CN117813186A - 一种形成微流体凝胶结构的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本文描述了一种制造内腔化凝胶结构的方法。该方法包括将含有凝胶前体溶液的第一液体引入微流体网络，该微流体网络在大致限定了微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界的位置处包含毛细管压力屏障；允许第一液体进入微流体网络的第一区域，并沿着毛细管压力屏障，从而在微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界处形成第一液体的液‑气弯液面；通过让第一液体与第二液体接触，形成穿过第一液体的内腔，其中第二液体的粘度低于第一液体的粘度；允许或引起第一液体凝胶化，以形成包含穿过其中的内腔的凝胶结构。本文还描述了一种包含具有穿过其中的内腔的凝胶结构的装置，以及该装置和内腔化凝胶结构在检测中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够实现细胞三维培养的方法和装置，该方法和装置能够可控和可靠地实现类器官测定和/或细胞培养的血管化和/或灌注。本发明还涉及研究细胞对该方法和装置产生的刺激物的反应的用途。
背景技术
为了模拟更加贴近生理条件的细胞培养环境，人们开发了许多模型来实现例如临床前细胞模型中的灌注流和共培养，以评估药物的有效性和/或ADME安全性。
微流体由于其在使用过程中液体或培养基的固有流动性，以及促进和实现复杂的微流体网络的微工程技术的进步，已成为一种体外细胞培养模型的通用平台技术。然而，人们仍然对开发能够模拟或再现人类或动物体内不同器官的细胞环境的模型有着浓厚的兴趣。
类器官培养，或者更一般地说，3D细胞培养，可以采用多种方式进行。3D球体可以在所谓的悬滴板(例如，参见WO 2010/031194)或低粘附微孔板中形成。尽管有人声称这些球体能够显著提高标准细胞培养的预测性，但它们并没有被用于大多数的类器官培养。原因在于，类器官通常需要细胞外基质成分，例如基质胶(Matrigel)或胶原，而这些成分在悬滴板或低粘附微孔板的球体中并不存在。同时，还开发了3D细胞培养模型，在该3D细胞培养模型中细胞生长嵌入至细胞外基质中。这种方法增强了分化功能的表达，并改善了组织结构(Pampaloni et al.(2007).Nat Rev Mol Cell Biol 8:839-84)。
培养类器官的典型平台包括标准培养皿、微孔板，在某些情况下还包括康宁公司的板。在这些情况下，类器官在细胞外基质(ECM)中或在ECM涂覆的孔中培养。正如上面已经提到的，这些类器官缺乏血管，由此类器官生长超过一定尺寸会发生缺氧并在后期可能形成坏死核心，从而限制了类器官的生长。同时，由于内皮细胞向靶组织分泌重要因子，因此可以假设内皮细胞的存在对于向生理相关组织的发育是至关重要的。
微流体细胞培养在药物筛选、组织培养、毒性筛选和生物学研究中发挥着日益重要的作用。
目前已经有许多微流体系统、设备、方法和制造技术是已知的，包括专利文献(例如WO 2008/079320、WO 2013/151616、WO 2010/086179、WO2012/120101)中公开的那些，或者可商购获得(例如从荷兰莱顿的Mimetas公司)的那些(例如：OrganoPlate；www.mimetas.com)。虽然不应从这些申请和文献中解读到本发明中提出的任何权利要求的任何特定限制，但是这些文献为本申请提供了有用的背景材料。
在文献A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on aChip.S.Deosarkar,B.Prabhakarpandian,B.Wang,J.B.Sheffield,B.Krynska,M.Kiani.PLOS ONE,2015中，开发了一种产生血管的微流体装置，该微流体装置采用筛状结构将内皮细胞与星形胶质细胞分离，试图产生血脑屏障型结构。在WO 2007/008609A2中，使用类似的筛状结构来形成细胞聚集体，以建立出更好地模拟例如肝脏生理学的组织形态。
因此，仍然需要一种方法和装置，可以让ECM支持的生物组织在灌注培养下更接近体内情况。特别令人感兴趣的是一种方法和装置，它可以在相邻的结构中对多种细胞进行图案化，同时最大限度地减少这些结构之间的空间分离和物理阻碍。这项技术也应与现代的读出和处理设备相兼容。
本发明的目的是解决上述需求中的一些或全部。
发明内容
根据本发明的第一方面，本文提供了一种用于形成内腔化凝胶结构的方法，包括：
将含有凝胶前体溶液的第一液体引入微流体网络，该微流体网络包括毛细管压力屏障，该毛细管压力屏障位于大体限定了微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界的位置；
允许第一液体进入微流体网络的第一区域，并让第一液体沿着毛细管压力屏障，从而在微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界处形成第一液体的液-气弯液面；
通过将第一液体与第二液体接触形成穿过第一液体的内腔，其中第二液体的粘度低于第一液体的粘度；和
允许或引起第一液体凝胶化，从而形成包含穿过其中的内腔的凝胶结构。
根据本发明的第二方面，本文提供了一种装置，包括：
微流体网络，该微流体网络包括：
至少两个入口；
毛细管压力屏障，该毛细管压力屏障位于限定了微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界的位置；和
凝胶，该凝胶设置在第一区域中，在所述至少两个入口中的两个入口之间延伸，并被毛细管压力屏障限制在第一区域内。
其中，该凝胶包含在所述至少两个入口中的两个入口之间穿过的内腔；所述凝胶具有面向内腔的第一表面和面向微流体网络的第二区域的第二表面，并且第一表面和第二表面之间的凝胶厚度为200μm或更小。
根据本发明的第三方面，本文提供了一种使用由第一方面的方法形成的内腔化凝胶结构在检测中的用途，例如选自以下一项或多项检测：屏障功能检测、跨上皮电阻(TEER)检测、免疫细胞粘附检测、免疫细胞跨移检测、转运体检测、血管舒张或收缩检测。
根据本发明的第四方面，提供了一种如第二方面中所定义的装置在检测中的用途，例如从以下一项或多项检测中选择的检测：屏障功能检测、跨上皮电阻(TEER)检测、免疫细胞粘附检测、免疫细胞迁移检测、转运体检测、以及血管舒张或收缩检测。
其他优选实施例在随后的说明书和从属权利要求中限定。
本申请的发明人意外地发现，通过策略性定位毛细管压力屏障并结合粘性指进技术，可以在微流体网络的第一区域形成内腔化凝胶结构，该结构具有面向微流体网络另一个区域的暴露表面。到目前为止，微流体网络中的内腔化凝胶结构要么填充微流体通道并在所有侧面接触通道壁，要么由膜支撑以便允许凝胶内外的扩散。由于粘性指进技术依赖于一种液体在另一种液体中形成腔，所以，出乎意外的是，粘性指进的内腔化没有破坏在毛细管压力屏障处固定的第一液体的表面张力，这本来会导致固定弯液面塌陷。虽然人们预期需要支撑壁来防止内腔化的液体向侧面流出，但本发明展示了一种意想不到的方法，其允许在非常接近开放空间的位置形成内腔，而无需限制壁。
本发明的方法和装置可以在具有薄的间质空间的细胞外基质中形成三维构成的组织，从而以一种之前在不使用膜的情况下无法实现的方式来模拟体内情况。这使得能够在生理真实环境中在靠近单层和/或组织特异性细胞的三维培养物的情况下对内皮化内腔进行受控共培养，例如将内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞和神经元在一个更真实的配置和基质中共培养，这比现有的微流体血脑屏障模型更真实。
释义
在整个说明书和权利要求书中使用的与本发明的装置、方法、用途和其他各个方面相关的各种不同的术语。除非另有说明，这些术语具有本发明所属技术领域中的通用含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式解释。虽然在实施本发明时可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但本文所述的为优选的材料和方法。
在本文中，除非另有明确说明，“不定冠词(a,an)”和“定冠词(the)”的单数形式还包括复数指示物。因此，例如，提及“细胞”包括两个/种细胞或更多个/种细胞等的组合。
当涉及诸如量，持续时间等可测量值时，本文中使用的术语“约和大约”意在包括特定值的±20％或±10％的变化，更优选地包括特定值的±5％的变化，甚至更优选地包括特定值的±1％的变化，仍更优选地包括特定值的±0.1％的变化，这类变化对于实施本文公开的方法而言是合适的。
本文使用的“包括”应解释为包含性的且开放的，而不是排除性的。具体而言，该术语及其变体意在包括具体特征、步骤或组分。这些术语不应被解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。
本文使用的“示例性”是指“作为实施例、例子或举例说明”，并且不应被解释为排除本文公开的其他配置。
本文使用的术语“微流体网络”是指由顶部基板或盖子覆盖的材料层上的或穿过该材料层的一个或多个通道，其长度、宽度或高度中的至少一个维度处于低范围(例如小于5mm或小于2mm)或在亚毫米范围内。应当理解的是，该术语包括线性通道以及分支的通道或在其路径中具有弯曲或拐角的通道。微流体网络通常包括至少一个用于施加一定量液体的入口，但也可以包括多个用于给微流体网络的不同区域施加一定量液体的入口。微流体网络中所封闭的体积通常在微升或亚微升范围内。微流体通道通常包括一个基底(其可为下层材料的上表面)、至少两个侧壁和一个天花板(其可为覆盖微流体通道的上部基板的下表面)，根据需要，该微流体通道具有任何入口、出口和/或通风口配置。基底、侧壁和天花板可以分别被称为微流体网络的内表面，也可以共同被称为微流体网络的内表面。在一些例子中，微流体网络可以有一个圆形或半圆形的横截面(其可被视为分别具有一个或两个内表面)。
本文使用的术语“毛细管压力屏障”指的是通过毛细管作用力使液体-空气弯液面固定在某个位置的装置的特征。毛细管压力屏障可被认为是将一个具有体积V0的微流体网络分成两个区域或两个子体积V1和V2，不同的液体可以被引入到这两个区域或两个子体积V1和V2中。换句话说，毛细管压力屏障通常限定了微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界。应该理解的是，虽然毛细管压力屏障通常限定了微流体网络区域之间的边界，但是在一个区域中所引起的液体固定弯液面可能不会固定在毛细管压力屏障的精确位置处，而是可能在仍然被固定的情况下，伸展或突出到毛细管压力屏障的相邻区域。例如，液体的弯液面可能是凸形的，并被毛细管压力屏障固定，凸形的液体前沿超出了毛细管压力屏障的覆盖区。液体的弯液面也可能是凹形的，液体前沿被毛细管压力屏障固定，并在与毛细管压力屏障相反的微流体网络表面上超出了毛细管压力屏障的覆盖区。
本文使用的“线性”毛细管压力屏障不应被解释为直线，而应被解释为具有两端的线，但其可包括一个或多个弯曲或角度。线性毛细管压力屏障通常在其每一端与微流体通道的侧壁相交。
本文使用的术语“内皮细胞”是指内皮起源的细胞，或分化至如下状态的细胞，在所述状态中，所述细胞表达识别作为内皮细胞的细胞的标志物。
本文使用的术语“上皮细胞”是指上皮起源的细胞，或分化至如下状态的细胞，在所述状态中，所述细胞表达识别作为上皮细胞的细胞的标志物。
本文使用的术语“生物组织”是指一组相同、相似或不同类型的功能相互连接的细胞，它们将在本文所述的方法中进行培养和/或检测。细胞可以是细胞聚集体、管状结构或单层的形式。生物组织可以由多种亚型的细胞构成。例如，或者是来自患者的特定组织样品。例如，“生物组织”这一术语源自或包含细胞系、类器官、组织活检、肿瘤组织、切除组织材料和胚胎体的细胞。
本文使用的术语“细胞聚集体”是指相对于通常单层生长的表面附着细胞而言的3D细胞簇。3D细胞簇通常更接近体内的情况。相比之下，表面附着细胞更容易受到基板性质的影响，并且可能发生去分化或向其他细胞类型转变。
本文使用的术语“类器官”是指组织的微型形式，其在体外形成并表现出内源性三维器官结构。
本文使用的术语“共培养”是指在本文所述的装置中培养两种或更多种不同的细胞类型。不同的细胞类型可以在装置的同一区域(例如，第一区域或第二区域)中培养，也可以在不同的区域(例如，一种细胞类型在第一区域，另一种细胞类型在第二区域)中培养。
例如，本文所述的装置可以在第一区域中培养内皮细胞，使内皮细胞形成一个具有开放内腔的小管，在第二区域中培养器官特异性(实质性)细胞，两者之间由第一区域的一层薄的凝胶层分隔。在一些实施例中，装置包含至少一个在第一区域中的内衬有内皮细胞的内腔化凝胶结构以及在第二区域中的组织特异性细胞。组织特异性细胞可在第二区域的整个凝胶结构中分布，覆盖第二区域的表面，形成一个与第一区域的凝胶结构(包括内皮细胞覆盖的腔)接触的小管；或者内衬穿过第二区域的凝胶结构的一个内腔。
本文使用的术语“内腔化凝胶结构”是指一种生物相容性凝胶，优选为一种生物相关的凝胶，例如细胞外基质，其具有贯穿凝胶的内腔，使其可以形成例如具有顶面和基面的微血管。应该理解的是，“内腔化凝胶结构”和“内腔凝胶结构”可以互换使用，因为这两个术语具有相同的含义。
本文使用的术语“内腔化细胞构件”是指具有内腔的生物组织(即由细胞构成)，例如具有顶面和基面的微血管。
本文使用的术语“移植”是指将组织(例如组织移植体)或细胞聚集体从一个位置转移到另一个位置，例如从存储容器转移到细胞培养装置。
本文使用的术语粘度，除非另有说明，是指动态粘度，并按照Kane等人的描述进行测定(AIP Advances 8,125332(2018))。内腔形成与粘度之间的关系与Saffman和Taylor在1958年提出的Saffman-Taylor不稳定性(Proceedings of the Royal Society ofLondon.Series A.Mathematical and Physical Sciences.245(1242):312–329.)所描述的一致，并可被本领域技术人员所理解。微通道尺寸与细胞外基质相关的其他相关性质之间的关系，与Bischel等人在文章中描述的一致(Journal of Laboratory Automation 17(2)96–103)。
附图说明
下面将参考附图仅以示例的方式描述本发明，其中：
图1A显示了根据本文所述的形成内腔化凝胶结构的方法的一系列步骤的截面图；
图1B显示了根据本文所述的形成内腔化凝胶结构的方法的一系列步骤的平面图；
图1C显示了根据本文所述的形成内腔化凝胶结构的方法的一系列步骤的截面图；
图2显示了根据本文所述的形成内腔化凝胶结构的方法的一系列步骤的截面图；
图3显示了根据本文所述的形成内腔化凝胶结构的方法的一系列步骤的截面图；
图4A显示了根据本文所述的形成内腔化凝胶结构的方法的一系列步骤的截面图；
图4B显示了根据本文所述的形成内腔化凝胶结构的方法的一系列步骤的截面图；
图5显示了包含两个相邻的内腔化细胞构件和细胞外基质重塑的装置的截面图；
图6A显示了本申请公开的包含内腔化细胞构件的示例性装置的截面图；
图6B显示了本申请公开的利用内腔化凝胶结构来形成内腔化细胞构件的示例性装置的截面图；
图7显示了本申请公开的包含三个内腔化细胞构件的示例性装置的截面图；
图8显示了本申请公开的包含三个内腔化细胞构件的示例性装置的截面图；
图9A显示了根据图8的装置通过实验获得的共聚焦显微镜截面图；
图9B显示了根据图5的装置通过实验获得的共聚焦显微镜平面图；
图10显示了根据本申请公开的另一装置通过实验获得的共聚焦显微镜截面图；
图11A显示了本申请公开的包含两个内腔化细胞构件的另一装置的截面图；
图11B显示了根据图11A的装置通过实验获得的共聚焦显微镜平面图；
图12显示了通过实验获得的图8装置的平面图的相差显微图像，该装置包括三个相邻内腔化细胞构件；
图13显示了根据本申请公开的另一装置的平面图通过实验获得的高分辨率图像；
图14显示了根据本申请公开的内容而建立的血脑屏障模型通过实验获得的相差显微镜截面图；
图15显示了根据本申请公开的内容而建立的血脑屏障模型通过实验获得的共聚焦显微镜截面图；
图16A显示了包含一个内腔化细胞构件的图7装置的实施例的截面图；
图16B显示了根据图16A的装置通过实验获得的相差显微镜平面图；
图17A显示了包含两个内腔化细胞构件的图7装置的实施例的截面图；
图17B显示了根据图17A的装置通过实验获得的相差显微镜平面图；
图18A、18B、18C显示了根据本申请公开的内容而建立的冠状动脉模型通过实验获得的共聚焦显微镜截面图；
图19显示了根据本申请公开的内容而建立的T细胞迁移模型通过实验获得的相差显微镜截面图；
图20显示了比较T细胞迁移模型通过实验获得的相差显微镜截面图；和
图21显示了从图19和图20所示模型中获得的定量数据。
具体实施方式
装置
本文描述了一种装置。该装置可以是一种微流体装置，本文中也称为微流体器件。该装置包括至少一个微流体网络，例如多个微流体网络。该微流体器件优选为多阵列形式/多孔板形式，从而能够用于体外细胞培养试验、药物筛选试验、毒性试验等；具体而言，其是高通量筛选形式。这种多孔培养平板通过在矩形矩阵中布置6-样品孔、12-样品孔、24-样品孔、48-样品孔、96-样品孔、384-样品孔和1536-样品孔而获得，其中，在本发明的背景下，本文所述的多阵列微流体网络存在于微流体器件中。在一个实施例中，微流体器件与ANSI/SLAS微量滴定板标准格式的一个或多个维度兼容。在另一个实施例中，微流体装置是具有显微镜载玻片尺寸的多阵列形式。在一些实施例中，微流体器件具有一种或多种功能，包括一个或多个可用于电学实验的电极；透明材料、窗口或其他使得光学测量得以进行的修改等。
因此，微流体装置优选具有多个如本文所述的微流体网络。在一个实施例中，多个微流体网络彼此不流体连通；换句话说，在微流体装置上，每个微流体网络都独立于任何其他微流体网络而运行。在其他实施例中，如稍后将描述的，微流体网络可以通过一个或多个连接通道相连。
总体而言，微流体装置是至少包括具有微流体通道的微流体网络的微流体装置。微流体通道或网络的不同结构均可在本发明的范围内，但是还可包括例如一个或多个微流体通道内的或与微流体通道流体连通的空间或子空间，其用于接受或限制凝胶的区域，例如，细胞外基质。
微流体装置总体上包括微流体网络，其在下文中将详细进行说明。
微流体网络
微流体装置的微流体网络总体上包括基底、微流体通道或微流体层以及盖子(在本文中也称为覆盖层)，并且所述微流体网络可以多种方式制造。
基底(在本文中也称为基底层或底板)优选地由基本上刚性的材料(例如，玻璃或塑料)形成，并且用于为微流体网络的剩余部分提供支撑表面。在一个实施例中，基底的尺寸与标准ANSI/SLAS微量滴定板的孔区域的尺寸相同或类似。
微流体装置或微流体网络包括设置在基底上的微流体通道或微流体层。在一些实施例中，微流体通道可包括或可被分隔成不同的区域，例如由本文所述的毛细管压力屏障的存在而进行分隔。在一些实施例中，微流体网络可包括第一区域和第二区域。毛细管压力屏障通常可以限定微流体网络相邻区域之间的边界，例如第一区域和第二区域之间的边界。在一些实施例中，微流体网络包括一个或多个微流体通道，每个微流体通道形成一个微流体网络区域，并且有自己的专用入口和/或出口。
第一区域和第二区域的宽度尺寸可在大约100μm到大约10mm之间，或者在大约200μm到大约500μm之间，或者在大约300μm到大约400μm之间。
制备微流体网络的典型方法是在模具上浇铸诸如聚二甲基硅氧烷之类的可模塑的材料，由此将微流体网络印在硅橡胶材料中，从而形成微流体层。带有网络或通道的橡胶材料随后放置于玻璃基底层上或相同的橡胶材料基底层上，从而进行密封。任选地，通道结构可蚀刻在诸如玻璃或硅之类的材料中，随后将其粘结至顶部基板或底部基板(也称为覆盖层和基底层)。粘结之后进行的塑料注塑或凸印是制造微流体通道网络的另一种方法。制造微流体通道网络的又一技术是在可曝光成像的聚合物(例如，SU-8或各种不同的其他干燥膜或液体光刻胶)中通过照相平版印刷形成微流体通道网络图案，随后进行粘合步骤。在进行粘合时，粘合是指由盖子或基底封闭通道。粘合技术包括阳极粘合，共价粘合，溶剂粘合，粘合剂粘合和热粘合，等等。
从上述各种不同的制造方法中可以推断出，微流体层可包括包含设置在基底层上的微流体通道的亚层或者在覆盖层或基底层上形成该微流体层的图案。在使用方向上，微流体亚层设置在基底层的顶部表面上。微流体通道可形成为穿过设置在基底层上的材料亚层的通道。在一个实施例中，所述材料亚层是设置在基底层上的聚合物并且在该材料亚层中形成微流体通道图案。在一些实施例中，微流体层包括两个或多个微流体通道，其可以彼此流体连通。
微流体通道可根据微流体装置的微流体网络的任何特定用途的需要设置有一个或多个入口和一个或多个出口或通风口。为了允许流体通过微流体网络进行填充、排空和灌注，微流体通道优选地具有至少两个入口。在一个实施例中，所述至少两个入口中的每一个入口优选为覆盖层中的孔。应当理解的是，通常情况下，入口和出口在几何形状上没有区别，而且在很多情况下，它们可以互换地用作入口和出口。具体地，应当理解的是，与通过其引入液体的入口孔相对的区域流体连通的入口孔此时将用作出口(或通风口)，以便排出空气或过量的液体。
微流体网络可包括至少两个入口，每个入口都设置为能够将液体引入微流体网络的第一区域，或者能够从第一区域中移除液体。在一些实施例中，微流体网络可包括至少三个入口，例如至少四个入口，其中至少有两个入口设置为能够将液体引入微流体网络的第二区域，或者能够从第二区域中移除液体或排出空气。在一些实施例中，微流体网络还可包括另外两个入口，每个入口都设置为能够将液体引入微流体网络的第三区域，或者能够从第三区域中移除液体或排出空气。应该理解的是，入口设置为能够将液体引入微流体网络的任何给定区域，这意味着入口与该区域流体连接，例如具有流体界面，能够将液体注射或转移到一个区域，或者注入到与所述区域相通的微流体通道。毛细管压力屏障的位置可以指示微流体网络的两个不同区域之间的边界。应该理解的是，两个区域之间的边界大致与一个平面中的这种毛细管压力屏障对齐，但是两个区域之间的界面可以在任何方向上弯曲远离毛细管压力屏障的投影。
在一些实施例中，微流体装置还包括置于上述覆盖层上的顶层，该顶层具有一个或至少一个与微流体装置的其余部分流体连通的孔或储液槽。在一些实施例中，该顶层具有多个这样的孔，并且至少有一个，例如至少有两个，例如至少有三个孔与装置的微流体网络或通道相通。例如，该顶层可包括一个孔或储液槽，该孔或储液槽通过微流体网络的覆盖层中提供的入口孔与微流体网络流体连通，从而形成符合SLAS标准的孔板。在一些实施例中，具有至少一个孔的顶层和微流体层是一体形成的。例如，一个微流体通道可以在具有至少一个孔的注塑微量滴定板的下表面形成图案。
毛细管压力屏障
该装置的微流体网络包括毛细管压力屏障，该毛细管压力屏障总体上限定了微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界。
毛细管压力屏障的功能和图案先前已被描述，例如在WO 2014/038943A1中。如从下文描述的示例性实施例中显而易见的，毛细管压力屏障不应被理解为壁(或例如可以填充有液体的腔)，而应理解为由这样的结构组成或包含这样的结构，该结构可确保液体不会由于表面张力而发生扩散。这个概念被称为弯液面钉扎。这样，可以实现将液体稳定限制到微流体网络的区域。在一个实施例中，毛细管压力屏障可以被称为限制相导件，其被配置为在细胞培养装置的正常使用期间不会溢出。本文结合本发明的方法的描述来描述液体的限制的性质。
在一个实施例中，毛细管压力屏障设置在微流体网络的内表面上，并且该毛细管压力屏障包括凸起、凹槽或材料线，该凸起、凹槽或材料线与微流体网络的内表面相比具有更大的水-空气接触角。在一个实施例中，毛细管压力屏障包括或由从微流体网络的内表面突出的材料的边缘或凸起组成；或者是微流体网络内表面上的凹槽。为了提供一个良好的屏障，凸起或凹槽的侧壁和凸起或凹槽的顶部形成的内角优选地小于110°，例如约90°，在一些实施例中小于90°。凸起的侧壁和毛细管压力屏障所在的微流体网络的内表面之间的角度也有相同的要求。类似的要求也适用于形成凹槽的毛细管压力屏障。
毛细管压力屏障的另一种形式是一块与微流体网络的内表面具有不同润湿性的材料区域，其由于毛细管力/表面张力而起到了阻止液体扩散的作用。因此，液体无法流动到毛细管压力屏障之外的区域，并能够在微流体网络的一个区域中形成稳定的受限体积。在一个实施例中，微流体网络的内表面包括亲水性材料，而毛细管压力屏障是疏水性或较低亲水性的材料区域。在一个实施例中，微流体网络的内表面包括疏水性材料，而毛细管压力屏障是亲水性或较低疏水性的材料区域。
因此，在一些实施例中，毛细管压力屏障选自边缘或脊、凹槽、孔或疏水材料线或其组合。在另一个实施例中，毛细管压力屏障可由选定间隔的柱子形成，柱子的排列将限定出由凝胶占据的第一区域。在一个实施例中，柱子延长了微流体网络的高度。
在一个实施例中，毛细管压力屏障基本上是线性的，它横跨微流体通道或网络的整个宽度或长度，并在两端与微流体网络的侧壁相交。
在另一个实施例中，毛细管压力屏障不是线性的，而是包括一个或多个弯曲或弧形部分。例如，毛细管压力屏障可包括连续的角度弯曲或弧形部分，从而形成蜿蜒或甚至直角的形状。这样，流体沿着毛细管压力屏障而流动的路径相对于沿着线性毛细管压力屏障而流动的路径被延长了。非线性毛细管压力屏障的优点在于，液体沿着这样的毛细管压力屏障而形成的内腔可具有非线性的形状，例如可模仿小肠的隐窝-绒毛结构，和/或非线性内腔的长度相对于其线性内腔延长了。
毛细管压力屏障与微流体通道的一个侧壁或多个侧壁的交点在毛细管压力屏障的下游侧可有一个角度，该角度相对于第一流体的预想充填方向大于70°，更优选为约90°，更优选为大于90°。为了提供一个良好的屏障，这个角度最好尽可能大，正如WO 2014/0389431中所描述的那样。
在一些实施例中，毛细管压力屏障被图案化形成于微流体网络的内表面上，以模仿生物结构。让毛细管压力屏障模仿生物结构的形状或构造有利于形成更接近于体内系统的体外系统。例如，毛细管压力屏障可包含正弦形状，以模拟隐窝绒毛结构。
第二毛细管压力屏障
在一些实施例中，该装置的微流体网络具有第二毛细管压力屏障，其形式和功能与上述的毛细管压力屏障基本相同。为避免混淆，当装置中存在第二毛细管压力屏障时，所提及的“毛细管压力屏障”应理解为“第一毛细管压力屏障”。
在一些实施例中，第二毛细管压力屏障限定了微流体网络的第一区域和第三区域之间的边界，或者第二区域和第三区域之间的边界。因此，具有两个毛细管压力屏障的微流体网络可包括第一区域，第二区域和第三区域，每个区域至少有一个专用的流体界面，例如专用入口、出口或者通风口。在一些实施例中，第二毛细管压力屏障设置在大体限定微流体网络第一区域和第三区域之间的边界的位置；这样，液体可以沿着第一毛细管压力屏障和第二毛细管压力屏障，从而形成面向微流体网络第三区域的凝胶结构的第三表面。在一些其他的实施例中，第二毛细管压力屏障设置在大体限定第二区域和第三区域之间的边界的位置，可选地允许图案化并且可能在第三区域中形成第二凝胶的内腔。应当理解的是，多个毛细管压力屏障、区域和凝胶结构可以组合成越来越复杂的微流体网络和凝胶结构。
凝胶
凝胶设置在微流体网络的第一区域中，在两个入口之间延伸并通过毛细管压力屏障限制在第一区域中。该凝胶包括在两个入口之间延伸的内腔，并且具有面向内腔的第一表面、面向微流体网络第二区域的第二表面，并且第一表面和第二表面之间的凝胶的厚度可以是200μm或更小。在一些实施例中，内腔基本上是圆柱形的，例如具有基本上为圆形的横截面。
可以按照本文所述的方法形成通过凝胶的内腔。毛细管压力屏障和通过凝胶形成腔体的组合提供了凝胶的两个表面，从而能够或者允许形成具有薄的间质空间的3D构成的组织，以一种之前无法实现的方式模仿体内情况。
可通过将凝胶前体溶液引入微流体网络的第一区域来将凝胶设置在微流体网络的第一区域中，例如通过为第一区域服务的入口，根据本文所述的方法通过凝胶前体溶液形成内腔。
凝胶或凝胶前体包括本领域已知的任何适合细胞培养的水凝胶。用于细胞培养的水凝胶可由大量的天然和合成材料形成，具有广泛的机械和化学性能。适合的水凝胶在由天然材料形成时能够促进细胞功能，在由合成材料形成时能够允许细胞功能。用于细胞培养的天然凝胶通常由蛋白质和ECM组分(如胶原，纤维蛋白，纤维蛋白原，纤维连接蛋白，透明质酸，层粘连蛋白或基质胶)以及来自其他生物来源的材料(如壳聚糖，海藻酸或丝纤维)形成。由于它们来自天然来源，这些凝胶具有固有的生物相容性和生物活性。允许的合成水凝胶可由纯非天然分子(如聚乙二醇(PEG)，聚(乙烯醇)，和聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯))形成。PEG水凝胶已被证明可维持封装细胞的活力，并且在它们降解时允许ECM沉积，表明即使没有整合素结合配体，合成凝胶也可以作为3D细胞培养平台。这种惰性凝胶具有高度的可重复性，容易调节机械性能，并且加工和制造简单。凝胶或凝胶前体可包括基底膜提取物，人类或动物组织或细胞培养衍生的细胞外基质，动物组织衍生的细胞外基质，合成细胞外基质，水凝胶，胶原，软琼脂，蛋白和商业可用的产品，如基质胶。
包括基底层的基底膜是薄的细胞外基质，其位于体内上皮细胞的下方并且由细胞外基质(例如蛋白质和蛋白聚糖)组成。在一个实施例中，基底膜由胶原IV，层粘连蛋白，黏附素，肝素硫酸蛋白聚糖以及多种其他微量成分组成(Quaranta et al，Curr.Opin.CellBiol.6,674-681,1994)。这些成分本身以及整个基底膜都具有生物活性，可促进细胞粘附、迁移，以及在许多情况下可促进细胞生长和分化。基于基底膜的凝胶的一个实例是Matrigel，它作为上皮细胞的基质，在体外具有非常高的生物活性。
在本文所述的方法和装置中使用的许多不同的合适的凝胶是商售的，包括但不限于：Matrigel rgf，BME1，BMEIrgf，BME2，BME2rgf，BME3(所有Matrigel变体)Collagen I，Collagen IV，Collagen I和Collagen IV的混合物，或Collagen I和Collagen IV以及Collagen II和Collagen III的混合物)，puramatrix，水凝胶，Cell-TakTM，Collagen I，Collagen IV，Matrix，Fibronectin，Gelatin，Laminin,Osteopontin,Poly-Lysine(PDL,PLL),PDL/LM和PLO/LM,/>或Vitronectin。在一个优选的实施例中，基质组分由市售的/>Matrix(Corning，NY 14831，USA)获得。
由于毛细管压力屏障的弯液面钉扎效应和凝胶(或前体)的内腔化，微流体网络中的凝胶(例如在微流体网络的第一区域中)具有两个可暴露在空气中的表面(例如通过从形成的内腔中抽出第二液体)，和/或可以用于引入其他液体来接触表面。为了方便起见，面向内腔的凝胶内表面通常被描述为第一表面，而面向微流体网络的相邻区域(例如第二区域)的凝胶的外表面通常被描述为第二表面。应当理解的是，当凝胶前体溶液被引入第一区域时，第二表面对应于被毛细管压力屏障钉扎的凝胶前体溶液的弯液面，因此可以延长毛细管压力屏障的长度。应当理解的是，第一表面可以沿着微流体网络的整个长度延伸，包括通向和远离毛细管压力屏障的网络部分，因此可比第二表面更长。
第一表面和第二表面之间的凝胶的厚度可以是200μm或更小。应当理解的是，凝胶的厚度沿着第一表面和第二表面之间的整个长度可能不是均匀的，这意味着200μm或更小的厚度可以是最小厚度，或者是最大厚度。在一些实施例中，第一表面和第二表面之间的凝胶的厚度可以是150μm或更小，例如100μm或更小，例如50μm或更小，例如40μm或更小，例如30μm或更小，例如20μm或更小，例如10μm或更小，例如大约1μm。在一些实施例中，第一表面和第二表面之间的凝胶的厚度可以接近零，例如小于1μm的厚度，例如小于500nm，例如小于250nm，例如小于100nm，例如小于50nm，以复制体内基底层。在一些实施例中，第一表面和第二表面之间的凝胶的厚度为20nm到200μm，例如从100nm到150μm，例如从500nm到100μm，例如从1μm到50μm。
如上所述，凝胶存在于微流体网络的第一区域中，并且由于凝胶被毛细管压力屏障钉扎，因此凝胶可以具有一个面向微流体网络的第二区域的表面。在一些实施例中，凝胶也被第二毛细管压力屏障钉扎，该第二毛细管压力屏障限定了微流体网络的第一区域和第三区域之间的边界。在这些实施例中，凝胶包括一个面向第三区域的第三表面。应当理解的是，与第二表面一样，第三表面的形状可能是凹形的或凸形的，并且可在仍然被钉扎的同时，延伸或凸出超过毛细管压力屏障的物理位置。
在其他实施例中，存在第二毛细管压力屏障，但是该第二毛细管压力屏障限定了微流体网络的第二区域和第三区域之间的边界。在这些实施例中，包括内腔凝胶的第一区域通过第二区域与第三区域间隔开。
在一些实施例中，微流体网络包括一个孔，该孔可能是一个不同于用于填充液体或通气的任何入口孔的孔，并且凝胶结构形成一个面向和/或基本密封孔的表面。孔本身可以作为一个毛细管压力屏障，防止液体流出孔。在一些实施例中，内腔不延伸到孔，而是延伸穿过孔下方的凝胶(使用时，包括凝胶的微流体网络在孔下方的平面的情况下)。因此，凝胶结构可以有一个面向和/或基本密封孔的表面，它可以与液体接触，并且可以沿着内腔的长度方向，在内腔的起始端和末端之间的位置接触凝胶。
在一些实施例中，第二区域也包括凝胶或凝胶前体溶液，与第一区域内的凝胶形成凝胶-凝胶的接触。在一些实施例中，微流体网络包括一个由第二毛细管压力屏障划分的第三区域，并且该第三区域也包括凝胶或凝胶前体溶液。在这些实施例中，第三区域可以与第一区域或第二区域相邻。因此，第三区域可包含凝胶，该凝胶与第一区域内的凝胶形成凝胶-凝胶的接触，或者该凝胶与第二区域内的凝胶形成凝胶-凝胶的接触，或者第一区域和第三区域中的凝胶之间不存在凝胶-凝胶的接触。当存在时，第二区域内的凝胶和第三区域内的凝胶可以是使用本文所述的方法形成的具有内腔的凝胶或凝胶结构。
虽然目前的讨论集中在一个或两个毛细管压力屏障的存在，以及随后的在微流体网络的第一区域、第二区域和第三区域中形成的凝胶结构，但是将理解，本发明不限于这样的配置，而且还可以包括更多的毛细管压力屏障，提供微流体网络的更多区域。因此，微流体网络通常可地包括N个区域或通道，以及N-1个分隔每个区域或通道的毛细管压力屏障。因此，所述方法可用于在N个可形成自由弯液面的通道中的任意一个中形成凝胶，并且可在微流体网络中的N个通道中创建N个内腔。
一旦使用本文所述的方法将微流体网络中的凝胶结构形成内腔之后，就可以将一种或多种细胞或细胞类型引入微流体网络中，以形成例如凝胶-支撑的管道或血管，这将在下文结合本发明公开的方法一起描述。
创建内腔化凝胶结构的方法
本文描述了一种创建内腔化凝胶结构的方法，包括：
将包含凝胶前体溶液的第一液体引入微流体网络，微流体网络包括毛细管压力屏障，该毛细管压力屏障处于大体上限定了微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界的位置。
让第一液体进入微流体网络的第一区域，并沿着毛细管压力屏障，从而在微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界处形成第一液体的液-气弯液面。
通过将第一液体与第二液体接触，形成穿过第一液体的内腔，其中第二液体的粘度低于第一液体的粘度；和
允许或者引起第一液体凝胶化，以形成凝胶结构，该凝胶结构包括穿过其中的内腔。
图1A，1B和1C显示了按照本文所述的方法的一系列步骤。图1A显示了包含微流体网络的装置的侧面图或截面图，而图1B显示了相同装置的平面图，图1C显示了相同装置的垂直于图1A视图的截面图。
装置100包括微流体网络102，在该实施例中，在微流体网络102的任一端均设有两个入口(未编号)，并且可通过包括孔105的覆盖层103从上方进入。
在一个实施例中，包含凝胶前体溶液的第一液体通过提供进入微流体网络的通道的入口被引入微流体网络中，例如通过注射或插入。更具体地说，微流体网络和入口被设置成使得入口与微流体网络的第一区域相通，即入口和微流体网络界定了从入口到第一区域的流路。一旦第一液体被引入微流体网络中，例如通过注射，它被允许进入第一区域，例如通过流路，并沿着毛细管压力屏障。通常，毛细管力足以使第一液体流经微流体网络，而不需要持续的注射压力或背压。在一些实施例中，施加背压来使第一液体进入第一区域并沿着毛细管压力屏障。
图1A到1C的第二幅图显示了包含凝胶前体溶液的第一液体104被引入微流体网络102。从图1B和图1C可以看出，毛细管压力屏障112设置在微流体网络102中，它大致限定了微流体网络的第一区域114和第二区域116之间的边界。毛细管压力屏障112设置成(图1B中以虚线显示)从微流体网络102的底部突出到主体或通道中的材料脊。一旦引入到微流体网络102中，第一液体104即填充第一区域114并沿着毛细管压力屏障112，形成沿着或平行于毛细管压力屏障112的液-气弯液面，因此其大致位于第一区域114和第二区域116之间的边界处。虽然液面被毛细管压力屏障112钉扎，但是从图1C可以看出，弯液面中与微流体网络的顶部接触的部分，部分地延伸到第二区域116。然而，应当理解的是，由于毛细管压力屏障112的弯液面钉扎效应，第一液体的液-气弯液面仍然大致处于边界处。
合适的凝胶和前体溶液包括但不限于如下凝胶，其包括：Matrigel，Matrigelgfr，BME1，BME1 gfr，BME2，BME2 gfr，BME3(所有Matrigel变体)，Collagen I，CollagenIV，Collagen I和Collagen IV的混合物，或者Collagen I和Collagen IV的混合物与Collagen II和Collagen III的混合物，puramatrix，水凝胶，Cell-TakTM，Matrix，Fibronectin，Gelatin，HA,Laminin，Osteopontin，Poly-Lysine(PDL,PLL)，PDL/LM和PLO/LM，/>或Vitronectin。在一种优选的实施方式中，作为凝胶前体溶液引入的基质组分是商售的/>Matrix(Corning,NY 14831,USA)。
接下来，通过在微流体网络的第一位置将第一液体与第二液体接触，从而在第一液体中形成内腔，其中第二液体的粘度低于第一液体的粘度。这种技术被称为粘性指进或Saffman-Taylor不稳定性，它依赖于两种液体的不同相对粘度来形成内腔。在渗透性基质中创建三维内腔结构的方法是本领域已知的(Bischel et al.J Lab Autom.(2012)17:96-103；and Bischel et al.Biomaterials(2013)34:1471-1477)。
为了使内腔化发生，必须创建压力梯度，从而导致较高粘度的第一液体被较低粘度的第二液体置换。该压力梯度可以通过多种方法实现，包括但不限于：由于液滴的表面张力(被动泵送)而产生的拉普拉斯力，静水压，气压，机械压力(例如，通过注射泵)。
第一液体，即凝胶前体溶液，可具有足够高的粘度来形成一个限定的结构，但是仍然允许具有较低粘度的第二液体通过第一液体分散，通过基于表面张力的被动泵送，而不需要外部压力驱动流，并且去除第一液体的一部分，从而产生延伸穿过第一液体或在第一液体内延伸的内腔。
在一些实施例中，第一液体可具有大约5cP到大约106cP的粘度，例如从大约5cP到5000cP，例如从大约30cP到1000cP。通过第一液体分散的第二液体的组成和/或粘度可以随着第一液体的粘度而变化。一般来说，第一液体越粘，第二液体的粘度可能需要越高，以使其延伸通过第一液体并在其中创建内腔。在一些实施例中，第二液体可具有大约0.5cP到大约5cP的粘度。应当理解的是，通常使用的水凝胶的粘度的绝对值取决于许多因素，包括动态性质，如剪切，应变和粘弹性性质，这是由于许多凝胶前体是非牛顿流体。然而，在这些范围内，凝胶前体(例如>5cP)总是明显地比用于内腔化的液体(例如水或细胞培养基(例如约1cP))更粘。只要可以预期凝胶前体的变化和动态粘度总是比第二液体更粘，即使凝胶的粘度是变化的或者只是近似限定的，所提出的方法也是适用的。
改变形成凝胶基质(ECM)的凝胶前体溶液的粘度的方法是本领域已知的，包括，例如调节溶液中聚合物(例如胶原)的浓度，其中更高的浓度产生更高的粘度；使溶液部分凝胶化，其中更多的凝胶化产生更高的粘度；改变温度，其中较低的温度减缓凝胶化，但是会增加未凝胶的凝胶前体的粘度，或者将粘度调节剂例如聚乙二醇引入到溶液中。
图1A至图1C中的第三幅图像显示了第二液体106的液滴，该第二液体106被引入到充满微流体网络102的第一液体104的顶部。为了说明的目的，第二液体106是通过与第一液体104相同的入口引入的，该入口可以被认为是第一位置。为了使第二液体106能够穿过第一液体104并使第一液体104形成内腔，可以在与第一位置间隔的第二位置施加第三液体108，例如进入微流体网络102的入口，该入口与引入第二液体106的入口间隔。第三液体108，与第二液体106一样，可能具有比第一液体104更低的粘度。
如果第二液体106由于入口处界面的表面张力而在其入口处受到限制，那么可以引入第三液体108。引入第三液体108可有助于破坏表面张力，因此需要第二液体106具有较低的压力。第三液体108可以与第二液体106具有相同或不同的组成，可以是但不限于：一种选自HBSS、细胞培养基、PBS、TRIS、水、HEPES、白蛋白溶液、平衡盐溶液、第二凝胶或凝胶前体溶液或缓冲剂的液体。第三液体可以与第二液体相同。第三液体的粘度可以低于、相似于或高于第一液体。在一些实施例中，第二液体106是在引入第三液体108之前引入的，而在另一些实施例中，引入的顺序则相反。
在一些实施例中，使凝胶前体溶液104与第二液体106接触，包括：形成第二液体106的弯液面，该弯液面形状为凸形并具有第一主曲率半径；并使凝胶前体溶液104与第三液体108接触，包括：形成第三液体108的的弯液面，该弯液面形状为凹形；或者形成一个凸形的弯液面，该弯液面具有小于第一主曲率半径的第二主曲率半径。提供形成凹形弯液面的第三液体108；或者形成凸形的弯液面，该弯液面的主曲率半径小于将形成内腔110的第二液体106的主曲率半径，这有利于减小或降低第一液体104的表面张力，使得第二液体106能够穿过第一液体104并形成内腔110。
如图1A至图1C的下部图像可以看出，通过这种方式，具有比第一液体凝胶前体104更低粘度的第二液体106的被动压力驱动流可以在第一液体104中形成大致为圆形或椭圆形的内腔110。在一些实施例中，可以利用重力在一个入口和另一个入口之间施加压力差来促进被动泵送，例如通过调整微流体网络的倾斜度。在其他实施例中，不使用第三液体108，而是施加外部压力来迫使第二液体106通过第一液体104。
内腔的尺寸可以随着多种因素而变化，包括但不限于通道的尺寸、第一液体和第二液体之间的相对粘度、流经第一液体的第二液体的体积流量和/或压力，以及它们的任何组合。在一些实施例中，内腔的横截面积可以超过通道的横截面积的50％。在一些实施例中，内腔的横截面积可以超过通道的横截面积的90％，例如98％或99％。在一些实施例中，内腔可具有大约10μm到大约1000μm的尺寸。在一些实施例中，内腔可具有20μm到大约500μm的尺寸，例如50μm到大约250μm。
一旦第一液体104被内腔化，即，使用第二液体106形成了穿过其中的内腔110之后，凝胶前体溶液104的凝胶化或聚合将形成包含有穿过其中的内腔110的凝胶结构，例如细胞外基质凝胶结构。
在一些实施例中，包含凝胶前体溶液的第一液体在内腔化之前被部分凝胶化。在其他实施例中，内腔化在第一液体104的任何凝胶化之前发生。通过对形成入口或出口的任何孔口施加正压或负压，可以从内腔110中抽出第二液体106，并且可以在凝胶化发生之前或之后抽出，从而暴露出凝胶结构的内表面。如图1C的底部图像所示，由第一液体104形成的凝胶结构具有一个面向内腔110的第一表面，和一个面向第二区域116的第二表面，这两个表面都可以通过添加一种或多种细胞类型来进行修饰，这将在后文进行描述。
在一些实施例中，第二液体106本身可包含凝胶前体溶液，能够被一种比第二液体106的粘度更低的穿孔液体内腔化。因此，所描述的方法可以包括通过使第二液体与比第二液体的粘度更低的液体接触，从而形成穿过第二液体的内腔；并允许或引起第二液体在第一凝胶结构中凝胶化，从而形成包含有穿过其中的内腔的层状凝胶结构。通过改变第二液体106的凝胶前体溶液相对于第一液体104的凝胶前体溶液的组成，可以产生分层的、可能同心的系统。具体地，在一些实施例中，第一液体104和第二液体106中的一个或两个都可以独立地包含一种或多种细胞类型，例如一种或多种间充质来源的细胞，例如选自基质细胞、肌细胞、周细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的细胞。
上述方法是针对具有一个毛细管压力屏障的微流体网络进行描述的，该毛细管压力屏障定义了微流体网络的两个区域。但是，应该理解的是，该方法可以应用于更复杂的系统，具有两个或更多的毛细管压力屏障，导致微流体网络有三个或更多的区域，每个区域都有一个或多个入口，并且可以独立地用一个基质凝胶结构进行图案化，该基质凝胶结构可以有或没有内腔，和/或具有一种或多种可以形成类器官体或者排列在所讨论的区域表面的血管的细胞类型。
因此，在一些实施例中，该方法可以包括将另一种液体，例如第二凝胶前体溶液，引入到微流体网络的第二区域，并且让第二凝胶前体溶液沿着毛细管压力屏障的长度方向与凝胶结构接触；通过使第二凝胶前体溶液与一种比第二凝胶前体溶液的粘度更低的液体接触，从而形成穿过第二凝胶前体溶液的内腔；并且允许或引起第二凝胶前体溶液凝胶化，从而形成第二凝胶结构，该第二凝胶结构包括穿过其中的内腔并接触第一凝胶结构，如图2和图3所示。
图2和图3都显示了包括微流体网络的装置200，该微流体网络具有两个分别用212和220表示的毛细管压力屏障。毛细管压力屏障212和毛细管压力屏障220均被设置为从微流体网络的底部或基底突出到通道中的凸起，但是应该理解的是，如本文所述，其他形式的毛细管压力屏障也是可能的。
在图2中，毛细管压力屏障212限定了第一区域214和第二区域216之间的边界。在这个实施例中，毛细管压力屏障220限定了第二区域216和第三区域218之间的边界。
图2的第二幅图显示了被引入到第一区域214中的第一液体204a(一种凝胶前体溶液)，并且在第三幅图像中显示了穿过其中的内腔210的形成。在第一液体204a凝胶化形成凝胶结构之后，第二凝胶前体溶液204b可以被引入到第二区域216中，它也可以按照本文所述的粘性指进法来进行内腔化，从而提供如第三幅图和第四幅图所示的第二内腔222。在第二凝胶前体溶液204b凝胶化以形成内腔化凝胶结构之后，第三凝胶前体溶液可以被引入到第三区域218中，并且形成第三内腔224。
图3显示了可选的步骤顺序，其产生的结果与图2的相同。在图3中，第一区域214可被认为是在微流体网络的中心，与左边的第二区域216之间的边界是毛细管压力屏障212，而第一区域214和第三区域218之间的边界是毛细管压力屏障220。
从图3的第三幅图可以看出，本发明公开的方法和布置方式可以形成具有三个表面的内腔化凝胶结构：第一表面面向管腔210，第二表面面向第二区域216，而第三表面面向第三区域218。虽然这样的布置对于某些应用可能是有利的，但图3也表明，也可以将凝胶前体溶液204b和204c分别引入到第二区域216和第三区域218中，并且通过第二区域216和第三区域218分别形成内腔222和224。
虽然图2和图3中的步骤顺序显示了所有三个区域都被凝胶填充，并且都进行内腔化，但是应该理解的是，只有在第一区域214和第二区域216中形成内腔化的凝胶结构，而保留第三区域218供培养基或测试溶液使用，才可能具有优点。
图4A和图4B显示了另一种装置300，其中除了专用的流体界面入口和出口之外，还设置了孔口340。孔口340可以作为毛细管压力屏障，钉扎第一液体304以使其形成弯液面，并且延伸穿过孔口340的表面。与前面描述的方法一样，第一液体凝胶前体溶液304被引入到装置300的微流体网络中，而第二液体306和第三液体308被引入到微流体网络的两端，以破坏表面张力并引起第一液体304的内腔化。
从图4A和图4B可以看出，内腔310从第二液体306延伸到第三液体308，并且没有延伸到孔口340。因此，可以看出，微流体网络的一个给定区域可以有多个孔口，这些孔口可以被认为是入口或出口，而且内腔化可以被控制，使得内腔只在微流体网络的期望位置(孔口)之间延伸。例如，形成内腔可包括最小化多个孔口中的一个孔口的主曲率半径，以使内腔延伸到那一个孔口，而且只延伸到那一个孔口。这可以通过将第二液体施加到孔口，并且使该孔口的表面张力最小化来实现。
这样，内腔化可发生在孔口平面的下方，从而产生凝胶结构的另一表面。图13显示了从此类装置的上方拍摄的高分辨率图像，通过孔口观察到穿过孔口下方的凝胶的内腔。覆盖图像的箭头指示了凝胶和内腔的路径。
图5的顶部图像显示了一个装置，其中由凝胶前体204a形成的凝胶结构被设置在第一区域214中，并且被毛细管压力屏障钉扎。内腔222穿过凝胶结构，并且衬有细胞小管228，这些细胞可以是内皮细胞或上皮细胞。在没有凝胶结构的第二区域216中，存在第二细胞小管230，小管之间的间质空间标记为“a”。通过减少凝胶结构在第一表面和第二表面之间的厚度和/或分泌一种或多种ECM成分，可以允许或刺激细胞228和/或细胞230重塑凝胶结构。细胞可以通过生长因子、葡萄糖和氧气水平的刺激，从而变得代谢更为活跃或更不活跃。增殖能力更强、活动能力更强的细胞通常会更积极地降解ECM。通过诸如MMP-3、纤溶酶、激肽释放酶、类胰蛋白酶、弗林蛋白酶等激活剂来激活ECM降解和重塑酶(例如MMP或ADAMTS)，将进一步增强ECM降解并减少凝胶结构的厚度。相反，ECM重塑可以通过使用MMP抑制剂、ROCK抑制剂等来抑制，这可以保留更厚的凝胶结构。
从图5的第二幅图可以看出，凝胶基质已经被重塑(在本例中为降解)到了这样的程度，以至于管腔之间的距离已减小到几乎为零，从而导致相邻管腔之间(几乎)发生了直接的细胞-细胞接触。
应当理解的是，存在于微流体网络中的任何细胞都可以重塑凝胶结构，例如通过凝胶前体溶液引入的细胞，或者引入到凝胶结构的内腔中的细胞(作为或通过细胞管腔)，或者引入到面向凝胶结构的微流体网络区域中的细胞。
图5显示了本文所述的装置和方法提供的管腔之间的间隙距离有望通过重塑细胞外基质凝胶而减少到零或接近零。一般来说，可以将一种或多种类型的细胞引入到微流体网络中，并且允许或刺激它们通过减少凝胶结构的厚度来重塑凝胶结构。在一些实施例中，凝胶结构的厚度在凝胶结构的第一表面和第二表面之间被重塑(也就是说，在面向内腔的表面和凝胶结构的外表面之间)。重塑可以包括任何ECM成分的沉积或降解。一种或多种细胞可以分泌一种或多种引起重塑的ECM成分。
细胞外基质凝胶的降解和重塑可以促进细胞的运动或迁移，例如通过定向诸如胶原纤维的基质成分。重塑的ECM通常可在癌症上皮细胞侵袭的区域观察到，会导致诸如厚度减少或纤维方向变化等拓扑变化，但是重塑的ECM也可能影响局部环境中基质、内皮或免疫细胞的行为，因此有必要研究细胞在重塑细胞外基质中的行为，或者细胞对重塑的细胞外基质的反应。本文所述的方法和装置解决了这个需求。
在图5的底部图像中，细胞(在这种情况下是上皮细胞)被允许通过分泌糖蛋白和胶原来重塑ECM，从而在管腔之间形成新的基底膜236。通过这种方式，可以得到更真实的用于研究的共培养模型，而且重塑的ECM在第一表面和第二表面之间的厚度可能接近于零，例如小于1μm的厚度，例如小于500nm的厚度，例如小于250nm的厚度，例如小于100nm的厚度，例如小于50nm的厚度。
本发明相对于在三通道微流体装置中的非内腔化凝胶结构具有特殊的优点，这可以参考图6A和图6B来解释。图6A显示了用于研究三通道系统中的生物结构之间的间质层的分子传输的典型模型。在这个模型中，由凝胶前体溶液形成的凝胶结构被设置在微流体网络的中心区域，由毛细管压力屏障214和220固定。
凝胶结构可包含或由细胞外基质(如胶原或)组成，并且可以包含分散在凝胶中的细胞(例如基质细胞)234b。凝胶结构的右侧是一层具有内腔224的单层细胞230(例如内皮或上皮细胞)小管，而凝胶结构的左侧是由细胞226和232形成的双层小管，例如它们可以是如上所述的周细胞/内皮细胞内衬小管。
在这里将双层和基质细胞作为实例进行介绍。本发明对于两个单层管和ECM凝胶中不添加细胞的情况也同样有效。在这种情况中，任何物质(测试化合物、营养培养基)必须通过双层管或单层管引入到微流体网络中，并且可能不容易到达相邻的凝胶结构和/或其他小管，因为它必须通过形成小管的细胞层-通过-如由细胞226和232形成的双层管内的封闭箭头所示。
相反，如果双层管是在一个如图6B所示的内腔化凝胶结构中形成的，那么则可以保留3通道系统中的一个通道(例如图6B中的第三区域218)用于添加触发剂、药物、染色试剂、标记物或报告分子，或者可用于例如分泌代谢物和基础分泌的细胞因子的取样。由于凝胶结构是由毛细管压力屏障220固定的，而不需要任何膜，所以凝胶的一个表面面向第三区域218，并且可与被引入到第三区域218中的任何溶液接触，从而促进物质通过间质凝胶结构到小管的交换和运输，从而使得第三区域的液体和凝胶结构及管的基底面之间可进行代谢物、营养物、化合物、药物、触发剂、趋化因子、细胞因子和氧气的自由交换。
不言而喻，本领域技术人员将认识到，细胞在细胞外基质环境(即凝胶结构)中仍然可以通过凝胶网络移动。运动性是依靠细胞基质相互作用通过粘着斑(如整合素、肌动蛋白重塑、胶原酶)和许多其他机制使细胞在细胞外基质环境中能够移动实现的。细胞也可能在实验过程中和/或穿过上皮或内皮屏障的过程中迁移进出ECM凝胶。这都是通过凝胶结构中的内腔组分和面向第三区域218的凝胶的自由表面来实现的。
如图7所示，也可将一种或多种细胞引入到微流体网络的第二区域或第三区域，并使细胞至少部分覆盖凝胶结构的第二表面或第三表面，并且微流体网络的第二区域或第三区域至少部分地在第二区域或第三区域中形成小管，例如其中一种或多种细胞选自内皮细胞或上皮细胞；间充质起源的细胞，例如(平滑)肌细胞、周细胞、足细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞。
在图7中，第一区域214表示微流体网络的三个区域的中心区域，该第一区域具有一层由细胞228(例如内皮管)组成的单层管。第二区域216显示为位于第一区域214的右边，并且被显示为没有凝胶结构。在这个实施例中，微流体网络的第二区域216和在第一区域214(该第一区域214面向第二区域216)中形成的凝胶的第二表面，包括一层形成小管的内皮细胞或上皮细胞。也就是说，细胞230覆盖了区域216的表面以及第一区域214的凝胶结构的表面，以在第二区域216中形成小管。
因此，小管本身形成了贯穿第二区域216的内腔224，其可用于营养培养基或测试溶液的灌注。在图7中，第三区域218设置了凝胶结构和细胞系统。值得注意的是，虽然这些图示说明了所有的小管基本上都被凝胶结构中存在的细胞(例如间充质起源的细胞)包围，但是也可能有其他的模型，其中只有第一小管和/或第二小管基本上被凝胶结构中存在的细胞(例如间充质起源的细胞)包围。
一般来说，将一种或多种细胞或细胞类型引入到微流体网络中，可以包括将含有细胞的液体通过微流体网络从一个入口灌注到另一个入口/出口。灌注液体可包括，例如，从入口到出口施加压力差，和/或调整微流体网络的倾斜度。值得注意的是，含有细胞的液体可以通过任何设置了流体界面的微流体网络区域进行灌注，以及通过该区域中存在的任何内腔和/或细胞小管进行灌注。在一些实施例中，将一种或多种细胞或细胞类型引入到微流体网络中，可包括将细胞沉淀引入或接种到微流体网络的一个区域中。在一些实施例中，在将细胞沉淀接种到一个区域之前，可先引入低粘度的液体，例如培养基。
在一些实施例中，第一区域到第三区域中的任何一个区域都可包括一个包含一种或多种类型的免疫细胞的凝胶结构，这些免疫细胞可选自但不限于T细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和B细胞。该一种或多种类型的免疫细胞可以存在于被引入到微流体网络的一个区域中的凝胶前体溶液中，或者可以设置在凝胶结构的内腔中，例如由细胞(例如内皮细胞或淋巴管)内衬的一个内腔，并且允许或刺激它们粘附到第一表面，例如内皮细胞或淋巴管，允许它们从腔内侧渗出到ECM侧。免疫细胞也可以被添加到微流体网络的一个没有任何凝胶结构的区域中，该区域被配置为营养培养基和/或测试溶液的灌注导管。
图8显示出了包含两个毛细管压力屏障214和220的示例装置，其标志了微流体网络的第一区域214、第二区域216和第三区域218之间的概念边界。三个区域都被分别含有凝胶前体溶液204a、204b和204c的液体填充，这些液体随后被内腔化以形成内腔210、222和224，并且被允许凝胶化。
首先看第一区域214，可知由凝胶前体溶液204a产生的凝胶包含细胞234a，这些细胞优选作为凝胶前体溶液的一部分被引入，但也可以在凝胶化后被引入，并且被刺激或被允许穿过上皮或内皮血管壁，迁移到凝胶结构中。细胞234a的细胞类型可以根据需要选择。在一些实施例中，细胞234a可包括一种或多种选自内皮细胞或上皮细胞的细胞；间充质、内胚层和外胚层起源的细胞，例如(平滑)肌细胞、周细胞、足细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、星形胶质细胞；或者一种或多种球体或类器官。在使用该装置提供研究血脑屏障的模型的实施例中，细胞234a可包括分散在由前体溶液204a形成的凝胶基质中的人类原代星形胶质细胞。
同样，由前体溶液204b和204c在第二区域216和第三区域218中形成的凝胶结构也可包括一种或多种分散在凝胶结构中的细胞234a和234b，这些细胞独立地选自内皮细胞或上皮细胞；间充质起源的细胞，例如(平滑)肌细胞、周细胞、足细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、星形胶质细胞；或者一种或多种球体或类器官。
因此，该方法可包括将间充质起源的细胞引入到微流体网络中，例如选自基质细胞、(平滑)肌细胞、周细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的细胞，以便基本上包围处于腔内的管和/或第二区域的管。间充质起源的细胞可存在于凝胶前体溶液中，以便从一开始就基本上将管包围，或者该细胞可通过运输通道引入到微流体网络中，然后通过凝胶结构进行迁移，以便基本上将管包围。
在一些实施例中，凝胶结构包含上皮细胞，这些细胞在培养过程中可以根据培养基的组成、可能存在的其他细胞类型和细胞外基质而增殖和/或分化。因此，在引入微流体网络后，要么使用水溶液，优选使用生长培养基，要么使用凝胶(前体)，上皮细胞就被允许在凝胶结构中增殖和/或分化。通过将培养基引入到微流体网络中，并在适合的条件下继续培养，从而实现一种或多种类型的细胞或细胞聚集体的培养，例如上皮细胞的培养。
在第二个实施例中，存在于凝胶或凝胶前体溶液中的至少一种细胞或细胞聚集物包括上皮细胞和间充质来源的细胞，例如成纤维细胞、平滑肌细胞、肌成纤维细胞、周细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。因此，在通过使用凝胶(前体)引入微流体网络后，上皮细胞和间充质来源的细胞即可相互作用并形成一种可选择性地增殖和/或分化的组织。
在另一个实施例中，至少一种细胞包括上皮细胞和间充质来源的细胞、免疫细胞(如T细胞、巨噬细胞、库普弗细胞、树突状细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞、B细胞、粒细胞、肥大细胞)和/或内皮细胞的任意组合。
所述方法还包括将一种或多种细胞引入凝胶结构的内腔中，例如其中所述的一种或多种细胞包括内皮细胞、上皮细胞或间充质来源的细胞，这些细胞被允许附着在内腔的表面并在内腔中形成管状结构。在一些实施例中，面向内腔的凝胶的表面可能包括一层内皮细胞或形成第一小管的上皮细胞。
如图8所示，第一区域214中的内腔210内衬有两种不同的细胞类型，以形成细胞226的主要细胞小管和位于主要小管226内的次要小管232，而内腔222和224则衬有细胞228和230。
例如，细胞228和/或230可以是内皮细胞，而面向内腔222和224的凝胶结构的第一表面可以被内皮细胞228和230填充，以生成具有开放内腔的内皮管状结构。但是，根据所研究的模型的类型，细胞228和230也可以选自上皮细胞或如其他地方所述的间充质来源的细胞。
在一个实施例中，引入内腔的液体可包含内皮细胞。一般来说，内皮细胞被认为是覆盖整个循环系统内表面的细胞，从心脏到最小的淋巴毛细血管。当与血液接触时，这些细胞被称为血管内皮细胞，当与淋巴系统接触时，它们被称为淋巴内皮细胞。在一种特定的实施方式中，该方法包括将内皮细胞引入微流体网络的内腔的步骤，并引起或允许所述内皮细胞排列在面向内腔的凝胶的表面，即引起或允许内皮细胞在内腔中形成小管。
另外，通过依次将细胞溶液引入内腔，也有可能形成多层小管，就像第一区域214中的内腔210一样。例如，细胞226可以是周细胞，内腔210可首先被周细胞226填充，这些周细胞被允许或被刺激以在内腔210中形成单层或多层小管。细胞232可以是内皮细胞，并且可以被引入以生成一个由周细胞/内皮细胞覆盖的小管，其中内皮细胞覆盖了周细胞。或者，多层小管也可以通过引入两种不同细胞类型的溶液(例如内皮细胞和平滑肌细胞)并让不同细胞类型自我组织成多层小管来实现。
如上所述，该方法可包括将一种或多种免疫细胞引入微流体网络中。在一些实施例中，该方法可包括将一种或多种免疫细胞，例如T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和/或B细胞引入内腔和/或凝胶结构中，使得一种或多种免疫细胞粘附在凝胶的第一表面，或者小管的第一表面(当小管存在的时候)或者存在于凝胶结构中。一旦引入到微流体网络中，可刺激或允许免疫细胞粘附在小管的上皮或内皮血管壁上，并且之后可选择性地穿过血管壁并进入凝胶结构中。
另外，免疫细胞可粘附在微流体网络中形成的内皮层上。免疫细胞也可以被刺激或允许迁移通过凝胶结构，以便观察其在微流体网络的另一区域中的行为，这将在下文结合使用由本发明的方法和装置产生的微流体网络进行的分析进行描述。
在图5到图8中，层230可以是例如上皮小管，包括但不限于肠小管(包括小肠、结肠、回肠、直肠、十二指肠)、视网膜色素上皮、肾上皮(包括近曲小管、远端小管、亨利氏袢、足细胞)、皮肤、胃上皮、胆管。
第二小管228或232可以是血管或淋巴管，其任选地被周细胞、足细胞、平滑肌细胞、间充质来源的细胞226包围。沉积在间质空间234a和234b的细胞可以是例如间充质来源的细胞，例如纤维细胞、肌纤维细胞或肌肉组织，以及驻留免疫细胞或浸润的免疫细胞。
通过这种方式，可再现完整的人体器官的功能单元。以肠道模型为例，该模型包含了与人体肠道相关的所有元素，包括上皮层、粘膜下层、基质细胞、血管室、淋巴部分以及模拟免疫激活过程的可能性。上皮管的内腔甚至可以补充粘液和微生物群。
这种模型对于疾病建模(例如炎症性肠病)以及模拟化合物的吸收和运输非常重要。本领域技术人员熟知，几乎任何器官的功能单元都包含了这些相同的元素，并且可在正确细胞的帮助下相应地进行建模。
检测
本发明还涉及一种或多种使用本文所述的装置或由本文所述的方法制备的内腔化凝胶结构进行的检测。
这些分析方法可包括屏障功能检测、跨上皮电阻(TEER)检测、免疫细胞粘附检测、免疫细胞迁移检测、转运体检测和血管舒张或收缩检测。然而，本发明并不限于使用本文所述的装置或由本文所述的方法制备的内腔化凝胶结构来进行这些检测，对于本领域技术人员而言，本发明能够根据细胞类型、细胞来源和要进行的测试进行任意数量的检测。
在一些实施例中，前文所述的引入到微流体网络中的任何一个或多个细胞或细胞聚集体可包括细胞系，包括永生化细胞系或器官样体系，原代细胞，诱导性多能干细胞衍生细胞，并且可以是但不限于簇状细胞，印刷细胞、类器官、组织活检、肿瘤组织、切除的组织材料、器官外植体或胚胎体。
一个或多个细胞或细胞聚集体，其获自、源自或表现出与特定生物组织相关的表型，例如肝脏、肾脏、大脑、乳房、肺、皮肤、胰腺、肠道、视网膜或头发。一个或多个细胞或细胞聚集体，可以包含健康的或病变的组织，也可以从患者身上获得或来源于患者。细胞可以是中胚层、内胚层或外胚层来源的细胞。
在一个实施例中，用于使内腔血管化的内皮细胞可从患者身上获得或来源于患者。在一个实施例中，从患者身上获得或来源于患者的内皮细胞可以包括血液外生长内皮细胞，或者来源于多能干细胞的内皮细胞。
通过使用自体内皮细胞，结合包含来自同一患者的一个或多个细胞或细胞聚集体组成的生物组织，血管化系统特别适合于个性化医疗领域以及临床模型和确定或预测患者对特定药物的可能反应的检测的开发。
例如，使用从患者身上获得的肿瘤组织，以及使用按照上述方法从患者身上获得的内皮细胞对该肿瘤组织进行血管化，可对患者对化疗治疗的可能反应进行完整的分析。此外，将一种或多种类型的患者自身的免疫细胞引入到这样的系统中，也可对患者对给定药物的可能免疫反应进行判断。
屏障功能检测
屏障功能检测是一种研究上皮或内皮细胞的性质和行为的方法，即形成上皮或内皮小管的细胞以及它们对物质的渗透性。这些检测可包括添加染料物质如荧光素，并观察染料物质是否能够通过上皮或内皮层扩散。
本发明提供了一种简单的屏障功能检测方法。例如，装置可设置有如图8的顶部图像中所描绘的微流体网络，其中细胞228和230可以是上皮细胞或内皮细胞。可以将一种扩散染料引入腔222，并且系统监测扩散染料在周围的凝胶基质、由细胞230小管形成的内腔和自由运输通道中的任何一个或多个部分中的存在。
跨上皮电阻(TEER)检测
TEER检测是一种特殊的屏障功能检测，它通过监测上皮细胞层的电阻来研究屏障的渗透性。例如，WO 2019/166644中描述了在微流体网络中的细胞层上进行的TEER检测，其内容通过引用并入本文。从WO 2019/166644的图2可以看出，例如本文所述的那些3通道微流体网络可以配备多达六对电极来测量TEER屏障功能检测中的电活动。
免疫细胞粘附检测
正如前文所述，本发明的方法可包括将免疫细胞引入到微流体网络中。免疫细胞可以是如上所述的免疫细胞，并且可以在网络的任何位置处被引入到微流体网络中。
免疫细胞粘附，例如T细胞与上皮或内皮组织的粘附，是炎症反应中的一个关键步骤，因此，需要能够研究免疫细胞与这些组织的粘附的系统，例如包含微流体网络的装置。
因此，本发明还涉及本文所述的装置和微流体网络在研究免疫细胞与生物结构的粘附的检测中的用途。
免疫细胞迁移检测
正如前文所述，本发明的方法可包括将免疫细胞引入微流体网络中。免疫细胞可以是如上所述的免疫细胞，并且可以在如上所述的网络的任何位置处被引入到微流体网络中。
本发明可以研究免疫细胞通过上皮和内皮的迁移动力学和调节机制。
针对重大疾病开发可靠的免疫治疗方法是一项备受关注的工作，因此，免疫细胞迁移检测，特别是观察调节性T细胞迁移的检测，可以帮助我们理解Treg在自身免疫性疾病中的潜在功能作用，包括多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎以及肺癌、结肠癌、鼻咽癌和乳腺癌等癌症。例如，为了防止同种异体移植排斥，Treg必须迁移到移植物和淋巴结。此外，功能抑制性Treg在肿瘤部位的迁移和积累与癌症的进展有关。
因此，本发明还涉及本文所述的装置和微流体网络在研究免疫细胞迁移的检测的用途。
转运体检测
正如前文所述，本发明涉及具有微流体网络的内腔化凝胶结构的内腔的单层生物结构和更复杂的多层生物结构的形成。这些生物结构可以再现体内环境，例如血脑屏障、肠道以及其他器官如肾脏或肝脏。
理解潜在的治疗药物如何通过这些生物结构进行转运具有高度临床重要性，因为任何给定的生物膜或屏障的渗透性不足将会导致候选药物的效力降低。在微流体网络的内腔化凝胶结构中形成生物学相关的组织，可以让我们能够对任何涉及药物运输的转运蛋白进行药代动力学研究。例如，一种化合物可以被施用到小管的顶端，例如肠道小管，然后可以在存在于内腔化ECM的血管中测量其浓度。该化合物可通过荧光成像、质谱、ELISA等方法进行定量。
血管舒张或血管收缩检测
所述装置和微流体网络可基于上皮或内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、心肌细胞等形成具有内腔的生物组织，例如，内皮细胞可以形成内皮血管，上皮细胞可以形成肠道型内腔或肾小管型内腔，心肌细胞可以形成心房或心室型内腔。
因此，具有此类组织的微流体网络特别适合于研究诸如血管舒张/收缩、肠道蠕动、肾小管压缩、血管压缩或心肌细胞驱赶等过程。支撑小管的(非常薄的)ECM很容易因收缩或扩张的小管或其他移动组织而变形，这使得它比细胞直接附着在更刚性的表面上的构造更能敏感地检测组织的运动。
因此，本发明还涉及本文所述的装置和微流体网络在血管舒张或收缩的检测以及研究肠道蠕动、肾小管压缩、血管压缩和心肌细胞驱赶的检测的用途，以研究刺激剂或抑制剂对生物系统的影响。
实施例
现在将参考以下实施例以示例的方式描述本发明。
实施例1
在内腔和凝胶上接种细胞
材料：
EGM-2TM培养基：
EBM-2基础培养基(Lonza,Cat.No.CC-3156)
EGM-2SingleQuots补充剂(Lonza,Cat.No.CC-4176)
1％青霉素/链霉素(Sigma,Cat.No.P4333)
EMEM:
Eagle最低必需培养基(EMEM)(ATCC,Cat.No.30-2003)
10％胎牛血清(Gibco,Cat.No.16140-071)
1％非必需氨基酸(LifeTech,Cat.No.11140050)
1％青霉素/链霉素(Sigma,Cat.No.P4333)
HBSS(Hanks平衡盐溶液；Sigma Aldrich,Cat.No.H6648)
PBS(磷酸盐缓冲盐水；Gibco,Cat.No.700130656)
在本实施例中，使用了3通道的(MIMETAS)，其通道宽度为400μm，包含一个由3个通道和两个毛细管压力屏障组成的微流体网络。
中间通道在入口处用中性牛I型胶原蛋白溶液(EZ Gel 5mg/ml，来自Advanced BioMatrix)填充；该溶液在毛细管压力屏障处被固定，使上下通道的气液界面处形成一个独立的弯液面。
在中间通道的入口处加入30μL的HBSS溶液，并在形成圆顶的中间通道的出口处的孔中加入1μL的含5％FBS的PBS溶液。这些溶液的粘度都低于EZ Gel。由于液滴的表面张力和拉普拉斯压力，产生了从出口向入口的压力，从而引发了内腔化。1分钟后，在出口处加入50μL的HBSS溶液，并将OrganoPlate在37℃和5％CO2的湿度控制环境中放置1小时。
Fleming等人发表的ECMs流变学的代表性测量结果(https://doi.org/10.1063/1.5067382)。Poon发表了常用的细胞培养基的粘度(https://doi.org/10.1101/2020.08.25.266221)。
为了进行细胞接种，将1μL含有10,000个细胞/μL的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞沉淀接种在中间通道的出口处。
让细胞贴壁2-6小时。之后，向中间通道加入EGM-2细胞培养基使得入口和出口处的体积都为50μL，并将放置在一个摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。
2天后，通过同样的方法在上层通道的入口处加入Caco-2细胞，将含有6,000个细胞/μL的Caco-2细胞沉淀物接种在上层通道的出口处。让细胞贴壁2-6小时。贴壁之后，将EMEM完全培养基从上层通道加入，使入口和出口处都含有50μL的EMEM完全培养基。被放置在一个摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。
在1-3天内，两种类型的细胞在内形成小管，由<200μm的ECM分隔。细胞培养维持10天，之后用3.7％福尔马林溶液固定。对Caco-2细胞进行上皮细胞粘附分子(EPCAM)染色，对HUVEC细胞进行VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin)染色，由此获得的共聚焦3D重建如图9A和图9B所示。图9A显示了沿着小管的视图，而图9B显示了从上方观察的视图。在这两个图中，左边的小管是由Caco-2细胞形成的，右边的小管是由HUVEC细胞形成的。可以清楚地看到毛细管压力屏障214的位置和由毛细管压力屏障214导致的小管的几何形状，特别是HUVEC小管的几何形状。
从这些图中还可看出，Caco-2细胞和HUVEC细胞接触紧密，促进了组织培养模型中的细胞-细胞通讯，使组织培养模型更接近于体内的情况。取决于保存时间的长短，该接触的距离为15-150μm。
在另一个实施例中，Caco-2细胞以与上述相同的方式接种在底层通道中，形成由3个小管组成的结构，参见图10。这说明了第三通道在支撑小管方面的作用。
另外两个实施例展示了如何在后续的过程中使两个甚至三个通道形成内腔。图11A显示了2通道OrganoPlate中的内腔ECM的两个Caco-2小管的示意图，其中图11B显示了由实验获得的相差显微镜图像的平面图。按照上述步骤，先在顶部通道中引入Purecol EZ溶液，并使用粘性指进图形形成内腔。然后在底部通道中引入Purecol EZ溶液并形成内腔。Caco-2细胞被接种在顶部通道的内腔中，HUVEC细胞被接种在底部通道的内腔中。这样，一个由两个包含小管的内腔ECM组成的结构就形成了。
通过类似的方式，图12显示了由三个内腔ECM组成的结构，其中三个内腔ECM均包含由Caco-2细胞组成的小管。
实施例2
内腔血脑屏障模型
内皮细胞培养基：
内皮细胞培养基(Cellbiologics，Ca.No.H1168)
内皮细胞培养基补充试剂盒(Cellbiologics，Ca.No.H1168)
NSC分化培养基：
内部专有配方，包括：
Neurobasal培养基(Gibco,Cat.No.21103049)
在本实施例中，使用了通道宽度为400μm的3通道(MIMETAS)，其包含由3个通道和两个毛细管压力屏障组成的微流体网络。
顶部通道在入口处填充中性牛I型胶原蛋白溶液EZ Gel 5mg/ml(Advanced BioMatrix)；该溶液在毛细管压力屏障处被固定，使上下通道的气液界面处形成一个独立的弯液面。
在顶部通道的入口处加入30μL的HBSS溶液，并在如实施例1的形成圆顶的顶部通道的出口处的孔中加入1μL的含5％FBS的PBS溶液。由于液滴的表面张力和由此产生的拉普拉斯压力，产生了从出口向入口的压力。1分钟后，在出口处加入50μL的HBSS溶液，并将OrganoPlate在37℃和5％CO2的湿度控制环境中放置1小时。
为了在凝胶中接种星形胶质细胞，将2μL4 mg/mL(Cultrex)的胶原蛋白I中的星形胶质细胞悬浮液接种在中间通道的出口处，每μL该悬浮液含有5000个星形胶质细胞。
将细胞置于37℃和5％CO2的湿度控制环境中附着2-6小时。
然后，将2μL含有15,000个细胞/μL的神经元细胞沉淀接种到底部通道的出口中。
让细胞贴壁2-6小时。随后，在底部通道加入NSC分化培养基(Gibco)，使入口和出口处的体积为50μL，并将放置在摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。
在1-7天内，星形胶质细胞在中间通道的凝胶和底部通道的神经元中形成了细胞网络。7天后，用同样的方法在顶部通道接种人脑微血管内皮细胞(HBMEC)，即将1μL含有10,000个细胞/μL的HBMEC细胞沉淀接种在顶部通道的出口处。让细胞贴壁2-6小时。
细胞附着后，将细胞培养基(Cell Biologics)加入顶部通道，使入口和出口处都含有50μL的细胞培养基(Cell Biologics)。将放置在摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。每2-3天更换一次顶部和底部通道的培养基。
在1-3天内，HBMEC细胞在内形成了小管，并与凝胶中的星形胶质细胞直接接触。细胞培养14天后，使用荧光素钠(稀释比1:100)和4.4kDa TRITC(稀释比1:50)对HBMEC细胞进行了屏障完整性检测。
图14(胶原蛋白I中的星形胶质细胞)和图15(中的星形胶质细胞)显示了这些实验结果的高分辨率图像。从这两幅图中可以看出，HBMEC细胞和星形胶质细胞之间接触紧密，促进了细胞间的通讯，使组织培养模型更接近于体内的情况。
实施例3
套管式内皮细胞/周细胞共培养
MV2培养基：
MV2(Promocell,Cat.No.C22022)
补充剂混合物(Promocell,Cat.No.C39226)
1％青霉素/链霉素(Sigma,Cat.No.P4333)
周细胞培养基：
周细胞生长培养基(Promocell，Cat.No.C-28041)
在本实施例中，使用了通道宽度为400μm的3通道(MIMETAS)，其包含由3个通道和两个毛细管压力屏障组成的微流体网络。
顶部通道在入口处填充中性牛I型胶原蛋白溶液EZ Gel 5mg/ml(Advanced BioMatrix)；该溶液在毛细管压力屏障处被固定，使上下通道的气液界面处形成一个独立的弯液面。
在顶部通道的入口处加入30μL的HBSS溶液，并在如实施例1的形成圆顶的顶部通道出口处的孔中加入1μL的含5％FBS的PBS溶液。由于液滴的表面张力和由此产生的拉普拉斯压力，产生了从出口向入口的压力。1分钟后，在出口处加入50μL的HBSS溶液，并将OrganoPlate在37℃和5％CO2的湿度控制环境中放置1小时。
为了接种周细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，将1μL含有15,000个细胞/μL的HUVEC和5,000个细胞/μL的胎盘周细胞的细胞沉淀接种到顶部通道的出口。由于细胞沉淀的表面张力，细胞悬浮液通过拉普拉斯压力被驱赶到微流体网络中。
让细胞贴壁2-6小时。随后，在顶部通道加入MV2培养基和周细胞生长培养基的1:1混合液，使入口和出口处的体积都为50μL，并将放置在摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。
在1-3天内，细胞在共培养物中自行组织起来。HUVEC在内形成小管，胎盘周细胞迁移到ECM中并保卫细胞小管。中间和底部的通道都充满了培养基。图16A显示了套管式HUVEC/周细胞共培养的横截面示意图，图16B显示了套管式HUVEC/周细胞共培养的由实验获得的共聚焦显微镜截面图。
实施例4
凝胶中基质细胞的三重共培养
MV2培养基:
MV2(Promocell,Cat.No.C22022)
补充剂混合物(Promocell,Cat.No.C39226)
1％青霉素/链霉素(Sigma,Cat.No.P4333)
EMEM:
Eagle最低必需培养基(EMEM)(ATCC,Cat.No.30-2003)
10％胎牛血清(Gibco,Cat.No.16140-071)
35 1％非必需氨基酸(LifeTech,Cat.No.11140050)
1％青霉素/链霉素(Sigma,Cat.No.P4333)
在本实施例中，使用了通道宽度为400μm的3通道(MIMETAS)，其包含由3个通道和两个毛细管压力屏障组成的微流体网络。
在中间通道的入口处填充中性牛I型胶原蛋白溶液EZ Gel 5mg/ml(Advanced BioMatrix)，其中含有浓度为5,000个细胞/μL的肠道成纤维细胞。该溶液在毛细管压力屏障处被固定，使上下通道的气液界面处形成一个独立的弯液面。在中间通道的入口处加入30μL的HBSS溶液，并在如实施例1的形成圆顶的中间通道出口处的孔中加入1μL的含5％FBS的PBS溶液。由于液滴的表面张力和由此产生的拉普拉斯压力，产生了从出口向入口的压力。在出口处加入50μL的HBSS溶液，并将OrganoPlate在37℃和5％CO2的湿度控制环境中放置1小时。
为了细胞接种，将1μL含有10,000个细胞/μL的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞沉淀接种在中间通道的出口处。让细胞贴壁2-6小时。随后，将MV2细胞培养基添加至中间通道，使入口和出口处的体积为50μL，并将放置在摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。2天后，通过相同方式将Caco-2细胞添加到顶部通道的入口处，将含有6,000个细胞/μL的Caco-2细胞沉淀接种到顶部通道的出口处。让细胞贴壁2-6小时。附着之后，将完全EMEM培养基添加到顶部通道，以使得入口处和出口处均包含50μL的完全EMEM培养基。将/>放置在摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。
在1-3天内，两种类型的细胞在内形成小管，被<200μm的ECM分隔开。凝胶中含有包裹HUVEC小管的成纤维细胞且位于HUVEC和Caco-2小管之间。图17A显示了三重共培养物的横截面示意图。
细胞培养维持7天，之后用3.7％福尔马林溶液固定。对Caco-2细胞进行上皮细胞粘附分子(EPCAM)染色，对HUVEC细胞进行VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin)染色，对包括成纤维细胞在内的三种细胞类型均进行肌动蛋白染色，由此得到的共聚焦3D重建如图17B所示。
实施例5
可视化收缩内腔
MV2培养基:
MV2(Promocell,Cat.No.C22022)
补充剂混合物(Promocell,Cat.No.C39226)
1％青霉素/链霉素(Sigma,Cat.No.P4333)
在本实施例中，使用了通道宽度为400μm的3通道(MIMETAS)，其包含由3个通道和两个毛细管压力屏障组成的微流体网络。该网络在观察窗处(3个通道汇合的地方)填充了50μL的HBSS溶液，以为板提供额外的湿度。
在中间通道的入口处填充中性牛I型胶原蛋白溶液EZ Gel 5mg/ml(Advanced BioMatrix)；该溶液在毛细管压力屏障处被固定，使上下通道的气液界面处形成一个独立的弯液面。
在中间通道的入口处加入30μL的HBSS溶液，并在如实施例1的形成圆顶的中间通道出口处的孔中加入1μL的含5％FBS的PBS溶液。由于液滴的表面张力和由此产生的拉普拉斯压力，产生了从出口向入口的压力。1分钟后，在出口处加入50μL的HBSS溶液，将OrganoPlate在37℃和5％CO2的湿度控制环境中放置1小时。
为了细胞接种，将1μL含有10,000个细胞/μL的原代人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)和2,500个细胞/μL的原代人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)的细胞悬浮液接种在中间通道的出口处。由于细胞沉淀的表面张力，细胞悬浮液通过拉普拉斯压力被驱赶到微流体网络中。
让细胞贴壁2-6小时。随后，在中间通道加入MV-2培养基，使入口处和出口处的体积都为50μL，并将放置在摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。在1-3天内，细胞在/>内创建的内腔内形成小管。
由于内腔中的ECM小于200μm，所以可以观察到小管受到刺激后的收缩。为此，细胞首先在第3天暴露于浓度为1μM、10μM和100μM的去甲肾上腺素，然后在第6天暴露于浓度为5μM、50μM和500μM的西地那非，包括仅含培养基和载体的对照。使用ImageExpress Nano相差显微镜(Molecular devices)每隔1分钟拍摄一次图像，持续拍摄30分钟。
图14A到14C展示了HCAEC和HCASMC共培养物在暴露于西地那非后的收缩情况。图18A是暴露前拍摄的；图18B是暴露后30分钟拍摄的；图18C显示了的复合轮廓说明了内腔的直径在受到刺激作用后发生了变化。由于内腔化过程中产生的ECM很薄，所以只需要很小的力就可以实现这种可视化。
实施例6
T细胞从上皮小管迁移到肿瘤细胞
MCDB131培养基:
MCDB131(Thermo Fischer,Cat.No.10372019)
10ng/ml hEGF(Sigma,Cat.No.E9644)
1μg/ml氢化可的松(Sigma,Cat.No.H0135)
10mM L-谷氨酰胺(Sigma,Cat.No.G7513)
10％Foetal胎牛血清(ATCC,Cat.No.30-2020)
1％青霉素/链霉素(Sigma,Cat.No.P4333)
AIM-V培养基:
AIM-V(Thermo Fischer,Cat.No.12055091)
在本实施例中，使用了通道宽度为400μm的3通道(MIMETAS)，其包含由3个通道和两个毛细管压力屏障组成的微流体网络。
在中间通道的入口处填充中性牛I型胶原蛋白溶液EZ Gel 5mg/ml(Advanced BioMatrix)；该溶液在毛细管压力屏障处被固定，使上下通道的气液界面处形成一个独立的弯液面。
在中间通道的入口处加入30μL的HBSS溶液，并在如实施例1的形成圆顶的中间通道出口处的孔中加入1μL的含5％FBS的PBS溶液。由于液滴的表面张力和由此产生的拉普拉斯压力，产生了从出口向入口的压力。1分钟后，在出口处加入50μL的HBSS溶液，将OrganoPlate在37℃和5％CO2的湿度控制环境中放置1小时。
为了细胞接种，将1μL含有10,000个细胞/μL的原代人乳腺上皮细胞(HMEC)沉淀接种在顶部通道的出口处。让细胞贴壁2-6小时。将MCDB131细胞培养基添加至顶部通道，使入口处和出口处的体积为50μL，并将放置在摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。
5天后，用同样的方法将A375肿瘤细胞添加到中间入口。为此，将2.5μL含有10,000个细胞/μL的A375肿瘤细胞沉淀接种到中间通道的出口处。让细胞贴壁2-6小时。一旦细胞附着之后，就将AIM-V细胞培养基(Thermo Fischer)添加到中间通道，以使入口处和出口处都含有50μL的AIM-V细胞培养基(Thermo Fischer)。将放置在摇摆平台上，以7°的角度、8分钟的间隔进行摇动，使细胞培养基能被动地灌注到内腔中。在1-3天内，上皮细胞在/>内形成小管，并通过小于200μm的ECM与肿瘤细胞分隔开。
由于分隔两种细胞类型的ECM小于200μm，所以可以进行T细胞迁移检测，以探究从上皮小管到肿瘤细胞区室迁移的T细胞数量。为此，在第6天，通过将T细胞沉淀重新悬浮于2.5μM CellTracker CMRA(Invitrogen)中，对从血沉棕黄层分离的T细胞进行荧光标记。标记的T细胞被加入到顶部入口，即顶部通道的上皮小管中。首先，在顶部通道的入口处加入50μL含有400,000个细胞/mL的AIM-V细胞培养基中的T细胞悬液。然后，在顶部通道的出口处加入50μL的AIM-V细胞培养基(Thermo Fischer)。留下细胞进入上皮小管。
在T细胞接种24h、48h和72h后，使用ImageExpress Nano相差显微镜(Moleculardevices)拍摄图像。从图19可以看出，上皮细胞区室和肿瘤细胞区室非常接近，类似于体内情况，T细胞通过ECM迁移到肿瘤细胞区室。
作为对比，参见图20，在常规的3通道上进行了相同的实验，但是顶部通道包含一个上皮小管(如图19所示)，该上皮小管与肿瘤细胞(这次位于底部通道)被约400μm的ECM隔开(在中间通道)。
图21分别显示了图15和图16的系统中T细胞迁移的定量图。从图21可以看出，24小时和48小时后，在使用本发明的方法(图21“内腔化ECM”)形成的肿瘤区室观察到的T细胞数量是上皮细胞和肿瘤细胞被400μm的ECM(图21“常规3通道”)隔开的实验的两倍。
因此，本发明能够实现多种类型的原代细胞的共培养，例如人脑来源的血管细胞(如内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞)以及建立肿瘤模型，在微流体网络中建立系统，使它们的正常的三维空间关系得以保持，特别是只有几十微米的薄的间质层，例如50μm或更少。这一切都是在不使用结构性膜的情况下实现的，因此可以在体外研究这些细胞的行为，同时忠实地模拟体内环境。
上述实施例是为了指导本领域普通技术人员如何实施本发明，并不旨在详细描述在阅读本说明书后显而易见的所有修改和变化。然而，本发明的目的在于将所有此类修改和变化均包括在本发明的范围内，本发明的范围由所附的权利要求书所限定。
Claims (42)
1.一种创建内腔化凝胶结构的方法，包括：
将含有凝胶前体溶液的第一液体引入微流体网络，所述微流体网络包括毛细管压力屏障，该毛细管压力屏障位于大体限定了微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界的位置；
允许第一液体进入微流体网络的第一区域，并让第一液体沿着毛细管压力屏障，从而在微流体网络的第一区域和第二区域之间的边界处形成第一液体的液-气弯液面；
通过将第一液体与第二液体接触形成穿过第一液体的内腔，其中第二液体的粘度低于第一液体的粘度；和
允许或引起第一液体凝胶化，从而形成包含穿过其中的内腔的凝胶结构。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述凝胶结构包括面向所述内腔的第一表面和面向微流体网络的第二区域的第二表面。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述凝胶结构在第一表面和第二表面之间的厚度为200μm或更小，优选小于100μm。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中，
在大体限定了微流体网络的第一区域和第三区域之间的边界的位置处设置第二毛细管压力屏障；和
使第一液体沿着第二毛细管压力屏障，从而形成面向微流体网络的第三区域的凝胶结构的第三表面。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述凝胶包括一种或多种任选地选自下述的细胞外基质：胶原蛋白I、胶原蛋白IV、纤维蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、透明质酸和合成水凝胶。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述凝胶前体溶液与第二液体接触包括：
形成第二液体的弯液面，其形状为凸形并具有第一主曲率半径。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，形成内腔包括：
使凝胶前体溶液与第二液体在微流体网络的第一位置处接触；和
将凝胶前体溶液与第三液体在与第一位置间隔开的第二位置处接触，其中第三液体的粘度低于所述第一液体的粘度。
8.如权利要求7所述的方法，当从属于权利要求6时，其中，所述使凝胶前体溶液与第三液体接触包括：
形成第三液体的弯液面，所述弯液面的形状为凹状；或者所述弯液面的形状为具有第二主曲率半径的凸形，第二主曲率半径小于第一主曲率半径。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述形成内腔包括利用表面张力或重力被动地泵送第二液体通过第一液体。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括，
将第二凝胶前体溶液引入微流体网络的第二区域并允许第二凝胶前体溶液沿着毛细管压力屏障的长度接触凝胶结构；
通过使第二凝胶前体溶液与粘度低于第二凝胶前体溶液的液体接触，形成穿过第二凝胶前体溶液的内腔；和
允许或引起第二凝胶前体溶液胶凝化，以形成第二凝胶结构，该第二凝胶结构包括穿过其中的内腔并与第一凝胶结构接触。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二液体包含凝胶前体溶液。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括，
通过使第二液体与粘度低于第二液体的液体接触，形成穿过第二液体的内腔；和
允许或引起第二液体在第一凝胶结构中胶凝化，以形成包括从中穿过的内腔的层状凝胶结构。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述凝胶前体溶液包含一种或多种间充质来源的细胞，例如选自基质细胞、肌细胞、周细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括：
将一种或多种细胞引入凝胶结构的内腔中，例如，其中所述一种或多种细胞包括内皮细胞或上皮细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述一种或多种细胞包括内皮细胞或上皮细胞，并且所述方法进一步包括：
允许所述一个或多个细胞在内腔表面并在内腔内形成小管。
16.如权利要求2至15中任一项所述的方法，进一步包括：
将一种或多种细胞引入微流体网络的第二区域，并允许所述的一种或多种细胞至少部分地覆盖凝胶结构的第二表面和微流体网络的第二区域，以在第二区域中至少部分地形成小管，例如，其中所述的一种或多种细胞选自：内皮细胞或上皮细胞；间充质来源的细胞，例如(平滑)肌细胞、周细胞、足细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、星形胶质细胞；或一种或多种球体或类器官。
17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，进一步包括：
通过减少第一表面和第二表面之间的凝胶结构的厚度和/或通过分泌一种或多种ECM组分，允许或刺激所述的一个或多个细胞重塑凝胶结构。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，进一步包括：
将间充质来源的细胞引入微流体网络中，以便基本上围绕内腔内的小管和/或第二区域中的小管，所述间充质来源的细胞例如选自：基质细胞、肌细胞、周细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的细胞。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括：
将一种或多种免疫细胞引入到所述内腔和/或所述凝胶中，使得所述一种或多种免疫细胞粘附至所述凝胶的第一表面、或者当小管存在时，使得所述一种或多种免疫细胞粘附至所述小管的第一表面，或者使得所述一种或多种免疫细胞存在于凝胶结构中，所述一种或多种免疫细胞例如：T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和/或B细胞。
20.如权利要求19所述的方法，进一步包括：
刺激或允许所述的一种或多种免疫细胞穿过所述小管的上皮或内皮血管壁，并且任选地迁移通过所述凝胶结构。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述毛细管压力屏障设置在微流体网络的内表面上并且包括可增大水与微流体网络的内表面的接触角的脊、槽或材料线。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微流体网络包括至少两个入口，并且，其中所述至少两个入口连接至所述第一区域。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微流体网络包括至少三个入口，并且，其中所述至少三个入口中的两个入口连接到第一区域，所述至少三个入口中的第三入口连接到第二区域；
优选地，其中所述微流体网络包括四个入口，并且，其中至少四个入口中的两个入口连接到第一区域，其中至少四个入口中的两个入口连接到第二区域。
24.一种装置，包括：
微流体网络，所述微流体网络包括：
至少两个入口；
毛细管压力屏障，该毛细管压力屏障位于限定微流体网络的第一区域和第二区域之间边界的位置；和
凝胶，该凝胶设置在第一区域中，在所述至少两个入口中的两个入口之间延伸，并被毛细管压力屏障限制于第一区域；
其中，所述凝胶包含在所述至少两个入口中的两个入口之间延伸穿过的内腔；凝胶具有面向所述内腔的第一表面，面向所述微流体网络的第二区域的第二表面，并且，第一表面和第二表面之间的凝胶的厚度为200μm或更小。
25.如权利要求24所述的装置，其中，所述装置被配置为允许形成或包括具有薄的间质空间的3D构成的组织。
26.如权利要求24或25所述的装置，其中，所述凝胶的第二表面沿着毛细管压力屏障的长度延伸。
27.如权利要求24至26中任一项所述的装置，其中，所述第一表面和所述第二表面之间的凝胶的厚度为100μm或更小，例如50μm或更小。
28.如权利要求24至27中任一项所述的装置，其中所述内腔基本上是圆柱形的，例如所述内腔包括基本上为圆形的横截面。
29.如权利要求24至28中任一项所述的装置，其中，所述微流体网络包括孔，并且所述凝胶结构形成面向和/或基本上密封所述孔的表面。
30.如权利要求29所述的装置，其中所述内腔不延伸至孔。
31.如权利要求24至30中任一项所述的装置，其中所述毛细管压力屏障设置在微流体网络的内表面上并且包括可增大水与微流体网络的内表面的接触角的脊、槽或材料线。
32.如权利要求24至31中任一项所述的装置，其中，所述毛细管压力屏障在微流体网络的内表面上图案化以模拟生物结构，例如毛细管压力屏障包括正弦曲线形状以模拟隐窝绒毛结构。
33.如权利要求24至32中任一项所述的装置，其中所述凝胶面向所述内腔的表面包括形成第一小管的内皮细胞层或上皮细胞层。
34.如权利要求24至44中任一项所述的装置，其中所述微流体网络的第二区域和面向第二区域的凝胶的第二表面包括形成第二小管的内皮细胞层或上皮细胞层。
35.如权利要求33或权利要求34所述的装置，其中，所述第一小管和/或第二小管基本上被间充质来源的细胞包围，例如，其中间充质来源的细胞存在于所述凝胶结构中。
36.如权利要求34或权利要求35所述的装置，其中通过凝胶从第一小管到第二小管的距离为200μm或更小，例如100μm或更小，例如50μm或更小，例如10μm m或更小，例如1μm或更小。
37.如权利要求24至36中任一项所述的装置，其中所述微流体网络包括第二毛细管压力屏障，该第二毛细管压力屏障限定了微流体网络的第一区域和第三区域之间的边界，或者限定了微流体网络的第二区域和第三区域之间的边界。
38.如权利要求37所述的装置，其中，在所述微流体网络的第三区域中设置凝胶，并且所述凝胶被第二毛细管压力屏障限制在第三区域中。
39.如权利要求24至38中任一项所述的装置，其中，所述凝胶包含一种或多种细胞或细胞类型，例如免疫细胞或间充质来源的细胞。
40.如权利要求24至39中任一项所述的装置，其中，在内腔和/或凝胶中提供一种或多种类型的免疫细胞，例如T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，以使得所述的一种或多种免疫细胞粘附在凝胶的第一表面，或者当小管存在时，使得所述的一种或多种免疫细胞粘附于第一小管的第一表面，或者使得所述的一种或多种免疫细胞存在于所述凝胶结构中。
41.如权利要求24至40中任一项所述的装置，其中所述微流体网络包括至少三个入口，优选为至少四个入口，并且其中至少两个入口连接到所述第一区域，并且其中一个或两个入口连接到所述第二区域。
42.由权利要求1至23中的任一项所述的方法制备的内腔化凝胶结构或权利要求24至39中的任一项所述的装置在检测中的用途，所述检测例如选自下列各项中的一种或多种：屏障功能检测、跨上皮电阻(TEER)检测、免疫细胞粘附检测、免疫细胞迁移检测、转运体检测、血管舒张或收缩检测。
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