CN117794553A - 鉴定共同肿瘤特异性t细胞受体和抗原 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴定跨患者的共同肿瘤特异性T细胞受体(TCR)及其相应抗原的方法。本发明还涉及这些TCR序列、编码所述TCR的核酸、和包括所述TCR和/或编码核酸的T细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴定跨患者的共同肿瘤特异性T细胞受体(TCR)及其相应抗原的方法。本发明还涉及这些TCR序列、编码所述TCR的核酸、和包括所述TCR和/或编码核酸的T细胞。
背景技术
自从已经显示免疫系统能够抵抗和排斥肿瘤以来，人们已经进行了巨大的努力来开发治疗性或预防性癌症疫苗。这些努力在抗原发现中遇到了艰巨的挑战，因为用于疫苗接种的合适肿瘤抗原需要结合三个基本要求。它们必须是免疫原性的以引发有效的治疗反应。它们需要是肿瘤特异性的，以允许安全治疗，尤其是在预防情况中。然而，与病原体相关抗原的交叉反应性在本发明的范围内。最后，需要鉴定在许多患者的肿瘤中表达的共有抗原。
在过去的十年中，开发了二种高通量平台，并广泛用于肿瘤抗原发现。然而，这二者仅在有限的程度上满足要求。完整外显子组测序方法清楚地允许鉴定肿瘤特异性突变抗原。但是除了某些复发性驱动突变外，绝大多数鉴定的突变反应性抗原是患者特异性的。另一方面，基于质谱的方法能够检测不同患者肿瘤中的共同HLA呈递肽。但是证明这些肽的免疫原性和肿瘤特异性仍然是具有挑战性的任务。
用遗传工程化以表达肿瘤反应性嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)或T细胞受体(TCR)进行的过继性免疫细胞疗法(ACT)是用于癌症患者的有希望的治疗策略。在血液系统恶性肿瘤中，针对某些血系特异性细胞表面抗原的CAR-T细胞因其疗效高且副作用可控而获得批准，但在实体瘤中，由于缺乏肿瘤限制表达的细胞表面靶抗原，CAR-T细胞的应用(目前)并不可行。(患者)经遗传工程化以表达肿瘤特异性转基因TCR的T细胞(tsTCRtg-T细胞)代表了有吸引力的替代方案，所述TCR识别来自HLA分子(pMHC)呈递的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原(TAA或TSA)的肽。尽管TAA(例如癌症/种系抗原、分化抗原、过表达抗原)和病毒(v)TSA(在具有病毒病因学的肿瘤中)可以在肿瘤之间广泛共享，并且导致共同pMHC在HLA匹配的患者中的呈递，但绝大多数(非病毒)TSA(新抗原)对于个体癌症是独特的。所得到的各种pMHC必须被认为是个体的私人抗原。然而，在少数情况下，由影响恶性肿瘤的共同驱动基因的点突变或染色体易位所导致的并且在肿瘤之间共有的TSA已经显示是免疫原性的(例如RAS突变、TP53突变、BRAF突变、PIK3CA突变和涉及ALK、ROS、NTRK、RET等的易位)。而且，迄今为止定义不明的抗原种类，如肿瘤特异性隐蔽(“暗物质”)或异常剪接的转录物，具有在肿瘤之间共享并被T细胞识别的潜力。
以前，本发明人已经开发了一种方法，通过比较从TIL获得的CDR3序列与邻近组织中的T细胞来鉴定肿瘤特异性T细胞受体(WO 2017/025564A1)。因此，通过增加患者的肿瘤相对于非肿瘤中T细胞克隆的存在，可能描绘肿瘤特异性。然而，大多数肿瘤特异性抗原通过限于个体患者的突变产生。而私人新抗原可以被个性化的tsTCRtg-T细胞疗法靶向，共享的TAA或TSA是表达匹配的HLA等位基因的患者中现成的tsTCRtg-T细胞疗法的理想靶标。个性化治疗是耗时、昂贵的，并且受FDA和EMA(ATMP，先进医药产品；基因治疗医药产品)高度调控。此外，许多患者的疾病进展速度比个性化疗法的生产速度更快。因此，开发一种通过扫描这些共同肿瘤特异性TCR的TIL库中的相同或高度相似的抗原识别结构域(CDR3α和CDR3β)来鉴定这些共同肿瘤特异性TCR的携带者，从而提供现成的治疗受体，并同时为其它治疗选择提供鉴定共有肿瘤特异性抗原的机会，的方法，是非常有利的。
基于上述现有技术，本发明的目的是提供鉴定共同肿瘤特异性TCR序列及其相应抗原的手段和方法。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题以及在本说明书的从属权利要求、示例、附图和一般说明中说明的另外的有利实施方式来实现。
发明内容
不是从需要在特异性和功能测试中进行严格验证的候选抗原开始，而是一种替代方式是分析不同癌症患者的肿瘤中的T细胞库，以寻找源自共有肿瘤抗原的特定效应。当T细胞浸润肿瘤并引起特异性受体介导的与肿瘤抗原的相互作用时，这种遭遇之后是肿瘤中克隆的激活、增殖和富集。因此，如通过肿瘤和邻近的非肿瘤组织之间TCR克隆型频率的比率定量测定的，这种独特TCR克隆型的优选定位是肿瘤特异性的预测因素。该技术描述于WO2017/025564 A1中。如果在其他患者的肿瘤中检测到这种独特的肿瘤特异性TCR克隆型或结构上密切相关的TCR克隆型，称为TCR聚类，则这表明在这些患者中存在共有的肿瘤抗原。当在HLA匹配的患者中检测到TCR聚类时，这是特别信息丰富的，揭示了呈递共有抗原表位的HLA等位基因的性质。最后一步，完整地阐明TCR聚类，例如通过单细胞技术，将产生对共有抗原具有特异性的α/β-TCR。
这种对共有肿瘤抗原具有特异性的HLA限制性α/β-TCR是重要应用的起点。
作为前所未有的新工具，它们可以在抗原发现中用作特异性探针，指导共享肿瘤抗原的靶向搜索。
作为载体形式的“现成”TCR，它们可用于转导到癌症患者的自体T细胞中以进行免疫治疗干预。适合的是HLA匹配的患者，其是聚类TCR的携带者或已知共有肿瘤抗原的携带者。
由于新的遗传工程技术(CRISPR/Cas9、TALEN、锌指核酸酶)，越来越有可能从健康供体生产同种异体细胞治疗产品，其比从大多数患者更容易获得并且数量更多，并且单一产品可以用于治疗几个患者。这是可能的，因为(自体的以及同种异体的)tsTCRtg-T细胞可以被遗传工程化以具有较低的免疫原性(例如，通过在同种异体情况下敲除内源HLA)、较不易于耗竭/功能障碍(例如，每敲除检查点受体)、以及较不易于诱导移植物抗宿主病(GvHD)或由于敲除内源TCR而具有不可预测的交叉反应性。
除了用α/β-tsTCR转导常规的自体或同种异体CD4+和CD8+T细胞之外，用受体转导另外类型的适应性或先天性免疫细胞，如γδ-T细胞、NKT细胞、和NK细胞，也是选项；上述基因工程技术使得能够用tTSTCR和CD3信号传导结构域共同转导NK细胞，其是在pMHC与TCR接合时细胞激活所必需的。
因此，发现一个以上个体共同共有肿瘤抗原和/或T细胞受体是非常有利的。
因此，需要鉴定共有的肿瘤特异性抗原和/或共有的肿瘤特异性T细胞受体。考虑到患者的HLA是已知匹配的，这将使得能够进行现成的癌症治疗。
为了实现这个目标，有必要开发鉴定这种共有的肿瘤特异性TCR和伴随的共有的肿瘤特异性抗原的方法。
本发明的第一方面涉及一种鉴定共同肿瘤特异性T细胞受体(TCR)的方法。
本发明的第二方面涉及一种鉴定共同肿瘤特异性抗原的方法。
本发明的第三方面涉及根据第一方面的方法鉴定的分离的TCR。
本发明的第四方面涉及编码第三方面所述的TCR的核酸序列。
本发明的第五方面涉及一种分离的自体T细胞，其包括第三方面所述的TCR和/或第四方面所述的核酸序列。
本发明的第六方面涉及用于治疗癌症的第三方面所述的TCR、第四方面所述的核酸序列、或第五方面所述的分离的自体T细胞。
术语和定义
为了解释本说明书，将应用以下定义，并且在任何适当的时候，以单数使用的术语也将包含复数，反之亦然。在以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献冲突的情况下，将以所阐述的定义为准。
本文使用的术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”以及其他类似的形式，以及其语法上的等同形式，其含义是等同的，并且是开放式的，即这些词语中的任何一个后面的一个或多个项并不意味着是对该项或多个项的详尽列举，也不意味着只限于列出的项或多个项。例如，“包括”组分A、B、和C的物可以由组分A、B、和C组成(即，仅含有组分A、B、和C)，或者可以不仅含有组分A、B、和C，而且可以包括一或更多个其它组分。因此，意图并理解的是，“包括”及其类似形式及其语法等同形式，包含“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方式的公开。
在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外明确规定，否则在所述范围的上限与下限之间的到下限的单位的十分之一的每一中间值，和在所述范围中的任何其它陈述的，或中间值涵盖在本发明内，但受所述范围中的任何特定排除的限制。在所述范围包含一个或二个限值的情况下，排除那些所包含的限值中的任一个或二个的范围也包含在本公开中。
本文提及的“约”值或参数包含(且描述)涉及该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包含“X”的描述。
如本文所用，包含在所附权利要求中，单数形式“一”、“或”、和“所述”包含复数指代物，除非上下文另外清楚地指明。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同的含义。标准技术被使用于分子、遗传和生物化学方法(一般见Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,4th ed.(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.以及Ausubel et al.,Short Protocols in MolecularBiology(2002)5th Ed,John Wiley&Sons,Inc.)以及化学方法。
序列
与本文公开的序列相似或同源(例如，至少约70％序列同一性)的序列也是本发明的一部分。在一些实施方式中，氨基酸水平上的序列同一性可以是约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在核酸水平上的序列同一性可以是约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，当核酸片段在选择性杂交条件(例如，非常高严格性杂交条件)下与链的互补物杂交时，存在基本同一性。核酸可以以全细胞、细胞裂解物、或部分纯化或基本纯的形式存在。
在本说明书的上下文中，术语序列同一性和序列同一性百分比是指代表通过逐个位置比较二个比对序列确定的序列比较结果的单一定量参数。用于比对序列以进行比较的方法是本领域公知的。用于比较的序列排列可以通过Smith and Waterman,Adv.App.Math.2:482(1981)的局部同源算法、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的全局排列算法、Pearson-Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.85:2444(1988)的搜索相似性方法，或这些算法的计算机化实施，包含但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。进行BLAST分析的软件是公众可获得的，例如通过国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
比较氨基酸序列的一个例子是使用默认设置的BLASTP算法：期望阈值：10；字长：3；查询范围中的最大匹配：0；基质：BLOSUM62；缺口成本：存在11，扩展1；组成调整：条件组合分数矩阵调整。比较核酸序列的一个例子是使用默认设置的BLASTN算法：期望阈值：10；词量：28；查询范围内最大匹配数：0；匹配/不匹配得分：1.-2；间隙成本：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指使用BLAST程序套件(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403–410(1990))用上述指明的默认参数进行蛋白质和核酸比较得到的值。
提及相同序列而没有指定百分比值暗示100％相同的序列(即相同序列)。
普通生物化学：肽、氨基酸序列
在本说明书的上下文中，术语多肽涉及由50个或更多个氨基酸组成的分子，其形成直链，其中氨基酸通过肽键连接。多肽的氨基酸序列可以代表整个(如生理学上发现的)蛋白质或其片段的氨基酸序列。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包含蛋白质及其片段。多肽在本文中公开为氨基酸残基序列。
在本说明书的上下文中，术语肽涉及由至多50个氨基酸，特别是8至30个氨基酸，更特别是8至15个氨基酸，组成的分子，其形成直链，其中氨基酸通过肽键连接。
氨基酸残基序列从氨基到羧基末端给出。序列位置的大写字母指单字母代码的L-氨基酸(Stryer,Biochemistry,3rd ed.p.21)。氨基酸序列位置的小写字母指相应的D-或(2R)-氨基酸。序列以从氨基到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列用三字母或单字母代码表示，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile、I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、和缬氨酸(Val，V)。
一般分子生物学：核酸序列、表达
术语基因指含有至少一个开放阅读框(ORF)的多核苷酸，其在被转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白质。多核苷酸序列可用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
术语基因表达或表达，或者术语基因产物，可以指核酸(RNA)的产生或肽或多肽的产生，也分别称为转录和翻译，的过程和其产物中的之一或二者，或调节遗传信息的加工以产生多肽产物的任何中间过程。术语基因表达也可应用于RNA基因产物，例如调节RNA或结构RNA(例如核糖体RNA)，的转录和加工。如果表达的多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包含在真核细胞中mRNA的剪接。表达可以在转录和翻译水平上，换句话说，mRNA和/或蛋白质产物上，进行测定。
在本说明书的上下文中，术语核苷酸涉及核酸或核酸类似物结构单元，其寡聚物能够基于碱基配对与RNA或DNA寡聚物形成选择性杂交。在此上下文中，术语核苷酸包含典型的核糖核苷酸结构单元腺苷、鸟苷、尿苷(和核糖基胸腺嘧啶)、胞苷、典型的脱氧核糖核苷酸脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷和脱氧胞苷。它还包含核酸的类似物，例如磷酸二酯、2′-O-甲基硫代磷酸酯、肽核酸(PNA；通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元，其中核碱基连接到甘氨酸的α-碳)或锁核酸(LNA；2′-O、4′-C亚甲基桥连的RNA结构单元)。无论本文中何处提及杂交序列，此类杂交序列可由任何上述核苷酸或其混合物组成。
T细胞生物学
本说明书的上下文中的术语“CDR3”指高变互补决定区3。CDR3的大小特别是特征在于氨基酸(AA)的总数和从Vβ、或Vα或Vγ或Vδ片段中的保守半胱氨酸到Jβ或Jα、Jγ或Jδ片段中的保守苯丙氨酸的位置的各自的核苷酸。
在本说明书的上下文中，术语“T细胞激活/耗竭/分化标志物”是指指示T细胞激活、耗竭、或分化的，T细胞分子，特别是T细胞表面上的分子。
(癌症)免疫疗法
在本说明书的上下文中，术语癌症免疫疗法、生物或免疫调节疗法意在涵盖有助于免疫系统对抗癌症的癌症治疗类型。癌症免疫疗法的非限制性实例包含免疫检查点抑制剂和激动剂、T细胞转移疗法、细胞因子及其重组衍生物、佐剂、和用小分子或细胞疫苗接种。
在本说明书的上下文中，术语“肿瘤样本”是指从患者肿瘤中获取的样本或样本库。肿瘤还可能包含转移灶或转移灶集合。
在本说明书的上下文中，术语“非肿瘤样本”是指从患者肿瘤附近的组织中获取的样本或样本库。
在本说明书的上下文中，术语“肿瘤特异性”特别是指T细胞存在于特定肿瘤中并且特别是在特定肿瘤中显示出优先分布。
在本发明的上下文中，术语“HLA”是指人白细胞抗原，作为通用术语主要组织相容性复合体(MHC)的特定亚组。
HLA超型是基于将具有相似结合特异性的MHC等位基因分组在一起而确定的，即具有相同或相似的所谓锚定氨基酸残基的肽(例如9和10聚体肽中的2和9或10位)。HLA超型进一步描述于Sidney et al.(BMC Immunology 2008,9:1)。
本说明书上下文中的术语单细胞测序是指允许鉴定单细胞的多个编码元件的方法。这包括基因组元件如核或细胞器DNA、其转录物或二者的组合的测序。通常，单个细胞的编码元件物理地、空间地或通过细胞特异性条形码连接，所述条形码允许在测序后元件的正确细胞分配。特别是，使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)以鉴定免疫受体的表达模式和/或可变序列。更特别是，scRNA-seq方法允许通过基于液滴的分选例如10X Genomicschromium技术平行鉴定至少1000个细胞的mRNA。表征细胞表达模式和/或TCR序列的其它替代方法是诸如NanoString Technologies公司的GeoMxTM或CosMxTM或10X Genomics公司的Visium空间基因表达、或ZipSeq(WO 2019/226631 A1)，其能够通过在样品如FFPE(福尔马林固定的石蜡包埋)中的空间分布来关联该信息。
在本说明书的上下文中，术语相关性测序是指允许单个细胞的多个编码元件的统计相关性的方法。这可以通过合并T细胞或包括T细胞库的样品并通过测序鉴定所述集合内的转录物来实现。包括二或更多个转录物的组合的那些库最可能包括共同克隆型，其允许通过统计学出现来指定该组合。最优选的是克隆型的TCR链组合的测序和关联。
聚类
文献(CDHIT(Limin Fu et al.Bioinformatics.2012Dec 1；28(23):3150–2)、iSMART(Hongyi Zhang et al.Clin Cancer Res.2020Mar 15；26(6):1359–1371)、GLIPH(Jacob Glanville et al.Nature.2017Jul 6；547(7661):94–98))中描述的T细胞受体(TCR)序列的聚类通常只对2条TCR链中的一条进行。在α/βT细胞的情况下，这几乎总是β链。已公开的TCR聚类方法的另一个先决条件是关于由TCR通过MHC分子识别的各自的抗原肽的知识。在已知病毒抗原表位的情况下，这些抗原表位被用作用于优化聚类算法的训练集(GLIPH，iSart)，在癌症特异性抗原肽的情况下，由于缺乏已知的肿瘤相关抗原，这是不可能的。
TCRpolyClust方法使用不同的方法。从开始，聚类算法对TCR起作用，TCR具有实验测量的在不同患者中是肿瘤特异性的评分，尽管抗原肽是未知的。此外，该算法明确利用TCR的二条链，并采用多维评分通过HLA型的重叠和各种激活/耗竭/分化标志物表达对患者间TCR聚类进行分级。
TCRpolycluster的示意性描述
在WO 2017/025564 A1中公开了为每个个体患者提供肿瘤特异性TCR(tsTCR)的基本方法：通过取自肿瘤组织和同时取自健康邻近组织的T细胞的CDR3区域的定量下一代测序(NGS)，通过与非肿瘤组织相比在肿瘤中明显富集的频率鉴定了tSTCR：肿瘤特异性比率是肿瘤与非肿瘤组织中克隆型频率之间的比率。本文介绍的用于表征每个个体患者的TSTCR的方法包括以下额外步骤。
1)同时鉴定各自的tsTCR的β和α链，优选通过相关测序，更优选通过单细胞VDJ测序，优选使用10XGenomics chromium技术。结果，每个tsTCR克隆型由覆盖完整CDR3区和相邻V片段和J片段的一个β链序列和一个或二个α链序列组成。基于该信息，TCR可以被完全合成。
2)通过单细胞基因表达分析，优选用10X Genomics chromium技术，同时鉴定许多激活/耗竭/分化标志物。基于TIL的深度测序方法和单细胞测序计划，已经清楚在癌症进展期间的慢性抗原暴露产生强直性TCR信号传导，其驱动T细胞耗竭并抑制T细胞效应子功能。耗竭/功能障碍的T细胞用某些受体“标记”。在分析中包含耗竭/激活标志物将旁观克隆型与肿瘤特异性克隆型区分开来。CD4+和CD8+效应T细胞的公知的激活/耗竭标志物是PD1，TIGIT，LAG3，TIM3，CTLA4，CD40，CD137(4-1BB)，CD69，或发现在被各自抗原激活后在T细胞中显著表达的任何其它基因。关于CD4+T细胞，另外的标志物对于区分肿瘤反应性Th1和Tfh细胞与免疫抑制性Th2、Treg、或Th17细胞非常有用，其在肿瘤发展的情况下起有争议的作用。抗肿瘤Th1和Tfh细胞的特征在于效应子功能的表达，如IFN-γ、TNF-α、GZMB、PRF，而Th2细胞表达IL-4、IL-5、Th17细胞、IL-17A、和Treg免疫抑制细胞因子TGF-β和IL-10等。此外，T细胞亚型和/或分化状态可以基于某些转录因子的表达而分化，例如对于Treg细胞的FOXP3、和对于效应T细胞的TBX21(TBET)和EOMES、对于表现出细胞毒性的细胞的RUNX3、TOX(维持增殖和功能能力的T细胞的耗竭亚群)等。
3)通常通过用标准方法分析患者血液样品来进行高达4位分辨率的HLA基因分型。与HLA型组合，所有这些信息都是建立每个患者的tsTCR库的足迹。在图1中给出了示例表格，在图2的流程图中示出了用于构建tsTCR足迹的单个步骤。许多患者的tsTCR足迹是下面描述的TCRpolyClust方法的基础。图3中还给出了图形概述。
4)通过其TCR CDR3序列的序列相似性比较一组不同的肿瘤患者。该算法在2轮中起作用，其中第1轮产生许多个子聚类，其通过将所有成对的TCR(α和β链视为1个序列)分组而发现，所述TCR在各自的β和α链上具有最大3个(每链3个错配)、特别是最大2个、更特别是最大1个、最特别是0个的莱文斯坦距离。为了有效地对数千TCR进行成对序列比较，可以使用几种算法，例如CDHIT、iMART、BLASTP。一旦种子聚类完成，就计算覆盖β-CDR3氨基酸序列的共有序列。在第二轮中，第1轮的所有共有序列经受具有与第1轮中类似的参数的聚类。
5)患者间聚类的最小聚类大小是2，即聚类必须包含来自至少二个不同患者的α–β配对的TCR。此外，肿瘤特异性中位数比(即与非肿瘤组织相比，肿瘤中克隆型频率之间的比率)必须>2(理想是>3，最优选是>5)，并且肿瘤组织中TCR-β的克隆型中位数频率必须至少>0.005％(特别是>0.01％，更特别是>0.05％，最特别是>0.1％)
6)TCR－抗原特异性严格地依赖于患者的HLA基因型。因此，有效患者间聚类的基本条件是一个聚类内HLA型的显著重叠。在该聚类中发现的所有患者中，至少一种HLA型(A、B、或C)的≥50％(更优选≥60％，最优选≥80％)。在连锁不平衡的情况下，这也可以应用于HLA对，直到完全单倍型。
7)单细胞RNA测序技术(例如10X Genomics)用于鉴定专用T细胞的TCR的二条链，并且在同一步骤中通过scRNAseq测量基因表达谱。可以测量上述一系列的激活/耗竭标志物(例如PD1、CTLA4、TIGIT、LAG3、TIM3等)、转录因子(例如FOXP3、RUNX3、EOMES、TBET、TOX等)、和效应子功能(IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL17等)的表达频率，从而可以针对一系列标志物或标志物组合的存在对每个单个T细胞进行评分。在该聚类中发现的所有患者的≥50％(更优选≥60％)中应发现至少一种标志物。
在本说明书的上下文中，术语共同T细胞受体涉及T细胞受体(TCR)，其不仅存在于一个患者中，而且存在于许多不同的患者中。由于TCR在患者之间是共有的，因此共同TCR也可以称为共有TCR。共同TCR在患者间共有相同或高度相似的CDR3区域，因此，共同TCR将可能识别相同的抗原。如果共同TCR为HLA依赖性，则其将可能在不同患者中识别具有相同或几乎相同的肽结合于MHC分子的相同MHC分子。因此，与患者之间共有的MHC分子结合的这种肽是共同抗原。
可以在该方法的一个单独步骤中确定所有测试的患者共有至少一个HLA基因(具有至少一个共同HLA基因)。
在本说明书的上下文中，术语共同抗原涉及由共同TCR识别的实体。在某些实施方式中，共同抗原是包括MHC分子和与MHC分子结合的肽的复合体。
在本说明书的上下文中，术语基本上相同涉及相同的或具有至少95％、特别是至少97％、更特别是至少98％、更特别是至少99％、最特别是超过99％的同一性的核酸序列。
在本说明书的上下文中，术语交叉反应性TCR涉及识别MHC分子上呈现的多于一个确定的肽序列的α/βTCR。优选地，所识别的抗原肽在至少一个氨基酸，更优选地二个氨基酸上不同，并且衍生自基本上不同的多肽前体。
本说明书上下文中的术语频率涉及多个序列中某一序列的相对丰度。为了确定序列的频率，对基本上相同的序列进行计数，并且将该数目除以所有观察到的序列的数目。
在本说明书的上下文中，术语同一组织类型指的是来自同一组织的组织样本。例如，转移瘤的组织类型是转移细胞来源的组织，而不是体内发现转移瘤的组织。
在本说明书的上下文中，术语相同HLA型的基因涉及编码MHC分子的HLA基因。本文的相同HLA型是指HLA基因编码MHC分子的相同变体。由于人类中存在多种HLA基因，在本发明方法的一个实施方式中确定了测试患者的HLA所有组成成分，并选择共有至少一种相同HLA型基因的患者用于进一步分析。
术语在抗原呈递细胞中表达序列理解如下。抗原呈递细胞(APC)用编码肽或蛋白质的核酸序列转染或转导。核酸序列存在于用于转染或转导哺乳动物细胞的合适表达载体内。一旦核酸序列被导入APC，APC表达编码的肽或蛋白质。在某些实施方式中，肽被呈递在APC细胞表面的HLA分子上。在某些实施方式中，由蛋白质产生的一种或几种肽呈递在APC细胞表面的HLA分子上。待呈递在HLA-I类分子上的重组抗原的表达是一种已被充分确立的流程，其可以通过用编码所述抗原的核酸转染表达所述I类分子的APC来实现。在某些实施方式中，为了在HLA-II类分子上有效呈递重组抗原，相应的APC必须表达所述II类分子并经历非规范自噬。已知非典型大自噬作用尤其能将细胞内表达的抗原重新定向，以便在HLA II类分子上呈现(Münz,Mol Aspects Med.2021Jun 16；100987)。
在本说明书的上下文中，术语T细胞的激活涉及T细胞的状态，其中表达某些激活标志物。T细胞通过其TCR与匹配的MHC呈递肽的相互作用而被特异性激活。激活可例如通过IFN-γ分泌T细胞来测量。
在本说明书的上下文中，术语肿瘤细胞系涉及源自癌性组织的细胞系。许多肿瘤细胞系是本领域已知的(Gandhi et al.,Nature.2019May；569(7757):503–508.)
给定单体组的聚合物是均聚物(由多个相同单体组成)；给定选择的单体的共聚物是由组中至少二种单体构成的杂聚物。
本文所用的术语药物组合物是指本发明的化合物、或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体。在某些实施方式中，根据本发明的药物组合物以适于局部、肠胃外或可注射的施用的形式提供。
如本文所用，术语药学上可接受的载体包含本领域技术人员已知的任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合(参见例如Remington:the Science and Practice of Pharmacy，ISBN0857110624)。
如本文所用，术语治疗或治疗任何疾病或病症(例如癌症)是指，在一个实施方式中，改善疾病或病症(例如减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一实施方式中，治疗或治疗是指减轻或改善至少一种身体参数，包含患者可能无法辨别的那些。在另一实施方式中，治疗或治疗是指调节疾病或病症，在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)、或在二者上。除非下文具体描述，否则评估疾病的治疗和/或预防的方法通常是本领域已知的。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及一种鉴定共同肿瘤特异性T细胞受体(TCR)的方法。
方法包括以下步骤：
a.通过以下步骤从n(n>1)名患者的每个个体患者获得多个肿瘤特异性TCR序列：
i.在基于肿瘤序列的步骤中，来确定多个肿瘤TCR序列中的每个的频率；
ii.在基于非肿瘤序列的步骤中，来确定多个非肿瘤TCR序列中的每个的频率；
iii.在肿瘤特异性选择步骤中，如果对于任何特定TCR序列，肿瘤TCR在多个肿瘤TCR核酸序列内的频率高于非肿瘤TCR在多个非肿瘤TCR核酸序列内的频率，则选择TCR核酸序列作为肿瘤特异性TCR序列；
b.通过以下步骤选择共同肿瘤特异性TCR序列：
i.将肿瘤特异性TCR核酸序列翻译成用于多名n名患者中的肿瘤特异性TCR氨基酸序列；
ii.确定所述肿瘤特异性TCR氨基酸序列的CDR3区域，得到所述n名患者中每一名的肿瘤特异性CDR3序列；
iii.比对所述n名患者的所述多个肿瘤特异性TCR氨基酸序列的CDR3区域；
iv.如果其CDR3区相差不超过3个氨基酸/CDR3，特别是不超过2个氨基酸/CDR3，更特别是不超过1个氨基酸/CDR3，最特别是没有差异，则将TCR序列分组为一个TCR克隆型聚类；
v.在共同TCR选择步骤中，如果所述TCR克隆型聚类存在于至少二个患者中，则选择TCR序列聚类作为共同肿瘤特异性TCR序列。
在某些实施方式中，如果TCR克隆型聚类在至少二名患者中的200种最普遍的肿瘤特异性TCR序列中，更特别是在100种最普遍的肿瘤特异性TCR序列中，则选择TCR序列聚类为共同肿瘤特异性TCR序列。
基于肿瘤序列的步骤包括以下步骤：
I.提供从所述患者获得的包括T细胞的分离的肿瘤样品；
II.从所述分离的肿瘤样品中分离肿瘤T细胞，得到分离的肿瘤T细胞；
从所述分离的肿瘤T细胞分离肿瘤核酸制剂；
III.从所述肿瘤核酸制剂获得多个肿瘤TCR核酸序列；
IV.比对所述多个肿瘤TCR核酸序列，并将基本上相同的肿瘤TCR核酸序列分组为肿瘤TCR克隆型组，并对每个肿瘤TCR克隆型组中的肿瘤TCR核酸序列进行计数，得到每个肿瘤TCR克隆型组中的肿瘤TCR核酸序列的数目；
V.通过将每个肿瘤TCR克隆型组中的肿瘤TCR核酸序列的数目除以从样品获得的所有肿瘤TCR核酸序列的数目，来确定每个肿瘤TCR的频率
基于非肿瘤序列的步骤包括以下步骤：
I.提供从所述患者获得的包括T细胞的分离的非肿瘤组织样品；
II.从所述分离的非肿瘤组织样品中分离非肿瘤T细胞，得到分离的非肿瘤T细胞；
从所述分离的非肿瘤T细胞中分离非肿瘤核酸制剂；
III.从所述非肿瘤核酸制剂获得多个非肿瘤TCR核酸序列；
IV.比对所述多个非肿瘤TCR核酸序列并将非肿瘤TCR核酸序列分组成一个基本上相同的非肿瘤TCR克隆型组，并对每个肿瘤TCR克隆型组中的非肿瘤TCR核酸序列进行计数，得到每个非肿瘤TCR克隆型组中的非肿瘤TCR核酸序列的数目；
V.通过将每个非肿瘤TCR克隆型组中的非肿瘤TCR核酸序列的数目除以从样品获得的所有非肿瘤TCR核酸序列的数目，来确定每个非肿瘤TCR的频率
在某些实施方式中，第一方面的方法完全按照如上所述的步骤顺序执行。
在第一方面的替代中，在肿瘤特异性选择步骤之前将核酸序列翻译成氨基酸序列，并且在肿瘤特异性选择步骤中，比较和选择氨基酸序列。
第一方面的方法的另一替代可以描述如下：。
a.通过以下步骤鉴定来自第一患者的肿瘤特异性TCR序列：
i.测序来自第一患者的肿瘤样品的TCR基因；
ii.测序来自第一患者的非肿瘤样品的TCR基因；
iii.如果这些TCR基因在肿瘤样本中的发现频率高于在非肿瘤样本中的发现频率，则将这些TCR基因选为肿瘤特异性基因；
b.通过同样的步骤i–iii，用第二名患者的样本鉴定第二名患者的肿瘤特异性TCR序列，并对n名患者重复上述方法；
c.通过以下步骤在n名患者中比较肿瘤特异性TCR序列：
i.在所有患者中在氨基酸水平上比对所鉴定的肿瘤特异性TCR序列的CDR3区域；
ii.如果CDR3区域序列相差不超过3个氨基酸/CDR3，特别是不超过2个氨基酸/CDR3，更特别是不超过1个氨基酸/CDR3，最特别是没有差异，则将TCR序列分组成一个聚类；
d.如果所述聚类存在于至少二个患者中，特别是存在于≥3、≥4、≥5、≥10、≥20、或≥30个患者中，则选择TCR序列作为共同肿瘤特异性TCR序列。
在某些实施方式中，n名患者的肿瘤样品具有相同的组织类型。
在某些实施方式中，所述非肿瘤组织样品与肿瘤样品具有相同的组织类型。
在某些实施方式中，在步骤III中获得多个非肿瘤TCR核酸序列之前，在分离步骤II之后根据其共受体CD4和/或CD8分选T细胞，从而获得HLA I类和/或HLA II类特异性序列。
在某些实施方式中，确定多个患者具有至少一个共同相同HLA型的基因。
在某些实施方式中，确定多个患者具有至少一个共同相同HLA型的基因，其中可由于根据CD4+或CD8+的T细胞的先前分选来指定相关HLA型。
在某些实施方式中，确定多个患者具有共同相同HLA型的基因，特别是具有正好一个共同相同HLA型的基因，并指定所述共同肿瘤特异性TCR为HLA型特异性TCR。
在某些实施方式中，所述通过以下步骤指定共同肿瘤特异性TCR为HLA型特异性TCR：
a.选择其中存在所述共同肿瘤特异性TCR序列的所有患者；
b.确定哪些HLA基因存在于所述选择的患者中；
c.如果在所有选择的患者中存在共同HLA基因，特别是存在正好一个共同HLA基因，则指定共同肿瘤特异性TCR为HLA型特异性TCR。
在某些实施方式中，如果肿瘤TCR克隆型组的频率比非肿瘤TCR克隆型组的频率高2倍，特别是高3倍，更特别是高5倍，甚至更特别是高10倍，则在肿瘤特异性选择步骤(a.iii.)中选择TCR序列作为肿瘤特异性TCR序列。
在某些实施方式中，患者的数目n为2至100，特别是n为10至50，更特别是n为20至30。
在某些实施方式中，所述共同TCR选择步骤(步骤b.v)另外包括T细胞激活/耗竭/分化标记的测量，特别是选自PDCD1(PD1)、TIGIT、LAG3、HAVCR2(TIM3)、CTLA4、IFNG、TNF、GZMB、TNFRSF9(CD137，4-1BB)、CD45(CD45RA/RO)、CD69、LAMP1(CD107a)、TBX21(T-BET)、TCF7(TCF-1)、EOMES、TOX、和RUNX3的标志物，其中如果携带TCR的细胞表达一或多个细胞激活/耗竭/分化标志物或其组合，则选择TCR序列为共同肿瘤特异性TCR序列。
本发明的第二方面涉及一种鉴定共同肿瘤特异性抗原的方法。
方法包括以下步骤：
a.根据第一方面，从n(n>1)名患者中鉴定出共同肿瘤特异性TCR；
b.通过以下步骤获得多个肿瘤特异性多肽：
(1)通过以下步骤从所述患者的每个患者获得多个肿瘤特异性mRNA序列：
i.在基于mRNA肿瘤序列的步骤中，测定多个肿瘤mRNA序列；
ii.在基于mRNA非肿瘤序列的步骤中，测定多个非肿瘤mRNA序列；
iii.在mRNA肿瘤特异性选择步骤中，选择肿瘤特异性mRNA序列；
(2)通过以下步骤选择多个肿瘤特异性多肽：
i.将所述多个肿瘤特异性RNA序列翻译成多个肿瘤特异性氨基酸序列；
ii.对来自多名n名患者的多个肿瘤特异性氨基酸序列进行比对；
iii.如果其氨基酸序列具有≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％、或≥99％的序列同一性，则将氨基酸序列组成一个多肽聚类；
iv.如果肿瘤特异性氨基酸序列存在于所有n名患者(从其选择共同肿瘤特异性TCR的所有患者)中，则选择氨基酸序列的多个多肽聚类作为肿瘤特异性多肽；
c.对于所述多个肿瘤特异性多肽的每个成员，在具有在从其选择共同肿瘤特异性TCR的所有患者之间共有的HLA基因的抗原呈递细胞中，表达所述多个肿瘤特异性多肽的所述成员；
d.检测每种抗原呈递细胞是否能够激活表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞；
e.如果表达所述肿瘤特异性多肽的抗原呈递细胞能够激活所述表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞，则选择肿瘤特异性多肽作为共同肿瘤特异性抗原。
基于mRNA肿瘤序列的步骤包括以下步骤：
I.从来自所述患者的肿瘤样品分离肿瘤RNA制剂；
II.从所述肿瘤RNA制剂获得多个肿瘤mRNA序列。
基于mRNA非肿瘤序列的步骤包括以下步骤：
I.从来自所述患者的所述非肿瘤组织样品分离非肿瘤RNA制剂；
II.从所述肿瘤RNA制剂获得多个非肿瘤mRNA序列。
mRNA肿瘤特异性选择步骤包括以下步骤：
I.将所述多个肿瘤mRNA序列与所述多个非肿瘤mRNA序列进行比对；
II.选择存在于肿瘤样品中但在非肿瘤样品中不存在(检测不到的)的mRNA序列作为肿瘤特异性RNA序列。
在某些实施方式中，另外，在表达所述共同肿瘤特异性抗原的抗原呈递细胞上的HLA分子上呈递的肽从HLA分子中分离并通过质谱法表征(Freudenmann et al.,Immunology.2018Jul；154(3):331–345)。
在某些实施方式中，另外
a.将通过第二方面的方法发现的抗原片段化成肽；
b.将各肽负载到抗原呈递细胞上的HLA分子上；
c.对于每个抗原呈递细胞，确定抗原呈递细胞是否能够激活通过根据第一方面的方法发现的表达共同肿瘤特异性TCR的T细胞。
在某些实施方式中，所述肿瘤样品和所述非肿瘤组织样品源自相同的组织样品，并且其中从所述组织样品分离肿瘤RNA制剂与从所述组织样品获得的单个肿瘤细胞和非肿瘤细胞分开进行。
单细胞测序是鉴定肿瘤特异性RNA的方便方法。由于肿瘤总是代表癌细胞和正常细胞的混合物，因此自动包含正常组织的参考RNA。然而，来自邻近组织的细胞也可用作参考。
第二方面的替代涉及鉴定常见肿瘤特异性抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
a.根据第一方面，从n(n>1)名患者中鉴定出共同肿瘤特异性TCR；
b.使表达共同肿瘤特异性TCR的T细胞与肿瘤细胞接触，其中所述肿瘤细胞衍生自肿瘤细胞系(表达从其选择共同肿瘤特异性TCR的所有患者之间共有的HLA基因)，并检测肿瘤细胞是否能够激活所述T细胞得到表达所述共同肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞系衍生细胞；
c.可选地用不同的肿瘤细胞系重复步骤b；
d.从表达所述共同肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞系衍生细胞制备cDNA文库；
e.对于cDNA文库的每个成员，在具有在从其选择共同肿瘤特异性TCR的所有患者之间共有的HLA基因的抗原呈递细胞中表达所述成员；
f.检测每种抗原呈递细胞是否能够激活表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞；
g.如果表达所述cDNA的抗原呈递细胞能够激活所述表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞，则选择cDNA作为共同肿瘤特异性抗原。
或者，可以获取肿瘤细胞系并敲除单个部分或基因。然后，必须鉴定不再被识别的那些克隆。可以想到使用转座子(随机)或CRISPR-Cas(靶向)的方法。
第二方面的方法的另一替代可以描述如下：
a.通过第一方面鉴定共同肿瘤特异性TCR序列；
b.通过以下步骤鉴定共同肿瘤特异性氨基酸序列：
i.测序第一患者的肿瘤样品的mRNA库；
ii.测序第一患者的非肿瘤样品的mRNA库；
iii.如果mRNA序列存在于肿瘤样品中并且不存在于非肿瘤样品中，则选择mRNA序列为在第一患者中肿瘤特异性的；
iv.对所有n名患者重复步骤i–iii；
v.将所有患者的肿瘤特异性mRNA序列翻译成氨基酸序列并比对肿瘤特异性氨基酸序列；
vi.如果其氨基酸序列具有≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％、或≥99％的序列同一性，则将氨基酸序列组成一个聚类；
vii.如果相应的聚类存在于所有测试的患者中，则选择序列作为共同肿瘤特异性氨基酸序列；
c.通过以下步骤评价共同肿瘤特异性TCR针对共同点肿瘤特异性氨基酸序列的反应性：
i.将每个共同肿瘤特异性氨基酸序列引入一个抗原呈递细胞；
ii.将表达共同肿瘤特异性TCR的T细胞与步骤i的所有抗原呈递细胞分别接触，并测量T细胞的IFNγ释放；
d.选择氨基酸序列作为共同肿瘤特异性抗原，对于所述抗原存在在前一步骤中T细胞的可检测的IFNγ释放。
本发明的第三方面涉及根据第一方面的方法鉴定的分离的TCR。
在某些实施方式中，TCR包括CDR3α序列及CDR3β序列，其中CDR3α序列和CDR3β序列与下文所给出的序列相同，或对每个CDR3序列具有一个或二个氨基酸取代，
其中
a.对于组a(聚类0)，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:6、1、59的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:38、41、20的序列组成的组，或
b.对于组b(聚类1)，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:11、12、18、26、55、58的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:47、72、73的序列组成的组，或
c.对于组c(聚类31)，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:62、63、71的序列组成的组，且CDR3β序列选自序列SEQ ID NO:28，或
d.对于组d(聚类2)，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:8、51的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:19、45、60的序列组成的组，或
e.对于组e(聚类3)，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:2、21、24、32的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:15、27、31的序列组成的组，或
f.对于组f(聚类4)，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:29、52的序列组成的组，且CDR3β序列选自序列SEQ ID NO:9，或
g.对于组g(聚类5)，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:13、65的序列组成的组，且CDR3β序列选自序列SEQ ID NO:61，或
h.对于组h(聚类6)，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:5、25、46的序列组成的组，并且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:7、10、17、42、44的序列组成的组，
特别是其中CRD3α序列和CDR3β序列在表1–8的同一行中鉴定，
特别是其中所述取代是根据以下给出的取代规则选择的，
其中，取代规则是：
-甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可互换；缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、和异亮氨酸(I)可互换，A和V可互换；
-色氨酸(W)和苯丙氨酸(F)可互换，酪氨酸(Y)和F可互换；
-丝氨酸(S)和苏氨酸(T)可互换；
-天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)可互换
-天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)可互换；N和S可互换；N和D可互换；E和Q可互换；
-甲硫氨酸(M)和Q可互换；
-半胱氨酸(C)、A和S可互换；
-脯氨酸(P)、G和A可互换；
-精氨酸(R)和赖氨酸(K)可互换。
一组CDR3序列也可称为聚类。
在某些实施方式中，CDR3序列选自a、b、f、g、和h组成的组。
在某些实施方式中，TCR另外包括可变(V)α序列、连接恒定(JC)α序列、Vβ序列、和JCβ序列或与所述序列具有≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％、或≥99％序列同一性的序列，其中完整TCR序列保留其生物活性，
其中
a.对于组a，Vα序列为SEQ ID NO:67，JCα序列为SEQ ID NO:4，Vβ序列为SEQ IDNO:23，且JCβ序列为SEQ ID NO:33，或
b.对于组b，Vα序列为SEQ ID NO:3，JCα序列为SEQ ID NO:53，Vβ序列为SEQ IDNO:64，且JCβ序列为SEQ ID NO:56，或
c.对于组c，Vα序列为SEQ ID NO:54，JCα序列为SEQ ID NO:48，Vβ序列为SEQ IDNO:43，且JCβ序列为SEQ ID NO:37，或
d.对于组d，Vα序列为SEQ ID NO:68，JCα序列为SEQ ID NO:70，Vβ序列为SEQ IDNO:30，且JCβ序列为SEQ ID NO:37，或
e.对于组e，Vα序列为SEQ ID NO:57，JCα序列为SEQ ID NO:4，Vβ序列为SEQ IDNO:16，且JCβ序列为SEQ ID NO:22，或
f.对于组f，Vα序列为SEQ ID NO:49，JCα序列为SEQ ID NO:66，Vβ序列为SEQ IDNO:39，且JCβ序列为SEQ ID NO:34，或
g.对于组g，Vα序列为SEQ ID NO:35，JCα序列为SEQ ID NO:40，Vβ序列为SEQ IDNO:43，且JCβ序列为SEQ ID NO:69，或
h.对于组h，Vα序列为SEQ ID NO:14，JCα序列为SEQ ID NO:50，Vβ序列为SEQ IDNO:36，且JCβ序列为SEQ ID NO:56。
TCR的生物活性通过肿瘤细胞或APC对包括TCR的T细胞的激活来测定。如果TCR仍然能够识别呈递TCR所特异的HLA－肽复合体的APC，则TCR甚至在具有偏离序列的情况下仍保留其生物活性。
本发明的第四方面涉及编码第三方面所述的TCR的核酸序列。
本发明的第五方面涉及一种分离的自体T细胞，其包括第三方面所述的TCR和/或第四方面所述的核酸序列。
在某些实施方式中，分离的自体T细胞是重组表达所述TCR的重组细胞。
本发明的第六方面涉及用于治疗癌症的第三方面所述的TCR、第四方面所述的核酸序列、或第五方面所述的分离的自体T细胞。
根据第三方面的TCR、根据第四方面的核酸序列、或根据第五方面的分离的自体T细胞，其用于治疗具有与通过第一方面的方法测定的HLA型特异性TCR相同的HLA型的患者中的癌症。
根据第三方面的TCR、根据第四方面的核酸序列、或根据第五方面的分离的自体T细胞，其用于具有以下HLA型的患者：
a.对于组a，HLA-B*08:01和/或HLA-C*07:01；或
b.对于组b，HLA-A*02:01超型(HLA-A*02:01/68:02)；或
c.对于组c，HLA-A*02:01超型(HLA-A*02:01/02:35/02:05)和/或HLA-C*07:01/07:04；或
d.对于组d，HLA-A*01:01和/或HLA-A*02:01；或
e.对于组e，HLA-A*02:01和/或HLA-A*01超型(A*01:01/68:01)；或
f.对于组f，HLA-C*07:01；或
g.对于组g，HLA-A*01:01和/或HLA-A*02:01和/或HLA-C*02:02；或
h.对于组h，HLA-B*15:01。
医学治疗、剂型和盐
类似地，在本发明的范围内是一种在需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用根据第三方面的TCR、根据第四方面的核酸序列、或根据第五方面的分离的自体T细胞。
类似地，提供了用于预防或治疗癌症的剂型，其包括根据第三方面的TCR、根据第四方面的核酸序列、或根据第五方面的分离的自体T细胞。
药物组合物和施用
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包括根据第三方面的TCR、根据第四方面的核酸序列、或根据第五方面的分离的自体T细胞。
在本发明的某些实施方式中，本发明的化合物通常被配制成药物剂型以提供药物的容易控制的剂量并给予患者简洁的且容易管理的产品。
药物组合物可以配制成用于肠胃外施用，例如通过静脉内输注。
根据本发明的制造方法和治疗方法
本发明还涵盖，作为另外的方面，如上详细说明的，根据第三方面的TCR、根据第四方面的核酸序列、或根据第五方面的分离的自体T细胞，用于制造用于癌症治疗或预防的药物的方法中的用途。
类似地，本发明涵盖治疗已被诊断患有与癌症相关的疾病的患者的方法。该方法需要向患者施用根据第三方面的TCR、根据第四方面的核酸序列、或根据第五方面的分离的自体T细胞。
通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从这些实施例和附图中可以得到进一步的实施方式和优点。这些实施例旨在说明本发明而不是限制其范围。
附图说明
图1：tsTCR足迹表的图示。从左到右，肿瘤特异性TCR足迹表包括每个TCR克隆型的以下元件：CDR3β氨基酸序列、CDR3α氨基酸序列、CDR3β序列的频率百分比、β链的V节段ID、β链的J节段ID、α链的V片段ID、α链的J片段ID、4位数分辨率的HLA型(I类或II类)、在几个列中具有各自的每克隆型表达率的一组标志物基因。
图2：TCR聚类图式，第I部分。这些是用于肿瘤和非肿瘤中TCR谱分析的步骤，最终浓缩到肿瘤特异性TCR足迹表中
图3：TCR聚类图式，第II部分。对于2、3、或更多不同患者，一张表代表TCR聚类具有密切相关的TCR。第1–13列和NN如下所述。1:任意的患者ID。2–3：二个CDR3链的氨基酸序列。4：肿瘤与邻近的非肿瘤组织中TCR克隆型频率之间的比率。5：肿瘤中各自TCR的频率。6–9：二条链的V/J片段。10:4位分辨率的HLA型(I/II)。11–13：各自的T细胞激活标志物频率。它们用单细胞测序基因表达技术测量，或者如果适用，则用细胞分选技术测量，并且各自的克隆型频率源自TCR测序数据。NN:可以以相同的方式使用T细胞激活的任何标志物。
图4：显示来自健康供体的CD8+T细胞通过CRISPR/CAS9介导的敲除从内源TCR中去除并用来自聚类0克隆型的TCR转导。然后通过IFN-γ-Elispot试验(未示出)针对七种NSCLC细胞系测试转导的TCR-T细胞。在表达聚类0相关MHC等位基因HLA-B*08:01的三种NSCLC系中，仅NCI-H1703被TCR-T细胞识别。除了NCI-H1703细胞之外，TCR-T细胞还识别了用HLA-B*08:01转导的K562细胞(但不是无HLA的野生型K562细胞)和表达HLA-B*08:01的淋巴母细胞系(LCL)(未示出)。针对NSCLC细胞的反应性可以被泛HLA特异性抗体阻断，表明肽－MHC限制性反应性(未示出)。
图5：显示来自健康供体的CD8+T细胞通过CRISPR/CAS9介导的敲除从内源TCR中去除并用来自聚类2克隆型的TCR转导。通过IFN-γ-Elispot试验针对五种HLA-A*02:01阳性NSCLC细胞系测试TCR转导的(TCR)T细胞。所有TCR-T细胞识别MZ-LC-16、NCI-H1703和NCI-H1792，高于背景反应性(仅TCR-T细胞，虚线)。TCR-ID2.1转导的TCR-T细胞另外显示针对MOR/CPR的微小反应。TCR-T细胞的交叉反应性的进一步试验显示，也识别了HLA-A*02:01转导的K562细胞(但非野生型K562细胞)和HLA-A*02:01阳性T2细胞(未示出)。HLA-A02特异性抗体可阻断针对NSCLC细胞的反应性，表明肽－MHC限制性反应性(未示出)。
实施例
A.1:非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤和正常肺组织样本的制备及TCRSafe分析
将每个肿瘤样本解剖，去除周围正常组织和坏死区域。将约1g来自肿瘤和正常肺组织的立方体切成小块，每个尺寸约为2–3mm。使用肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotech)并按照制造商的说明书，将切片的肿瘤(以及非肿瘤)活组织检查样品置于商业机械/酶组织解离系统(GentleMacs，德国贝吉施格拉德巴赫的Miltenyi Biotech)中。在GentleMACS解聚之后，使细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器。取肿瘤细胞和肺细胞的等分试样并冷冻保存在10％ DMSO(Sigma-Aldrich)和90％ FCS(Life Technologies)中以备随后使用。使用PBS/RPMI 1640中40％/80％梯度的Percoll(GE Healthcare Europe GmbH)对剩余的细胞悬浮液进行密度梯度离心。从相间收获T淋巴细胞，在完全培养基(RPMI 1640，Lonza)中洗涤。随后，将肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)和来自正常肺组织的淋巴细胞置于含有浓度为0.5×106细胞/mL的2mL恢复培养基(RM)的24孔组织培养板中。RM是RPMI 1640，其中补充有25mMHEPES pH 7.2和L-谷氨酰胺(Lonza)、100IU/mL青霉素、100mg/mL链霉素和50mMβ-巯基乙醇(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific)，补充有10％自体人血清。将平板置于含有5％CO2的湿润37℃培养箱中并培养过夜。第二天，从TIL和正常肺培养物中收获和合并细胞，并通过FACS分离下列亚群：
·CD4+T细胞
·CD8+T细胞
·PD1+细胞(仅来自TIL)
·PD1-阴性细胞(仅来自TIL)
从亚群中提取基因组DNA并进行TCRsafe分析(如WO 2014/096394 A1中所公开的)。在如WO 2017/025564A1中详细描述的鉴定的亚群和肿瘤特异性克隆型之间比较所得T细胞克隆型频率。
这些实施例的所有后续步骤涉及如上所述从肿瘤和非肿瘤组织分离的CD8+T细胞。
A.2:用10x Genomics高通量单细胞测序进行T细胞受体(TCR)α/β配对
从TIL单细胞悬液开始，使用10x Genomics Chromium Next GEM单细胞V(D)J试剂盒和Chromium单细胞V(D)J富集试剂盒(人类)对5000–10000个细胞进行高通量单细胞RNASeq分析。10xGemCodeTM技术将数千个单个细胞分散成乳液中凝胶珠(GEM)液滴。将GEM捕获的单细胞裂解，并在GEM溶液中，将附着于珠的条形码化引物、寡聚物、主混合物、和裂解的细胞组分混合，并通过RT-PCR，产生全长寡聚物dT激活的cDNA文库。通过使用模板开关机制完成第一链cDNA合成，包含附着于珠子的条形码化序列。单个GEM中的所有cDNA分子用相同的条形码标记。GEM被分解，进一步的文库制备继续作为本体反应。在cDNA清理后，Chromium单细胞V(D)J富集试剂盒有效地扩增TCR序列并生成与Illumina测序相容的测序文库。与全cDNA扩增组合，Illumina测序揭示了分析的每个单个T细胞的成对α/βTCR序列和每个细胞的相应全转录组。二种试剂盒，10x Genomics Chromium NEXT GEM单细胞V(D)J试剂盒和Chromium单细胞V(D)J富集试剂盒(人)均根据制造商的推荐使用。
使用上述A.1所述的TCR与来自单细胞VDJ配对的TCR之间相同的核苷酸序列来建立TCR关于α链和β链、频率和肿瘤特异性的完整注释。
A.3:TCR的聚类(TCRpolyClust)
如TCRpolyClust方法的图示中所述，一旦A.1和A.2的组合建立，随后的TCR聚类分析鉴定了具有共同TCR和匹配HLA型的患者，使得能够筛选共有的肿瘤抗原。
在分离自自体患者或健康供体的T细胞中聚类TCR的合成、克隆、和异位表达
配对聚类TCR是密码子优化的、合成的，并作为双顺反子嵌合构建体(βTCR-VDJ-mC_P2A-元件_αTCR-VJ-mC；mC代表鼠恒定域)克隆到逆转录病毒(或类似的)表达载体中，用于从各自患者或健康供体的血液中转导自体或同种异体T细胞。用CRISPR/Cas9预处理受体T细胞以敲除内源TCR，从而防止由混合TCR二聚体介导的脱靶免疫反应(内源×外源链，在自体和同种异体情况中)或由内源TCR介导的同种异体反应(在同种异体情况中)。所述嵌合(c)TCR重组T细胞在体外扩增并用于功能实验，例如识别自体肿瘤细胞(如果可用的话)、同种异体肿瘤细胞系、和/或如下所述的抗原筛选。
用于筛选共有肿瘤抗原的靶向方法
肿瘤的比较性全外显子组(WES)和全转录组(WTS)测序以及相应的正常组织基因组和总RNA(包含来自各TCR聚类的所有患者的样品)被用于鉴定共有的新抗原(SNV、MNV、InDel、融合基因产物、结构改变)、异常表达的规范基因(癌症/种系抗原和过表达抗原)、以及异常表达和翻译的非规范转录物(暗物质转录物或隐蔽转录物)。然后测试所有类别的候选物被cTCR转导的重组T细胞的识别。抗原形式是编码全长抗原cDNA的表达质粒或仅编码具有候选抗原的免疫原性潜力的肽编码区的串联小基因(TMG)。二种形式都通过在293T-或COS-7细胞中共转染编码抗原和HLA-cDNA的质粒，并在IFN-γELISPOT试验中使转染子接受T细胞的识别测试来测试。或者，可以使用公共预测算法(IEDB，NetMHC)预测候选抗原肽与相关HLA等位基因的结合，合成肽并将其脉冲到HLA匹配的抗原呈递细胞上。然后将后者进行ELISpot试验，测试它们被重组T细胞的识别。
肿瘤cDNA表达文库筛选方法
候选抗原的靶向鉴定可能不是对所有抗原类别都同等有效。例如，虽然使用全外显子组和转录组测序筛选肿瘤细胞的非同义体细胞突变是敏感的、高度可再现的，并且产生潜在新抗原的定量列表，但是由于通常缺乏可靠地鉴定它们的特定性状，隐蔽可翻译转录物(暗物质抗原)的鉴定是较低效的。这个难题可以通过cDNA表达文库筛选方法探测肿瘤细胞的完整转录组来解决。无论是来自分选的自体肿瘤细胞还是来自HLA匹配的肿瘤细胞系，如前所示被cTCR转导的T细胞识别，从总RNA产生的cDNA表达文库与适当的HLA等位基因在抗原呈递细胞(293T-或COS-7细胞)中共表达。然后通过ELISpot试验测试转染子被cTCR转导的T细胞的识别。为了在转染后有机会获得甚至是稀有转录物的表达，筛选流程需要高通量方法来测试高度分级的cDNA文库。为此目的，产生cDNA文库，其由例如2000个含有100个cDNA的库组成，每孔在96孔板中制备。以这种96孔板进行使用经cTCR转导的T细胞作为效应细胞的转染和ELISpot测定，并且从100个已识别的库中，逐步减少库(例如10个cDNA/库和孔，cDNA克隆/库和孔)并测试将导致选择编码抗原的cDNA克隆。
因为仅对于少数患者可以获得足够纯的和足够大的用于RNA分离和cDNA文库制备的活的自体肿瘤细胞群，所以可以进行用于类型匹配的肿瘤细胞系的识别的预筛选。细胞系可以选择HLA等位基因的共有表达或用感兴趣的HLA转导。识别的细胞系用作存在共同抗原的证据并作为RNA提取和cDNA文库产生的来源。
序列
TCR序列的构建如下(从N端至C端)：
区V__CDR3__区J/C
| 区V | 从起始密码子(M)至可变CDR3区域的TCR链(α或β)恒定部分 |
| CDR3 | 互补决定区3 |
| 区J/C | 从CDR3至J片段至各C元件的恒定区，以终止(*)密码子结束 |
表1：聚类ID 0：
| SEQ-ID | CDR3β：氨基酸序列 | CDR3α：氨基酸序列 | HLA_B_I | HLA_C_II |
| 0.1 | CASSPGPNYEQYF(SEQ ID NO:38) | CAGAYNQGGKLIF(SEQ ID NO:6) | B*08:01 | C*07:01 |
| 0.2 | CASSAGPNYEQYF(SEQ ID NO:41) | CAASFNQGGKLIF(SEQ ID NO:1) | B*08:01 | C*07:01 |
| 0.3 | CASSLGPNYEQYV(SEQ ID NO:20) | CAASSNQGGKLIF(SEQ ID NO:59) | B*08:01 | C*07:01 |
聚类ID 0：
聚类0与HLA-B*08:01和HLA-C*07:01相关联
β链，TRB：TRBV7-6*01、TRBJ2-7*01、TRBC2*02
聚类0区V ATGGGCACCAGTCTCCTATGCTGGGTGGTCCTGGGTTTCCTAGGGACAGATCACACAGGTGCTGGAGTCTCCCAGTCTCCCAGGTACAAAGTCACAAAGAGGGGACAGGATGTAGCTCTCAGGTGTGATCCAATTTCGGGTCATGTATCCCTTTATTGGTACCGACAGGCCCTGGGGCAGGGCCCAGAGTTTCTGACTTACTTCAATTATGAAGCCCAACAAGACAAATCAGGGCTGCCCAATGATCGGTTCTCTGCAGAGAGGCCTGAGGGATCCATCTCCACTCTGACGATCCAGCGCACAGAGCAGCGGGACTCGGCCATGTATCGC(SEQ ID NO:96)
Seq-ID0.1b TGTGCCAGCAGCCCCGGACCCAACTACGAGCAGTACTTC(SEQ ID NO:74)
Seq-ID0.2b TGTGCCAGCAGTGCAGGGCCCAATTACGAGCAGTACTTC(SEQ ID NO:139)
Seq-ID0.3b TGTGCCAGCAGCTTAGGCCCGAATTACGAGCAGTACGTC(SEQ ID NO:125)
聚类0区J/C GGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG(SEQ ID NO:151)
聚类0区V MGTSLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWYRQALGQGPEFLTYFNYEAQQDKSGLPNDRFSAERPEGSISTLTIQRTEQRDSAMYR(SEQ ID NO:23)
Seq-ID0.1b CASSPGPNYEQYF(SEQ ID NO:38)
Seq-ID0.2b CASSAGPNYEQYF(SEQ ID NO:41)
Seq-ID0.3b CASSLGPNYEQYV(SEQ ID NO:20)
聚类0区J/C GPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG(SEQ ID NO:33)
α链，TRA：TRAV13-1*01、TRAJ23*01、TRAC*01
聚类0区V ATGACATCCATTCGAGCTGTATTTATATTCCTGTGGCTGCAGCTGGACTTGGTGAATGGAGAGAATGTGGAGCAGCATCCTTCAACCCTGAGTGTCCAGGAGGGAGACAGCGCTGTTATCAAGTGTACTTATTCAGACAGTGCCTCAAACTACTTCCCTTGGTATAAGCAAGAACTTGGAAAAAGACCTCAGCTTATTATAGACATTCGTTCAAATGTGGGCGAAAAGAAAGACCAACGAATTGCTGTTACATTGAACAAGACAGCCAAACATTTCTCCCTGCACATCACAGAGACCCAACCTGAAGACTCGGCTGTCTACTTC(SEQ ID NO:108)
Seq-ID0.1a TGTGCAGGGGCGTATAACCAGGGAGGAAAGCTTATCTTC(SEQ ID NO:85)
Seq-ID0.2a TGTGCAGCAAGTTTTAACCAGGGAGGAAAGCTTATCTTC(SEQ ID NO:106)
Seq-ID0.3a TGTGCAGCAAGTAGTAACCAGGGAGGAAAGCTTATCTTC(SEQ ID NO:123)
聚类0区J/C GGACAGGGAACGGAGTTATCTGTGAAACCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(SEQ ID NO:87)
聚类0区V MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYF(SEQ ID NO:67)
Seq-ID0.1a CAGAYNQGGKLIF(SEQ ID NO:6)
Seq-ID0.2a CAASFNQGGKLIF(SEQ ID NO:1)
Seq-ID0.3a CAASSNQGGKLIF(SEQ ID NO:59)
聚类0区J/C GQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:4)
表2：聚类ID 1：
| SEQ-ID | CDR3β：氨基酸序列 | CDR3α：氨基酸序列 | HLA_A_I | HLA_A_II |
| 1.1 | CASSFVSGTDTQYF(SEQ ID NO:47) | CAFMARGSTLGRLYF(SEQ ID NO:58) | A*02:01 | A*02:01 |
| 1.2 | CASSFVSGTDTQYF(SEQ ID NO:47) | CAFMERGSTLGRLYF(SEQ ID NO:12) | A*02:01 | |
| 1.3 | CASSFLSGTDTQYF(SEQ ID NO:73) | CAFLTRGSTLGRLYF(SEQ ID NO:18) | ||
| 1.4 | CASSFLSGTDTQYF(SEQ ID NO:73) | CAFMPRGSTLGRLYF(SEQ ID NO:55) | A*68:02 | |
| 1.5 | CASSFLAGTDTQYF(SEQ ID NO:72) | CAPLPRGSTLGRLYF(SEQ ID NO:26) | A*02:01 | |
| 1.6 | CASSFVSGTDTQYF(SEQ ID NO:47) | CALLSRGSTLGRLYF(SEQ ID NO:11) | A*02:01 |
聚类ID 1：
聚类1与HLA-A*02:01超型(HLA-A*02:01/68:02)相关联
β链，TRB：TRBV28*01、TRBJ2-3*01、TRBC2*01
聚类1区V ATGGGAATCAGGCTCCTCTGTCGTGTGGCCTTTTGTTTCCTGGCTGTAGGCCTCGTAGATGTGAAAGTAACCCAGAGCTCGAGATATCTAGTCAAAAGGACGGGAGAGAAAGTTTTTCTGGAATGTGTCCAGGATATGGACCATGAAAATATGTTCTGGTATCGACAAGACCCAGGTCTGGGGCTACGGCTGATCTATTTCTCATATGATGTTAAAATGAAAGAAAAAGGAGATATTCCTGAGGGGTACAGTGTCTCTAGAGAGAAGAAGGAGCGCTTCTCCCTGATTCTGGAGTCCGCCAGCACCAACCAGACATCTATGTACCTC(SEQ ID NO:97)
Seq-ID1.1b TGTGCCAGCAGTTTCGTCAGCGGCACAGATACGCAGTATTTT(SEQ ID NO:115)
Seq-ID1.2b TGTGCCAGCAGTTTTGTGAGCGGCACAGATACGCAGTATTTT(SEQ ID NO:88)
Seq-ID1.3b TGTGCCAGCAGTTTTCTTAGCGGCACAGATACGCAGTATTTT(SEQ ID NO:157)
Seq-ID1.4b TGTGCCAGCAGTTTTCTTTCAGGCACAGATACGCAGTATTTT(SEQ ID NO:101)
Seq-ID1.5b TGTGCCAGCAGTTTCCTAGCGGGCACAGATACGCAGTATTTT(SEQ ID NO:136)
Seq-ID1.6b TGTGCCAGCAGTTTCGTTTCAGGCACAGATACGCAGTATTTT(SEQ ID NO:133)
聚类1区J/C GGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCAAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG(SEQ ID NO:86)
聚类1区V MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYL(SEQ ID NO:64)
Seq-ID1.1b CASSFVSGTDTQYF(SEQ ID NO:47)
Seq-ID1.2b CASSFVSGTDTQYF(SEQ ID NO:47)
Seq-ID1.3b CASSFLSGTDTQYF(SEQ ID NO:73)
Seq-ID1.4b CASSFLSGTDTQYF(SEQ ID NO:73)
Seq-ID1.5b CASSFLAGTDTQYF(SEQ ID NO:72)
Seq-ID1.6b CASSFVSGTDTQYF(SEQ ID NO:47)
聚类1区J/C GPGTRLTVLEDLKNVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG(SEQ ID NO:56)
α链，TRA：TRAV24*01、TRAJ18*01、TRAC*01
聚类1区V ATGGAGAAGAATCCTTTGGCAGCCCCATTACTAATCCTCTGGTTTCATCTTGACTGCGTGAGCAGCATACTGAACGTGGAACAAAGTCCTCAGTCACTGCATGTTCAGGAGGGAGACAGCACCAATTTCACCTGCAGCTTCCCTTCCAGCAATTTTTATGCCTTACACTGGTACAGATGGGAAACTGCAAAAAGCCCCGAGGCCTTGTTTGTAATGACTTTAAATGGGGATGAAAAGAAGAAAGGACGAATAAGTGCCACTCTTAATACCAAGGAGGGTTACAGCTATTTGTACATCAAAGGATCCCAGCCTGAAGACTCAGCCACATACCTC(SEQ ID NO:131)
Seq-ID1.1a TGTGCCTTTATGGCCAGAGGCTCAACCCTGGGGAGGCTATACTTT(SEQ ID NO:134)
Seq-ID1.2a TGTGCCTTTATGGCCAGAGGCTCAACCCTGGGGAGGCTATACTTT(SEQ ID NO:124)
Seq-ID1.3a TGTGCCTTTATGGCCAGAGGCTCAACCCTGGGGAGGCTATACTTT(SEQ ID NO:119)
Seq-ID1.4a TGTGCCTTTATGGCCAGAGGCTCAACCCTGGGGAGGCTATACTTT(SEQ ID NO:147)
Seq-ID1.5a TGTGCCTTTATGGCCAGAGGCTCAACCCTGGGGAGGCTATACTTT(SEQ ID NO:102)
Seq-ID1.6a TGTGCCTTATTAAGCAGAGGCTCAACCCTGGGGAGGCTATACTTT(SEQ ID NO:132)
聚类1区J/C GGAAGAGGAACTCAGTTGACTGTCTGGCCTGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(SEQ ID NO:138)
聚类1区V MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYL(SEQ ID NO:3)
Seq-ID1.1a CAFMARGSTLGRLYF(SEQ ID NO:58)
Seq-ID1.2a CAFMERGSTLGRLYF(SEQ ID NO:12)
Seq-ID1.3a CAFLTRGSTLGRLYF(SEQ ID NO:18)
Seq-ID1.4a CAFMPRGSTLGRLYF(SEQ ID NO:55)
Seq-ID1.5a CAPLPRGSTLGRLYF(SEQ ID NO:26)
Seq-ID1.6a CALLSRGSTLGRLYF(SEQ ID NO:11)
聚类1区J/C GRGTQLTVWPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:53)
表3：聚类ID 31：
| SEQ-ID | CDR3β：氨基酸序列 | CDR3α：氨基酸序列 | HLA_A_I | HLA_C_II |
| 31.1 | CASSLDGMNTEAFF(SEQ ID NO:28) | CAARLTGTASKLTF(SEQ ID NO:63) | A*02:05 | C*07:01 |
| 31.2 | CASSLDGMNTEAFF(SEQ ID NO:28) | CAARNAGTASKLTF(SEQ ID NO:71) | A*02:35 | C*07:04 |
| 31.3 | CASSLDGMNTEAFF(SEQ ID NO:28) | CAARNTGTASKLTF(SEQ ID NO:62) | A*02:01 | C*07:01 |
聚类ID 31：
聚类31与HLA-A*02:01超型(HLA-A*02:01/02:35/02:05)或HLA-C*07:01/07:04相关联
β链，TRB：TRBV5-1*01、TRBJ1-1*01、TRBC1*01
聚类31区V ATGGGCTCCAGGCTGCTCTGTTGGGTGCTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTAAAGGCTGGAGTCACTCAAACTCCAAGATATCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACACTGAGCTGCTCCCCTATCTCTGGGCATAGGAGTGTATCCTGGTACCAACAGACCCCAGGACAGGGCCTTCAGTTCCTCTTTGAATACTTCAGTGAGACACAGAGAAACAAAGGAAACTTCCCTGGTCGATTCTCAGGGCGCCAGTTCTCTAACTCTCGCTCTGAGATGAATGTGAGCACCTTGGAGCTGGGGGACTCGGCCCTTTATCTT(SEQ ID NO:116)
Seq-ID31.1b TGCGCCAGCAGTTTGGACGGGATGAACACTGAAGCTTTCTTT(SEQ ID NO:98)
Seq-ID31.2b TGCGCCAGCAGCTTGGACGGAATGAACACTGAAGCTTTCTTT(SEQ ID NO:83)
Seq-ID31.3b TGCGCCAGCAGCTTGGACGGCATGAACACTGAAGCTTTCTTT(SEQ ID NO:129)
聚类31区J/C GGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGA(SEQ ID NO:103)
聚类31区V MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYL(SEQ ID NO:43)
Seq-ID31.1b CASSLDGMNTEAFF(SEQ ID NO:28)
Seq-ID31.2b CASSLDGMNTEAFF(SEQ ID NO:28)
Seq-ID31.3b CASSLDGMNTEAFF(SEQ ID NO:28)
聚类31区J/C GQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:37)
α链，TRA：TRAV29/DV5*01、TRAJ44*01、TRAC*01
聚类31区V ATGGCCATGCTCCTGGGGGCATCAGTGCTGATTCTGTGGCTTCAGCCAGACTGGGTAAACAGTCAACAGAAGAATGATGACCAGCAAGTTAAGCAAAATTCACCATCCCTGAGCGTCCAGGAAGGAAGAATTTCTATTCTGAACTGTGACTATACTAACAGCATGTTTGATTATTTCCTATGGTACAAAAAATACCCTGCTGAAGGTCCTACATTCCTGATATCTATAAGTTCCATTAAGGATAAAAATGAAGATGGAAGATTCACTGTCTTCTTAAACAAAAGTGCCAAGCACCTCTCTCTGCACATTGTGCCCTCCCAGCCTGGAGACTCTGCAGTGTACTTC(SEQ ID NO:79)
Seq-ID31.1a TGTGCAGCAAGACTTACCGGCACTGCCAGTAAACTCACCTTT(SEQ ID NO:143)
Seq-ID31.2a TGTGCAGCAAGGAATGCCGGCACTGCCAGTAAACTCACCTTT(SEQ ID NO:148)
Seq-ID31.3a TGTGCAGCAAGGAATACCGGCACTGCCAGTAAACTCACCTTT(SEQ ID NO:152)
聚类31区J/C GGGACTGGAACAAGACTTCAGGTCACGCTCGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(SEQ ID NO:158)
聚类31区V MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYF(SEQ ID NO:54)
Seq-ID31.1a CAARLTGTASKLTF(SEQ ID NO:63)
Seq-ID31.2a CAARNAGTASKLTF(SEQ ID NO:71)
Seq-ID31.3a CAARNTGTASKLTF(SEQ ID NO:62)
聚类31区J/C GTGTRLQVTLDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:48)
表4：聚类ID 2：
| SEQ-ID | CDR3β：氨基酸序列 | CDR3α：氨基酸序列 | HLA_A_I | HLA_A_II |
| 2.1 | CASSEDGMNTEAFF(SEQ ID NO:19) | CAVLMDSNYQLIW(SEQ ID NO:51) | A*01:01 | A*02:01 |
| 2.2 | CASSSDGMNTEAFF(SEQ ID NO:60) | CAVLMDSNYQLIW(SEQ ID NO:51) | A*01:01 | A*02:01 |
| 2.3 | CASSPDGMNTEAFF(SEQ ID NO:45) | CALLMDSNYQLIW(SEQ ID NO:8) | A*01:01 | A*02:01 |
聚类ID 2：
聚类2与HLA-A*01:01或HLA-A*02:01相关联
β链，TRB：TRBV10-2、TRBJ1-1、TRBC1*01
聚类2区V ATGGGCACCAGGCTCTTCTTCTATGTGGCCCTTTGTCTGCTGTGGGCAGGACACAGGGATGCTGGAATCACCCAGAGCCCAAGATACAAGATCACAGAGACAGGAAGGCAGGTGACCTTGATGTGTCACCAGACTTGGAGCCACAGCTATATGTTCTGGTATCGACAAGACCTGGGACATGGGCTGAGGCTGATCTATTACTCAGCAGCTGCTGATATTACAGATAAAGGAGAAGTCCCCGATGGCTATGTTGTCTCCAGATCCAAGACAGAGAATTTCCCCCTCACTCTGGAGTCAGCTACCCGCTCCCAGACATCTGTGTATTTC(SEQ ID NO:78)
Seq-ID2.1b TGCGCCAGCAGTGAGGACGGCATGAACACTGAAGCTTTCTTT(SEQ ID NO:77)
Seq-ID2.2b TGCGCCAGCAGTTCCGACGGGATGAACACTGAAGCTTTCTTT(SEQ ID NO:107)
Seq-ID2.3b TGCGCCAGCAGCCCGGACGGAATGAACACTGAAGCTTTCTTT(SEQ ID NO:92)
聚类2区J/C GGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGA(SEQ ID NO:103)
聚类2区V MGTRLFFYVALCLLWAGHRDAGITQSPRYKITETGRQVTLMCHQTWSHSYMFWYRQDLGHGLRLIYYSAAADITDKGEVPDGYVVSRSKTENFPLTLESATRSQTSVYF(SEQ ID NO:30)
Seq-ID2.1b CASSEDGMNTEAFF(SEQ ID NO:19)
Seq-ID2.2b CASSSDGMNTEAFF(SEQ ID NO:60)
Seq-ID2.3b CASSPDGMNTEAFF(SEQ ID NO:45)
聚类2区J/C GQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:37)
α链，TRA：TRAV21*01、TRAJ33*01、TRAC*01
聚类2区V ATGGAGACCCTCTTGGGCCTGCTTATCCTTTGGCTGCAGCTGCAATGGGTGAGCAGCAAACAGGAGGTGACACAGATTCCTGCAGCTCTGAGTGTCCCAGAAGGAGAAAACTTGGTTCTCAACTGCAGTTTCACTGATAGCGCTATTTACAACCTCCAGTGGTTTAGGCAGGACCCTGGGAAAGGTCTCACATCTCTGTTGCTTATTCAGTCAAGTCAGAGAGAGCAAACAAGTGGAAGACTTAATGCCTCGCTGGATAAATCATCAGGACGTAGTACTTTATACATTGCAGCTTCTCAGCCTGGTGACTCAGCCACCTACCTC(SEQ ID NO:145)
Seq-ID2.1a TGTGCTGTCCTAATGGATAGCAACTATCAGTTAATCTGG(SEQ ID NO:120)
Seq-ID2.2a TGTGCTGTCTTAATGGATAGCAACTATCAGTTAATCTGG(SEQ ID NO:146)
Seq-ID2.3a TGTGCTTTACTCATGGATAGCAACTATCAGTTAATCTGG(SEQ ID NO:90)
聚类2区J/C GGCGCTGGGACCAAGCTAATTATAAAGCCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(SEQ ID NO:111)
聚类2区V METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYL(SEQ ID NO:68)
Seq-ID2.1a CAVLMDSNYQLIW(SEQ ID NO:51)
Seq-ID2.2a CAVLMDSNYQLIW(SEQ ID NO:51)
Seq-ID2.3a CALLMDSNYQLIW(SEQ ID NO:8)
聚类2区J/C GAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:70)
表5：聚类ID 3：
聚类ID 3：
聚类3与HLA-A*02:01或HLA-A*01超型(A*01:01/68:01)相关联
β链，TRB：TRBV29-1*01、TRBJ1-4*01、TRBC1*01
聚类3区V ATGCTGAGTCTTCTGCTCCTTCTCCTGGGACTAGGCTCTGTGTTCAGTGCTGTCATCTCTCAAAAGCCAAGCAGGGATATCTGTCAACGTGGAACCTCCCTGACGATCCAGTGTCAAGTCGATAGCCAAGTCACCATGATGTTCTGGTACCGTCAGCAACCTGGACAGAGCCTGACACTGATCGCAACTGCAAATCAGGGCTCTGAGGCCACATATGAGAGTGGATTTGTCATTGACAAGTTTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAACATTCTCAACTCTGACTGTGAGCAACATGAGCCCTGAAGACAGCAGCATATATCTC(SEQ ID NO:112)
Seq-ID3.1b TGCAGCGTTGGGGCTCAGGGAACTAATGAAAAACTGTTTTTT(SEQ ID NO:84)
Seq-ID3.2b TGCAGCGTTGGGTCCGGGGGCACTAATGAAAAACTGTTTTTT(SEQ ID NO:144)
Seq-ID3.3b TGCAGCGTCGGAACAGGGGGGACTAATGAAAAACTGTTTTTT(SEQ ID NO:89)
Seq-ID3.4b TGCAGCGTTGGGACAGGGGGAACTAATGAAAAACTGTTTTTT(SEQ ID NO:127)
Seq-ID3.5b TGCAGCGTTGGGTCCGGGGGCACTAATGAAAAACTGTTTTTT(SEQ ID NO:144)
Seq-ID3.6b TGCAGCGTCGGAACAGGGGGGACTAATGAAAAACTGTTTTTT(SEQ ID NO:89)
Seq-ID3.7b TGCAGCGTTGGGACAGGGGGAACTAATGAAAAACTGTTTTTT(SEQ ID NO:127)
聚类3区J/C GGCAGTGGAACCCAGCTCTCTGTCTTGGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGA(SEQ ID NO:81)
聚类3区V MLSLLLLLLGLGSVFSAVISQKPSRDICQRGTSLTIQCQVDSQVTMMFWYRQQPGQSLTLIATANQGSEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYL(SEQ ID NO:16)
Seq-ID3.1b CSVGAQGTNEKLFF(SEQ ID NO:15)
Seq-ID3.2b CSVGSGGTNEKLFF(SEQ ID NO:27)
Seq-ID3.3b CSVGTGGTNEKLFF(SEQ ID NO:31)
Seq-ID3.4b CSVGTGGTNEKLFF(SEQ ID NO:31)
Seq-ID3.5b CSVGSGGTNEKLFF(SEQ ID NO:27)
Seq-ID3.6b CSVGTGGTNEKLFF(SEQ ID NO:31)
Seq-ID3.7b CSVGTGGTNEKLFF(SEQ ID NO:31)
聚类3区J/C GSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:22)
α链，TRA：TRAV5*01、TRAJ23*01/TRAJ37*01/TRAJ31*01、TRAC*01
聚类3区V ATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCCTGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGACTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCTCCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACTCACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAGACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTC(SEQ ID NO:104)
Seq-ID3.1a TGTGCAGAGAGTACCTCCAGGGGAAAGCTTATCTTC(SEQ ID NO:100)
Seq-ID3.2a TGTGCAGAGAGTACTCCGGGAGGAAAGCTTATCTTC(SEQ ID NO:155)
Seq-ID3.3a TGTGCAGAGAGCTCGCCGCAAGGCAAACTAATCTTT(SEQ ID NO:142)
Seq-ID3.4a TGTGCAGAGTCAACTCCCCGGGGCAGACTCATGTTT(SEQ ID NO:110)
Seq-ID3.5a TGTGCAGAGAGTACTCCGGGAGGAAAGCTTATCTTC(SEQ ID NO:155)
Seq-ID3.6a TGTGCAGAGAGCTCGCCGCAAGGCAAACTAATCTTT(SEQ ID NO:142)
Seq-ID3.7a TGTGCAGAGTCAACTCCCCGGGGCAGACTCATGTTT(SEQ ID NO:110)
聚类3区J/C GGACAGGGAACGGAGTTATCTGTGAAACCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(SEQ ID NO:87)
聚类3区V MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYF(SEQ ID NO:57)
Seq-ID3.1a CAESTSRGKLIF(SEQ ID NO:24)
Seq-ID3.2a CAESTSRGKLIF(SEQ ID NO:2)
Seq-ID3.3a CAESTSRGKLIF(SEQ ID NO:21)
Seq-ID3.4a CAESTPRGRLMF(SEQ ID NO:32)
Seq-ID3.5a CAESTSRGKLIF(SEQ ID NO:2)
Seq-ID3.6a CAESTSRGKLIF(SEQ ID NO:21)
Seq-ID3.7a CAESTPRGRLMF(SEQ ID NO:32)
聚类3区J/C GQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:4)
表6：聚类ID 4：
| SEQ-ID | CDR3β：氨基酸序列 | CDR3α：氨基酸序列 | HLA_C_I | HLA_C_II |
| 4.1 | CASSYDSGTGELFF(SEQ ID NO:9) | CALSETGNQFYF(SEQ ID NO:52) | C*07:01 | |
| 4.2 | CASSYDSGTGELFF(SEQ ID NO:9) | CALSETGNQFYF(SEQ ID NO:52) | C*07:01 | |
| 4.3 | CASSYDSGTGELFF(SEQ ID NO:9) | CALSDTGNQFYF(SEQ ID NO:29) | C*07:01 | |
| 4.4 | CASSYDSGTGELFF(SEQ ID NO:9) | CALSDTGNQFYF(SEQ ID NO:29) | C*07:01 |
聚类ID 4：
聚类4与HLA-C*07:01相关联
β链，TRB：TRBV6-5*01/TRBV6-1*01、TRBJ2-2*01、TRBC2*01
聚类4区V ATGAGCATCGGCCTCCTGTGCTGTGCAGCCTTGTCTCTCCTGTGGGCAGGTCCAGTGAATGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAAATTCCAGGTCCTGAAGACAGGACAGAGCATGACACTGCAGTGTGCCCAGGATATGAACCATGAATACATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGCATGGGGCTGAGGCTGATTCATTACTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGACCAAGGAGAAGTCCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGCTGTCGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTC(SEQ ID NO:154)
Seq-ID4.1b TGTGCCAGCAGTTATGACAGCGGAACCGGGGAGCTGTTTTTT(SEQ ID NO:121)
Seq-ID4.2b TGTGCCAGCAGTTACGACAGTGGGACCGGGGAGCTGTTTTTT(SEQ ID NO:140)
Seq-ID4.3b TGTGCCAGCAGTTACGACTCAGGGACCGGGGAGCTGTTTTTT(SEQ ID NO:141)
Seq-ID4.4b TGTGCCAGCAGTTACGACTCAGGGACCGGGGAGCTGTTTTTT(SEQ ID NO:141)
聚类4区J/C GGAGAAGGCTCTAGGCTGACCGTACTGGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCAAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG(SEQ ID NO:128)
聚类4区V MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYF(SEQ ID NO:39)
Seq-ID4.1b CASSYDSGTGELFF(SEQ ID NO:9)
Seq-ID4.2b CASSYDSGTGELFF(SEQ ID NO:9)
Seq-ID4.3b CASSYDSGTGELFF(SEQ ID NO:9)
Seq-ID4.4b CASSYDSGTGELFF(SEQ ID NO:9)
聚类4区J/C GEGSRLTVLEDLKNVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG(SEQ ID NO:34)
α链，TRA：TRAV19*01、TRAJ49*01、TRAC*01
聚类4区V ATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAGGGCAGTCATAGCCTCCATCTGTGTTGTATCCAGCATGGCTCAGAAGGTAACTCAAGCGCAGACTGAAATTTCTGTGGTGGAGAAGGAGGATGTGACCTTGGACTGTGTGTATGAAACCCGTGATACTACTTATTACTTATTCTGGTACAAGCAACCACCAAGTGGAGAATTGGTTTTCCTTATTCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCAAAATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTCCAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACTTCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATACTTC(SEQ ID NO:149)
Seq-ID4.1a TGTGCTCTGAGTGAAACCGGTAACCAGTTCTATTTT(SEQ ID NO:114)
Seq-ID4.2a TGTGCTCTGAGTGAGACCGGTAACCAGTTCTATTTT(SEQ ID NO:91)
Seq-ID4.3a TGTGCTCTGAGTGAAACCGGTAACCAGTTCTATTTT(SEQ ID NO:99)
Seq-ID4.4a TGTGCTCTGAGTGAAACCGGTAACCAGTTCTATTTT(SEQ ID NO:99)
聚类4区J/C GGGACAGGGACAAGTTTGACGGTCATTCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(SEQ ID NO:76)
聚类4区V MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYF(SEQ ID NO:49)
Seq-ID4.1a CALSETGNQFYF(SEQ ID NO:52)
Seq-ID4.2a CALSETGNQFYF(SEQ ID NO:52)
Seq-ID4.3a CALSDTGNQFYF(SEQ ID NO:29)
Seq-ID4.4a CALSDTGNQFYF(SEQ ID NO:29)
聚类4区J/C GTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:66)
表7:聚类ID 5：
| SEQ-ID | CDR3β：氨基酸序列 | CDR3α：氨基酸序列 | HLA_A_I | HLA_A_II | HLA_C_I |
| 5.1 | CASSLEGQASSYEQYF(SEQ ID NO:61) | CAGSGAGSYQLTF(SEQ ID NO:13) | A*01:01 | A*02:01 | C*02:02 |
| 5.2 | CASSLEGQASSYEQYF(SEQ ID NO:61) | CAGAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:65) | A*01:01 | A*02:01 | C*02:02 |
聚类ID 5：
聚类5与HLA-A*01:01、HLA-A*02:01或HLA-C*02:02相关联
β链，TRB：TRBV5-1*01、TRBJ2-7*01、TRBC2*01
聚类5区V ATGGGCTCCAGGCTGCTCTGTTGGGTGCTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTAAAGGCTGGAGTCACTCAAACTCCAAGATATCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACACTGAGCTGCTCCCCTATCTCTGGGCATAGGAGTGTATCCTGGTACCAACAGACCCCAGGACAGGGCCTTCAGTTCCTCTTTGAATACTTCAGTGAGACACAGAGAAACAAAGGAAACTTCCCTGGTCGATTCTCAGGGCGCCAGTTCTCTAACTCTCGCTCTGAGATGAATGTGAGCACCTTGGAGCTGGGGGACTCGGCCCTTTATCTT(SEQ ID NO:116)
Seq-ID5.1b TGCGCCAGCAGCTTGGAAGGACAGGCGAGCTCCTACGAGCAGTACTTC(SEQ IDNO:75)
Seq-ID5.2b TGCGCCAGCAGCTTGGAGGGTCAGGCCAGCTCCTACGAGCAGTACTTC(SEQ ID NO156)
聚类5区J/C GGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCAAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG(SEQ ID NO:80)
聚类5区V MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYL(SEQ ID NO:43)
Seq-ID5.1b CASSLEGQASSYEQYF(SEQ ID NO:61)
Seq-ID5.2b CASSLEGQASSYEQYF(SEQ ID NO:61)
聚类5区J/C GPGTRLTVTEDLKNVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG(SEQ ID NO:69)
α链，TRA：TRAV25*01、TRAJ28*01、TRAC*01
聚类5区V ATGCTACTCATCACATCAATGTTGGTCTTATGGATGCAATTGTCACAGGTGAATGGACAACAGGTAATGCAAATTCCTCAGTACCAGCATGTACAAGAAGGAGAAGACTTCACCACGTACTGCAATTCCTCAACTACTTTAAGCAATATACAGTGGTATAAGCAAAGGCCTGGTGGACATCCCGTTTTTTTGATACAGTTAGTGAAGAGTGGAGAAGTGAAGAAGCAGAAAAGACTGACATTTCAGTTTGGAGAAGCAAAAAAGAACAGCTCCCTGCACATCACAGCCACCCAGACTACAGATGTAGGAACCTACTTC(SEQ ID NO:105)
Seq-ID5.1a TGTGCAGGATCTGGGGCTGGGAGTTACCAACTCACTTTC(SEQ ID NO:126)
Seq-ID5.2a TGTGCTGGGGCTGGGGCTGGGAGTTACCAACTCACTTTC(SEQ ID NO:135)
聚类5区J/C GGGAAGGGGACCAAACTCTCGGTCATACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(SEQ ID NO:153)
聚类5区V MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYF(SEQ ID NO:35)
Seq-ID5.1a CAGSGAGSYQLTF(SEQ ID NO:13)
Seq-ID5.2a CAGAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:65)
聚类5区J/C GKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:40)
表8：聚类ID 6：
| SEQ-ID | CDR3β：氨基酸序列 | CDR3α：氨基酸序列 | HLA_A_I |
| 6.1 | CASSIGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:10) | CVVSAGREYGNKLVF(SEQ ID NO:25) | B*15:01 |
| 6.2 | CASSLTSGNYNEQFF(SEQ ID NO:42) | CVVSAGREYGNKLVF(SEQ ID NO:25) | B*15:01 |
| 6.3 | CASSRTSGSLNEQFF(SEQ ID NO:7) | CVVTAGREYGNKLVF(SEQ ID NO:5) | B*15:01 |
| 6.4 | CASTVTSGSYNEQFF(SEQ ID NO:44) | CVVSAGREYGNKLVF(SEQ ID NO:25) | B*15:01 |
| 6.5 | CASSLTSGSYNEQFF(SEQ ID NO:17) | CVVSVGREYGNKLVF(SEQ ID NO:46) | B*15:01 |
聚类ID 6：
聚类6与HLA-B*15:01相关联
β链，TRB：TRBV19*01、TRBJ2-1*01、TRBC2*01
聚类6区V ATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTGTGTGGTCCTTTGTTTCCTGGGAGCAAACACCGTGGATGGTGGAATCACTCAGTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGTGACCCTGAGTTGTGAACAGAATTTGAACCACGATGCCATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGAGATTGATCTACTACTCACAGATAGTAAATGACTTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCTC(SEQ ID NO:109)
Seq-ID6.1b TGTGCCAGTAGTATTGGCAGCGGGAGTTACAATGAGCAGTTCTTC(SEQ ID NO:118)
Seq-ID6.2b TGTGTGGTGAGCGCCGGGAGGGAATATGGAAACAAACTGGTCTTT(SEQ ID NO:94)
Seq-ID6.3b TGTGCCAGTAGTCGGACTAGCGGGAGTCTTAATGAGCAGTTCTTC(SEQ ID NO:93)
Seq-ID6.4b TGTGCCAGTACCGTAACAAGCGGGAGCTACAATGAGCAGTTCTTC(SEQ ID NO:117)
Seq-ID6.5b TGTGCCAGTAGTCTCACTAGCGGTTCCTACAATGAGCAGTTCTTC(SEQ ID NO:95)
聚类6区J/C GGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCAAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG(SEQ ID NO:113)
聚类6区V MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYL(SEQ ID NO:36)
Seq-ID6.1b CASSIGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:10)
Seq-ID6.2b CASSLTSGNYNEQFF(SEQ ID NO:42)
Seq-ID6.3b CASSRTSGSLNEQFF(SEQ ID NO:7)
Seq-ID6.4b CASTVTSGSYNEQFF(SEQ ID NO:44)
Seq-ID6.5b CASSLTSGSYNEQFF(SEQ ID NO:17)
聚类6区J/C GPGTRLTVLEDLKNVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG(SEQ ID NO:56)
α链，TRA：TRAV10*01、TRAJ47*01、TRAC*01
聚类6区V ATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTGGTGATTTTGTGGCTTTATTTTTATAGGGGGAATGGCAAAAACCAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGTCCCTGATCATCCTGGAGGGAAAGAACTGCACTCTTCAATGCAATTATACAGTGAGCCCCTTCAGCAACTTAAGGTGGTATAAGCAAGATACTGGGAGAGGTCCTGTTTCCCTGACAATCATGACTTTCAGTGAGAACACAAAGTCGAACGGAAGATATACAGCAACTCTGGATGCAGACACAAAGCAAAGCTCTCTGCACATCACAGCCTCCCAGCTCAGCGATTCAGCCTCCTACATC(SEQ ID NO:150)
Seq-ID6.1a TGTGTGGTGAGCGCGGGGAGGGAATATGGAAACAAACTGGTCTTT(SEQ ID NO:122)
Seq-ID6.2a TGTGTGGTGAGCGCCGGGAGGGAATATGGAAACAAACTGGTCTTT(SEQ ID NO:94)
Seq-ID6.3a TGTGTGGTGACCGCGGGGAGGGAATATGGAAACAAACTGGTCTTT(SEQ ID NO:130)
Seq-ID6.4a TGTGTGGTGAGCGCGGGGAGGGAATATGGAAACAAACTGGTCTTT(SEQ ID NO:122)
Seq-ID6.5a TGTGTGGTGAGCGTTGGAAGGGAATATGGAAACAAACTGGTCTTT(SEQ ID NO:82)
聚类6区J/C GGCGCAGGAACCATTCTGAGAGTCAAGTCCTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(SEQ ID NO:137)
聚类6区V MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYI(SEQ ID NO:14)
Seq-ID6.1a CVVSAGREYGNKLVF(SEQ ID NO:25)
Seq-ID6.2a CVVSAGREYGNKLVF(SEQ ID NO:25)
Seq-ID6.3a CVVTAGREYGNKLVF(SEQ ID NO:5)
Seq-ID6.4a CVVSAGREYGNKLVF(SEQ ID NO:25)
Seq-ID6.5a CVVSVGREYGNKLVF(SEQ ID NO:46)
聚类6区J/C GAGTILRVKSYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:50)
Claims (24)
1.一种鉴定共同肿瘤特异性T细胞受体(TCR)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.通过以下步骤从n(n>1)名患者的每个个体患者获得多个肿瘤特异性TCR序列：
i.在基于肿瘤序列的步骤中，通过以下步骤来确定多个肿瘤TCR序列中的每个的频率：
I.提供从所述患者获得的分离的肿瘤样品；
II.从所述肿瘤样品中分离肿瘤T细胞；
III.获得多个肿瘤TCR核酸序列；
IV.将基本相同的肿瘤TCR核酸序列分组为肿瘤TCR克隆型组，并对每个肿瘤TCR克隆型组中的肿瘤TCR核酸序列进行计数；
V.通过将每个肿瘤TCR克隆型组中的肿瘤TCR核酸序列的数目除以所有肿瘤TCR核酸序列的数目，来确定每个肿瘤TCR的频率；
ii.在基于非肿瘤序列的步骤中，通过以下步骤来确定多个非肿瘤TCR序列中的每个的频率：
I.提供从所述患者获得的分离的非肿瘤组织样品；
II.从所述非肿瘤组织样品中分离非肿瘤T细胞；
III.获得多个非肿瘤TCR核酸序列；
IV.将非肿瘤TCR核酸序列分组为一个基本相同的非肿瘤TCR克隆型组，并对每个肿瘤TCR克隆型组中的非肿瘤TCR核酸序列进行计数；
V.通过将每个非肿瘤TCR克隆型组中的非肿瘤TCR核酸序列的数目除以所有非肿瘤TCR核酸序列的数目，来确定每个非肿瘤TCR的频率；
iii.在肿瘤特异性选择步骤中，如果所述肿瘤TCR的频率高于所述非肿瘤TCR的频率，则选择TCR核酸序列作为肿瘤特异性TCR序列；
b.通过以下步骤选择共同肿瘤特异性TCR序列：
i.将肿瘤特异性TCR核酸序列翻译成肿瘤特异性TCR氨基酸序列；
ii.测定所述n名患者的所述肿瘤特异性TCR氨基酸序列的CDR3区域；
iii.比对所述n名患者的所述多个肿瘤特异性TCR氨基酸序列的CDR3区域；
iv.如果其CDR3区相差不超过3个氨基酸/CDR3，特别是不超过2个氨基酸/CDR3，更特别是不超过1个氨基酸/CDR3，最特别是没有差异，则将TCR序列分组为一个TCR克隆型聚类；
v.在共同TCR选择步骤中，如果所述TCR克隆型聚类存在于至少二个患者中，则选择TCR序列聚类作为共同肿瘤特异性TCR序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述n名患者的肿瘤样品具有相同的组织类型。
3.根据前述权利要求中任一所述的方法，其中所述非肿瘤组织样品与所述肿瘤样品具有相同的组织类型。
4.根据前述权利要求中任一所述的方法，其中确定所述多个患者具有至少一个共同相同HLA型的基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，确定所述多个患者具有共同相同HLA型的基因，特别是具有正好一个共同相同HLA型的基因，并指定所述共同肿瘤特异性TCR为HLA型特异性TCR。
6.根据前述权利要求中任一所述的方法，其中通过以下步骤指定所述共同肿瘤特异性TCR为HLA型特异性TCR：
a.选择其中存在所述共同肿瘤特异性TCR序列的所有患者；
b.确定哪些HLA基因存在于所述选择的患者中；
c.如果在所有选择的患者中存在共同HLA基因，特别是存在正好一个共同HLA基因，则指定共同肿瘤特异性TCR为HLA型特异性TCR。
7.根据前述权利要求中任一所述的方法，其中如果所述肿瘤TCR克隆型组的频率比所述非肿瘤TCR克隆型组的频率高2倍，特别是高3倍，更特别是高5倍，甚至更特别是高10倍，则在所述肿瘤特异性选择步骤(a.iii.)中选择TCR序列作为肿瘤特异性TCR序列。
8.根据前述权利要求中任一所述的方法，其中患者的数目n为2至100，特别是n为10至50，更特别是n为20至30。
9.根据前述权利要求中任一所述的方法，其中所述共同TCR选择步骤(步骤b.v)另外包括T细胞激活/耗竭/分化标志物，特别是选自PDCD1(PD1)、TIGIT、LAG3、HAVCR2(TIM3)、CTLA4、IFNG、TNF、GZMB、TNFRSF9(CD137，4-1BB)、CD45(CD45RA/RO)、CD69、LAMP1(CD107a)、TBX21(T-BET)、TCF7(TCF-1)、EOMES、TOX和RUNX3的标志物，的测量，其中如果携带所述TCR的T细胞表达一或多个T细胞激活/耗竭/分化标志物或其组合，则选择TCR序列作为共同肿瘤特异性TCR序列。
10.一种鉴定共同肿瘤特异性抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
a.从n(n>1)位患者中鉴定根据前述权利要求中任一所述的共同肿瘤特异性TCR；
b.通过以下步骤获得多个肿瘤特异性多肽：
(1)通过以下步骤从所述患者的每个患者获得多个肿瘤特异性mRNA序列：
i.在基于mRNA肿瘤序列的步骤中，通过以下步骤确定多个肿瘤mRNA序列：
I.从来自所述患者的肿瘤样品分离肿瘤RNA制剂；
II.从所述肿瘤RNA制剂获得多个肿瘤mRNA序列；
ii.在基于mRNA非肿瘤序列的步骤中，通过以下步骤确定确个非肿瘤mRNA序列：
I.从来自所述患者的所述非肿瘤组织样品分离非肿瘤RNA制剂；
II.从所述肿瘤RNA制剂获得多个非肿瘤mRNA序列；
iii.在mRNA肿瘤特异性选择步骤中，通过以下步骤选择肿瘤特异性mRNA序列：
I.将所述多个肿瘤mRNA序列与所述多个非肿瘤mRNA序列进行比对；
II.选择存在于肿瘤样品中但不存在于非肿瘤样品中的mRNA序列作为肿瘤特异性RNA序列；
(2)通过以下步骤选择多个肿瘤特异性多肽：
i.将所述多个肿瘤特异性RNA序列翻译成多个肿瘤特异性氨基酸序列；
ii.对来自多名n名患者的多个肿瘤特异性氨基酸序列进行比对；
iii.如果其氨基酸序列具有≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％、或≥99％的序列同一性，则将氨基酸序列组成一个多肽聚类；
iv.如果所述肿瘤特异性氨基酸序列存在于所有n名患者中，则选择氨基酸序列的多个多肽聚类作为肿瘤特异性多肽；
c.对于所述多个肿瘤特异性多肽的每个成员，在抗原呈递细胞中表达所述成员；
d.检测每种抗原呈递细胞是否能够激活表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞；
e.如果表达所述肿瘤特异性多肽的抗原呈递细胞能够激活所述表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞，则选择肿瘤特异性多肽作为共同肿瘤特异性抗原。
11.根据权利要求10的方法，其中表达所述共同肿瘤特异性抗原的抗原呈递细胞上的HLA分子上呈递的肽另外被分离并通过质谱法表征。
12.根据权利要求10所述的方法，其中随后
a.通过权利要求10的方法发现的抗原被片段化成肽；
b.将各肽负载到抗原呈递细胞上的HLA分子上；
c.对于每个抗原呈递细胞，确定所述抗原呈递细胞是否能够激活表达共同肿瘤特异性TCR的T细胞。
13.根据前述权利要求10、11或12中任一所述的方法，其中所述肿瘤样品和所述非肿瘤组织样品来源于相同的组织样品，并且其中从所述组织样品分离肿瘤RNA制剂与从所述组织样品获得的单个肿瘤细胞和非肿瘤细胞分开进行。
14.一种鉴定共同肿瘤特异性抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
a.从n(n>1)位患者中鉴定根据前述权利要求中任一所述的共同肿瘤特异性TCR；
b.使表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞与肿瘤细胞接触，其中所述肿瘤细胞衍生自肿瘤细胞系，并检测所述肿瘤细胞是否能够激活所述T细胞产生得到所述共同肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞系衍生细胞；
c.可选地用不同的肿瘤细胞系重复步骤b；
d.从表达所述共同肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞系衍生细胞制备cDNA文库；
e.对于cDNA文库的每个成员，在抗原呈递细胞中表达所述成员；
f.检测每种抗原呈递细胞是否能够激活表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞；
g.如果表达所述cDNA的抗原呈递细胞能够激活所述表达所述共同肿瘤特异性TCR的T细胞，则选择cDNA作为共同肿瘤特异性抗原。
15.一种分离的TCR，其通过根据权利要求1至9中任一所述的方法鉴定。
16.根据权利要求15所述的分离的TCR，其中，所述TCR包括CDR3α序列和CDR3β序列，其中CDR3α序列和CDR3β序列与下面给出的序列相同，或对每个CDR3序列具有一个或二个氨基酸取代，
其中
a.对于组a，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:59的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:20的序列组成的组，或
b.对于组b，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73的序列组成的组，或
c.对于组c，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:71的序列组成的组，且CDR3β序列选自序列SEQ ID NO:28，或
d.对于组d，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:51的的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:60的序列组成的组，或
e.对于组e，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:32的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31的序列组成的组，或
f.对于组f，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:52的序列组成的组，且CDR3β序列选自序列SEQ ID NO:9，或
g.对于组g，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:65的序列组成的组，且CDR3β序列选自序列SEQ ID NO:61，或
h.对于组h，CDR3α序列选自包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:46的的序列组成的组，且CDR3β序列选自包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44的序列组成的组，
特别是其中CRD3α序列和CDR3β序列在表1–8的同一行中鉴定，
特别是其中所述取代是根据以下给出的取代规则选择的，
其中，取代规则是：
-甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可互换；缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、和异亮氨酸(I)可互换，A和V可互换；
-色氨酸(W)和苯丙氨酸(F)可互换，酪氨酸(Y)和F可互换；
-丝氨酸(S)和苏氨酸(T)可互换；
-天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)可互换
-天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)可互换；N和S可互换；N和D可互换；E和Q可互换；
-甲硫氨酸(M)和Q可互换；
-半胱氨酸(C)、A和S可互换；
-脯氨酸(P)、G和A可互换；
-精氨酸(R)和赖氨酸(K)可互换。
17.根据权利要求16所述的分离的TCR，其中所述CDR3序列选自a、b、f、g、和h组成的组。
18.根据权利要求16或17所述的分离的TCR，其中所述TCR另外包括可变(V)α序列、连接恒定(JC)α序列、Vβ序列和JCβ序列或与所述序列具有≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％、或≥99％序列同一性的序列，
其中
a.对于组a，Vα序列为SEQ ID NO:67，JCα序列为SEQ ID NO:4，Vβ序列为SEQ ID NO:23，且JCβ序列为SEQ ID NO:33，或
b.对于组b，Vα序列为SEQ ID NO:3，JCα序列为SEQ ID NO:53，Vβ序列为SEQ ID NO:64，且JCβ序列为SEQ ID NO:56，或
c.对于组c，Vα序列为SEQ ID NO:54，JCα序列为SEQ ID NO:48，Vβ序列为SEQ ID NO:43，且JCβ序列为SEQ ID NO:37，或
d.对于组d，Vα序列为SEQ ID NO:68，JCα序列为SEQ ID NO:70，Vβ序列为SEQ ID NO:30，且JCβ序列为SEQ ID NO:37，或
e.对于组e，Vα序列为SEQ ID NO:57，JCα序列为SEQ ID NO:4，Vβ序列为SEQ ID NO:16，且JCβ序列为SEQ ID NO:22，或
f.对于组f，Vα序列为SEQ ID NO:49，JCα序列为SEQ ID NO:66，Vβ序列为SEQ ID NO:39，且JCβ序列为SEQ ID NO:34，或
g.对于组g，Vα序列为SEQ ID NO:35，JCα序列为SEQ ID NO:40，Vβ序列为SEQ ID NO:43，且JCβ序列为SEQ ID NO:69，或
h.对于组h，Vα序列为SEQ ID NO:14，JCα序列为SEQ ID NO:50，Vβ序列为SEQ ID NO:36，且JCβ序列为SEQ ID NO:56。
19.一种编码根据权利要求15至18中任一所述的TCR的核酸序列。
20.一种分离的自体T细胞，其包括根据权利要求15至18中任一所述的TCR、和/或根据权利要求19所述的核酸序列。
21.根据权利要求20所述的分离的自体T细胞，其中所述分离的自体T细胞是重组T细胞。
22.根据权利要求15至18中任一所述的TCR、根据权利要求19所述的核酸序列、或根据权利要求20或21所述的分离的自体T细胞，用于治疗癌症。
23.根据权利要求15至18中任一所述的TCR、根据权利要求19所述的核酸序列、或根据权利要求20或21所述的分离的自体T细胞，用于治疗具有与通过根据权利要求5或6所述的方法测定的HLA型特异性TCR相同的HLA型的患者的癌症。
24.根据权利要求15至18中任一所述的TCR、根据权利要求19所述的核酸序列、或根据权利要求20或21所述的分离的自体T细胞，其根据权利要求23用于具有以下HLA类型的患者：
a.对于组a，HLA-B*08:01和/或HLA-C*07:01；或
b.对于组b，HLA-A*02:01超型(HLA-A*02:01/68:02)；或
c.对于组c，HLA-A*02:01超型(HLA-A*02:01/02:35/02:05)和/或HLA-C*07:01/07:04；或
d.对于组d，HLA-A*01:01和/或HLA-A*02:01；或
e.对于组e，HLA-A*02:01和/或HLA-A*01超型(A*01:01/68:01)；或
f.对于组f，HLA-C*07:01；或
g.对于组g，HLA-A*01:01和/或HLA-A*02:01和/或HLA-C*02:02；或
h.对于组h，HLA-B*15:01。
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