CN117783538A - 一种基于im-cl亲和系统的spr可逆生物传感器芯片及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测领域,具体的,本发明涉及一种基于IM‑CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片及其制备方法与应用。本发明以传感芯片CM5为基板,在所述基板表面偶联免疫蛋白,捕获带有标签的融合蛋白,可以用于检测CL标签的融合蛋白的候选药物之间的亲和力,实现药物筛选,同时该芯片检测的蛋白‑药物亲和动力学也可被用于药物药理学研究。本发明芯片可以通过再生试剂处理后实现芯片的可逆循环使用性能,在循环使用200次后,其芯片还能具有80%的活性,大幅度降低了SPR应用中芯片成本。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体的,本发明涉及一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片及其制备方法与应用。
背景技术
金属纳米结构的表面等离子体共振耦合研究是等离子体电子学领域的一个重要领域,表面等离子体共振(SPR)是一种十分灵敏、最常用的监测两个未标记分子间相互作用的技术,它是建立在电介质衬底上半透明贵金属层中光与自由电子相互作用的基础上。表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance,SPR)的生物传感器,能够实时监测生物分子间的相互作用,且无需标记,已被广泛应用于蛋白质组学、药物研发等领域,并且显示出广阔的应用前景。其中传感芯片是Biacore系列仪器的核心部件,价格昂贵。因此,作为SPR生物传感器一直在突破传感器表面修饰技术、抑制非特异性吸附技术、传感器芯片表面再生技术等方面的难题。CN201310134867.1其利用组氨酸标签与阳离子的亲和作用将待固定于芯片固相载体上的蛋白固定在芯片载体上,该结合方式对于蛋白质的功能基本不产生影响,同时组氨酸标签的携带简化了蛋白质的分离纯化及在SPR芯片上的固定方法。CN201610300717.7公开了靶向人FKBP51蛋白的先导化合物及其筛选方法与应用,通过表达FKBP51的FK1结构域,利用SPR技术定量测定FK1与小分子化合物之间相互作用的强弱,用氨基偶联法将FK1偶联到CM5芯片上进行测定,以NaOH或HCl或EDTA为芯片再生条件,选取最优的再生条件进行循环测定,以研究FKBP51的FK1与小分子的结合。
发明内容
提高SPR生物传感器芯片的灵敏度、选择性等性能已成为该领域必须解决的关键问题,同时寻找传感芯片再生的方法,可以进一步的降低芯片的成本。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明的一个方面,提供了一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片,所述芯片以传感器芯片CM5为基板,所述基板表面偶联有大肠杆菌免疫蛋白,所述大肠杆菌免疫蛋白为IM2、IM7、IM8和IM9中的一种或多种,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个方面,提供了一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)芯片表面活化,将传感芯片CM5作为基板放入SPR仪器中,注入活化液使其对基板进行活化;
(2)免疫球蛋白偶联,向SPR仪器中注入免疫球蛋白溶液,使其与活化后的基板偶联;
(3)残余活性位点封闭,向SPR仪器中注入封闭液溶液,封闭残余的活性位点;
作为本发明的进一步优化方案,所述活化液能够在芯片的基片表面形成氨基或羧基功能化的单分子层,以便与免疫球蛋白偶联。所述封闭液选自乙醇胺、BSA、酪蛋白、脱脂牛粉、双层磷脂膜中的一种或多种;进一步优选地,所述活化液为EDC和NHS的混合液,所述封闭液为乙醇胺。
本发明的第三个方面,提供了一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片筛选蛋白活性小分子的方法,筛选步骤包括:
(1)检测筛选系统组装:将所述生物传感器芯片装入SPR仪器中;
(2)融合蛋白的固定:将带有CLs标签的融合蛋白用工作液(Running buffer)稀释,然后注入到SPR仪器中,将融合蛋白固定在所述生物传感器芯片表面;所述CLs标签选自CL2、CL7、CL8和CL9中的一种或多种,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
(3)小分子上机:在SPR仪器中加入不同浓度或不同类型的与融合蛋白有亲和力的小分子化合物,运行结合、解离程序,程序运行后,用软件进行数据分析小分子与融合蛋白的亲和力。
作为本发明的进一步优化方案,所述融合蛋白为HSP90a,其氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。
作为本发明的进一步优化方案,所述SPR仪器为Biacore S200/8k+,小分子上机过程中的结合时间为300s,解离时间为1800s。
本发明的第四个方面,提供了一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的再生方法,所述方法包括:在SPR仪器中注入解离液,使解离液与固定有融合蛋白的生物传感器芯片反应,促使芯片再生。
作为本发明的进一步优化方案,所述解离液选自8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍、0.1mol/L盐酸、0.1mol/L NaOH、1%SDS中的一种或者多种,进一步优选地,所述解离液为6mol/L盐酸胍。
有益效果
(1)本发明的基于IM-CL高亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片制备方法简单,结合能力强,可以有效的用于检测带CLs标签的融合蛋白和候选药物之间的亲和力,实现药物筛选。
(2)本发明的芯片再生能力强,经检测,在使用再生试剂循环处理200次后,其芯片还能具有80%的活性,大幅度降低了SPR应用中芯片成本。
附图说明
图1免疫蛋白镍柱亲和纯化图;图中:1,全细胞;2,裂解后沉淀;3,裂解后上清;4,穿透;5,Buffer A洗脱后收集的样品;6,20mM咪唑洗脱后的样品;7,300mM咪唑洗脱的目的蛋白;
图2标签蛋白strep柱亲和纯化图;图中:1,全细胞;2,裂解后沉淀;3,裂解后上清;4,穿透;5,Buffer A洗脱后收集的样品;6,75mM生物素洗脱后的目的蛋白;
图3免疫蛋白与标签蛋白相互作用亲和力检测图;
图4应用蛋白HSP90a-CL镍柱亲和纯化图;图中:1,全细胞;2,裂解后沉淀;3,裂解后上清;4,穿透;5,Buffer A洗脱后收集的样品;6,20mM咪唑洗脱后的样品;7,300mM咪唑洗脱的目的蛋白;
图5应用蛋白与AT13887相互作用亲和力检测图;
图6可逆芯片再生检测效果图;
图7免疫蛋白IM8变复性效果图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述,有必要在此指出的是,以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明,不能理解为对本申请保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
本发明的一个实施例,本发明提供了一种基于IM-CL高亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片。本发明传感器芯片以市售的传感芯片为基板,在所述基板表面偶联大肠杆菌免疫蛋白IM2、IM7、IM8或IM9,其中IM2、IM7、IM8和IM9的蛋白序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;优选的,所述市售的传感芯片为CM5。
本发明的一个实施例,本发明提供了一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的制备方法,所述方法包括:
(1)芯片表面活化,将传感芯片CM5作为基板放入SPR仪器中,注入活化液使其对基板进行活化;
(2)免疫球蛋白偶联,向SPR仪器中注入免疫球蛋白溶液,使其与活化后的基板偶联;
(3)残余活性位点封闭,向SPR仪器中注入封闭液溶液,封闭残余的活性位点;
基于IM-CL高亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的制备方法的步骤(1)的芯片选自售的传感芯片CM5;所述芯片活化为将基板放入Biacore S200/8k+仪器中,注入EDC和NHS的混合液使其以10μl/min的流速持续流过基板表面10min。
免疫球蛋白的偶联过程为,向Biacore S200/8k+仪器中以10μl/min的流速注入100μg/ml用乙酸钠稀释的免疫蛋白(IMs),注入持续时间为10min。
残余活性位点的封闭为向Biacore S200/8k+仪器中注入10min的1M乙醇胺,流速为10μl/min。
本发明的一个实施例,本发明提供了一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片筛选蛋白活性小分子的方法,筛选步骤包括:
(1)检测筛选系统组装:将上述制备获得的生物传感器芯片装入SPR仪器中;
(2)融合蛋白的固定:将带有CLs标签的融合蛋白用工作液(Running buffer:10mMHEPES(pH 7.4),150mM NaCl,0.005%(v/v)Tween 20)稀释,然后注入到SPR仪器中,将融合蛋白固定在所述生物传感器芯片表面;所述CLs标签选自CL2、CL7、CL8和CL9中的一种或多种,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示,所述融合蛋白为HSP90a,其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
(3)小分子上机:在SPR仪器中加入不同浓度或不同类型的与融合蛋白有亲和力的小分子化合物,运行结合、解离程序。小分子上机过程中的结合时间为300s,解离时间为1800s。程序运行后,用软件进行数据分析小分子与融合蛋白的亲和力。
本发明的一个实施例,本发明提供了一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的再生方法,所述方法包括:在SPR仪器中注入解离液,使解离液与固定有融合蛋白的生物传感器芯片反应,促使芯片再生。
所述解离液选自8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍、0.1mol/L盐酸、0.1mol/L NaOH、1%SDS中的一种或者多种,进一步优选地,所述解离液为6mol/L盐酸胍。
实施例1基于IM-CL高亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的制备
1.1大肠杆菌4种免疫蛋白表达及纯化
1.1.1大肠杆菌4种免疫蛋白表达
大肠杆菌4种免疫蛋白(IM2、IM7、IM8和IM9)基因序列由天霖生物合成,其中IM2、IM7、IM8和IM9的蛋白对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
利用分子克隆技术将4种免疫球蛋白基因连接构建在表达载体pET32a上。构建好的质粒转化到感受态细胞BL21(DE3),将4种免疫蛋白的菌株分别接种至50mL LB液体培养基中37℃培养过夜,将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1L LB液体培养基中,37℃培养至菌液OD600为0.6-0.8时加入0.5mM IPTG 15℃培养过夜,5000rpm离心收集菌体。
1.1.2大肠杆菌免疫蛋白纯化
将收集的菌体称重,按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HClpH 7.5,500mM NaCl,5%甘油),使用高压均质机破碎菌体,16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析His FF富集纯化蛋白,纯化前先用纯水和裂解缓冲液平衡His FF柱,将所有细胞上清挂柱后,用不同梯度的咪唑溶液洗脱,收集不同梯度咪唑洗脱下的穿透液并取样进行SDS-PAGE检测,纯化结果如图1所示,4种免疫蛋白均可以被300mM咪唑洗脱。最后将纯化得到的蛋白,置于保存液中,保存液(50mM HEPES(pH 7.5),150mM NaCl,5%甘油)。
1.2大肠杆菌4种CL标签蛋白表达及纯化
1.2.1大肠杆菌4种CL标签蛋白表达
大肠杆菌4种CL标签蛋白(CL2、CL7、CL8和CL9)基因序列由天霖生物合成,CL2、CL7、CL8和CL9标签蛋白氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示。
利用分子克隆技术将CL2、CL7、CL8和CL9的基因序列连接构建在表达载体pET28a上。构建好的质粒转化到感受态细胞BL21(DE3),将4种CL标签蛋白的菌株分别接种至50mLLB液体培养基中37℃培养过夜,将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1L LB液体培养基中,37℃培养至菌液OD600为0.6-0.8时加入0.5mM IPTG 15℃培养过夜,5000rpm离心收集菌体。
1.2.2大肠杆菌免疫蛋白纯化
将收集的菌体称重,按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HClpH 7.5,500mM NaCl,5%甘油,1mM DTT),使用高压均质机破碎菌体,16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析strep柱富集纯化蛋白,纯化前用再生缓冲液清洗strep柱并用裂解缓冲液平衡strep柱,将所有细胞上清挂柱后,用75mM的生物素(biotin)洗脱,收集洗脱峰并进行SDS-PAGE检测,纯化结果如图2所示,4种免疫蛋白均可以被75mM生物素(biotin)洗脱。
1.3免疫蛋白与对应的CL标签蛋白相互作用亲和力检测
为了检测本发明提供的可逆芯片的灵敏度,检测了免疫蛋白IM与CL标签蛋白的亲和力,使用SPR方法分别检测了亲和力。具体操作:用10mM醋酸钠pH 4.5将免疫蛋白浓度稀释到5μg/ml,NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基卡巴朴胺)以10μl/min的流速流经CM5芯片600s用以活化芯片表面的羧基葡聚糖基质;设置流速为5μl/min,总共24s,将不同的免疫蛋白IM2、IM7、IM8和IM9固定到活化后的CM5芯片上;用1M乙醇胺盐封闭,流速为10μl/min,总时间420s;然后分别注入4种不同稀释浓度的标签蛋白CL2、CL7、CL8和CL9,设置流速为30μl/min,结合时间为180s,解离时间为3600s,程序运行结束后,用分析软件进行数据分析。实验结果见图3,根据分析的数据可知,IM2和CL2的亲和力为19.52nM、IM7和CL7的亲和力为385.2pM、IM8和CL8的亲和力为14.49pM、IM9和CL9的亲和力为428.5pM、其中IM8和CL8之间的亲和力最强。
1.4不同CL标签的HSP90a蛋白纯化
为了验证制备的SPR可逆芯片是否可以应用于蛋白化合物筛选,本发明以HSP90a蛋白作为测试,选择了HSP90a蛋白的化合物AT13887(上海源叶生物,货号:S81094)进行测试。具体的实验方案如下:
1.4.1不同CL标签的HSP90a蛋白表达
不同CL标签的HSP90a蛋白HSP90a-CL2、HSP90a-CL7、HSP90a-CL8和HSP90a-CL9基因序列均由天霖生物合成,HSP90a氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示;
利用分子克隆技术将HSP90a-CL2、HSP90a-CL7、HSP90a-CL8和HSP90a-CL9基因序列分别连接构建在表达载体pET28a上。构建好的质粒转化到感受态细胞BL21(DE3),将4种CL标签HSP90a蛋白的菌株分别接种至50mL LB液体培养基中37℃培养过夜,将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1L LB液体培养基中,37℃培养至菌液OD600为0.6-0.8时加入0.5mM IPTG 15℃培养过夜,5000rpm离心收集菌体。
1.4.2不同CL标签的HSP90a蛋白纯化
将收集的菌体称重,按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HClpH 7.5,500mM NaCl,5%甘油),使用高压均质机破碎菌体,16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析His FF富集纯化蛋白,纯化前先用纯水和裂解buffer平衡His FF柱,将所有细胞上清挂柱后,用不同梯度的咪唑溶液洗脱,收集不同梯度咪唑洗脱下的穿透液并取样进行SDS-PAGE检测,纯化结果如图4所示,4种不同的应用蛋白HSP90a-CL2、HSP90a-CL7、HSP90a-CL8和HSP90a-CL9均可以被300mM咪唑洗脱。
1.5SPR可逆生物传感器芯片的制备与小分子化合物的筛选
1.5.1基于IM-CL体系可逆芯片的制备
以市售的传感片CM5为基板,将所述基板放入Biacore S200/8k+仪器中,Runningbuffer清洗管路后注入EDC和NHS的混合液使其以10μl/min的流速持续流过基板表面十分钟,随后又分别向该仪器中以10μl/min的流速注入100μg/ml用乙酸钠稀释的免疫蛋白IM2、IM7、IM8和IM9,注入持续时间为10min;最后向芯片注入10min的1M乙醇胺封闭,流速为10μl/min。
1.5.2基于IM-CL体系可逆芯片检测蛋白和小分子亲和力
固定好免疫蛋白IM2、IM7、IM8和IM9的CM5-IM芯片,将制备好的HSP90a-CL2、HSP90a-CL7、HSP90a-CL8和HSP90a-CL9蛋白分别用Running buffer稀释到50μg/ml,以5μl/min的流速注入120s,然后分别加入不同稀释浓度的AT13887,设置流速为30μl/min,结合时间为300s,解离时间为1800s,程序运行结束后,用软件进行数据分析。
实验结果见图5,根据分析的数据可知,AT13887和HSP90a-CLs的亲和力分别为593pM、489pM、244pM和931pM,结果比较接近。
实施例2SPR可逆生物传感器芯片的再生
2.1可逆生物传感器芯片的再生效果检测
为了验证本发明免疫蛋白IM-CL可逆芯片是否可以再生后使用,用6M盐酸胍进行测试,通过观察HSP90a蛋白的固定情况判断再生后芯片的效果。具体操作如下,以IM8为例:先制备CM5-IM8芯片,如2.5.1,将IM8固定在芯片上,稀释HSP90a-CL8蛋白到50μg/ml,设置程序以5μl/min的流速注入120s,流速调整为30μl/min,五分钟后,注入120s盐酸胍;该程序运行200次,结果如图6所示,蛋白固定水平在80次后约剩90%活性,200次后免疫蛋白IM8还有约80%活性。
2.2再生后可逆生物传感器芯片在化合物筛选中的应用
注入不同稀释浓度的AT13887后,传感图呈现难解离的趋势,加入6M盐酸胍设置流速为30μl/min,注入时间为120s。盐酸胍再生后,重复2.5.2步骤,重新偶联HSP90a-CL2、HSP90a-CL7、HSP90a-CL8和HSP90a-CL9蛋白,再次检测该蛋白与小分子AT13887的结合亲和力,重复8次,HSP90a-CL2、HSP90a-CL7、HSP90a-CL8和HSP90a-CL9蛋白再生后同等条件偶联水平如图6。
表1不同标签HSP90a与AT13887的亲和力结果
Order | Sample ID | Ligand | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
1 | AT13887 | HSP90a-CL2 | 2.72E+06 | 1.62E-03 | 5.94E-10 |
2 | AT13887 | HSP90a-CL2 | 1.93E+06 | 1.08E-03 | 5.57E-10 |
3 | AT13887 | HSP90a-CL2 | 2.57E+06 | 8.79E-04 | 3.43E-10 |
4 | AT13887 | HSP90a-CL2 | 3.71E+05 | 2.96E-04 | 7.96E-10 |
5 | AT13887 | HSP90a-CL2 | 2.61E+05 | 2.79E-04 | 1.07E-09 |
6 | AT13887 | HSP90a-CL2 | 2.67E+05 | 1.89E-04 | 7.08E-10 |
7 | AT13887 | HSP90a-CL2 | 2.73E+05 | 2.24E-04 | 8.18E-10 |
8 | AT13887 | HSP90a-CL2 | 4.03E+05 | 3.15E-04 | 7.82E-10 |
1 | AT13887 | HSP90a-CL7 | 2.13E+06 | 1.20E-03 | 5.64E-10 |
2 | AT13887 | HSP90a-CL7 | 2.22E+06 | 1.28E-03 | 5.77E-10 |
3 | AT13887 | HSP90a-CL7 | 2.14E+06 | 1.24E-03 | 5.80E-10 |
4 | AT13887 | HSP90a-CL7 | 2.33E+06 | 1.31E-03 | 5.64E-10 |
5 | AT13887 | HSP90a-CL7 | 1.97E+06 | 1.15E-03 | 5.86E-10 |
6 | AT13887 | HSP90a-CL7 | 2.59E+06 | 1.53E-03 | 5.91E-10 |
7 | AT13887 | HSP90a-CL7 | 2.46E+06 | 1.42E-03 | 5.78E-10 |
8 | AT13887 | HSP90a-CL7 | 2.33E+06 | 1.40E-03 | 6.00E-10 |
1 | AT13887 | HSP90a-CL8 | 2.13E+06 | 5.20E-04 | 2.44E-10 |
2 | AT13887 | HSP90a-CL8 | 3.71E+06 | 1.22E-03 | 3.28E-10 |
3 | AT13887 | HSP90a-CL8 | 4.47E+06 | 1.62E-03 | 3.62E-10 |
4 | AT13887 | HSP90a-CL8 | 3.77E+06 | 1.11E-03 | 2.94E-10 |
5 | AT13887 | HSP90a-CL8 | 3.39E+06 | 8.13E-04 | 2.40E-10 |
6 | AT13887 | HSP90a-CL8 | 2.41E+06 | 5.27E-04 | 2.19E-10 |
7 | AT13887 | HSP90a-CL8 | 2.91E+06 | 9.35E-04 | 3.21E-10 |
8 | AT13887 | HSP90a-CL8 | 3.44E+06 | 1.59E-03 | 4.61E-10 |
1 | AT13887 | HSP90a-CL9 | 1.45E+06 | 1.35E-03 | 9.30E-10 |
2 | AT13887 | HSP90a-CL9 | 1.75E+06 | 1.86E-03 | 1.07E-09 |
3 | AT13887 | HSP90a-CL9 | 1.61E+06 | 1.65E-03 | 1.02E-09 |
4 | AT13887 | HSP90a-CL9 | 1.62E+06 | 1.64E-03 | 1.02E-09 |
5 | AT13887 | HSP90a-CL9 | 1.65E+06 | 1.58E-03 | 9.59E-10 |
6 | AT13887 | HSP90a-CL9 | 1.55E+06 | 1.57E-03 | 1.01E-09 |
7 | AT13887 | HSP90a-CL9 | 1.64E+06 | 1.45E-03 | 8.86E-10 |
8 | AT13887 | HSP90a-CL9 | 1.77E+06 | 1.51E-03 | 8.52E-10 |
表1列出了具体的SPR的数据,根据SPR的曲线和相应的数据可知,用盐酸胍处理芯片后,其检测到的化合物和目标蛋白的亲和力数据非常接近,说明盐酸胍可以成功地实现芯片的可逆使用。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程,是以本发明技术方案为前提下进行实施,但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
Claims (10)
1.一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片,其特征在于,所述芯片以传感器芯片CM5为基板,所述基板表面偶联有大肠杆菌免疫蛋白,所述大肠杆菌免疫蛋白为IM2、IM7、IM8和IM9中的一种或多种,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.一种如权利要求1所述的基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)芯片表面活化,将传感芯片CM5作为基板放入SPR仪器中,注入活化液使其对基板进行活化;
(2)免疫球蛋白偶联,向SPR仪器中注入免疫球蛋白溶液,使其与活化后的基板偶联;
(3)残余活性位点封闭,向SPR仪器中注入封闭液溶液,封闭残余的活性位点。
3.根据权利要求2所述的一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的制备方法,其特征在于,所述活化液能够在芯片的基片表面形成氨基或羧基功能化的单分子层,以便与免疫球蛋白偶联。所述封闭液选自乙醇胺、BSA、酪蛋白、脱脂牛粉、双层磷脂膜中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的制备方法,其特征在于,所述活化液为EDC和NHS的混合液,所述封闭液为乙醇胺。
5.一种利用如权利要求1所述的基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片筛选蛋白活性小分子的方法,其特征在于,筛选步骤包括:
(1)检测筛选系统组装:将所述生物传感器芯片装入SPR仪器中;
(2)融合蛋白的固定:将带有CLs标签的融合蛋白用工作液(Running buffer)稀释,然后注入到SPR仪器中,将融合蛋白固定在所述生物传感器芯片表面;所述CLs标签选自CL2、CL7、CL8和CL9中的一种或多种,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。
(3)小分子上机:在SPR仪器中加入不同浓度或不同类型的与融合蛋白有亲和力的小分子化合物,运行结合、解离程序,程序运行后,用软件进行数据分析小分子与融合蛋白的亲和力。
6.根据权利要求5所述的一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片筛选蛋白活性小分子的方法,其特征在于,所述融合蛋白为HSP90a,其氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。
7.根据权利要求5所述的一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片筛选蛋白活性小分子的方法,其特征在于,所述SPR仪器为Biacore S200/8k+,小分子上机过程中的结合时间为300s,解离时间为1800s。
8.一种如权利要求1所述的基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的再生方法,其特征在于,所述方法包括:在SPR仪器中注入解离液,使解离液与固定有融合蛋白的生物传感器芯片反应,促使芯片再生。
9.根据权利要求8所述的一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的再生方法,其特征在于,所述解离液选自8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍、0.1mol/L盐酸、0.1mol/LNaOH、1%SDS中的一种或者多种。
10.根据权利要求9所述的一种基于IM-CL亲和系统的SPR可逆生物传感器芯片的再生方法,其特征在于,所述解离液为6mol/L盐酸胍。
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