酸的信号。
作为安全特征物的另一个示例，可裂解的连接分子为用裂解位点修饰的HP寡聚物。在该示例中，暗猝灭剂44附接到HP寡聚物的游离端部，其还附接到聚合物水凝胶42。当流通池10被插入到正在使用的测序系统中时，测序系统确定流通池10是否是用于测序系统的适当流通池10。如果测序系统将流通池10识别为正确的，则系统将提示用户(例如，经由用户界面)引入裂解剂，这取决于裂解位点。然后可将流通池10暴露于洗涤循环，并且可如本文所述进行测序。如果测序系统将流通池10识别为不正确的，则系统将提示用户(例如，经由用户界面)移除流通池10。如果用户试图进行测序，则测序的温度(例如60℃)将使HP寡聚物的双链部分变性，因此延伸HP寡聚物链并将暗猝灭剂44置于待产生的新生链94的信号猝灭接近度内。暗猝灭剂44将抑制掺入的核苷酸(例如FFN 80)的信号。
作为安全特征物的又一示例，可裂解的连接分子为用裂解位点修饰的DNA折纸。在该示例中，暗猝灭剂44附接到DNA折纸的游离端部，其还附接到聚合物水凝胶42。当流通池10被插入到正在使用的测序系统中时，测序系统确定流通池10是否是用于测序系统的适当流通池10。如果测序系统将流通池10识别为正确的，则系统将提示用户(例如，经由用户界面)引入裂解剂，这取决于裂解位点。然后可将流通池10暴露于洗涤循环，并且可如本文所述进行测序。如果测序系统将流通池10识别为不正确的，则系统将提示用户(例如，经由用户界面)移除流通池10。如果用户试图进行测序，则暗猝灭剂将抑制掺入的核苷酸的信号。
在其中进行同时配对末端测序的流通池10的示例中，暗猝灭剂44可经由本文所公开的可裂解连接分子的示例附接到聚合物水凝胶42的不同区域42A、42B。在这些示例中，暗猝灭剂44可用于抑制感兴趣的分子在正向读取或反向读取方向上的信号。如所提及的，将可裂解的连接分子的合适裂解剂(例如，酸性溶液、甲酰胺、还原剂等)添加到传感器中，以便在任一方向上的信号可以被容易地分辨之前移除暗猝灭剂44。
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供这些实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。
非限制性工作实施例
实施例1
在该示例中使用带有八个泳道的多层结构。多层结构包括熔融二氧化硅和玻璃基座载体以及树脂层。在八个泳道中的每一个中，树脂层被图案化有节距为550nm且直径为360nm的凹入部。将聚合物水凝胶，即聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)沉积在泳道中的每一个中，并进行抛光以从空隙区域和边缘区域移除聚合物水凝胶。
这些泳道中的七个用不同的引物接枝，如表1中所概述。利用标准P5引物和P7引物，以及包含暗猝灭剂的经修饰的P5引物和P7引物。
表1
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使用标准碱性或碳酸盐缓冲液接枝条件将适当的引物加载到泳道中，如表1所列出。
然后进行CAL红(CFR)测定以建立流通池的泳道中的每个泳道中的基线引物加载量。在CFR测定期间，将流通池的所有泳道都暴露于缓冲溶液中的荧光标记的(CAL红(CFR)染料)寡核苷酸。这些寡核苷酸与初始接枝的P5、P7或经修饰的P5引物互补。这些荧光标记的互补寡核苷酸结合到表面结合的引物，并且过量的CFR标记的互补寡核苷酸被洗掉。然后在荧光检测器中扫描表面以测量表面上的CFR强度。初始接枝后每个泳道内的强度示于图7A中。泳道1、2和3(包括标准引物)的强度值在所使用的引物浓度的预期范围内。泳道4和5的强度值表明，分别含有BHQ-1或BHQ-2种的经修饰的P5-1和经修饰的P5-2显示出降低的CFR强度(即，抑制发射)。泳道6和7的强度值表明，即使存在经修饰的P5-1或经修饰的P5-2引物，也检测到与标准P7引物杂交的CFR标记的寡核苷酸。
然后将荧光标记的互补寡核苷酸从表面引物变性。将包含USERTM酶的裂解混合物(其为尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)和DNA糖苷酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物)引入到七个泳道的每一个中。使裂解混合物在38℃孵育约30分钟，并且然后用温和的柠檬酸盐缓冲液(pH 7)从泳道中的每一个中冲洗。
然后进行第二CAL红(CFR)测定以确定BHQ-1或BHQ-2种的移除的效果。然后在荧光检测器中扫描表面以测量表面上的CFR强度。暗猝灭剂移除和附加的接枝后每个泳道内的强度也示于图7A中。泳道1、2和3(包括标准引物)的第二强度值(在暗猝灭剂移除和附加的接枝后)也在所使用的引物浓度的预期范围内。泳道4和5的第二强度值(在暗猝灭剂移除和附加的接枝后)表明，分别含有BHQ-1或BHQ-2种的经修饰的P5-1和经修饰的P5-2的移除导致所测量的发射强度的可感知的增加(100％-150％)。泳道6和7的第二强度值(在暗猝灭剂移除和附加的接枝后)类似于这些相应泳道在初始接枝后的强度值，这至少部分是由于以下事实：在暗猝灭剂移除后，对于P7链以及稍短的经修饰的P5-1和经修饰的P5-2，CFR标记的互补寡核苷酸的杂交可以近似相等的效率发生。
计算CAL红(CFR)测定之间的发射变化，并且结果示于图7B中。在暗猝灭剂移除后，泳道4和5中的发射的变化％是清楚的。
总之，该示例中的结果说明了经修饰的P5-1和经修饰的P5-2有助于抑制流通池表面内的荧光发射的能力。结果还表明，暗淬灭剂从经修饰的P5链的裂解可能有助于发射强度的增加。
实施例2
在该示例中使用带有八个泳道的多层结构。多层结构包括熔融二氧化硅和玻璃基座载体以及树脂层。在八个泳道中的每一个中，树脂层被图案化有节距为700nm且直径为360nm的凹入部。将聚合物水凝胶，即聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)沉积在泳道中的每一个中，并进行抛光以从空隙区域和边缘区域移除聚合物水凝胶。
这些泳道中的八个用不同的引物接枝，如表2中所概述。利用标准P5引物和P7引物，以及包含暗猝灭剂的一些经修饰的P5引物和P7引物，及包含ALEXA647的其它经修饰的P7引物。使用经修饰的P7引物来评估是否存在针对猝灭的任何染料特异性，以及该分子的发射位置是否将导致增强的猝灭。/>
表2
使用标准碱性或碳酸盐缓冲液接枝条件将适当的引物加载到泳道中，如表2所列出。
然后进行CAL红(CFR)测定以建立流通池的泳道中的每个泳道中的基线引物加载量。在CFR测定期间，将流通池的所有泳道都暴露于缓冲溶液中的荧光标记的(CAL红(CFR)染料)寡核苷酸。这些寡核苷酸与初始接枝的P5引物、P7引物、经修饰的P5引物或经修饰的P7引物互补。这些荧光标记的互补寡核苷酸结合到表面结合的引物，并且过量的CFR标记的互补寡核苷酸被洗掉。然后在荧光检测器中扫描表面以测量表面上的CFR强度。初始接枝后每个泳道内的强度示于图8A中。泳道1(包括标准引物)的强度值在所使用的引物浓度的预期范围内。泳道2至8的强度值表明经修饰的P5-1、经修饰的P5-2、经修饰的P5-3和经修饰的P5-4显示出降低的CFR强度(即，抑制发射)。
然后将荧光标记的互补寡核苷酸从表面引物变性。将包含USERTM酶的裂解混合物(其为尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)和DNA糖苷酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物)引入到八个泳道的每一个中。使裂解混合物在38℃孵育约30分钟，并且然后用温和的柠檬酸盐缓冲液(pH 7)从泳道中的每一个中冲洗。
然后进行第二CAL红(CFR)测定以确定BHQ-1或BHQ-2种的移除的效果。然后在荧光检测器中扫描表面以测量表面上的CFR强度。暗猝灭剂移除和附加的接枝后每个泳道内的强度也示于图8A中。泳道1(包括标准引物)的第二强度值(在暗猝灭剂移除和附加的接枝后)可能由于降低的P5杂交效率而低于预期的。泳道3和5的第二强度值(在裂解后)表明，分别含有BHQ-1或BHQ-2种的经修饰的P5-1和经修饰的P5-2的移除导致所测量的发射强度的可感知的增加(20％-30％)。泳道2、4和6(带有经修饰的P7)的第二强度值(在暗猝灭剂移除和附加的接枝后)略低于这些相应泳道在初始接枝后的强度值。据信荧光团标记的P7可能已经降低了裂解混合物的效率或来自CAL/>红荧光团的发射效率。泳道7和8(其中BHQ-1或BHQ-2种未裂解)的第二强度值(在暗猝灭剂移除和附加接枝后)略低于初始强度。
计算CAL红(CFR)测定之间的发射变化，并且结果示于图8B中。在暗猝灭剂移除后，泳道3和5中的发射的变化是清楚的。
总之，该示例中的结果说明了经修饰的P5-1、经修饰的P5-2、经修饰的P5-3和经修饰的P5-4有助于抑制流通池表面内的荧光发射的能力。结果还表明，暗淬灭剂从经修饰的P5链中的一些链的裂解可能有助于发射强度的增加。
附加说明
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“一种示例”等意指结合该示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。
下面参考以下带编号的条款阐述本发明的各方面：
1.一种流通池，所述流通池包括：
具有表面的基底；
聚合物水凝胶，其附接到基底表面的至少一部分，该聚合物水凝胶包含暗猝灭剂；以及
附接到聚合物水凝胶的至少一个引物组。
2.根据条款1所述的流通池，其中聚合物水凝胶作为多个垫施加到基底表面，其中该多个垫中的每一个通过空隙区域与该多个垫彼此隔离。
3.根据条款1或条款2所述的流通池，其中：
基底包括限定在基底表面中的通过空隙区域彼此隔离的多个凹入部；以及
该多个凹入部中的每一个具有施加于其中的聚合物水凝胶。
4.根据任一前述条款所述的流通池，其中：
基底包括限定在基底表面中的泳道；以及
泳道具有施加于其中的聚合物水凝胶。
5.根据任何前述条款所述的流通池，其中聚合物水凝胶包括丙烯酰胺共聚物。
6.根据任何前述条款所述的流通池，其中暗猝灭剂选自由以下项组成的组：二甲基氨基偶氮苯磺酸、4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺、4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺以及它们的组合。
7.根据任一前述条款所述的流通池，其中：
基底为多层基底，该多层基底包括：
基座载体；以及
树脂层，该树脂层定位在基座载体上；以及
聚合物水凝胶附接到树脂层的至少一部分。
8.根据任何前述条款所述的流通池，其中所述聚合物水凝胶具有通过可裂解的连接分子可移除地附接的所述暗猝灭剂。
9.根据条款8所述的流通池，其中可裂解的连接分子包括非共价结合对。
10.根据条款8或9所述的流通池，其中暗猝灭剂相对于聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
11.根据任何前述条款所述的流通池，其中聚合物水凝胶具有掺入到其主链中的暗猝灭剂。
12.根据任何前述条款所述的流通池，其中暗猝灭剂相对于聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
13.根据任何前述条款所述的流通池，其中暗猝灭剂通过连接分子共价附接到聚合物水凝胶。
14.根据条款13所述的流通池，其中：
连接分子为非寡核苷酸接头；以及
连接分子相对于聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
15.根据条款13所述的流通池，其中：
连接分子是寡核苷酸接头；
聚合物水凝胶包含附接到寡核苷酸接头的多个官能团；以及寡核苷酸接头以足以占据该多个官能团的约0.5％至约50％的量存在。
16.根据任何前述条款所述的流通池，其中暗猝灭剂通过发夹寡核苷酸或DNA折纸共价附接到聚合物水凝胶。
17.根据任何前述条款所述的流通池，其中暗猝灭剂在约400nm至约670nm范围内的一个或多个波长处表现出吸收。
18.一种流通池表面化学物质，该流通池表面化学物质由以下组成：
包含暗猝灭剂的聚合物水凝胶；以及
附接到聚合物水凝胶的至少一个引物组。
19.根据条款18所述的流通池表面化学物质，其中聚合物水凝胶为具有以下结构的丙烯酰胺共聚物：
其中：
RA选自由以下项组成的组：叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的炔烃、卤素、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、腈氧化
物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
RB为H或任选取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自由H和任选取代的烷基组成的组；
-(CH2)p-中的每个能够任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；并且
m为在1至100,000范围内的整数。
20.根据条款18或19所述的流通池表面化学物质，其中聚合物水凝胶为直链或支链的共聚物，该共聚物包括具有以下结构的第一丙
烯酰胺单体：
其中R1和R2独立地选自由以下项组成的组：烷基、烷基氨基、烷基酰胺基、烷硫基、芳基、二醇和它们的任选取代的变
体；和具有以下结构的第二丙烯酰胺单体：
其中R3为氢或烷基；R4为氢或烷基；L为包括直链的接头，所述直链具有2至20个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选的取代基；A为具有结构的N取代的酰胺，其中R5为氢或烷基；E为直链，所述直链具有1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选的取代基；并且Z为任选的含氮杂环。
21.根据条款18至20中任一项所述的流通池表面化学物质，其中聚合物水凝胶具有通过可裂解的连接分子可移除地附接的暗猝灭剂。
22.根据条款21所述的流通池表面化学物质，其中可裂解的连接分子包括非共价结合对。
23.根据条款21或22所述的流通池表面化学物质，其中暗猝灭剂相对于聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
24.根据条款18至23中任一项所述的流通池表面化学物质，其中聚合物水凝胶具有掺入到其主链中的暗猝灭剂。
25.根据条款18至24中任一项所述的流通池表面化学物质，其中暗猝灭剂相对于聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
26.根据条款18至25中任一项所述的流通池表面化学物质，其中暗猝灭剂通过连接分子共价附接到聚合物水凝胶。
27.根据条款26所述的流通池表面化学物质，其中：
连接分子为非寡核苷酸接头；并且
连接分子相对于聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
28.根据条款26所述的流通池表面化学物质，其中
连接分子是寡核苷酸接头；
聚合物水凝胶包含附接到寡核苷酸接头的多个官能团；并且
寡核苷酸接头以足以占据该多个官能团的约0.5％至约50％的量存在。
29.根据条款18至28中任一项所述的流通池表面化学物质，其中暗猝灭剂通过发夹寡核苷酸或DNA折纸共价附接到聚合物水凝胶。
30.根据条款18至29中任一项所述的流通池表面化学物质，其中暗猝灭剂选自由以下项组成的组：二甲基氨基偶氮苯磺酸、4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺、4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺以及它们的组合。
31.根据条款18至30中任一项所述的流通池表面化学物质，其中暗猝灭剂在约400nm至约670nm范围内的一个或多个波长处表现出吸收。
32.一种方法，所述方法包括：
将聚合物水凝胶附接到基底的表面的至少一部分，所述聚合物水凝胶包含暗猝灭剂；以及
将至少一种捕获物质附接到聚合物水凝胶。
33.根据条款32所述的方法，其中暗猝灭剂在聚合物水凝胶的表面的信号猝灭接近度内。
34.根据条款32或33所述的方法，其中暗猝灭剂在该至少一种捕获物质的信号猝灭接近度内。
Claims (34)
1.一种流通池，所述流通池包括：
具有表面的基底；
聚合物水凝胶，其附接到所述基底表面的至少一部分，所述聚合物水凝胶包含暗猝灭剂；和
附接到所述聚合物水凝胶的至少一个引物组。
2.根据权利要求1所述的流通池，其中所述聚合物水凝胶作为多个垫施加到所述基底表面，其中所述多个垫中的每一个通过空隙区域与所述多个垫彼此隔离。
3.根据权利要求1所述的流通池，其中：
所述基底包括限定在所述基底表面中的通过空隙区域彼此隔离的多个凹入部；并且
所述多个凹入部中的每一个具有施加于其中的所述聚合物水凝胶。
4.根据权利要求1所述的流通池，其中：
所述基底包括限定在所述基底表面中的泳道；并且
所述泳道具有施加于其中的所述聚合物水凝胶。
5.根据权利要求1所述的流通池，其中所述聚合物水凝胶包括丙烯酰胺共聚物。
6.根据权利要求1所述的流通池，其中所述暗猝灭剂选自由以下项组成的组：二甲基氨基偶氮苯磺酸、4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺、4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺以及它们的组合。
7.根据权利要求1所述的流通池，其中：
所述基底为多层基底，所述多层基底包括：
基座载体；和
树脂层，所述树脂层定位在所述基座载体上；并且
所述聚合物水凝胶附接到所述树脂层的至少一部分。
8.根据权利要求1所述的流通池，其中所述聚合物水凝胶具有通过可裂解的连接分子可移除地附接的所述暗猝灭剂。
9.根据权利要求8所述的流通池，其中所述可裂解的连接分子包括非共价结合对。
10.根据权利要求9所述的流通池，其中所述暗猝灭剂相对于所述聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
11.根据权利要求1所述的流通池，其中所述聚合物水凝胶具有掺入到其主链中的所述暗猝灭剂。
12.根据权利要求11所述的流通池，其中所述暗猝灭剂相对于所述聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
13.根据权利要求1所述的流通池，其中所述暗猝灭剂通过连接分子共价附接到所述聚合物水凝胶。
14.根据权利要求13所述的流通池，其中：
所述连接分子为非寡核苷酸接头；并且
所述连接分子相对于所述聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
15.根据权利要求13所述的流通池，其中：
所述连接分子为寡核苷酸接头；
所述聚合物水凝胶包含附接到所述寡核苷酸接头的多个官能团；并且
所述寡核苷酸接头以足以占据所述多个官能团的约0.5％至约50％的量存在。
16.根据权利要求1所述的流通池，其中所述暗猝灭剂通过发夹寡核苷酸或DNA折纸附接到所述聚合物水凝胶。
17.根据权利要求1所述的流通池，其中所述暗猝灭剂在约400nm至约670nm范围内的一个或多个波长处表现出吸收。
18.一种流通池表面化学物质，所述流通池表面化学物质由以下组成：
包含暗猝灭剂的聚合物水凝胶；和
附接到所述聚合物水凝胶的至少一个引物组。
19.根据权利要求18所述的流通池表面化学物质，其中所述聚合物水凝胶为具有以下结构的丙烯酰胺共聚物：
其中：
RA选自由以下项组成的组：叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的炔烃、卤素、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
RB为H或任选取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自由H和任选取代的烷基组成的组；
-(CH2)p-中的每个能够任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；并且
m为在1至100,000范围内的整数。
20.根据权利要求18所述的流通池表面化学物质，其中所述聚合物水凝胶为直链或支链的共聚物，所述共聚物包括具有以下结构的第一丙烯酰胺单体：
其中R1和R2独立地选自由以下项组成的组：烷基、烷基氨基、烷基酰胺基、烷硫基、芳基、二醇和它们的任选取代的变体；和具有以下结构的第二丙烯酰胺单体：
其中R3为氢或烷基；R4为氢或烷基；L为包括直链的接头，所述直链具有2至20个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选的取代基；A为具有结构的N取代的酰胺，其中R5为氢或烷基；E为直链，所述直链具有1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选的取代基；并且Z为任选的含氮杂环。
21.根据权利要求18所述的流通池表面化学物质，其中所述聚合物水凝胶具有通过可裂解的连接分子可移除地附接的所述暗猝灭剂。
22.根据权利要求21所述的流通池表面化学物质，其中所述可裂解的连接分子包括非共价结合对。
23.根据权利要求22所述的流通池表面化学物质，其中所述暗猝灭剂相对于所述聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
24.根据权利要求18所述的流通池表面化学物质，其中所述聚合物水凝胶具有掺入到其主链中的所述暗猝灭剂。
25.根据权利要求24所述的流通池表面化学物质，其中所述暗猝灭剂相对于所述聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
26.根据权利要求18所述的流通池表面化学物质，其中所述暗猝灭剂通过连接分子共价附接到所述聚合物水凝胶。
27.根据权利要求26所述的流通池表面化学物质，其中：
所述连接分子为非寡核苷酸接头；并且
所述连接分子相对于所述聚合物水凝胶中的总摩尔数，以约0.25mol％至约50mol％范围内的量存在。
28.根据权利要求26所述的流通池表面化学物质，其中
所述连接分子为寡核苷酸接头；
所述聚合物水凝胶包含附接到所述寡核苷酸接头的多个官能团；并且
所述寡核苷酸接头以足以占据所述多个官能团的约0.5％至约50％的量存在。
29.根据权利要求18所述的流通池表面化学物质，其中所述暗猝灭剂通过发夹寡核苷酸或DNA折纸附接到所述聚合物水凝胶。
30.根据权利要求18所述的流通池表面化学物质，其中所述暗猝灭剂选自由以下项组成的组：二甲基氨基偶氮苯磺酸、4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺、4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[(N-4”-羧乙基-4”-(N-乙基)-4'-(4-硝基-苯基重氮)-2'-甲氧基-5'-甲氧基-偶氮苯)-氨基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2'-脱氧尿苷-3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺以及它们的组合。
31.根据权利要求18所述的流通池表面化学物质，其中所述暗猝灭剂在约400nm至约670nm范围内的一个或多个波长处表现出吸收。
32.一种方法，所述方法包括：
将聚合物水凝胶附接到基底的表面的至少一部分，所述聚合物水凝胶包含暗猝灭剂；以及
将至少一种捕获物质附接到所述聚合物水凝胶。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述暗猝灭剂在所述聚合物水凝胶的表面的信号猝灭接近度内。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述暗猝灭剂在所述至少一种捕获物质的信号猝灭接近度内。
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