CN117794389A - 包含超氧化物歧化酶(sod)的植物活性提取物与胡芦巴提取物的组合及其用途 - Google Patents

包含超氧化物歧化酶(sod)的植物活性提取物与胡芦巴提取物的组合及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产品，及其用于预防或治疗认知障碍，特别是人类认知障碍的用途，所述产品包含含有SOD的植物活性提取物以及胡芦巴提取物。

Description

包含超氧化物歧化酶(SOD)的植物活性提取物与胡芦巴提取 物的组合及其用途
技术领域
本发明涉及认知障碍的治疗或预防的领域。
背景技术
最佳的认知功能主要依赖于神经元之间的活动和交流，但可能会受到多种因素的损害，例如老化、细胞应激、慢性应激和神经变性疾病。认知能力下降的特征可能是思维、学习、记忆、警觉性下降和/或心理技能受损，以及抑郁和焦虑。应激的心理生物学特征也可能代表氧化应激的表现，长期暴露于应激下可以诱发或加重认知障碍。正常老化还引起记忆、语言、思维或判断方面的问题。
因此，治疗或预防认知障碍对于提高人类的生活质量至关重要。
本申请人具体证明，含有SOD的植物活性提取物，特别是富含超氧化物歧化酶SOD的瓜汁浓缩物与胡芦巴提取物的组合对于减轻认知障碍具有协同作用。
此前由Milesi等人(2009年)得知并由Carillon等人(2014年)证实，口服补充(一种由Bionov销售的富含SOD的包覆的冻干瓜汁浓缩物(14UI SOD/mg粉末))对感知应激、疲劳和生活质量(身心健康状况)的多种体征和症状具有积极作用。
但是，仍然需要提高其在认知障碍方面的表现并开发新产品。
这正是本发明用富含SOD的瓜汁提取物与胡芦巴提取物的组合所解决的目标。
发明内容
本发明的第一目的在于一种产品，其包含含有SOD的植物活性提取物以及胡芦巴提取物，特别地和至少一种生理上可接受的赋形剂。
特别地，产品包含富含SOD的甜瓜(Cucumis melo)的植物活性提取物(也称为富含SOD的瓜汁浓缩物)和胡芦巴提取物。
在第一实施方案中，产品是营养产品，旨在用于健康受试者，意指暴露于例如应激、疲劳和/或老化但未受病理病症影响的受试者。
在另一个实施方案中，产品是药物产品，旨在用于有需要的患者，即患有病理学病症的非健康受试者。
本发明还涉及本发明的营养产品用于改善有需要的受试者的认知功能，特别是改善选自感知、记忆、注意力和/或推理的一种状况的用途。
另一个目的在于本发明的营养产品在治疗或预防选自认知障碍、情绪障碍、应激和焦虑症的病症中的用途。
本发明的另一个目的在于本发明的药物产品，其用于在有需要的患者中治疗或预防神经变性疾病，特别是选自轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病和帕金森病的神经变性疾病。
定义
在一个特别且优选的实施方案中，本发明使用含有SOD的植物活性提取物。
在植物中，环境逆境例如干旱、高温、低温、洪水、重金属和常量营养素缺乏通常导致还原氧物种(ROS)的产生增加，因此，SOD在植物的应激耐受性中发挥着重要作用。
富含SOD的植物活性“提取物”或“浓缩物”是指包含根据Zhou和Prognon(2006)的方法测量至少60IU/mg粉末，特别地80至180IU/mg粉末，优选90至150IU/mg粉末的SOD水平的原始或未包覆的干燥提取物或浓缩物。在一个特别的实施方案中，富含SOD的浓缩物包含至少90IU/mg粉末的SOD水平。
当富含SOD的植物活性“提取物”或“浓缩物”为包覆的形式时，其包含根据Zhou和Prognon(2006)的方法测量5至25SOD U/mg粉末，特别地10至20SOD U/mg粉末，特别地14USOD/mg粉末的SOD水平。
作为含有SOD的植物活性提取物的示例，可以提及的植物活性提取物包括但不限于：瓜、大麦、黑李、卷心菜、腰果、硬质小麦、葡萄、玉米、木瓜、豌豆、大米、甘蔗、茶树、小麦或西瓜(Stephanie等，2015)；还包括海洋植物来源，例如浮游植物和藻类，例如紫球藻(Prophyridium cruentum)、细叶扁藻(Tetraselmis gracilis)、周氏扁藻(Tetraselmischuii)、红树植物木榄(Bruguirea glymnorrhiza)、亚心型扁藻(Platymonassubcordiformis)、海榄雌(Avicennia marina)、缘管浒苔(Enteromorpha linza)或杯萼海桑(Sonneratia alba)(Zeinaldi等人，2020)。
在一个特别的实施方案中，含有SOD的植物活性提取物选自瓜、玉米、木瓜、大米、小麦、西瓜和浮游植物。
在一个优选的实施方案中，含有SOD的植物活性提取物是富含SOD的瓜提取物。
“SOD”在本发明的含义中是超氧化物歧化酶类型的酶。应当注意，本发明的超氧化物歧化酶是天然的，即它们未经化学修饰。特别地，本发明涉及SOD的整体而不是其片段。SOD根据其活性位点所含金属分为三类：锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铜和锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。
如本文所使用，“认知功能”是指涉及符号操作的任何心理过程，例如感知、记忆、注意力和推理。在一个实施方案中，“认知功能”是指记忆。
如本文所使用，“认知障碍”是指损害认知功能的任何病症。在一个实施方案中，“认知障碍”是指学习障碍、注意力缺陷障碍(ADD)和注意力缺陷多动障碍(ADHD)。
如本文所使用，“应激诱导的或应激相关的认知功能障碍”是指应激诱导、加剧或相关的认知功能障碍。
如本文所使用，“情绪障碍”是指情绪状态的紊乱，例如抑郁、心境恶劣和双相情感障碍。在一个实施方案中，情绪障碍为抑郁。
如本文所使用，“焦虑症”是指恐惧和焦虑的功能失调状态，例如与应激情况或对应激情况的预期不成比例的恐惧和焦虑。在一个实施方案中，焦虑症为广泛性焦虑症、强迫症、恐慌症、创伤后应激障碍和社交焦虑症中的任一种或其组合。在一个实施方案中，焦虑症为应激诱导的焦虑症。
如本文所使用，“神经变性疾病”或等同地“神经变性病症”是指涉及中枢神经系统中功能性神经元进行性丧失的任何病症。在一个实施方案中，神经变性疾病与年龄相关的细胞死亡有关。示例性的神经变性疾病包括但不限于轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(也称为ALS和卢伽雷氏病)，以及AIDS痴呆综合征、肾上腺脑白质营养不良、亚历山大病、阿尔珀病、共济失调毛细血管扩张症、巴顿病、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳万病、皮质基底节变性、克雅氏病、路易体痴呆、致命性家族性失眠、额颞叶变性、肯尼迪病、克拉伯病、莱姆病、马查多-约瑟夫病、多发性硬化症、多系统萎缩症、神经棘红细胞增多症、尼曼-皮克病、皮克病、原发性侧索硬化症、进行性核上性麻痹、雷夫叙姆病、桑德霍夫病、弥漫性髓鞘质硬化症、脊髓小脑性共济失调、脊髓亚急性联合变性、脊髓痨、泰-萨克斯病、中毒性脑病和传染性海绵状脑病。在一个实施方案中，神经变性疾病选自轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病和帕金森病。在一个实施方案中，神经变性疾病为阿尔茨海默病。在另一个实施方案中，神经变性疾病为轻度认知障碍(MCI)。
附图说明
图1：本发明的组合(Cpd X)在第3天对新物体识别(新物体时间段(novel objectsession))的作用。n为10至12只每组。$$p<0.01$$$p<0.001相比于辨识指数(discrimination index)的理论值的50％；Wilcoxon符号秩次检验(上/下-左)。***p<0.001相比于Sc.Aβ/Veh组；#p<0.05,##p<0.01相比于Aβ25-35/Veh组；单向方差分析后的Dunnett检验(上/下-右)。
图2：本发明的组合(Cpd X)对海马中脂质过氧化的作用。n为6只每组。***p<0.001相比于Sc.Aβ/Veh组；###p<0.001相比于Aβ25-35/Veh组；单向方差分析后的Dunnett检验。
图3：本发明的组合(Cpd X)对海马中淀粉样蛋白-β1-42水平的作用。n为10至12只每组。***p<0.001相比于Sc.Aβ/Veh组；###p<0.001相比于Aβ25-35/Veh组；单向方差分析后的Dunnett检验。
图4：本发明的组合(Cpd X)对海马中pTau水平的作用。n为10至12只每组。***p<0.001相比于Sc.Aβ/Veh组；#p<0.05,###p<0.001相比于Aβ25-35/Veh组；单向方差分析后的Dunnett检验。
图5：本发明的组合(Cpd X)对皮质中PSD-95水平的作用。n为10至12只每组。***p<0.001相比于Sc.Aβ/Veh组；##p<0.01相比于Aβ25-35/Veh组；单向方差分析后的Dunnett检验。
图6：本发明的组合(Cpd X)对皮质中突触素水平的作用。n为10至12只每组。***p<0.001相比于Sc.Aβ/Veh组；###p<0.001相比于Aβ25-35/Veh组；单向方差分析后的Dunnett检验。
图7：本发明的组合(Cpd X)对皮质中半胱天冬酶-9水平的作用。n为10至12只每组。**p<0.01相比于Sc.Aβ/Veh组；###p<0.001相比于Aβ25-35/Veh组；单向方差分析后的Dunnett检验。
图8：胡芦巴提取物的HPLC-DAD(280nm)谱图。
具体实施方式
本发明涉及一种产品，其包含一种或多种超氧化物歧化酶(SOD)和胡芦巴提取物，特别是含有SOD的植物活性提取物以及胡芦巴提取物。
在本发明的含义中，术语“产品”涵盖在单一产品中包含SOD(优选含有SOD的植物活性提取物)和胡芦巴提取物以及至少一种生理学上可接受的赋形剂的“组合物”，以及可替代地试剂盒，其中SOD(优选含有SOD的植物活性提取物)和胡芦巴提取物处于单独的组合物中，用于同时、顺序或延迟施用。
SOD和含有SOD的植物活性提取物
本发明的产品包含一种或多种SOD和胡芦巴提取物，优选含有SOD的植物活性提取物。
在一个实施方案中，SOD为植物来源的SOD混合物的形式，其特征在于其基本上由3种超氧化物歧化酶组成：锰超氧化物歧化酶、铜和锌超氧化物歧化酶以及铁超氧化物歧化酶，至少有两种亚型。这种植物来源的SOD的混合物例如公开于国际公开WO 2016/128531中。
在下文详细公开的特别且优选的实施方案中，SOD为含有SOD的植物活性提取物的形式。
作为非限制性示例，本发明中使用的含有SOD的植物活性提取物选自瓜、大麦、黑李、卷心菜、腰果、硬质小麦、葡萄、玉米、木瓜、豌豆、大米、甘蔗、茶树、小麦、西瓜，和海洋植物来源，例如浮游植物和藻类，例如紫球藻、细叶扁藻、周氏扁藻、红树植物木榄、亚心型扁藻、海榄雌、缘管浒苔或杯萼海桑。
在一个特别的实施方案中，本发明中使用的含有SOD的植物活性提取物选自瓜、玉米、木瓜、大米、小麦、西瓜和浮游植物。
在一个优选的实施方案中，本发明中使用的含有SOD的植物活性提取物为富含SOD的瓜提取物，特别是Bionov销售的含有SOD的瓜汁浓缩物。
含有超氧化物歧化酶(SOD)的瓜汁浓缩物
在一个特别的实施方案中，含有SOD的提取物为瓜的植物活性提取物，也称为瓜汁浓缩物。
在以下说明书中，术语“瓜的植物活性提取物”或“瓜汁浓缩物”可以互换使用。
瓜汁浓缩物(未包覆形式)
在一个特别的实施方案中，如专利US 5,616,323中所公开，本发明中使用的瓜的植物活性提取物由甜瓜获得，并且具有大于30酶单位/mg可溶性蛋白质，特别地大于50酶单位/mg，优选大于60单位/mg可溶性蛋白质的超氧化物歧化酶活性。
作为一个特别的实施方案，获得提取物的甜瓜的类型特别地描述于国际专利申请WO 92/02622中。
这些植物活性提取物可以通过本领域中任何能够回收可溶性物质的方法获得。有利地，这些植物活性提取物(也称为瓜汁浓缩物)可以通过物理处理获得，所述物理处理包括压碎瓜、回收果肉、离心、过滤和冷冻干燥。
在一个特别的实施方案中，通过在水性介质中在约7.5的pH研磨或压榨甜瓜，然后回收上清液，尤其是通过离心或过滤以用于可能的后续纯化，来获得瓜汁浓缩物。该方法的pH优选为5至9，这使得可以保持在最佳生理条件内(不使SOD变性)。优选地，离心能够排出膜状碎片。最后，将瓜汁浓缩物进行冷冻干燥步骤。
本发明使用的瓜汁浓缩物含有超氧化物歧化酶和其他化合物，包括类胡萝卜素、维生素和无机元素如镁、铜和锌。
本发明的原始或未包覆的干燥提取物或瓜汁浓缩物包含根据Zhou和Prognon(2006)的方法测量至少60 IU/mg粉末，特别地80至180 IU/mg粉末，优选90至150 IU/mg粉末的SOD水平。在一个特别的实施方案中，富含SOD的浓缩物包含至少90 IU/mg粉末的SOD水平。
在一个特别的实施例中，下表1说明了本发明的一批生的或未包覆的瓜汁浓缩物的组成：
表1
包覆的瓜汁浓缩物
在一个特别且优选的实施方案中，含有超氧化物歧化酶(SOD)的瓜汁浓缩物被包覆和/或微囊化，以保护其活性成分(SOD、维生素……)免受水介质、酶、pH和温度变化的影响，特别是经由口服途径使用时。
在一个特别的实施方案中，本发明的瓜汁浓缩物被包覆或微囊化在基于脂肪物质的脂溶性试剂中，如US2002/0182269中所公开的。特别地，脂溶性试剂是植物来源的。有利地，其选自氢化油；棕榈油或来自棕榈果心的油；氢化种子；硬脂酸酯，特别是选自硬脂精、硬脂酸及其衍生物；蜡，特别是植物蜡，例如巴西棕榈蜡；脂肪酸单二甘油酯；饱和C14 C20脂肪酸甘油三酯及其混合物。在一个特别的实施方案中，脂溶性试剂是基于植物油的氢化油，特别是选自氢化椰子油、氢化棕榈油、氢化大豆油或氢化菜籽油及其混合物。在一个特别的实施方案中，瓜汁浓缩物包覆有氢化棕榈油。
在另一个实施方案中，本发明的瓜汁浓缩物被包覆或微囊化在虫胶中，如公开WO2013/153220中所公开的。
在另一个实施方案中，本发明的瓜汁浓缩物被包封在可生物降解的聚合物微粒中，如国际公开WO2006/030111中所公开的。特别地，可生物降解聚合物微粒从核心向外依次包含：A)由碳水化合物或多元醇或多胺交联基质组成的阳离子或阴离子亲水性可生物降解聚合物核心，所述基质的体积来自阳离子或阴离子基团，并且所述基质掺入含有超氧化物歧化酶的活性植物提取物；B)相对于核心A带相反电荷的外部阴离子亲水性可生物降解聚合物层，所述层通过化学相互作用缔合，有利地与核心A成离子，并且表面分子或聚合物不是通过共价键接枝在所述层B的外表面上。
在一个特别的实施方案中，根据本发明使用的含有SOD的植物活性提取物为一种专有的包覆的冻干瓜汁浓缩物，其通过对非转基因瓜品种进行物理处理(粉碎瓜、回收果肉、离心、过滤、冷冻干燥、包覆以保护SOD活性免受消化酶的影响)而获得，所述瓜品种含有高水平的SOD和其他抗氧化物，如上表1所示。
在一个优选的实施方案中，含有SOD的瓜汁浓缩物为包覆的冻干瓜汁浓缩物，其包含根据Zhou和Prognon(2006)的方法测量5至25SOD U/mg粉末，特别地10至20SOD U/mg粉末，特别地14U SOD/mg粉末的SOD水平，有利地还包含类胡萝卜素、维生素和无机元素，例如镁、铜和锌。
在一个特别的实施方案中，冻干瓜汁浓缩物包覆有棕榈油。
作为说明性示例，根据本发明用于口服的一粒胶囊含有10mg所述冻干瓜汁浓缩物(140U的SOD)。胶囊通常还含有活性补充剂，例如淀粉或麦芽糖糊精。
说明书中进一步公开的实施例说明了Bionov销售的产品的效果，该产品为包覆有棕榈油并含有14U SOD/mg粉末的冻干瓜汁浓缩物。这种产品可以如公开号US2002/0182269的申请的实施例1中所公开的那样来制备。
胡芦巴提取物
胡芦巴(Trigonella foenum-graecum)是豆科一年生植物，叶子由三片小倒卵形至长圆形小叶组成。它在世界范围内作为半干旱作物种植。它的种子和叶子是印度烹饪中的常见成分。胡芦巴种子的成分包括类黄酮、生物碱、香豆素、维生素和皂苷。胡芦巴已广泛用作多种传统烹饪中的增味剂。此外，胡芦巴的药用性质，例如抗癌、抗糖尿病、抗氧化、降胆固醇、抗炎和免疫性质，使其成为食品和制药行业中使用的重要物质。研究表明，通过使用天然来源的具有生物活性的化合物，例如酚类、皂苷、类黄酮、生物碱和其他天然抗氧化剂，可以避免慢性疾病例如癌症、糖尿病、心脏病、感染、炎症和许多其他人类疾病。经由本领域技术人员已知的不同提取方法进行生物活性化合物的提取，例如浸渍、超声辅助提取和微波辅助提取。
在一个特别的实施方案中，胡芦巴提取物是通过以下方法获得的胡芦巴提取物：
a)将胡芦巴种子经超临界CO2提取，进一步脱脂
b)通过醇提取进一步提取脱脂胡芦巴种子。
使用超临界CO2提取，从胡芦巴种子中获得高附加值的提取物，脱臭和脱脂提取物。这种提取还提高了提取物的纯度，并且脱脂防止了提取物氧化酸败的风险。
在一个特别的实施方案中，胡芦巴提取物是通过以下步骤获得的：
a)将胡芦巴种子经超临界CO2提取，进一步脱脂
b)将脱脂胡芦巴种子进一步用80％乙醇提取，然后过滤，浓缩至20％干物质，巴氏灭菌，最后用10％麦芽糊精雾化，得到胡芦巴的干燥提取物。
根据本发明的干燥胡芦巴提取物为粉末，其具有超过95％的干物质，粒度小于250μm，其特征在于通过HPLC/HPTLC方法测量存在4OH异亮氨酸(1.5至3.5％)和葫芦巴碱(trigonellin)(2至5％)。
HPLC：高效液相色谱法/HPTLC：高效薄层色谱法。
这些测量是根据以下条件获得的：
-分析LC/MS(液相色谱-质谱法)
-柱：正相250x 4.6mm，5μm
-溶剂组成：乙醇/水0.1％甲酸
流速：1ml/min。
在一个特别的实施方案中，干燥胡芦巴提取物还含有一种或多种选自异荭草素(homo-orientine)、牡荆素、薯蓣皂苷元、菝葜皂甙元(sarsapogenins)、néotogogenin和异黄酮的化合物。通过HPLC方法检测此类化合物。
在一个特别且优选的实施方案中，根据本发明使用的胡芦巴提取物是具有如图8所示的HPLC-DAD(280nm)曲线的胡芦巴提取物，其中主要化合物为异荭草素、牡荆素和胡芦巴碱。
使用以下条件获得该曲线：
-波长：280nm
-柱：Agilent Poroshell 120S-C18,4.6*150mm，2.7μm
-溶剂组成：水0.15％甲酸/乙腈，按下表2。
表2
时间 ％水/甲酸 ％乙腈
0-5min 95 5
5-35min 40 60
35-50min 15 85
50-55min 5 95
-进样体积2μl
-柱温：30℃
-流速：1ml/min。
因此，在一个特别且优选的实施方案中，本发明中使用的胡芦巴提取物含有4OH异亮氨酸和胡芦巴碱，并且有利地还含有异荭草素和/或牡荆素。
在一个特别且优选的实施方案中，胡芦巴提取物由ROBERTET出售。
含有SOD和胡芦巴提取物的本发明的产品
在本发明的含义中，术语“产品”涵盖在单一产品中包含SOD(优选含有SOD的植物活性提取物)和胡芦巴提取物的“组合物”，以及可替代地试剂盒，其中SOD(优选含有SOD的植物活性提取物)和胡芦巴提取物处于单独的组合物中，用于同时、顺序或延迟施用。因此，根据本发明，SOD(优选含有SOD的植物活性提取物)和胡芦巴提取物在试剂盒的相同组合物中或在单独的组合物中。
在一个特别的实施方案中，组合物或试剂盒还含有锌。本领域技术人员将按照每日施用矿物质的通常建议的浓度加入锌。
在一个优选的实施方案中，本发明的产品为包含包覆的冻干瓜汁浓缩物、胡芦巴提取物和锌的组合物。
在本发明的含义中，术语“营养组合物”或“营养产品”特别涵盖营养制品组合物(特别是食品补充剂，例如固体或液体形式)、保健食品组合物和饮料，特别是膳食或营养性质的，例如具有抗氧化性质的饮料。优选地，营养组合物包含营养制品组合物和健康饮料，例如具有抗氧化性质的饮料。
在本说明书中，生理学上可接受的赋形剂是指包含在产品中的化合物或化合物的组合，其不引起副反应，并且例如使得活性化合物的施用便利化、其寿命和/或体内功效增加、在溶液中的溶解度增加或保质期改善。这些可接受的赋形剂是众所周知的，并且可以由本领域技术人员进行调整以适应所选择的活性化合物的施用类型和模式。
在一个特别的实施方案中，包含SOD(优选含有SOD的植物活性提取物)和胡芦巴提取物的本发明的产品旨在经由口服、鼻腔或肠胃外途径，优选口服途径施用。
当本发明的产品旨在用于营养用途时，其有利地旨在经由口服途径施用。在一个特别且优选的实施方案中，产品为具有食品级赋形剂的营养产品，特别是片剂、硬胶囊、软胶囊、泡腾片、待稀释的香囊或棍、口香糖、饮料、果汁、酸奶、糖果、饼干或棒的形式。
当本发明的产品旨在用于药物用途时，其旨在经由口服、鼻腔或肠胃外途径，优选口服途径施用。
因此，本发明的另一个目的在于一种具有药物赋形剂的药物产品。例如，本发明的药物产品为片剂、硬胶囊、软胶囊、泡腾片、待稀释的香囊或棍、糖浆、酏剂、花草茶、口香糖、喷雾剂、气雾剂或注射溶液的形式。
在一个优选的实施方案中，本发明的产品旨在经由口服途径施用。
本发明产品中每种组分的日剂量和有效量将由本领域技术人员根据待治疗的受试者进行调整，并且将基于待治疗的受试者的体重来确定。
在一个特别的实施方案中，对于70kg的人类受试者，营养用途的每日剂量将为：
-70至560IU SOD，优选140至560IU SOD(相当于5mg至40mg具有14IU SOD/mg的瓜汁浓缩物，优选10mg至40mg具有14IU SOD/mg的瓜汁浓缩物)，
-和200至1600mg胡芦巴提取物，优选400mg胡芦巴提取物。
因此，在一个特别的实施方案中，本发明的产品为用于每日施用的营养产品，特别地剂量等于或相当于每千克(kg)体重1至8IU SOD和2.8至22.8mg胡芦巴提取物。
在一个特别的实施方案中，本发明的产品包含140UI SOD和400mg胡芦巴提取物，在试剂盒的同一组合物中或者单独组合物中。
在一个特别的实施方案中，用于口服施用的产品包含如上文所公开的10mg包覆的冻干瓜汁浓缩物(14U SOD/mg粉末)和400mg胡芦巴提取物。
在一个特别的实施方案中，本发明的产品包含140UI SOD和400mg胡芦巴提取物以及锌(浓度为通常用于每日施用矿物质的浓度)，在试剂盒的同一组合物中或者单独组合物中。
用途和治疗方法
本发明还涉及如上定义的包含SOD(优选含有SOD的植物活性提取物)和胡芦巴提取物的产品用于改善有需要的受试者的认知功能，特别是改善选自感知、记忆、注意力和/或推理的一种状况的用途。在一个特别的实施方案中，本发明的产品为营养产品，旨在改善健康受试者，即未受病理疾病影响的受试者的认知功能。
在一个特别的实施方案中，本发明的产品用于治疗或预防选自认知障碍、情绪障碍、应激和焦虑症的病症。
在一个特别的实施方案中，使用本发明的产品，特别是包含富含SOD的包覆的冻干瓜汁提取物和胡芦巴提取物的产品，将改善选自感知、记忆、注意力和推理的一种状况，特别是至少记忆力。
在一个特别的实施方案中，使用本发明的产品，特别是包含富含SOD的包覆的冻干瓜汁提取物和胡芦巴提取物的产品，将预防或治疗选自学习障碍、注意力缺陷障碍(ADD)和注意力缺陷多动障碍(ADHD)的疾病。
在一个特别的实施方案中，使用本发明的产品，特别是包含富含SOD的包覆的冻干瓜汁提取物和胡芦巴提取物的产品，将预防或治疗情绪障碍。
在一个特别的实施方案中，使用本发明的产品，特别是包含富含SOD的包覆的冻干瓜汁提取物和胡芦巴提取物的产品，将预防或治疗焦虑症。
由于一些认知功能障碍是由应激引起、加剧或与应激相关的，因此本发明的产品旨在预防或治疗遭受应激的受试者。
在一个特别的实施方案中，营养产品旨在每日施用，特别地剂量等于或相当于每千克(kg)体重1至8IU SOD和2.8至22.8mg胡芦巴提取物。
在本发明的另一个应用中，本发明的产品为用于治疗或预防有需要的患者的神经变性疾病，特别是选自轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病和帕金森病的神经变性疾病的药物产品。
神经变性疾病的其他示例包括但不限于肌萎缩侧索硬化症(也称为ALS和卢伽雷氏病)，以及AIDS痴呆综合征、肾上腺脑白质营养不良、亚历山大病、阿尔珀病、共济失调毛细血管扩张症、巴顿病、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳万病、皮质基底节变性、克雅氏病、路易体痴呆、致命性家族性失眠、额颞叶变性、肯尼迪病、克拉伯病、莱姆病、马查多-约瑟夫病、多发性硬化症、多系统萎缩症、神经棘红细胞增多症、尼曼-皮克病、皮克病、原发性侧索硬化症、进行性核上性麻痹、雷夫叙姆病、桑德霍夫病、弥漫性髓鞘质硬化症、脊髓小脑性共济失调、脊髓亚急性联合变性、脊髓痨、泰-萨克斯病、中毒性脑病和传染性海绵状脑病。在一个实施方案中，神经变性疾病选自阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病和帕金森病。在一个实施方案中，神经变性疾病为阿尔茨海默病。在另一个优选的实施方案中，神经变性疾病为轻度认知障碍(MCI)。
本领域技术人员将根据待治疗的疾病和患者状况调整产品的每种组分的剂量。
本发明还涉及一种治疗有需要的受试者的方法，其包括施用如上定义的包含SOD(优选含有SOD的植物活性提取物)和胡芦巴提取物的产品。
特别地，本发明的方法用于治疗或预防神经变性疾病，特别是选自轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病和帕金森病的神经变性疾病。
现在将在非限制性实施例中阐明本发明。
实施例
实施例1：材料
1-1瓜提取物
以下实施例中使用的瓜提取物(也称为瓜汁浓缩物)由BIONOV公司以商标销售。该提取物在包覆氢化棕榈油后，具有14单位每mg提取物的SOD活性。的组合物包含以重量计20％的活性植物提取物和以重量计80％的脂溶性试剂。
1-2胡芦巴提取物
以下实施例中使用的胡芦巴提取物是通过以下步骤获得的：
a)将胡芦巴种子经超临界CO2提取，进一步脱脂，
b)将脱脂胡芦巴种子进一步用80％乙醇提取，然后过滤，浓缩至20％干物质，巴氏灭菌，最后用10％麦芽糊精雾化，得到胡芦巴的干燥提取物。
以下实施例中使用的胡芦巴的干燥提取物为粉末，其具有超过95％的干物质，粒度小于250μm，其特征在于通过HPLC/HPTLC方法测量存在4OH异亮氨酸(1.5至3.5％)和葫芦巴碱(1.5至4.5％)。
这些测量是根据以下条件获得的：
-分析LC/MS(液相色谱-质谱法)
-柱：正相250x 4.6mm，5μm
-溶剂组成：乙醇/水0.1％甲酸
流速：1ml/min。
以下实施例中使用的胡芦巴提取物是具有如图8所示的HPLC-DAD(280nm)曲线的胡芦巴提取物，其中主要化合物为异荭草素、牡荆素和胡芦巴碱。
使用以下条件获得该曲线：
-波长：280nm
-柱：Agilent Poroshell 120S-C18,4.6*150mm，2.7μm
-溶剂组成：水0.15％甲酸/乙腈，按下表3。
表3
时间 ％水/甲酸 ％乙腈
0-5min 95 5
5-35min 40 60
35-50min 15 85
50-55min 5 95
-进样体积2μl
-柱温：30℃
-流速：1ml/min。
以下实施例中使用的胡芦巴提取物由ROBERTET出售。
1-3本发明的组合：瓜汁浓缩物和胡芦巴提取物
本发明的组合在以下用于小鼠测试的实施例中也称为“共混物”或“Cpd X”，其包含95mg/kg小鼠，分别为24.6mg/kg小鼠的实施例1-1中公开的瓜提取物(相当于24.6IUSOD)+70.3mg/kg小鼠的实施例1-2中公开的胡芦巴提取物。
事实上，小鼠的每日剂量是根据人类的每日剂量来定义的，即：
-140IU瓜提取物(10mg产品，14IU/mg)
-和400mg胡芦巴提取物。
食品药品监督管理局(Food and Drug Evaluation Administration，FDA)制定了一份指导文件，提供用于推导人体等效剂量(human equivalent dose，HED)的通用换算系数，即，预期在给定剂量下对人体产生与在动物中观察到的效果相同程度的效果的人体剂量(美国DHHS FDA指南，2005年)。
术语HDE通常用于指NOAEL(No Observed Adverse Effect Levels，未观察到不良反应水平)的人体等效剂量。这种转换基于剂量与体表面积的标准化。由于体表面积随体重变化，因此换算系数取决于动物的体重。然而，进行的分析表明，标准系数可以对大范围的人类和动物体重的HED进行合理的估计。
因此，考虑到成人的平均体重(70kg)和小鼠的换算系数(上述FDA指南中规定的12.3)，小鼠的每日剂量相当于：
-24.6IU/kg小鼠的瓜提取物(140IU/70kg x 12.3)
-70.3mg/kg小鼠的胡芦巴提取物(400mg/70kg x 12.3)
在以下实施例2中使用本发明的所述组合。
实施例2：本发明的组合在阿尔茨海默病Aβ25-35小鼠模型中的保护性质分析
阿尔茨海默病(AD)的特征在于细胞内神经原纤维缠结、细胞外实质老年斑和主要由淀粉样-β(Aβ)肽组成的脑血管沉积物的进行性积累。
Aβ肽是通过连续蛋白水解来源于淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解产物，所述APP是由β-分泌酶裂解而产生的。APP裂解位点的突变增加Aβ寡聚物的产生。Aβ以老年斑形式的进行性积累是阿尔茨海默病(AD)的病理标志之一，已被认为是AD病理学的主要原因之一(Kawahara和Kuroda，2000)，通过引发神经毒性、氧化损伤、突触损失和炎症(Cummings等人，1998)。AD大脑老年斑中发现的最丰富的Aβ肽形式是40和42氨基酸形式(Sisodia等人，1990)。
然而，AD大脑特定区域的老年斑数量与神经元死亡或突触丧失的局部程度或认知障碍的相关性较差。最近的研究表明，可溶性Aβ形式水平与突触丧失的程度和认知障碍的严重程度之间存在很强的相关性(Sakono等人，2010年的综述)。令人感兴趣的是，较短的淀粉样蛋白-β25-35(Aβ25-35)代表Aβ的生物活性区域，因为它是能够聚集在纤维状β-片层结构中的最短片段(Sato等人，1995)。此外，Aβ25-35的单体形式显示出神经毒性作用(Clementi等人，2005)。
2-1第一研究
第一研究的目的在于确定本发明的组合是否可以减轻脑室内(ICV)注射淀粉样蛋白β25-35肽(Aβ25-35)在小鼠中诱导的病理学。
在肽注射后7天开始在以下方面评价组合功效：
-新物体识别(novel object recognition，NOR)测试
-脂质过氧化(LPO)
-Aβ1-42和pTau(T181)
通过强饲法每天一次(o.d.)口服(PO)施用组合和载体，持续30天。在Aβ25-35肽注射前两周(D14)开始施用测试组合和载体，并持续到第17天(D17)。
2-1-1动物和处理组
·使用三十四(34)只雄性Swiss小鼠(30至35g)。
·按以下方式组成三(3)个动物组。
表4.本研究中的处理组
组处理 时间段
n1
1.Sc.Aβ+载体溶液,PO,o.d.从D-14至D16 10
2.Aβ25-35+载体溶液,PO,o.d.从D-14至D16 12
3.Aβ25-35+测试组合(95mg/kg),PO,o.d.从D- 12
总计 34
Sc.Aβ＝乱序Aβ25-35(对照肽)
·从Aβ25-35肽注射前两周(D-14)至D16，通过强饲法每天一次口服施用载体和测试组合
·从Aβ25-35肽注射前14天(D-14)至肽注射前一天(D-01)，将载体施用至组#1和#2
·从Aβ25-35肽注射前14天(D-14)至肽注射前一天(D-01)，将测试组合施用至组#3
·在D01，在载体或测试组合施用后1小时，脑室内(ICV)注射Sc.Aβ或寡聚Aβ25-35肽
·从Aβ25-35肽注射当天(D01)至(D17)，将载体施用至组#1和#2
·从Aβ25-35肽注射当天(D01)至(D17)，将测试组合施用至组#3
·从D08至D16，在D09、D10和D11进行新物体识别(NOR)。
·在D17，处死所有动物。
从所有用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的小鼠中收集心脏穿刺的血液(500至600μl)以制备血浆。用注射器(S-Monovette 1.2ml Hep-Lithium，Sarstedt)抽取血液(800μl)，并放入Eppendorf管中用于血浆制备。收集两份血浆(200μl)。
仔细收集大脑，并解剖出海马体(右和左)、皮质区域(右和左)。将在进一步公开的第二研究中使用皮质区域。
使用右海马体(n＝6个/组)用比色法测定脂质过氧化(LPO)水平。
使用左海马体(所有样品/组)通过ELISA测定Aβ1-42和pTau(T181)水平。
2-1-2药物施用
将测试组合溶解在其载体(无菌水)中，所述载体在每次施用前新鲜制备。在施用前将测试组合保存在4℃。
载体(无菌水)和测试组合的施用如下：
·途径：口服
·方法：通过强饲法，使用不锈钢插管和一次性塑料1ml注射器，以实现准确剂量。将测试组合和载体以根据每只小鼠的个体体重计算的体积以5ml/kg施用。
·频率：
о对于载体一天一次(组#1和#2)
о对于测试组合一天一次(组#3)
·处理长度
о对于所有小鼠从D-14至D17(31天)
Aβ25-35：
·名称：淀粉样-β蛋白(25-35)(Aβ25-35)人、小鼠、大鼠
·CAS:131602-53-4
·供应商：Genepep(法国)
·编号：GPS13387
·分子量：1060.28
·储存温度：-20℃
·外观：白色粉末
·载体：无菌双蒸水
Sc.Aβ：
·名称：乱序淀粉样-β蛋白(25-35)(Sc.Aβ)人、小鼠、大鼠
·CAS:NA
·供应商：Genepep(法国)
·编号：GPS19507
·分子量：1131.34
·储存温度：-20℃
·外观：白色粉末
·载体：无菌双蒸水。
2-1-3淀粉样肽注射
用2.5％异氟烷麻醉雄性Swiss小鼠5分钟。在将其约束并将其头部固定住后，使用10pL汉密尔顿注射器通过26号不锈钢针(长3.5mm)向其大脑的外侧右脑室注射。在30秒内逐渐递送3pL的注射量，并在取出前将针头保留在原位30秒(Haley和McCormick，1957)。根据之前描述的方法(Maurice等人,1996；Villard等人,2009)，以3pL/小鼠的最终体积，用Aβ25-35肽(9nmol/小鼠)或Sc.Aβ肽(9nmol/小鼠)处理动物。
2-1-4动物
体重为30至35g的雄性Swiss小鼠被分组饲养，除了在行为实验期间以外，可随意获取食物和水。它们被饲养在温度和湿度受控的动物设施中，光照/黑暗周期为12小时/12小时(晚上07:00熄灯)。通过用永久性记号笔在小鼠的尾巴上做记号来对小鼠进行编号。所有动物程序均严格遵守2010年9月22日的欧盟指令(2010/63/UE)。
2-1-5新物体识别测试(NOR测试)
从D09到D11，对所有小鼠进行新物体测试以测量识别记忆。任务过程由三个时间段组成。
时间段1(D09)：将小鼠单独放置在由白色有机玻璃制成的方形旷场(50cm x 50cmx 50cm高)和配备红外发光二极管的地板中。在10分钟的持续时间段中，小鼠适应旷场，并通过IR-敏感相机捕获它们的运动活动，并使用软件(Noldus)进行分析。根据软件定义的总行进距离(m)、运动速度(cm/s)和25x25cm中心区域的出现百分比来分析活动。
时间段2(D10)：在时间段1后24小时，将两个相同的物体(带盖的50ml塑料瓶)放置在指定位置(中心区域的两个相对边缘)。将每只小鼠置于旷场，并记录探索活动10分钟。使用鼻子跟踪方案根据与物体的接触次数和接触持续时间来分析活动。
时间段3(D11)：在时间段2后24小时，位置#2上的物体被一个新的物体(软塑料椅脚保护装置)取代，其颜色、形状和纹理与熟悉的物体不同。每只小鼠再次被放置在旷场中，并在10分钟的时间段内记录探索活动。根据两个参数对活动进行类似的分析：优先探索指数和辨识指数。优先指数计算为与位置#2上的物体接触的次数(或持续时间)与和两个物体接触的总数(或持续时间)的比例。因此，优先指数高于50％表示对新物体的偏好，低于50％表示对熟悉物品的偏好，50％表示没有偏好(Wang等人,2007)。辨识指数DI表示为DI＝(#2-#1)/(#1+#2)，其为探索新物体(#2)和熟悉物体(#1)的接触次数(或持续时间)与和这两个物体的接触总次数(持续时间)之间的时间差。结果可以为+1(花在新物体上的时间更多)至-1(花在熟悉物体上的时间更多)，0表示无偏好(Silver等人，2007)。
将在时间段2或时间段3期间与物体接触次数少于10次的动物从研究中剔除。通常，这代表10至15％的动物(高损耗测试)。视频跟踪系统可以同时跟踪4只动物。动物根据其编号进行测试。在两个时间段之间，先后用水和50％乙醇溶液清洗旷场和物体。
结果：
在第一天(D09)和第二天(D10)期间，在相同物体时间段过程中，在频率或互动时间方面没有观察到处理的差异效果。
在第三天(D11)期间，两个物体中的一个被替换为新的物体。小鼠可以自由地探索它们。对新物体的兴趣代表了完整的识别记忆。
如图1所示，与Sc.Aβ小鼠(对照)相比，Aβ25-35注射非常显著地损害了识别记忆。本发明的组合(CpdX)在接触频率(左上)或互动时间(左下)方面非常显著且完全减轻了由Aβ25-35注射引起的识别记忆缺陷。事实上，高于50％的值表明对新物体进行了更多的研究。
辨识指数(DI)的测量也显示了相同的结果：辨识指数为零表示在两个物体上花费的时间相同，而正值表示与熟悉的物体相比，研究新物体的时间更多。
2-1-6安乐死和组织取样
在D17，处死所有动物。
о将所有小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，收集心脏穿刺获得的血液(800μl)以制备血浆。用注射器(S-Monovette 1.2ml Hep-Lithium，Sarstedt；Adaptateur multiple LuerSartstedt)抽取血液并放入两个Eppendorf管中。将管颠倒几次并保持在室温(RT)，直到通过离心(2000g，4摄氏度，10分钟)分离血浆。制备两份200μl的血浆。
о之后，取出心脏(左心室)，收集到管中，并立即冷冻在液氮中。
о断头后快速收集大脑，对海马体(右侧和左侧放入两个Eppendorf管中)、皮质区域(右侧和左侧放入两个Eppendorf管中)和大脑其余部分(在一个Eppendorf管中)进行称重并冷冻在液氮中。
·使用右海马体(n＝6个/组)用比色法测定脂质过氧化(LPO)水平。
·使用左海马体(所有样品/组)通过ELISA测定Ab1-42和pTau(T181)水平。
2-1-7生化分析
2-1-7-1通过改进的FOX测试进行的脂质过氧化测量
使用每组中的六(6)个海马体进行LPO测量，如Hermes-Lima等人，1995年所描述。解冻后，将样品在冷甲醇(1/10w/v)中均质化，以1,000g离心5分钟，并将上清液置于Eppendorf管中。将每个均质物的反应体积加入到FeSO4 1mM、H2SO4 0.25M、二甲酚橙1mM中，并在室温孵育30分钟。在读取580nm处的吸光度(A5801)后，将10iil的1mM氢过氧化枯烯(CHP)加入到样品中，并在室温孵育30分钟，以确定最大氧化水平。在580nm处测量吸光度(A5802)。
根据以下公式将脂质过氧化水平确定为CHP当量：CHPE＝A5801/A5802 x[CHP(nmol)]，并表示为CHP当量每组织湿重，和对照组数据的百分比(V-处理的Sc.Aβ-施用小鼠)。
结果：
如图2所示，与Sc.Aβ/V-处理的小鼠相比，Aβ25-35注射非常显著地增加了海马体中的LPO水平。
测试组合(CpdX)非常显著但部分减少了Aβ25-35注射引起的氧化应激的增加。
2-1-7-2生物标志物测量
从n＝6个样品/组中，通过ELISA方法分析多个标志物：
·对于Aβ1-42(左海马体)，ELISA试剂盒来自Cloud-Clone Corp.，
·对于pTau(T181),(左海马体),ELISA试剂盒来自Fisher Scientific。
解冻后，将海马组织(随机选择/盲选)在50mM Tris-150mM NaCl缓冲液(pH7.5)中均质化，并超声处理20秒。在离心(16,100g，15分钟，4℃)后，根据各自制造商的说明，将上清液用于ELISA测定。
对于所有测定，在450nm处读取吸光度，并使用标准曲线计算每个样品的浓度。所有结果均以对照Sc.Aβ处理组的％表示。所有样品均进行两次测定，并将这些重复的平均值用于计算。
结果
如图3所示，与Sc.Aβ/V-处理的小鼠相比，Aβ25-35注射非常显著地增加了海马体中的Aβ1-42水平。测试组合(CpdX)非常显著且完全抑制Aβ25-35注射引起的增加。
如图4所示，与Sc.Aβ/V-处理的小鼠相比，Aβ25-35注射非常显著地增加了海马体中的pTau水平。
测试组合(CpdX)非常显著但部分抑制Aβ25-35注射引起的增加。
统计分析
所有值均表示为平均值±S.E.M.。对于新物体识别测试的分析，通过单向方差分析(F值)和其后的Wilcoxon多重比较检验进行分析。对于D.I.，通过单向方差分析(F值)和其后的Dunnett事后多重比较检验进行分析。
该研究的结论
所有这些结果证明，与Sc.Aβ/V-处理的小鼠相比，Aβ25-35注射非常显著产生识别记忆方面的行为障碍，并且还非常显著增加海马体中氧化应激(海马体中的脂质过氧化)和阿尔茨海默病标志物Aβ1-42和pTau的水平。
测试组合(Cpd X)对新物体识别范例中的识别记忆表现出有益的预防作用，并且还部分但显著减轻了苏氨酸181上Tau的氧化应激和过度磷酸化的增加，而其完全抑制了海马体中Aβ1-42内源性水平的增加。
2-2第二研究
该研究的目的在于确定本发明的测试组合是否可以减轻脑室内(ICV)注射淀粉样蛋白-β25-35肽(Aβ25-35)在小鼠中诱导的病理学。
通过Aβ25-35诱导的皮质中突触后密度95(PSD-95)、突触素(SYN)和半胱天冬酶9表达的调节，在体外评价测试组合的治疗功效。PSD-95(突触后密度蛋白95，也称为SAP-90(突触相关蛋白90))和突触素(SYN)是突触改变的标志物；半胱天冬酶9是线粒体应激的标志物。
为此目的，通过ELISA分析第一研究中注射Aβ25-35的小鼠的皮质样品。
2-2-1动物和处理组
对上述第一研究中收集的样品进行三(3)次ELISA测定，以完成生化变化测定：
>一侧皮质(右半球)的PSD-95水平
>一侧皮质(右半球)的突触素水平
>一侧皮质(右半球)的半胱天冬酶-9水平。
从10至12只小鼠/组的皮质中制备样品(重复)：
表5.本研究中的处理组
组处理 时间段
n1
1.皮质样品，来自Sc.Aβ+载体溶液,PO,o.d.从D- 10
2.皮质样品，来自Aβ25-35+载体溶液,PO,o.d.从D- 12
3.皮质样品，来自Aβ25-35+测试组合,PO,o.d.从D- 12
总计小鼠 34
·将Sc.Aβ和Aβ25-35样品在商业ELISA检测试剂盒专用的提取缓冲液中均质化，如制造商和参考文献所述。
·ELISA试剂盒为：
对于PSD-95，ELISA试剂盒来自Cloud-Clone Corp.，
对于突触素，ELISA试剂盒来自Cloud-Clone Corp.，
对于半胱天冬酶9，ELISA试剂盒来自Fine Test。
2-2-2通过ELISA进行的生化分析
使用n＝10/12个皮质样品每组，并根据供应商的建议通过ELISA方法分析多种标志物。
在解冻后，将皮质组织(随机选择/盲选)在50mM Tris-150mM NaCl缓冲液(pH7.5)中均质化，并超声处理20秒。在离心(16,100g，15分钟，4℃)后，根据各自制造商的说明，将上清液用于三项ELISA测定。
对于所有测定，在450nm处读取吸光度，并使用标准曲线计算各个样品的浓度。所有结果均以对照Sc.Aβ处理组的％表示。所有样品均进行两次测定，并将这些重复的平均值用于计算。
统计分析
所有值均表示为平均值±S.E.M.。使用单向方差分析(F值)和其后的Dunnett事后多重比较检验对每种化合物分别进行统计分析。
结果：
如图5所示，与Sc.Aβ/V-处理的小鼠(对照)相比，Aβ25-35注射非常显著地降低了皮质中的PSD-95水平。测试组合Cpd X非常显著但部分抑制了这种降低。
如图6所示，与Sc.Aβ/V-处理的小鼠(对照)相比，Aβ25-35注射非常显著地降低了皮质中的突触素水平。测试组合Cpd X非常显著且完全抑制了这种降低。
如图7所示，
与Sc.Aβ/V-处理的小鼠(对照)相比，Aβ25-35注射非常显著地降低了皮质中的半胱天冬酶9水平。测试组合Cpd X非常显著且完全抑制了这种降低。
因此这些结果证明，与Sc.Aβ/V-处理的小鼠(对照)相比，Aβ25-35注射非常显著地降低了两种突触标志物PSD-95和突触素的水平，并非常显地增加了皮质中半胱天冬酶-9的水平。本发明的组合(Cpd X)部分但显著抑制了PSD-95的降低，并完全抑制了皮质中突触素水平的降低。
Cpd X非常显著且完全抑制了皮质中半胱天冬酶-9水平的增加。
这些研究产生的所有数据表明，本发明的组合可能是预防或治疗认知或神经疾病例如阿尔茨海默病(AD)的相关候选物。
实施例3：在25-35β-淀粉样蛋白损伤后，本发明的组合相比于单独的每种组分对 大鼠原代皮质存活的作用。
作为对上文公开的前述研究的补充，本研究的目的在于确定本发明的组合相比于单独的每种组分，对人淀粉样蛋白β25-35肽中毒的大鼠原代皮质神经元(体外阿尔茨海默病模型)的协同作用。
在神经元上研究皮质神经元总数、神经突总长度、半胱天冬酶3表达和蛋白质羰基化。
3-1皮质神经元细胞培养
按照Singer(1999)的描述培养大鼠皮质神经元。通过颈椎脱位处死妊娠15天的短暂怀孕雌性大鼠，并将胎鼠从子宫中取出。去除皮质，并置于Leibovitz(L15；PanBiotech)的冰冷介质中。通过胰蛋白酶作用(Trypsin EDTA 1X；Pan Biotech)解离皮质。通过加入含有II级DNAase I(0.1mg/ml；PanBiotech)和10％胎牛血清(FCS；Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle介质(DMEM；PanBiotech)来终止反应。然后，通过10ml移液管传代3次，机械解离细胞。然后，将细胞在4℃以515x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于由Neurobasal(Invitrogen)组成的特定培养介质中，所述培养介质补充有B27(Invitrogen)、L-谷氨酰胺(2mM；PanBiotech)、2％PS(PanBiotech)和10ng/ml BDNF(PeproTech)。使用台盼蓝排除试验在Neubauer细胞仪中对活细胞进行计数。将细胞以30000个细胞/孔的密度接种在预先涂布有聚D-赖氨酸(Greiner)的96孔板中，并在37℃湿润空气(95％)/CO2(5％)气氛中培养。
3-2β-淀粉样蛋白制备、暴露和药物处理：保护方案
将淀粉样蛋白-β25-35(Sigma)在特定培养介质中复原。在培养10天后，用测试化合物或参比化合物(50ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF)预处理细胞24小时，然后用Aβ25-35使细胞中毒。
在培养11天后，将Aβ25-35制剂用于原代皮质神经元，最终浓度为40μM(在对照介质中稀释)，孵育48小时，以诱导约40％的神经元细胞死亡。
活性物质1：如实施例1.2中公开的胡芦巴
活性物质2：如实施例1.1中公开的瓜提取物
共混物(组合)：活性物质1+活性物质2。
满足以下条件：
板1：
·对照
·10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL活性物质1+Aβ25-35(40μM,48小时)
·50ng/ml BDNF+Aβ25-35(40μM,48小时)
·对照+Aβ25-35(40μM,48小时)
板2：
·对照
·35μg/mL、3.5μg/mL、1.05μg/mL、0.35μg/mL、0.105μg/mL活性物质2+Aβ25-35(40μM,48小时)
·50ng/ml BDNF+Aβ25-35(40μM,48小时)
·对照+Aβ25-35(40μM,48小时)。
应当注意，活性物质2在浓度为10mg/ml时不溶于DMSO。因此，制备35μg/ml、3.5μg/ml、1.05μg/ml、0.35μg/ml和0.105μg/ml的活性成分混悬液，并在与细胞一起孵育之前剧烈摇动溶液。
板3：
·对照
·10μg/mL活性物质1+3.5μg/mL活性物质2+Aβ25-35(40μM,48小时)
·3μg/mL活性物质1+1.05μg/mL活性物质2+Aβ25-35(40μM,48小时)
·1μg/mL活性物质1+0.35μg/mL活性物质2+Aβ25-35(40μM,48小时)
·0.3μg/mL活性物质1+0.105μg/mL活性物质2+Aβ25-35 5(40μM,48小时)
·0.1μg/mL活性物质1+0.035μg/mL活性物质2+Aβ25-35(40μM,48小时)
·50ng/ml的BDNF+Aβ25-35(40μM,48小时)
·对照+Aβ25-35(40μM,48小时)
每种条件用6个孔进行一次培养。
3-3终点评价：皮质神经元总数和神经突长度的测量；在Aβ25-35中毒后和不中毒时半胱天冬酶3和蛋白质羰基染色的皮质神经元的评价
在孵育48小时后，用5％乙酸(Sigma)和95％乙醇(VWR)溶液在室温下固定细胞20分钟。然后，用含有皂苷(Sigma)和FCS的磷酸盐缓冲盐水(PBS；PanBiotech)溶液在室温下透化细胞15分钟。将细胞与小鼠单克隆抗MAP-2抗体(1/5000,Sigma；编号:M4403)和兔单克隆抗半胱天冬酶3抗体(1/500,Abcam；编号:ab13847)在含有皂苷和FCS的PBS中在4℃孵育过夜。将这些抗体与Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(1/400,Molecular probe,编号:A11001)和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG(1/400,Molecular probe,编号:A11011)在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中在室温下反应1小时。在同一溶液中用荧光标记物(Hoechst溶液，Sigma；编号：B1155)标记细胞核。然后，用Alexa 647羰基探针(1/1000，OXIProteomics)在PBS中在室温标记细胞1小时。
对于每个培养孔，使用InCell AnalyzerTM 2200(GE Healthcare)以20倍放大倍数拍摄20张照片每孔。所有图像都是在相同条件下拍摄的。使用Developer系统分析(GEHealthcare)自动评价皮质神经元的数量、神经突的长度、半胱天冬酶3表达水平和神经元细胞体上的蛋白质羰基化水平。
统计
数据表示为平均值±s.e.平均值(每个条件6个数据，1个培养物)。使用单向方差分析(ANOVA)和其后的Dunnett检验对数据进行全局分析。显著性水平设置为p<0.05。
结果
神经元存活
/>
本发明的组合提高了神经元存活。并且，条件6(胡芦巴0.35μg/ml)与条件1(胡芦巴3μg/ml)和条件2(/>1.05μg/ml)的结果的比较证明了组合中各组分之间的协同效应，因为每种组分用量减少三倍时结果相似。
神经突长度
/>
本发明的组合增加了神经突长度。并且，条件12(胡芦巴1μg/ml+0.35μg/ml)与条件7(胡芦巴3μg/ml)和8(/>1.05μg/ml)的结果的比较证明了组合中各组分之间的协同效应，因为每种组分用量减少三倍时结果相似。
半胱天冬酶3表达
/>
本发明的组合抑制了半胱天冬酶3表达。并且，条件21(胡芦巴1μg/ml+0.35μg/ml)与条件16(胡芦巴3μg/ml)和17(/>1.05μg/ml)的结果的比较证明了组合中各组分之间的协同效应，因为每种组分用量减少三倍时结果相似。
蛋白质羰基
本发明的组合抑制了蛋白质的羰基化。并且，条件30(胡芦巴1μg/ml+0.35μg/ml)与条件25(胡芦巴3μg/ml)和26(/>1.05μg/ml)的结果的比较证明了组合中各组分之间的协同效应，因为每种组分用量减少三倍时结果相似。
所有这些结果表明，本发明的组合对神经变性疾病例如阿尔茨海默病具有协同保护作用。
实施例4：制剂
以下制剂基于用于70 kg的成人的富含SOD(14U/mg粉末)的包覆的冻干瓜汁浓缩物和胡芦巴提取物的有效量，但可以根据待治疗受试者的体重进行调整。
4-1 2合1胶囊
*如在1.1和1.2中所制备
根据胶囊配制的常规方法制备包含本发明组合的“2合1”胶囊。
对于140IU SOD的每日剂量，每天口服2粒胶囊能够提供针对认知和神经系统疾病的研究效果。
4-2包含1粒瓜汁浓缩物胶囊(100 mg)和1粒胡芦巴胶囊(500 mg)的试剂盒
作为“2合1”胶囊的替代方案，将本发明的组合配制成包含1粒瓜胶囊和1粒胡芦巴胶囊的试剂盒。
富含SOD的瓜汁浓缩物胶囊
*如在1.1中所制备
胡芦巴胶囊
*如在1.2中所制备
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Claims (13)

1.一种产品，其包含含有SOD的植物活性提取物以及胡芦巴提取物。
2.根据权利要求1所述的产品，其中含有SOD的植物活性提取物为含有SOD的瓜汁浓缩物。
3.根据权利要求2所述的产品，其中含有SOD的瓜汁浓缩物为包覆的冻干瓜汁浓缩物，其包含5至25SOD U/mg粉末，特别地10至20SOD U/mg粉末，特别地14U SOD/mg粉末的SOD水平，有利地还包含类胡萝卜素、维生素和无机元素，例如镁、铜和锌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的产品，其中胡芦巴提取物通过以下方法获得：
a)将胡芦巴种子经超临界CO2提取，进一步脱脂，和
b)通过醇提取进一步提取脱脂胡芦巴种子。
5.根据权利要求4所述的产品，其中胡芦巴提取物含有4OH异亮氨酸和胡芦巴碱，并且有利地还含有异荭草素和/或牡荆素。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的产品，其中含有SOD的植物活性提取物以及胡芦巴提取物在试剂盒的相同组合物中或在单独的组合物中。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的产品，其中其旨在经由口服、鼻腔或肠胃外途径，优选口服途径施用。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的产品，其为具有食品级赋形剂的营养产品，特别是片剂、硬胶囊、软胶囊、泡腾片、待稀释的香囊或棍、口香糖、饮料、果汁、酸奶、糖果、饼干或棒的形式。
9.根据权利要求8所述的营养产品用于改善有需要的受试者的认知功能，特别是改善选自感知、记忆、注意力和/或推理的一种状况的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，用于治疗或预防选自认知障碍、情绪障碍、应激和焦虑症的病症。
11.根据权利要求9或10所述的用途，其中营养产品旨在每日施用，特别地剂量等于或相当于每千克(kg)体重1至8IU SOD和2.8至22.8mg胡芦巴提取物。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的产品，其为具有药物赋形剂的药物产品。
13.根据权利要求12所述的药物产品，其用于在有需要的患者中治疗或预防神经变性疾病，特别是选自轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病和帕金森病的神经变性疾病。
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