CN117778620A - 区分番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针、试剂盒及方法，该DNA探针具有如SEQ.ID.NO.1所述的核苷酸序列；该DNA探针用于区分番木瓜环斑病毒抗性品种和番木瓜环斑病毒低抗性品种。根据番木瓜各品种的叶绿体基因组序列对齐结果，我们发现10 kb附近区域存在一段差异位点。通过这一个位点，我们可以区分不同PRSV抗性的番木瓜品种，为分子标记的理想位点。我们截取了差异位点的上下游250 bp的序列作为参考序列选取同源序列设计引物，番木瓜各品种样品的DNA作为模板进行PCR扩增，在7个模板中均能扩增出单一明亮、与预期大小一致的条带，证明对叶绿体基因组序列分析得到的差异位点片段存在且可进行扩增和鉴定并依据差异位点设计了DNA探针。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针、试剂盒及方法。
背景技术
番木瓜（Carica papaya L.）是番木瓜科番木瓜属植物，原产热带美洲，自明清时期传入中国，至今已在我国南方热带及亚热带地区多地种植，是一种用途广泛的热带草本果树，其果实营养价值高、富含蛋白酶，既可做水果鲜食，又可作工业提取与加工，被广泛应用与食品、药品等多个行业。
番木瓜环斑病毒（Papaya Ring Spot Virus，PRSV）是番木瓜产业的毁灭性植物病毒，可造成番木瓜植株畸形、花叶、组织坏死，在热带及亚热带番木瓜产区均有流行，PRSV传染性强、致死率高，对番木瓜的生产危害极大，因而番木瓜品种的PRSV抗性对番木瓜引种、生产和布局十分重要。在番木瓜产业中，不同的品种具备不同的PRSV抗性，在引种和作物布局工作上需要对此进行考虑，而依靠传统形态学特征对番木瓜种质进行区分较为困难，因而不同PRSV抗性品种的分子生物学鉴别方法十分重要。
叶绿体基因组（cpDNA）分子标记在植物科学领域中具有重要意义，特别是在系统发育、进化生物学、物种鉴定、种群遗传学以及生态学和保护生物学等方面。叶绿体基因组通常是单一的环形分子，大小在120-160 kb范围内，包含一系列编码光合作用、电子传递和其他生物合成途径的基因，其具有高度的遗传稳定性、低重组率和母体遗传特性。这些特点使得叶绿体基因组成为高效和可靠的分子标记，能够提供高解析度的信息，特别适用于解析疏远亲缘关系的植物和评估种群结构、基因流以及历史动态。通过比较不同物种或种群的叶绿体基因组，研究人员可以更深入地了解植物如何适应各种生态环境以及背后的演化机制，从而为生物多样性保护和可持续利用提供科学依据。
发明内容
本研究对番木瓜多个品种的叶绿体基因组测序、组装、分析，获取了在PRSV抗性方面具有差异的多个番木瓜品种的叶绿体基因组差异位点，以此开发分子标记探针，区分番木瓜PRSV高抗性与低抗性的品种。
区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针，所述DNA探针具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
其中，所述DNA探针的核苷酸序列5’端大于等于35个碱基处插入一个四氢呋喃。
其中，所述DNA探针上标记有示踪标记。
其中，所述示踪标记为同位素标记、非同位素标记中的一种或多种。
其中，所述非同位素标记为酶或者有色基团。
其中，番木瓜环斑病毒抗性品种为大青、红妃和台农，番木瓜环斑病毒低抗性品种为广蜜、红铃、桂热、琼海黄。
本申请提供的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的方法，包括如下步骤：
S1提取待测植物的叶绿体基因组DNA；
S2以该植物的叶绿体基因组为模板进行PCR扩增，使用前述的DNA探针检测叶绿体特异性基因是否存在；
S3若叶绿体特异性基因存在，则判断该植物为番木瓜环斑病毒抗性品种。
本申请还提供用于区分番木瓜环斑病毒抗性品种的试剂盒，该试剂盒包括前述的DNA探针。
根据番木瓜各品种的叶绿体基因组序列对齐结果，我们发现了多个差异位点，其中10 kb附近区域存在一段差异位点。通过这一个位点，我们可以区分不同PRSV抗性的番木瓜品种，为分子标记的理想位点。我们截取了差异位点的上下游250 bp的序列作为参考序列选取同源序列设计引物，番木瓜各品种样品的DNA作为模板进行PCR扩增，在7个模板中均能扩增出单一明亮、与预期大小一致的条带，证明对叶绿体基因组序列分析得到的差异位点片段存在且可进行扩增和鉴定。
对PCR扩增产物进行Sanger测序，并将测序结果进行比对，比对结果证实在此位点存在一个20 bp的差异位点能够将PRSV高抗性与低抗性的番木瓜品种区分开，依据该位点设计了寡核苷酸荧光探针，可应用RPA（Recombinase Polymerase Amplification）等分子生物学方法对番木瓜叶片组织进行检测，通过是否存在荧光信号即可实现其分子鉴定，以此能够高效区分番木瓜不同PRSV抗性的品种。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是番木瓜各品种叶绿体基因组10 kb处差异位点，番木瓜品种从上至下分别为大青、广蜜、红铃、桂热、红妃、琼海黄、台农；
图2番木瓜各品种叶绿体基因组分子标记PCR扩增电泳条带，电泳条带从左开始分别为Marker、红妃、台农、大青、广蜜、红铃、琼海黄、桂热、空白对照，条带大小约为250 bp。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
一、实验仪器
高速冷冻离心机：ThermoFisher，Micro 21R；
恒温水浴锅：精宏，DK-S24；
超微量分光光度计：ThermoFisher，NanoDrop2000；
PCR仪：ThermoFisher，Applied Biosystems VeritiPro；
凝胶电泳仪：六一，DYY-8C；
凝胶成像系统：VILBER，FUSION FX7；
二、 实验试剂
植物基因组DNA提取试剂盒：天根，DP305；
2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)：诺唯赞，P525；
D2000分子量标准：天根，MD114。
三、 实验方法
叶绿体基因组的获取：对样品进行叶绿体全基因组测序，清洗低质量数据后，对clean reads进行组装，获取较为完整的叶绿体基因组数据。
序列对齐：使用软件MAFFT将番木瓜叶绿体基因组序列对齐，获取番木瓜品种间差异位点，具体番木瓜品种见表1。
表1番木瓜品种名称以及PRSV抗性
PCR引物设计：根据番木瓜各品种叶绿体基因组对齐结果，选择可以区分番木瓜不同PRSV抗性品种的叶绿体基因序列差异位点，提取差异位点及其上下游约250 bp的序列，使用Primer-BLAST设计引物，筛选得到PCR引物CPP2F=SEQ.ID.NO.2=GCTCTAGATTTCCCGTTCGA、CPP2R=SEQ.ID.NO.3=TGCGTCCAATAGGATTTGAACC，并由华大基因（北京）股份有限公司合成。
样品研磨：使用液氮将样品组织研磨成均匀的粉末。
DNA提取：参照说明书流程，提取多种品种番木瓜的植株叶片组织DNA并检测浓度。
PCR扩增验证：根据表2配置PCR反应体系，按照表3设置PCR程序进行PCR扩增。
表2 PCR体系
表3 PCR程序
凝胶电泳：使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的条带大小。
扩增产物测序：将电泳结果符合预期的PCR产物送往华大基因（北京）股份有限公司进行测序。
探针设计：遵循探针设计原则，在番木瓜叶绿体基因特异性位点处设计长度45-50nt（碱基）的寡核苷酸探针，在5’端标记一个FAM荧光基团，在3’端用C3-spacer进行修饰，探针中部距离5’端大于等于35 nt处插入一个d-Spacer（THF四氢呋喃）。
探针序列=SEQ.ID.NO.1：5’-CTATCTATTTGAATATGTATTAATCTATTTGAATTGTATTAATTCAC-3’。
插入四氢呋喃后的探针序列: 5’-CTATCTATTTGAATATGTATTAATCTATTTGAAT(THF)TGTATTAATTCAC-3’。
四、试验结果
对番木瓜各品种叶绿体基因组序列进行组装后进行align，可筛选到差异位点如图1所示。
对差异位点附近片段进行扩增验证，得到琼脂糖核酸电泳检测结果符合预期，各品种均扩增出目标片段，具体如图2所示，之后对扩增产物送样测序，获得测序结果与叶绿体基因组组装结果基本一致，结果表明叶绿体基因组序列组装符合预期，差异位点片段真实存在。
依据差异位点设计荧光型分子标记寡核苷酸探针，结果如表4所示。
表4基于特异性位点的荧光探针序列
五、番木瓜环斑病毒抗性品种的区分方法
S1提取待测植物的叶绿体基因组DNA；
S2以该植物的叶绿体基因组为模板进行PCR扩增，使用前述的DNA探针检测叶绿体特异性基因是否存在；
S3若叶绿体特异性基因存在，则判断该植物为番木瓜环斑病毒抗性品种。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (8)
1.区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针具有如SEQ.ID.NO.1所述的核苷酸序列；
所述DNA探针用于区分番木瓜环斑病毒抗性品种和番木瓜环斑病毒低抗性品种。
2.根据权利要求1所述的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针的核苷酸序列5’端大于等于35个碱基处插入一个四氢呋喃。
3.根据权利要求1所述的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针上标记有示踪标记。
4.根据权利要求3所述的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针，其特征在于，所述示踪标记为同位素标记、非同位素标记中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针，其特征在于，所述非同位素标记为酶或者有色基团。
6.根据权利要求1-5任一所述的番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针，其特征在于，所述番木瓜环斑病毒抗性品种为大青、红妃和台农，番木瓜环斑病毒低抗性品种为广蜜、红铃、桂热、琼海黄。
7.区分番木瓜环斑病毒抗性品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1提取待测植物的叶绿体基因组DNA；
S2以该植物的叶绿体基因组为模板进行PCR扩增，使用如权利要求1-5任一所述的DNA探针检测叶绿体特异性基因是否存在；
S3若叶绿体特异性基因存在，则判断该植物为番木瓜环斑病毒抗性品种。
8.用于区分番木瓜环斑病毒抗性品种的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括如权利要求1-6任一所述的DNA探针。
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