CN117771442A - 复层软组织修复补片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种复层软组织修复补片及其制备方法。所述复层软组织修复补片包括层叠复合的致密层和疏松层，所述致密层包括经交联处理的脱细胞膜片，所述疏松层包括经交联处理的胶原海绵材料和/或脱细胞膜片材料。所述复层软组织修复补片的力学性能优异，且能够有效促进缺损部位软组织修补和再生。

Description

复层软组织修复补片及其制备方法

技术领域

本申请涉及医用材料技术领域，特别是涉及一种复层软组织修复补片及其制备方法。

背景技术

目前，临床上使用的软组织修复补片主要分为自体组织、同种异体材料、脱细胞基材料、胶原基材料以及人工合成材料，以使用方式可以分为缝合型与免缝合型。其中，自体组织虽然修补效果好，免疫原性风险低，但是其会对病人供区产生二次伤害；同种异体材料存在免疫排斥风险；人工合成材料（如聚乳酸）降解时间虽然可控，但是其降解产物多为酸性，容易引起炎症反应。另外，脱细胞基材料的力学强度较高，缝合强度高，但是过于致密，不利于细胞快速长入；胶原基材料为疏松多孔海绵状，多孔结构有利于成纤维细胞长入以及软组织再生，但是力学强度低，不利于手术缝合。因而，有方法将脱细胞基材料与胶原基材料进行复合使用，以期在具有较好力学性能的同时，更有利于软组织的修补和再生。

然而，传统的脱细胞基材料与胶原基材料复合材料存在两种材料间结合力较差的问题，使得整体的力学性能下降，软组织修补和再生的效果也有待进一步改善。

发明内容

基于此，本申请提供一种力学性能优异，且能够有效促进缺损部位软组织修补和再生的复层软组织修复补片及其制备方法。

本申请的第一方面，提供一种复层软组织修复补片，包括层叠复合的致密层和疏松层，所述致密层包括经交联处理的脱细胞膜片，所述疏松层包括经交联处理的胶原海绵材料和/或脱细胞膜片材料。

在其中一个实施例中，所述经交联处理的胶原海绵材料的孔径为10μm~300μm；

可选地，所述经交联处理的胶原海绵材料的孔径为50μm~150μm。

在其中一个实施例中，所述经交联处理的脱细胞膜片的厚度为0.05mm~1mm。

在其中一个实施例中，所述复层软组织修复补片的厚度为2mm~8mm。

在其中一个实施例中，所述致密层与所述疏松层接触的表面经过粗糙化处理。

本申请的第二方面，提供一种复层软组织修复补片的制备方法，包括如下步骤：

取脱细胞膜片进行第一交联，制备经交联处理的脱细胞膜片；

取胶原海绵材料和/或脱细胞膜片材料进行第二交联，然后粉碎，与酸溶液混合，制备疏松层浆料；

将所述疏松层浆料施加至经交联处理的脱细胞膜片的表面，进行冷冻干燥，制备中间体；

将所述中间体进行第三交联，灭菌，制备所述复层软组织修复补片。

在其中一个实施例中，将所述疏松层浆料施加至经交联处理的脱细胞膜片的表面之前，还包括对经交联处理的脱细胞膜片的表面进行粗糙化处理的步骤，包括：

将所述经交联处理的脱细胞膜片于溶液中进行浸泡，然后对待进行施加的表面进行粗糙化；

可选地，溶液为水、浓度为0.005mol/L~0.5mol/L的醋酸水溶液或浓度为0.0005mol/L~0.01mol/L的盐酸水溶液。

在其中一个实施例中，所述第一交联、第二交联和第三交联的方法各自独立地为加热交联、紫外交联和辐照交联中的至少一种；

可选地，加热交联的条件包括：真空度＜10mbar，温度90℃~120℃，时间为0.5h~24h；

可选地，紫外交联的条件包括：紫外线照射的强度为200nm~300nm波长下70μW/cm²~200μW/cm²，时间5min~60min；

可选地，辐照交联的条件包括：采用电子束或钴60辐照，剂量为5kGY~30kGY。

在其中一个实施例中，所述疏松层浆料的质量浓度为0.6%~1.2%；及/或

所述酸溶液为醋酸的水溶液，浓度为0.005mol/L~0.5mol/L。

在其中一个实施例中，灭菌的方法包括电子束灭菌、钴60灭菌和环氧乙烷灭菌中的至少一种；

可选地，环氧乙烷灭菌的工艺参数包括：预真空度为-30±10kpa，环氧乙烷浓度为6±1kg，灭菌温度为50±5℃，灭菌湿度为50±20%，环氧乙烷作用时间为350±50min，换气真空度为-20±10kpa，换气次数为3~5次，换气时间为20min~40min；

可选地，电子束灭菌的工艺参数包括：剂量为15kGY ~35KGY；

可选地，钴60灭菌的工艺参数包括：剂量为15kGY~35KGY。

在其中一个实施例中，冷冻干燥的程序包括：

1）预冻阶段：降温至-40℃，降温时间为30min~60min，保温30min~120min；

2）抽真空阶段：温度为-40℃，维持时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

3）第一升温阶段：升温至-10℃，升温时间为60min，真空度为0.2bar~0.3bar；

4）第一干燥阶段：温度为-10℃，维持时间为600min，真空度为0.2bar~0.3bar；

5）第二升温阶段：升温至20℃，升温时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

6）第二干燥阶段：温度为20℃，维持时间为240min，真空度为0.2bar~0.3bar；

7）第三升温阶段：升温至30℃，升温时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

8）第三干燥阶段：温度为30℃，维持时间为180min，真空度为0.2bar~0.3bar。

上述复层软组织修复补片，通过采用经交联处理的脱细胞膜片与经交联处理的胶原海绵材料进行复合，其中经交联处理的脱细胞膜片能够调控致密层在接触到疏松层的制备溶液时的溶胀程度，减少因过度溶胀降低结合力以及整体力学性能的情况，经交联处理的胶原海绵材料可以在不改变用量的情况下更容易进入到致密层表面材料的间隙中，进而增加上下层结合力。如此可以综合提升复层软组织修复补片的力学性能，使补片具备可缝合性能，同时胶原海绵材料的稳定存在，能够更好地贴合缺损部位，并使得成纤维细胞更容易进入到补片中，使得缺失部位更容易得到修补和再生。

此外，上述复层软组织修复补片为可缝合、可贴合型，而且具备生物降解和免疫原性低的优点，可以作为外科手术中软组织缺损修复的再生支架。

附图说明

图1为实施例2制备得到的复层软组织修复补片的扫描电子显微镜图；

图2为实施例2制备得到的复层软组织修复补片的植入图；

图3为实施例2制备得到的复层软组织修复补片植入2周时的HE染色切片图；

图4为实施例2制备得到的复层软组织修复补片植入16周时的HE染色切片图；

图5为实施例1中高温交联前后的猪皮脱细胞膜片的膨胀性考察图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本申请的复层软组织修复补片及其制备方法作进一步详细的说明。本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

本文中，“一种或多种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。

本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。

本申请中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。

本申请中的室温一般指4℃~30℃，较佳地指20±5℃。

本申请的一些示例提供一种复层软组织修复补片，包括层叠复合的致密层和疏松层，所述致密层包括经交联处理的脱细胞膜片，所述疏松层包括经交联处理的胶原海绵材料和/或脱细胞膜片材料。

在其中一些示例中，所述经交联处理的胶原海绵材料的孔径为10μm~300μm。具体地，所述经交联处理的胶原海绵材料的孔径包括但不限于：10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm。进一步地，所述经交联处理的胶原海绵材料的孔径为50μm~150μm。

在其中一些示例中，所述经交联处理的脱细胞膜片的厚度为0.05mm~1mm。具体地，所述经交联处理的脱细胞膜片的厚度包括但不限于：0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55mm、0.6mm、0.65mm、0.7mm、0.75mm、0.8mm、0.85mm、0.9mm、0.95mm、1mm。

在其中一些示例中，所述复层软组织修复补片的厚度为2mm~8mm。具体地，述复层软组织修复补片的厚度包括但不限于：2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm。

在其中一些示例中，所述致密层与所述疏松层接触的表面经过粗糙化处理。

另外，不作限制地，所述脱细胞膜片和脱细胞膜片材料可以相同或不同，来源可以为牛胸膜、猪胸膜、牛腹膜、猪腹膜、牛心包膜、猪心包膜、牛肠系膜、猪肠系膜、牛筋膜、猪皮等。

不作限制地，胶原海绵材料可以为冻干胶原海绵，来源可以为牛跟腱、牛皮、猪皮、鼠尾肌腱、鱼皮等制备而成的胶原溶液。

本申请的另外一些示例提供一种复层软组织修复补片的制备方法，包括如下步骤：

取脱细胞膜片进行第一交联，制备经交联处理的脱细胞膜片；

取胶原海绵材料和/或脱细胞膜片材料进行第二交联，然后粉碎，与酸溶液混合，制备疏松层浆料；

将所述疏松层浆料施加至经交联处理的脱细胞膜片的表面，进行冷冻干燥，制备中间体；

将所述中间体进行第三交联，灭菌，制备所述复层软组织修复补片。

可以理解地，该制备方法制备的复层软组织修复补片类似如上所述复层软组织修复补片，具有类似的特征和优点。

在其中一些示例中，将所述疏松层浆料施加至经交联处理的脱细胞膜片的表面之前，还包括对经交联处理的脱细胞膜片的表面进行粗糙化处理的步骤，包括：

将所述经交联处理的脱细胞膜片于溶液中进行浸泡，然后对待进行施加的表面进行粗糙化。对经交联处理的脱细胞膜片的表面进行粗糙处理，有利于提升疏松层浆料的渗入，进一步增加两层复合的结合力。不作限制地，粗糙处理可以采用如钉盘摩擦、钢刷摩擦等。

在其中一些示例中，溶液为水、浓度为0.005mol/L~0.5mol/L的醋酸水溶液或浓度为0.0005mol/L~0.01mol/L的盐酸水溶液。具体地，醋酸水溶液的浓度包括但不限于：0.005mol/L、0.01mol/L、0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L。

不作限制地，所述第一交联、第二交联和第三交联的方法各自独立地为加热交联、紫外交联和辐照交联中的至少一种。

进一步地，通过合理控制脱细胞膜片制备过程中的交联（第一交联）条件，能够有效防止膜片制备过程中溶胀过度，合理控制胶原海绵材料和/或脱细胞膜片材料的交联（第二交联）条件，能够在不改变质量分数的条件下调控浆料的粘度，从而使得浆料更容易进入到致密层粗糙化的缝隙中去，如此综合提升两层间的结合力以及整体的力学性能。

在其中一些示例中，加热交联的条件包括：真空度＜10mbar，温度90℃~120℃，时间为0.5h~24h。具体地，加热交联的温度包括但不限于：90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃。加热交联的时间包括但不限于：0.5h、1h、3h、5h、6h、8h、10h、12h、15h、20h、24h。

在其中一些示例中，紫外交联的条件包括：紫外线照射的强度为200nm~300nm波长下70μW/cm²~200μW/cm²，时间5min~60min。

在其中一些示例中，辐照交联的条件包括：采用电子束或钴60辐照，剂量为5kGY~30kGY。具体地，辐照交联的剂量包括但不限于：5kGY、10kGY、15kGY、20kGY、25kGY、30kGY。

在其中一些示例中，所述疏松层浆料的质量浓度为0.6%~1.2%。具体地，所述疏松层浆料的质量浓度包括但不限于：0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%。

在其中一些示例中，所述酸溶液为醋酸的水溶液，浓度为0.005mol/L~0.5mol/L。具体地，醋酸的水溶液的浓度包括但不限于：0.005mol/L、0.01mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.07mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L。

不作限制地，与酸溶液混合后还包括均质、脱泡等步骤。

不作限制地，将所述疏松层浆料施加至经交联处理的脱细胞膜片的表面的施加方式为涂覆或流延，施加后还可以包括刮平、静置、去除气泡等步骤。

在其中一些示例中，冷冻干燥的程序包括：

1）预冻阶段：降温至-40℃，降温时间为30min~60min，保温30min~120min；

2）抽真空阶段：温度为-40℃，维持时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

3）第一升温阶段：升温至-10℃，升温时间为60min，真空度为0.2bar~0.3bar；

4）第一干燥阶段：温度为-10℃，维持时间为600min，真空度为0.2bar~0.3bar；

5）第二升温阶段：升温至20℃，升温时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

6）第二干燥阶段：温度为20℃，维持时间为240min，真空度为0.2bar~0.3bar；

7）第三升温阶段：升温至30℃，升温时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

8）第三干燥阶段：温度为30℃，维持时间为180min，真空度为0.2bar~0.3bar。

可以理解地，第三交联结束后还包括灭菌步骤。灭菌方式包括但不限于环氧乙烷灭菌、钴60辐照灭菌和电子束辐照灭菌等。

在其中一些示例中，环氧乙烷灭菌的条件包括：预真空度为（-30±10）kpa，环氧乙烷浓度为（6±1）kg，灭菌温度为（50±5）℃，灭菌湿度为（50±20）%，环氧乙烷作用时间为350±50min，换气真空度为（-20±10）kpa，换气次数为3~5次，换气时间为20min~40min。

在其中一些示例中，钴60辐照灭菌和电子束辐照灭菌的剂量为15 kGY ~25 kGY。

可以理解地，由于第三交联和灭菌均可以利用辐照进行，因此两者也可以同步进行。

不作限制地，粉碎的方法包括粉碎机粉碎和裁剪粉碎中的至少一种。

不作限制地，与酸溶液混合后进行溶胀和均质，制备所述疏松层浆料。

以下具体实施例中未写明的实验参数，优先参考本申请文件中给出的指引，还可以参考本领域的实验手册或本领域已知的其它实验方法，或者参考厂商推荐的实验条件。

以下具体实施例中涉及的原料和试剂，可以通过市售得到，或者本领域技术人员能够根据已知手段制备。

实施例中采用的脱细胞膜片来源为猪腹膜或猪皮，不作限制地，制备方法如下：

1)将猪腹膜或猪皮刮除脂肪层，洗净；

2)依次使用饱和氯化钠溶液配置的1mol/L的NaOH溶液和HCl溶液浸泡猪腹膜或猪皮各4h，用以病毒灭活和脱细胞；

3)使用1%的碳酸钠溶液中和膜片酸性，并且使用注射用水清洗膜片至中性；

4)使用50%乙醇、75%乙醇和无水乙醇依次浸泡膜片1h，使得膜片脱水；

5)使用正己烷浸泡膜片24h，并且更换3天，用以除去脂肪；

6)将脱去脂肪的膜片放在超净工作台中干燥12h，而后放入真空干燥箱中继续干燥24h，排出所有有机溶剂，制得猪腹膜脱细胞膜片或猪皮脱细胞膜片。

实施例中采用的胶原海绵材料来源于牛跟腱去端肽胶原，购自深圳兰度生物材料有限公司。

实施例1

本实施例为复层软组织修复补片，制备步骤如下：

（1）致密层制备：

预选择厚度为0.5mm~1mm的猪皮脱细胞膜片，将膜片放入真空干燥箱中，保持真空度＜10mbar，在110℃高温交联6h，作为致密层。

（2）疏松层浆料制备：

将猪皮脱细胞膜片使用15kGY钴60辐照进行交联，然后使用水冷气流粉碎机粉碎成颗粒，用0.01mol/L醋酸水溶液溶胀，配制成1%质量分数的溶液，继续使用匀浆机匀浆，制成疏松层浆料。

（3）复合：

将步骤（1）制备的致密层的粗糙面朝上，使用0.005mol/L醋酸水溶液浸润，并用钉盘摩擦粗糙化后铺平，将步骤（2）的疏松层浆料涂覆于脱细胞膜片的粗糙面上，刮平，浆料厚度为4mm±0.5mm，放入冻干机中冻干，冻干程序如下：

1）预冻阶段：降温至-40℃，降温时间为40min，保温80min；

2）抽真空阶段：温度为-40℃，维持时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

3）第一升温阶段：升温至-10℃，升温时间为60min，真空度为0.2bar~0.3bar；

4）第一干燥阶段：温度为-10℃，维持时间为600min，真空度为0.2bar~0.3bar；

5）第二升温阶段：升温至20℃，升温时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

6）第二干燥阶段：温度为20℃，维持时间为240min，真空度为0.2bar~0.3bar；

7）第三升温阶段：升温至30℃，升温时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

8）第三干燥阶段：温度为30℃，维持时间为180min，真空度为0.2bar~0.3bar。

（4）后处理：

将步骤（3）复合得到的膜片用裁切刀裁切成目标尺寸后，将膜片放入真空干燥箱中，保持真空度＜10mbar，在110℃高温交联6h。而后使用双层吸塑托盘进行包装，并使用电子束对补片进行灭菌，灭菌剂量为15kGY，制得成品复层软组织修复补片。

最终成品复层软组织修复补片的胶原海绵层孔径为50μm~150μm，补片厚度为4mm~5mm。

实施例2

本实施例的复层软组织修复补片制备步骤同实施例1，主要区别在于：

将步骤（1）和（2）中的猪皮脱细胞膜片替换为厚度为0.05mm~0.5mm厚度的猪腹膜脱细胞膜片；

步骤（2）中破碎方式为剪刀裁剪为2cm×2cm的碎片，然后按照1.2%质量分数的比例加入到0.01mol/L的醋酸水溶液溶胀，继续使用匀浆机匀浆，制成疏松层浆料；

步骤（3）中浆料厚度调整为2mm~3mm；

步骤（4）中高温交联参数调整为：保持真空度＜1mbar，在100℃高温交联30min；

灭菌调整为环氧乙烷灭菌，参数为：预真空度为-30kPa，环氧乙烷浓度为6kg，灭菌温度为50℃，灭菌湿度为50%，环氧乙烷作用时间为350min，换气真空度为-20kPa，换气次数为5次，换气时间为30min。

最终成品复层软组织修复补片的胶原海绵层孔径为10μm~100μm，补片厚度为2mm~3.5mm。

实施例3

本实施例的复层软组织修复补片制备步骤同实施例1，主要区别在于：步骤（2）中疏松层浆料制备过程替换如下：

1)将牛跟腱去端肽胶原稀释为1.0%质量分数的溶液，并且倒入模具中冻干；

2)将冻干后的海绵放入真空干燥箱中，保持真空度＜10mbar，在110℃高温交联12h；

3)将高温交联后的海绵使用水冷气流粉碎机粉碎成颗粒；

4)将颗粒使用0.01mol/L醋酸水溶液溶胀，配制成0.8%质量分数的溶液，继续使用匀浆机匀浆，制成疏松层浆料，与脱细胞膜片层进行复合，浆料厚度控制在6mm±1mm。

最终制得的复层软组织修复补片的胶原海绵层孔径为50μm~150μm，补片厚度为5mm~7mm。

测试例：

（1）防渗漏性：将实施例1~实施例3制备的补片（10cm*10cm规格）在新鲜（无抗凝剂）的血液中充分浸润，使用夹具夹住，保证周边密封性，夹具上方为一开口容器，底部放置一个烧杯，往上方容器中加入10mL纯水，观察补片的防渗漏性。结果显示，补片5min内均不会发生渗漏，没有水通过补片进入到下方烧杯中，说明膜片能够作为有效屏障，减少体液外漏。

（2）将实施例1~实施例3制备的补片裁成长条形状(10mm25mm)，在离短边边缘3mm处用4-0号缝合线穿过样品，对折缝合线，在距离穿孔处约5cm处将缝合线打结，防止缝合线脱落。吸水饱和后，将样品未穿线一端和缝合线一端分别固定在万能力学试验机上（厂家：美特斯，型号CMT 6103），拉伸速度100mm/min，直至样品被撕裂，取拉伸负荷的最大值为本产品撕裂力。最终结果取3片产品撕裂力的平均值，实施例1~实施例3制备的补片结果分别为3.85±0.42N、2.94±0.65N、5.09±0.38N。

（3）将实施例1~实施例3制备的补片按GB/T 528-2009 中2型试样进行制样，在万能力学试验机（厂家：美特斯，型号CMT 6103）上进行测试，拉伸速度500mm/min±50mm/min，直至产品被撕裂，取拉伸负荷的最大力为本产品拉伸强度，实施例1~实施例3制备的补片检测结果为3.0935±1.0578N、2.0721±0.1114N、3.0328±0.2884N。

（4）将实施例1~实施例3制备的补片按照YY/T 0500-2021中A.5.3.5规定的方法进行检验，在胀破强度仪（厂家：美邦仪器，型号YG032E）上进行测试，实施例1~实施例3制备的补片顶破强度检测结果为：83.6kPa、83.2kPa、145.1kPa。

（5）将实施例1~实施例3制备的补片剪成约5mm25mm（小规格产品剪成相同面积）的碎片，按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1143 中方法1规定的方法进行检验。结果显示实施例1~实施例3制备的补片细菌内毒素为阴性。

（6）将实施例2制备的补片以纵截面为观察面，切割为1mm厚的样品，喷金180s，使用日立扫描电子显微镜（型号TM3030）检测，结果如图1所示。可见，海绵层和致密层间无明显间隙，结合紧密。

（7）动物有效性试验

制备兔子颅骨缺损（12mm~15mm直径），并且在颅骨缺损中心使用显微剪剪出8mm直径的硬脑膜，将实施例2制备的补片切割成直径12mm的圆片覆盖脑膜缺损，而后缝合一次缝合伤口，植入过程如图2所示。

术后1周、2周观察，兔子无术区渗液、头部倾斜、畏光、颅穹肿胀等脑脊液漏的症状。

术后2周、4周、8周、12周和16周分批次取材并进行HE染色切片观察，可见，手术位点均未出现明显脑脊液漏，且补片的海绵层较快长入成纤维细胞并且随着时间的延长而逐渐被再生组织所取代。术后2周和16周的结果如图3和图4所示，图3可见，手术位点没有显著炎症，且少量细胞长入补片中，图4可见，补片已经基本上完全降解，并且被新生组织所替代。

考察例：

（1）膨胀性：

比较实施例1制备致密层的过程中，高温交联前后的猪皮脱细胞膜片的膨胀性，结果如图5所示。可见，（a）为高温交联前猪皮脱细胞膜片，（b）为高温交联后猪皮脱细胞膜片，二者同时浸泡于0.01mol/L醋酸水溶液30min后厚度对比，经过高温交联后的膜片能够很好的维持原有厚度，保证其力学性能。

（2）浆料粘度：

按照实施例1制备疏松层浆料（猪皮脱细胞膜片，均质后质量分数为1%）的步骤进行不同条件交联以及未交联的浆料制备，并进行粘度测试（粘度计，BROOKFIELD公司，型号RVDV-2T），结果如下表1所示。可见，交联后能够明显降低浆料的粘度，更有利于对致密层的渗入，提升结合力和整体力学性能。

表1

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种复层软组织修复补片，其特征在于，包括层叠复合的致密层和疏松层，所述致密层包括经交联处理的脱细胞膜片，所述疏松层包括经交联处理的胶原海绵材料和/或脱细胞膜片材料。

2.根据权利要求1所述的复层软组织修复补片，其特征在于，所述经交联处理的胶原海绵材料的孔径为10μm~300μm；

可选地，所述经交联处理的胶原海绵材料的孔径为50μm~150μm。

3.根据权利要求1所述的复层软组织修复补片，其特征在于，所述经交联处理的脱细胞膜片的厚度为0.05mm~1mm。

4.根据权利要求1~3任一项所述的复层软组织修复补片，其特征在于，所述复层软组织修复补片的厚度为2mm~8mm。

5.根据权利要求1~3任一项所述的复层软组织修复补片，其特征在于，所述致密层与所述疏松层接触的表面经过粗糙化处理。

6.一种复层软组织修复补片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

取脱细胞膜片进行第一交联，制备经交联处理的脱细胞膜片；

取胶原海绵材料和/或脱细胞膜片材料进行第二交联，然后粉碎，与酸溶液混合，制备疏松层浆料；

将所述疏松层浆料施加至经交联处理的脱细胞膜片的表面，进行冷冻干燥，制备中间体；

将所述中间体进行第三交联，灭菌，制备所述复层软组织修复补片。

7.根据权利要求6所述的复层软组织修复补片的制备方法，其特征在于，将所述疏松层浆料施加至经交联处理的脱细胞膜片的表面之前，还包括对经交联处理的脱细胞膜片的表面进行粗糙化处理的步骤，包括：

将所述经交联处理的脱细胞膜片于溶液中进行浸泡，然后对待进行施加的表面进行粗糙化；

可选地，溶液为水、浓度为0.005mol/L~0.5mol/L的醋酸水溶液或浓度为0.0005mol/L~0.01mol/L的盐酸水溶液。

8.根据权利要求6或7所述的复层软组织修复补片的制备方法，其特征在于，所述第一交联、第二交联和第三交联的方法各自独立地为加热交联、紫外交联和辐照交联中的至少一种；

可选地，加热交联的条件包括：真空度＜10mbar，温度90℃~120℃，时间为0.5h~24h；

可选地，紫外交联的条件包括：紫外线照射的强度为200nm~300nm波长下70μW/cm²~200μW/cm²，时间5min~60min；

可选地，辐照交联的条件包括：采用电子束或钴60辐照，剂量为5kGY~30kGY。

9.根据权利要求6或7所述的复层软组织修复补片的制备方法，其特征在于，所述疏松层浆料的质量浓度为0.6%~1.2%；及/或

所述酸溶液为醋酸的水溶液，浓度为0.005mol/L~0.5mol/L。

10.根据权利要求6或7所述的复层软组织修复补片的制备方法，其特征在于，具有如下所示特征中的至少一项：

（1）灭菌的方法包括电子束灭菌、钴60灭菌和环氧乙烷灭菌中的至少一种；

可选地，环氧乙烷灭菌的条件包括：预真空度为-30±10kpa，环氧乙烷浓度为6±1kg，灭菌温度为50±5℃，灭菌湿度为50±20%，环氧乙烷作用时间为350±50min，换气真空度为-20±10kpa，换气次数为3~5次，换气时间为20min~40min；

可选地，钴60辐照灭菌和电子束辐照灭菌的剂量为15kGY~35kGY；

（2）冷冻干燥的程序包括：

1）预冻阶段：降温至-40℃，降温时间为30min~60min，保温30min~120min；

2）抽真空阶段：温度为-40℃，维持时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

3）第一升温阶段：升温至-10℃，升温时间为60min，真空度为0.2bar~0.3bar；

4）第一干燥阶段：温度为-10℃，维持时间为600min，真空度为0.2bar~0.3bar；

5）第二升温阶段：升温至20℃，升温时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

6）第二干燥阶段：温度为20℃，维持时间为240min，真空度为0.2bar~0.3bar；

7）第三升温阶段：升温至30℃，升温时间为30min，真空度为0.2bar~0.3bar；

8）第三干燥阶段：温度为30℃，维持时间为180min，真空度为0.2bar~0.3bar。