CN117776899A - 一种从含有琥珀酸镁的发酵液中纯化琥珀酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从含有琥珀酸镁的发酵液中纯化琥珀酸的方法，包括以下步骤：对含琥珀酸的发酵液进行菌体自聚集去除菌体，对去除菌体的发酵液进行微滤处理，对得到的发酵液进行超滤处理；对超滤得到的发酵液进行脱色处理，并过滤；将过滤得到的发酵液通过填充有H⁺形式的阳离子交换树脂；结晶琥珀酸以形成中间晶体，并将中间晶体与发酵液分离，将分离后的发酵液再循环至超滤步骤；回收中间晶体，进行复溶脱色，结晶并离心，将分离后的处理液再循环至结晶步骤，并回收纯化后的琥珀酸。

Description

一种从含有琥珀酸镁的发酵液中纯化琥珀酸的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从含有琥珀酸镁的发酵液中纯化琥珀酸的方法。

背景技术

琥珀酸是四碳二羧酸，参与三羧酸循环。估计全球琥珀酸产量为每年16000至30000吨，年均增长10％。琥珀酸在化妆品、制药、食品工业和聚合物制备等许多领域中皆有应用。到目前为止，琥珀酸主要通过石油化学工艺生产，包括马来酸的氢化、1，4-丁二醇的氧化和乙二醇的羰基化。然而，由于石油资源的减少和环境污染日益严重等问题，化学生产工艺的弊端日益显现。由可再生原料生产琥珀酸，通过发酵的生物生产工艺一直被重点关注，作为石油化学工艺的有吸引力的替代品。这是取代由不可再生资源生产酸的能源更密集、更不利于环境的方法的途径。

目前，已经有报道采用液-液萃取、沉淀、蒸汽蒸馏、逆流萃取和电渗析与萃取组合方法从发酵液中纯化有机酸。但从商业角度来看，已经报道的用于从含有琥珀酸碱式盐的发酵液回收琥珀酸的众多方法是冗长和昂贵的。如美国专利号5,034,105提供了一种从含有琥珀酸钠的发酵液中制备琥珀酸的方法，该方法使培养液经历常规电渗析以制备不饱和的琥珀酸盐溶液，再经历水分解电渗析以产生超饱和琥珀酸溶液，随后使琥珀酸从超饱和溶液中结晶。但这种方法不适于大规模纯化琥珀酸，商业应用价值低。US 2010/0297715提供了一种从含有琥珀酸镁的发酵液分离和纯化琥珀酸的方法，该分离方法包括双极电渗析法结晶和高温处理以循环回收试剂。但这种方法过于复杂，且大规模使用这种方法产生琥珀酸的成本十分昂贵。EP2371802提供了一种使琥珀酸结晶的方法，该方法用氧化剂处理包含琥珀酸的水溶液，进一步结晶得到琥珀酸。该方法对于去除富马酸和乳酸等杂质并降低最终琥珀酸晶体的着色非常有效；WO2009/082050公开了一种培养液结晶提纯琥珀酸的方法，包括浓缩除去产生琥珀酸微生物的培养液、酸化浓缩培养液以及通过冷却酸化的培养液回收琥珀酸晶体的步骤。但以上方法提纯后仍然残有大量的葡萄糖、乳酸、甲酸、乙酸等副产物，以及不同的提纯方法虽能提纯出高质量的琥珀酸，但提纯过程过于复杂和昂贵，不适于大规模纯化琥珀酸，同时发酵液中的菌体去除困难，离心收集的菌体中仍含有大量发酵液，无法彻底分离，导致产物的浪费。因此，仍需寻找一种产率高、产物中有机酸含量和杂质离子含量低、适宜工业生产的纯化琥珀酸的简便方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种从含有琥珀酸镁的发酵液中纯化琥珀酸的新方法。

本发明的第一个目的是提供一种从含有琥珀酸镁的发酵液中纯化琥珀酸的方法，包括以下步骤：

S1、使用菌体自聚集剂处理含琥珀酸镁的发酵液，随后对发酵液进行离心处理以除去自聚集菌体和未反应的碳酸镁颗粒；

S2、调节离心滤液的pH为4.0～6.0，微滤，进一步除去悬浮固体，收集微滤透过液；

S3、对微滤透过液进行超滤处理，除去蛋白质等生物大分子，收集超滤透过液，并对超滤透过液进行脱色处理；

S4、采用阳离子交换树脂对脱色后的发酵液进行离子交换，将发酵液中的琥珀酸镁转化成琥珀酸，得到琥珀酸溶液，并回收镁；

S5、将离子交换后的琥珀酸溶液进行结晶处理，分离中间晶体与发酵液，得到琥珀酸粗晶体及回收母液；

S6、将回收母液加水稀释并循环至步骤S3重复步骤S3～S5，提纯上述琥珀酸粗晶体得到纯化后的琥珀酸。

进一步地，含琥珀酸镁的发酵液是以镁盐(如碳酸镁)为中和剂，通过发酵可产生琥珀酸的微生物而获得的发酵液。

进一步地，上述发酵为有氧-厌氧两阶段发酵，有氧阶段0～8h，厌氧阶段8～96h，发酵周期为60～96h。具体地：

有氧阶段(0～8h)：温度：35～40℃，通过搅拌转速及通气量控制DO值10％～100％，通过补加氨水控制PH值6.5～7.5。

厌氧阶段(8～96h)：温度35～40℃，通过补加碳酸镁来控制发酵液的pH值为6.2～6.6，通过控制补料速率维持发酵液的葡萄糖浓度在0～0.5g/L。

发酵过程结束后，在100～110℃条件下对发酵液进行连续灭菌操作。

进一步地，发酵培养液的pH范围为6-8，优选6.4-7。具体地，通过加入中和剂如碳酸钠、碳酸镁或铵调节发酵培养液的pH值。发酵温度为30-45℃，优选35-40℃。

进一步地，所述含琥珀酸的发酵液中，琥珀酸的浓度为30-145g/L。

进一步地，发酵所用重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌FMME-N-5，于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2020454。

进一步地，在步骤S1中，所述菌体自聚集剂包括但不限于抗菌肽NIPAm和氨基乙基丙烯酰胺的共聚物S-SP25等，共聚物S-SP25能够使发酵液中菌体聚集，便于除去发酵液中的菌体。

进一步地，菌体自聚集剂的添加量为发酵液的0.1％-1％。

进一步地，在步骤S1中，离心的操作温度为70～90℃。

进一步地，在步骤S2中，采用硫酸调节离心滤液pH，除去发酵液中残留的碳酸镁颗粒。

进一步地，在步骤S2中，采用陶瓷膜进行微滤处理，操作条件为温度70～90℃，跨膜压力0.2～1.0MPa。微滤处理以除去发酵液中自聚集菌体、固体和胶体等杂质，以降低对超滤膜的膜污染。

进一步地，陶瓷膜的膜孔径为0.2至1.2μm，优选为0.8μm左右。

进一步地，在步骤S3中，超滤所采用的膜组件型式为管式或中空纤维式，操作条件为温度45～60℃，跨膜压力0.2～1.0MPa。

进一步地，在步骤S3中，采用活性炭进行脱色处理，具体地，将发酵液通过填充有粒状活性炭柱。这种处理可去除发酵液中的氮化合物和有色物质。

进一步地，在步骤S4中，通过阳离子交换树脂以除去来自先前步骤(包括活性炭处理)的阳离子，尤其是镁。所使用的树脂可以是由DOWR制造的DOW88或PuroliteR制造的C150。

进一步地，在步骤S4中，所述回收镁为，向离子交换得到的镁离子溶液中加入镁离子沉淀剂，如加入碳酸盐得到碳酸镁沉淀，其可以作为回收的中和剂在发酵中使用。

进一步地，在步骤S5中，所述结晶为蒸发结晶。在这种情况下，结晶步骤包括蒸发阶段和连续结晶阶段，其中蒸发阶段通过在50-90℃(优选在60-80℃之间、更优选在65-80℃之间)下蒸发水来浓缩水溶液；连续结晶阶段中，使浓缩的水溶液达到1-25℃的温度，从而发生结晶。

优选地，结晶包括通过本领域已知的任何合适的方法使水溶液的pH达到1至4、优选1至2。将水溶液达到优选的pH值可以通过使用阳离子交换树脂来酸化或通过在所述溶液中直接加入盐酸等强酸来进行。优选地，使水溶液达到目标pH值可以通过使含有琥珀酸盐的处理液通过H⁺形式的阳离子交换树脂来进行。树脂中的H⁺与溶液的阳离子交换。

进一步地，在步骤S5中，通过离心或过滤将中间晶体与发酵液分离，分离后，获得含有中间晶体的湿饼和来自分离步骤的含有液相的母液。

进一步地，在步骤S6中，将分离后的处理液再循环到超滤膜处理步骤中。将经处理的母液以一定比例加入到水溶液中，再通过超滤膜处理。

进一步地，回收母液与水的体积比为10％～50％，最优选为25％。

进一步地，在步骤S6中，所述提纯为，将琥珀酸粗晶体复溶脱色后，进行与S5相同的结晶处理，离心后对晶体进行烘干，将分离后的处理液再进行脱色最终获得纯度非常高的最终产品。

进一步地，所述的复溶脱色是将中间晶体采用超纯水溶解，再用活性炭进行脱色。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过优化琥珀酸纯化工艺，并通过菌体自聚集技术彻底将菌体和发酵液分离，提高回收效率，并通过不同过滤手段的选择与组合，同时通过施加压力的优化提高琥珀酸的浓度，降低乳酸、乙酸浓度和杂离子含量，另外可通过对Mg²⁺回收重新转化为MgCO₃用作发酵过程中的pH中和剂，极大提高对MgCO₃利用，同时降低生产成本。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为琥珀酸提纯工艺流程图；

图2为本发明实施例1中琥珀酸发酵液的色谱图；

图3为本发明实施例3纯化后琥珀酸产品的色谱图；

图4为0.1g/L琥珀酸标样；

图5为0.1g/L乳酸标样；

图6为0.1g/L乙酸标样；

图7为陶瓷滤液样品的色谱图；

图8为超滤液样品的色谱图；

图9为离子交换后得到的下柱液样品的色谱图；

图10为实施例6中采用不同体积比的母液与水时琥珀酸的回收结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中涉及的实验材料和检测方法：

高效液相色谱测定样品中琥珀酸、乳酸和乙酸的含量时，检测条件为:色谱分离柱为Aminex HPX-87H(300×7.8mm)，流动相为5mmol/L稀硫酸，柱温为52℃，检测器为紫外检测器，检测波长为210mm，进样量10μL，流动相流速0.6mL/min。

Agilent1 260氨基酸专用高效液相色谱仪测定样品中的氨基酸。检测条件为:色谱分离柱为Agilent Hypersil ODS柱(5μm,4.0mm x 250mm)；流动相A(pH＝7.2):27.6mmo/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃(体积比为500:0.11:2.5)，流动相B(pH＝7.2):80.9mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈(体积比为1:2:2)；柱温为40℃；检测器为紫外检测器，检测波长为338nm，脯氨酸以262nm检测；进样量10μL；采用梯度洗脱，洗脱程序为:0min，8％B；17.0min，50％B；20.1min，100％B；24.0min，0％B；流动相流速为1.0mL/min；

利用电感耦合的等离子体通过原子发射谱测定Na⁺,Mg²⁺,K⁺阳离子；

离子浓度通过Waters高效液相色谱仪，检测条件为:色谱分离柱为AS11-HC色谱柱，流动相为离子液发生器30mM氢氧化钾，进样量10μL，流动相流速1mL/min。

无机氮通过E-10离子分析仪测量，残糖通过M-100生物传感分析仪测量，蛋白总量通过凯氏定氮仪测量。

种子培养基组成：胰蛋白胨5～10g/L、酵母提取物1～10g/L、氯化钠5～10g/L，配制完成后在110～125恒温灭菌30～45min。降温后移入菌种，培养条件：pH值为6.5～8.2，35～40℃培养5～10h。

发酵培养基的组成：玉米浆5～30g/L，硫酸铵1.7～5.1g/L，硫酸镁0.2～0.5g/L，磷酸氢二钾0.9～2.1g/L，磷酸二氢钾0.4～0.9g/L，葡萄糖20～45g/L，适量消泡剂，以氢氧化钠调节pH值为6.5～8.2。配制完成后在110～125℃恒温灭菌30～45min。

共聚物S-SP25的合成原料为聚丙烯酰胺和NIPAm，其中聚丙烯酰胺购自苏州如日化工科技有限公司，NIPAm购自阿拉丁试剂；聚丙烯酰胺和NIPAm利用可逆加成-断裂链转移法聚合形成共聚物S-SP25。

本发明涉及的方案如下：

对含琥珀酸的发酵液进行菌体自聚集去除菌体，对去除菌体的发酵液进行微滤处理，对得到的发酵液进行超滤处理；对超滤得到的发酵液进行脱色处理，并过滤；将过滤得到的发酵液通过填充有H⁺形式的阳离子交换树脂；结晶琥珀酸以形成中间晶体，并将中间晶体与发酵液分离，将分离后的发酵液再循环至超滤步骤；回收中间晶体，进行复溶脱色，结晶并离心，将分离后的处理液再循环至结晶步骤，并回收纯化后的琥珀酸。

实施例1发酵液的制备

发酵液中琥珀酸的一般浓度通常在30-145g/L。

发酵液通过发酵可产生琥珀酸的大肠杆菌而获得。发酵液允许细胞生长和琥珀酸生产。发酵分为有氧与厌氧阶段两个阶段。本发明将厌氧发酵方法定义为如下发酵方法，其在发酵时不通入空气，通过碳酸盐中和有机酸产生二氧化碳排出发酵液中的空气。厌氧发酵为主要产酸阶段，通过加入中和剂碳酸镁调节发酵培养液的pH值使其范围在6.5左右。发酵温度为37℃。具体步骤如下：

(1)产生琥珀酸的大肠杆菌选取公开号为CN112280725A中的高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌，构建过程为：以保藏号为CCTCC NO:M 2020454的大肠杆菌FMME-N-5为宿主，敲除了其中的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB-focA、乳酸脱氢酶编码基因ldhA和磷酸转乙酰基酶编码基因pta，并过量表达了磷酸烯醇式丙酮酸所激酶Pck和亚磷酸酯脱氢酶PtxD。

(2)发酵阶段：

发酵罐上发酵培养基如下：

发酵培养基为：葡萄糖35g/L，玉米浆20g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，K₂HPO₄ 1.4g/L，KH₂PO₄ 0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，NaCl 2g/L；补料培养基为：葡萄糖800g/L；

挑取重组菌株进行7.5L发酵罐两阶段发酵。单克隆接种于25mL(50mL摇瓶)的LB培养基作为一级种子液，置于37℃ 200rpm的条件下培养8.5h。取一级种子液200μl接种至50mL/500mL的种子培养基中；37℃、200rpm培养7.5h得到二级种子液。发酵罐的初始装液量为4L，种子接种量为10％，有氧阶段发酵条件为：培养温度为37℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速为600r/min，氨水控制pH为7.0，整个有氧阶段溶氧控制在20％的水平，当菌体浓度生长至OD₆₀₀＝52-60时，转为厌氧发酵阶段；厌氧阶段：停止通气，搅拌转速为200r/min，补加800g/L葡萄糖并控制补料速率控制发酵液的残糖<10g/L，厌氧阶段使用碱式MgCO₃控制pH＝6.5，发酵周期为总共96h。得到发酵液，高效液相色谱测定样品中琥珀酸、乳酸和乙酸的含量。

测得的液相图谱如图2，琥珀酸的出峰时间约为11.00min，乳酸出峰时间约为12.00，乙酸出峰时间约为14.30。

实施例2发酵液提纯准备

待实施例1得到的发酵液中糖消耗为零后，将发酵液121℃，30min灭菌处理，得到母液。糖浓度通过西尔曼科技有限公司的M-100生物分析仪检测。

后续通过菌体自聚集、生物质分离、微滤膜、超滤膜以及来自PuroliteR的阳离子交换树脂的酸化来获得含有琥珀酸的粗液并对其进行蒸发结晶与母液回收。

实施例3发酵液的纯化

A、菌体自聚集：按照0.1％的比例添加共聚物S-SP25至发酵母液，操作温度为37℃，处理1h；

B、离心分离：对经过菌体自聚集处理的琥珀酸发酵液采用碟式离心机进行离心，以除去自聚集菌体和未反应的碳酸镁颗粒，操作温度70～90℃；

C、陶瓷膜微滤：使用硫酸调节离心滤液的pH为4.0～6.0，进行微滤，进一步除去悬浮固体，操作温度70～90℃，操作压力：0.2～1.0MPa，收集微滤透过液；

D、超滤：除去蛋白质等生物大分子，操作温度45～60℃，操作压力：0.2～1.0MPa，收集超滤透过液；

E、脱色：将超滤透过液用活性炭脱色柱进行脱色，操作温度60～80℃；

F、发酵液的连续离子交换：脱色后的发酵液进入阳离子树脂柱进行连续离子交换，将发酵液中的丁二酸镁转化成丁二酸；

G、离交再生液回收碳酸镁；硫酸镁溶液以MVR浓缩至25～30％，与25～30％浓度的碳酸钠溶液在三合一设备(反应、过滤及洗涤)生成碳酸镁沉淀，滤饼以脱盐水洗涤，至滤液TDS不高于5000ppm，滤饼进入耙式干燥机在105～115℃条件下干燥至水分不高于20％，干燥机末端有粉碎系统，粉状碳酸镁以气流输送的方式送至发酵罐上方的料仓。

H、丁二酸溶液的蒸发浓缩及结晶：将离交后的丁二酸溶液进入MVR蒸发浓缩系统浓缩至200～350g/L，浓缩液降温至20～30℃时在连续结晶器中得到丁二酸粗晶体；

I、丁二酸重结晶提纯：将丁二酸粗晶体以1.5～2倍脱盐水复溶，溶液以活性炭脱色，操作温度60～80℃，过滤清液降温至20℃，丁二酸结晶析出；一次结晶后的母液重新浓缩，进行二次结晶析出；二次结晶后的母液重新浓缩，进行三次结晶析出；

J、丁二酸结晶体的干燥：将结晶析出的丁二酸晶体进行真空干燥，得到合格丁二酸固体；

采用高效液相色谱法分别测定微滤、超滤、离子交换后得到的样品以及纯化流程完成后收集到的琥珀酸样品，结果分别见图3和图7-9。从图7-9中可知，下游处理方式对发酵液成分，包括无机离子和有机酸都有很大影响，其中超滤液与下柱液中的成分明显不同——陶瓷滤液中残糖富集，琥珀酸含量没有明显变化；超滤液中金属离子浓度提高，琥珀酸浓度降低17.72％；下柱液中金属离子几乎不存在，琥珀酸浓度降低56.79％。在含氨基酸的样品中，丙氨酸和缬氨酸浓度较高，其余氨基酸浓度极低，陶瓷滤液与超滤液中氨基酸浓度降低，下柱液中无氨基酸；各种发酵处理液中皆有蛋白存在，镁再生溶液中蛋白总量最低，下柱液中依然有少量蛋白。从图3中可知，收集到的琥珀酸样品无杂质。

表3

实施例4微滤条件优化

本实施例中比较了微滤时施加不同压力的过滤情况。

母液按照实施例2相同的方式生产。然后母液分为三部分，分别施加不同压力得到不同陶瓷滤液。如表1，显示了在施加压力为0.4pa时效果最好。

表1

实施例5超滤条件优化

本实施例中比较了超滤时施加不同压力的过滤情况。

待处理液按照实施例3相同的方式生产。然后将待处理液分为三部分，分别施加不同压力得到不同超滤液。

如表2，显示了在施加压力为0.3Mpa时效果最好。

表2

实施例6母液与水混合稀释

由于在连续生产期间杂质不断累积，所以直接处理通过母液再循环回收的琥珀酸的量会影响品质。如图10所示，母液以25％的体积比与水混合稀释后直接再循环从超滤膜处理到蒸发结晶步骤，使相对琥珀酸回收率提高到1.57，并减少32％废水量，在25％比例以上减少排水量效果不明显，较以10％、50％、75％、100％的体积比与水混合循环最优。且回收率逐渐降低。该方法符合绿色经济。

综上，本发明提纯琥珀酸所用的发酵原液处理后仅含有少量葡萄糖、乳酸、乙酸，没有甲酸、柠檬酸、富马酸。本方法极大地简化了提纯过程，并没有用到电渗析等高耗费过程，使用菌体自凝聚使发酵液中的菌体彻底分离出来，提高了产物的收率，镁离子等阳离子被离交柱上的树脂吸附，然后用氢离子置换离子交换柱上的镁离子等，含有镁离子的洗脱液再加碳酸钠生成碳酸镁沉淀，收集沉淀滤干，得含有游离水碳酸镁，回收碳酸镁做发酵pH调节剂节约了成本。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同的变动。而由此所引申出的显而易见的变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种从含有琥珀酸镁的发酵液中纯化琥珀酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、使用菌体自聚集剂处理含琥珀酸镁的发酵液，随后对发酵液进行离心处理以除去自聚集菌体和未反应的碳酸镁颗粒；

S2、调节离心滤液的pH为4.0～6.0，微滤，进一步除去悬浮固体，收集微滤透过液；

S3、对微滤透过液进行超滤处理，除去蛋白质等生物大分子，收集超滤透过液，并对超滤透过液进行脱色处理；

S4、采用阳离子交换树脂对脱色后的发酵液进行离子交换，将发酵液中的琥珀酸镁转化成琥珀酸，得到琥珀酸溶液，并回收镁；

S5、将离子交换后的琥珀酸溶液进行结晶处理，分离中间晶体与发酵液，得到琥珀酸粗晶体及回收母液；

S6、将回收母液加水稀释并循环至步骤S3重复步骤S3～S5，提纯上述琥珀酸粗晶体得到纯化后的琥珀酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述菌体自聚集剂包括抗菌肽NIPAm和氨基乙基丙烯酰胺的共聚物S-SP25。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，离心的操作温度为70～90℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，采用陶瓷膜进行微滤处理，操作条件为温度70～90℃，跨膜压力0.2～1.0MPa。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，超滤所采用的膜组件型式为管式或中空纤维式，操作条件为温度45～60℃，跨膜压力0.2～1.0MPa。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，采用活性炭进行脱色处理。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述回收镁为，向离子交换得到的镁离子溶液中加入镁离子沉淀剂，如加入碳酸盐得到碳酸镁沉淀，其可以作为回收的中和剂在发酵中使用。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S5中，所述结晶为蒸发结晶，包括蒸发阶段和连续结晶阶段；其中，蒸发阶段通过在50-90℃下蒸发水来浓缩发酵液，连续结晶阶段中，使浓缩的发酵液达到1-25℃的温度，从而发生结晶。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S6中，回收母液的体积为水的10％～50％。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S6中，所述提纯为，将琥珀酸粗晶体复溶脱色后，进行与步骤S5相同的结晶处理。