CN117771344A - 西曲瑞克的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西曲瑞克的新应用，西曲瑞克能够靶向N‑乙酰葡萄糖胺激酶并提高N‑乙酰葡萄糖胺激酶的活性，还能够降低脑缺血再灌注诱导的小鼠脑梗死体积，缓解神经功能障碍，减轻脑组织病理损伤，同时改善血脑屏障功能紊乱，作为N‑乙酰葡萄糖胺激酶激动药物在预防或/和治疗脑缺血再灌注损伤的药物中具有良好应用前景。

Description

西曲瑞克的应用

技术领域

本发明涉及一种西曲瑞克的应用，尤其涉及一种西曲瑞克作为N-乙酰葡萄糖胺激酶激动剂药物的应用。

背景技术

脑卒中(Stroke)是严重危害人类健康和生命安全的常见难治性疾病，根据发病特征主要分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中是最常见的卒中类型，具有高发病率、高复发率、高致死率和高致残率等特点。目前，临床所用的治疗药物如阿替普酶的治疗时间窗狭窄(至多4.5h)，存在引起脑出血的潜在风险。缺血性脑卒中病理机制复杂，脑缺血再灌注(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)发生过程中涉及诸多病理环节，主要包括氧化应激反应、炎症反应、血脑屏障破坏、兴奋性氨毒性、钙超载以及细胞凋亡等，各个环节之间相互作用、相互影响。其中血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)的破坏是脑缺血再灌注损伤早期的重要病理特征，其会使细胞旁通透性增加，脑水肿严重，进一步加剧神经功能损伤。因此，基于BBB早期通透性变化病理过程，寻找保护内皮屏障的潜在靶点和药物可为脑缺血再灌注损伤的防治提供新策略。

在脑卒中的发病过程中，相关代谢物及其调控酶发挥着不可替代的作用，N-乙酰葡萄糖胺(N-acetlyglucosamine，GlcNAc)代谢物在大脑中动脉闭塞再灌注(Middlecerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)模型小鼠和临床脑中风患者血清中显著升高，并确证GlcNAc可促进缺糖缺氧再复灌诱导的脑微血管内皮细胞焦亡。N-乙酰葡萄糖胺激酶(N-acetylglucosamine kinase，NAGK)是代谢物GlcNAc的关键调控酶，在哺乳动物中普遍存在，在几乎所有的组织中都检测到了NAGK mRNA和酶活性。研究表明，NAGK能够调节细胞分裂，影响神经元发育，且与动力蛋白轻链(DYNLRB1)相互作用有效抑制小鼠脑细胞中亨廷顿蛋白和α-突触核蛋白聚集，抑制ROS的产生，维持线粒体的正常形态，缓解神经退行性疾病。研究发现，NAGK在MCAO/R模型小鼠中的表达显著下降，采用腺相关病毒脑原位过表达NAGK，可降低MCAO/R诱导的小鼠脑组织中GlcNAc含量以及LDH的释放，从而改善脑组织病理损伤，发挥显著的脑保护作用，提示靶向NAGK的激动剂是治疗脑缺血再灌注损伤的潜在药物，然而目前缺乏该类激动剂的发现和报道。

虽然目前全球在缺血性脑卒中的病理机制和诊断方面已经取得了很大的进步，但仍缺乏特效治疗药物。目前治疗急性缺血性脑卒中的手段主要为t-PA溶栓治疗，但它会引起再灌注损伤，进一步加重脑损伤，相关治疗药物仍处于非常紧缺的状态。而血脑屏障是脑缺血再灌注发生后关键的病理始动环节。故基于血脑屏障早期通透性变化病理过程，寻找保护内皮屏障的药物可为脑缺血再灌注损伤的防治提供新策略，具有广阔的市场空间。

发明内容

发明目的：本发明旨在提供一种西曲瑞克作为N-乙酰葡萄糖胺激酶激动剂药物的应用。

技术方案：本发明所述的西曲瑞克应用于制备预防或/和治疗脑血管疾病、神经退行性疾病的药物中。

优选，所述药物为预防或/和治疗脑卒中的药物。

进一步优选，所述药物为预防或/和治疗缺血性脑卒中的药物。

更进一步优选，所述药物为预防或/和治疗脑缺血再灌注损伤的药物。

再进一步优选，所述药物能够减少脑梗死体积，缓解神经功能障碍，改善脑组织损伤；能够上调脑组织中紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin)的表达水平；能够下调金属基质蛋白酶(MMP-9和MMP-2)的表达水平。

优选，所述药物为N-乙酰葡萄糖胺激酶激动剂药物。

进一步优选，所述药物能够提高N-乙酰葡萄糖胺激酶活性或/和表达水平，改善血脑屏障功能紊乱。

本发明通过检索DrugBank药物数据库，筛选发现得分最高的上市药物西曲瑞克(Cetrorelix acetate,CTX)，通过分子对接技术发现西曲瑞克与N-乙酰葡萄糖胺激酶之间具有较好的结合能，并采用N-乙酰葡萄糖胺激酶试剂盒检测西曲瑞克对N-乙酰葡萄糖胺激酶的激动作用，最后采用MST技术验证了西曲瑞克能够与N-乙酰葡萄糖胺激酶相结合。在体内采用MCAO/R模型小鼠，发现西曲瑞克能够通过提高N-乙酰葡萄糖胺激酶活性及表达水平，改善血脑屏障功能紊乱，从而减轻脑缺血再灌注损伤。本发明为NAGK的靶向激动剂西曲瑞克的发现及该激动剂在制备治疗脑缺血性再灌注损伤药物中的应用提供了重要参考依据和数据支撑。

本发明所述的西曲瑞克的药学上可接受的盐也能够应用于上述场景，药学上可接受的盐为西曲瑞克与选自如下任一的酸形成的盐：

盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、碳酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸、杏仁酸、阿魏酸。

“药学上可接受的盐”是指化合物的盐，由具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当化合物中含有相对酸性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的游离体形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的游离体形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸(形成碳酸盐或碳酸氢盐)、磷酸(形成磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、硫酸(形成硫酸盐或硫酸氢盐)、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；有机酸盐还包括氨基酸(如精氨酸等)、葡糖醛酸等有机酸的盐。当某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的游离体形式。化合物的游离体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。

“药学上可接受的盐”可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。

本发明所述的以西曲瑞克作为活性成分的药物组合应用于制备预防或/和治疗脑缺血再灌注损伤的药物中。

所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

“药学上可接受的载体”可为药物生产领域中广泛采用的辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望的速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体pH值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可以包括下列辅料中的一种或多种：粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂、填充剂、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。

本发明所述的药物组合物可根据公开的内容使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋或冻干工艺。

本发明所述的药物组合物可以任何形式给药，包括注射(静脉内)、粘膜、口服(固体和液体制剂)、吸入、眼部、直肠、局部或胃肠外(输注、注射、植入、皮下、静脉内、动脉内、肌内)给药。本发明的药物组合物还可以是控释或缓释剂型(例如脂质体或微球)。固体口服制剂的实例包括但不限于粉末、胶囊、囊片、软胶囊剂和片剂。口服或粘膜给药的液体制剂实例包括但不限于悬浮液、乳液、酏剂和溶液。局部用制剂的实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药的制剂实例包括但不限于注射用溶液、可以溶解或悬浮在药学上可接受载体中的干粉制剂、注射用悬浮液和注射用乳剂。所述的药物组合物的其它合适制剂的实例包括但不限于滴眼液和其他眼科制剂；气雾剂，如鼻腔喷雾剂或吸入剂；适于胃肠外给药的液体剂型；栓剂以及锭剂。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

西曲瑞克能够靶向N-乙酰葡萄糖胺激酶并提高N-乙酰葡萄糖胺激酶的活性，还能够降低脑缺血再灌注诱导的小鼠脑梗死体积，缓解神经功能障碍，减轻脑组织病理损伤，同时改善血脑屏障功能紊乱，作为N-乙酰葡萄糖胺激酶激动药物在预防或/和治疗脑缺血再灌注损伤的药物中具有良好应用前景。

附图说明

图1为西曲瑞克与NAGK的对接结果；

图2为体外检测西曲瑞克对N-乙酰葡萄糖胺激酶活性的激动作用结果；

图3为MST检测西曲瑞克与N-乙酰葡萄糖胺激酶的相互作用结果；

图4为西曲瑞克减小MCAO/R模型小鼠的脑梗死体积的结果(mean±SD，n＝6，^##P＜0.01vs.Sham group，**P＜0.01vs.Model group)；

图5为西曲瑞克改善MCAO/R模型小鼠脑组织病理损伤以及神经功能损伤的结果(mean±SD，n＝3-6，^##P＜0.01vs.Sham group，**P＜0.01vs.Model group)；

图6为西曲瑞克减少MCAO/R模型小鼠脑组织中伊文思蓝的渗漏量的结果(mean±SD，n＝6，^##P＜0.01vs.Sham group，**P＜0.01vs.Model group)；

图7为西曲瑞克增加MCAO/R模型小鼠脑组织中紧密连接蛋白的表达(mean±SD，n＝3，^##P＜0.01vs.Sham group，**P＜0.01vs.Model group)；

图8为西曲瑞克降低MCAO/R模型小鼠脑组织中金属基质蛋白酶MMP-2/9的表达结果(mean±SD，n＝3，^##P＜0.01vs.Sham group，**P＜0.01vs.Model group)；

图9为激动剂西曲瑞克对MCAO/R模型小鼠脑组织中NAGK蛋白水平和基因水平的影响结构(小鼠缺血1h，再灌注24h后，图A：采用Westernblotting技术检测小鼠脑组织中NAGK蛋白水平的表达情况(n＝6)；图B：采用q-PCR检测NAGK mRNA表达水平(n＝6)；结果以mean±SD表示，^##P＜0.01vs.Sham group，**P＜0.01vs.Model group)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：N-乙酰葡萄糖胺激酶激动剂的遴选与初步验证

1、基于DrugBank药物数据库对NAGK的激动剂进行筛选

从DrugBank药物数据库中对NAGK相关的激动剂进行挖掘。重点初步预测激动NAGK作用的潜在上市药物约1800多种，排除已在脑卒中领域报道过及毒副作用较大的药物外，按得分高低顺序分类列出极具代表性的重要上市药物(前50种)，但不限含有类似结构的药物，筛选结果如表1所示，遴选出得分最高的上市药物是西曲瑞克，提示其可能是NAGK的激动剂，拟通过体内外实验进行验证。

表1.利用DrugBank药物数据库预测出NAGK激动剂的相关上市药物

2、基于分子对接技术的结合自由能分析

从初步筛选得到的上市药物中选取得分最高的代表即西曲瑞克与靶蛋白NAGK进行分子对接，计算分子间结合自由能及具体结合部位，AutoDock 4.1软件将西曲瑞克与NAGK进行对接，PyMol软件进行可视化分析。其中NAGK与西曲瑞克的对接结果如图1所示，结合自由能为-10.3kcal/mol，可见得分最高的上市药物西曲瑞克与NAGK的结合能＜-5kcal/mol，说明从DrugBank数据库筛选得到的激动剂西曲瑞克能够与NAGK较稳定地结合。

3、体外检测N-乙酰葡萄糖胺激酶激动剂西曲瑞克对酶活性的影响

图2在体外检测西曲瑞克对N-乙酰葡萄糖胺激酶活性的影响，结果显示，西曲瑞克对N-乙酰葡萄糖胺激酶的活性存在直接的激动作用，其中IC₅₀为2.279μmol/L。进一步提示西曲瑞克可能是N-乙酰葡萄糖胺激酶的直接激动剂。

4、MST技术检测西曲瑞克与N-乙酰葡萄糖胺激酶的相互作用

首先使用Monolith^TM RED-NHS二代蛋白标记试剂盒标记N-乙酰葡萄糖胺激酶重组蛋白，运用MST技术考察西曲瑞克与N-乙酰葡萄糖胺激酶的结合能力。结果如图3所示，Kd值为413.61±84.87nM，表明西曲瑞克能与N-乙酰葡萄糖胺激酶相互作用，进一步证实西曲瑞克能与N-乙酰葡萄糖胺激酶相结合。

实施例2：西曲瑞克对脑缺血再灌注诱导的模型小鼠脑损伤的改善作用

1、实验方法

(1)小鼠大脑中动脉阻塞及复灌的动物模型制备

参照依据文献建立的小鼠大脑中动脉阻塞及复灌(Middle cerebral arteryocclusion/reperfusion，MCAO/R)模型，采用线栓法制备，选择C57雄性小鼠，体重在20-22g之间。小鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠，麻醉后，仰卧位固定，颈部中线切口。分离并暴露右侧的颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，依次在颈总动脉近心端预留结扎线，远心端结扎颈外动脉，并游离颈外动脉远端。沿颈内动脉向深部游离一段颈内动脉，于颈外动脉近心端预留结扎线。采用小型无创血管夹夹闭近心端颈总动脉及远端颈内动脉，于颈外动脉远心端用显微剪刀剪一小口，插入线栓通过颈总动脉分叉，进入颈内动脉。插入线段直至遇到轻微阻力，此时线段头端插入大脑前动脉约1mm。插线结束后，将预先放置于颈外动脉的结扎线缚紧。MCAO 60min后，分离暴露颈外动脉，松开固定线，拔除线栓，松开颈总和动脉结扎线实现再灌注，常规缝合颈部伤口。手术过程中动物肛温保持在37℃，术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒中自由饮水、进食。

建立MCAO/R模型后，动物分为假手术组(Sham组)、模型组、模型给药组(MCAO/R+西曲瑞克10mg/kg)、阳性对照组(尤瑞克林0.0025PNA/kg)，除假手术组不插入线栓外，其余处理同其他组。再灌注同时腹腔注射给药，假手术组和模型组腹腔注射生理盐水。24h后进行行为学评价，取脑收集样本。

(2)西曲瑞克溶液的制备和给药方法

将醋酸西曲瑞克制备为治疗缺血性脑卒中的药物的方法：首先将醋酸西曲瑞克粉末溶解于生理盐水中制备得20mg/kg的醋酸西曲瑞克溶液，然后再加入生理盐水稀释得到10mg/kg的给药剂量。

(3)TTC染色测定脑梗死体积

小鼠脑缺血再灌注24h后，处死取脑，放入-20℃冰箱至脑组织完全冻住，然后在冰盒上将冻好的脑组织切成5片厚约2mm的冠状脑切片，迅速将切好的脑片放入1％2,3,5-三苯基四唑氯铵(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液中，注意朝一个方向放置脑片。随后，在37℃孵箱中避光孵育30min。置于黑色纸板上拍照传入电脑，采用Image J图像分析软件测量脑梗死体积。计算公式如下：

梗死体积百分比＝右半脑梗死体积/脑总体积×100％

(4)神经行为学评分

神经功能障碍是缺血性脑卒中损伤评价的重要指标之一。小鼠缺血再灌注24h后，按照Longa神经功能评分考察神经功能障碍行为学，将神经功能损伤分为5个等级：0分：正常，无神经功能缺损；1分：右侧(瘫痪侧)前爪不能完全伸展，但行走时无明显转圈，轻微神经功能缺损；2分：小鼠向右测转圈，行走缓慢，中度神经功能缺损；3分：小鼠身体向右侧倾倒，缓慢转小圈，重度神经功能缺损；4分：不能自发行走，意识丧失。

(5)苏木精-伊红染色法

再灌注24h后将各组小鼠处死，取脑，用4％多聚甲醛固定24h以上，进行石蜡包埋、切片，H&E染色，随后用数字病理切片扫描仪扫描观察并拍照，考察脑组织的病理损伤情况。

2、实验结果

(1)西曲瑞克减少MCAO/R模型小鼠脑梗死体积

如图4(A)所示，Sham组小鼠脑组织呈红色，未见明显梗死区域。MCAO/R组小鼠缺血侧有严重的白色梗死灶，MCAO/R+西曲瑞克(10mg/kg)组与尤瑞克林(HUK)给药组小鼠右脑的梗死区域显著减小。图4(B)为各组脑梗死体积半定量图。经统计，与Sham组相比，MCAO/R模型组小鼠的脑梗死体积显著增加。而与MCAO/R模型组相比，MCAO/R+西曲瑞克(10mg/kg)组与尤瑞克林(HUK)给药组小鼠的脑梗死体积在给药后显著减少。

(2)西曲瑞克改善MCAO/R模型小鼠脑组织病理损伤以及神经功能损伤

如图5(A)所示，相较于Sham组，MCAO/R组小鼠脑组织出现空泡化、细胞核发生固缩、神经细胞数量减少，血管周围腔隙增宽。而给药后，西曲瑞克治疗组(10mg/kg)小鼠脑组织相较于MCAO/R组损伤明显减轻。如图5(B)所示，Sham组小鼠未出现明显神经功能损伤，与Sham组相比，MCAO/R组小鼠神经功能学评分明显升高。与MCAO/R组相比，缺血后给予西曲瑞克(10mg/kg)，能够明显减少模型小鼠神经功能损伤。

实施例3：西曲瑞克改善脑缺血再灌注诱导的模型小鼠血脑屏障功能紊乱

1、实验方法

(1)伊文思蓝检测小鼠血脑屏障通透性

利用尾静脉注射伊文思蓝的方法，考察微血管的渗出性。MCAO/R造模22h后，各组小鼠尾静脉注射2％伊文思蓝溶液，循环2h后，小鼠心脏灌注1×PBS至血液冲净，取出完整大脑，拍照。取大脑右半球(缺血侧大脑)，于生理盐水中洗去残留血丝，用滤纸适当吸干并称重，预冷的甲酰胺和脑组织按1mL：0.1g的比例进行匀浆，移至1.5mL EP中，离心机预冷到4℃，转速13000r/min，离心20min，取上清液，在620nm波长处测定吸光度，最后根据标准曲线计算含量。

(2)Western blotting技术检测小鼠脑组织中紧密连接蛋白和金属基质蛋白酶的表达量

各组小鼠于脑缺血再灌注手术后24h处死，1×PBS缓冲溶液进行心脏灌注，取脑，于生理盐水中洗去残留血丝，取缺血半暗带脑组织进行蛋白质免疫印迹，分析各组ZO-1、Occludin、MMP-9、MMP-2表达量。

组织蛋白提取方法：各组小鼠MCAO/R 24h后，断头处死，取缺血侧皮层固体组织0.1g提取蛋白，加入组织裂解液匀浆，于4℃条件下裂解30min。在4℃离心机中13000rpm离心10min，取上清液，测定蛋白含量。剩余的上清液加入5ⅹloading buffer，蛋白变性后，分别上样于10％SDS-PAGE凝胶中进行分析。湿法转膜后的条带孵育对应的一抗过夜，然后孵育对应的二抗，最后利用ECL试剂盒显影，采用凝胶成像仪进行条带曝光，目标蛋白表达量表示为相应内参蛋白表达量的相对值。

2、实验结果

(1)西曲瑞克减少脑缺血再灌注诱导的小鼠脑组织中伊文思蓝的渗漏量

图6(A-B)所示，与Sham组相比，MCAO/R组小鼠脑组织伊文思蓝渗漏明显。与MCAO/R组相比，MCAO/R+西曲瑞克(10mg/kg)组和HUK组明显降低MCAO/R后小鼠脑组织伊文思蓝的渗漏。结果表明，西曲瑞克能减少脑缺血再灌注诱导的小鼠脑组织中血脑屏障的损伤。

(2)西曲瑞克增加MCAO/R模型小鼠脑组织中紧密连接蛋白的表达

紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的降解是脑缺血后血脑屏障损伤的重要病理环节，同时也是血脑屏障结构重要的组成部分。如图7(A-B)所示，相较Sham组，MCAO/R组ZO-1和Occludin的表达明显降低。而给药后，西曲瑞克治疗组(10mg/kg)使ZO-1和Occludin的表达显著增加。结果表明，西曲瑞克对MCAO/R模型小鼠的血脑屏障功能紊乱具有改善作用。

(3)西曲瑞克降低MCAO/R模型小鼠脑组织中金属基质蛋白酶的表达

MMP-2/9是脑缺血再灌注发生后促进紧密连接蛋白以及细胞基底膜降解的关键分子，同时也是参与炎症反应的重要因子。如图8(A-B)所示，相较于Sham组，MCAO/R组脑组织中MMP-2和MMP-9的表达水平明显升高。而给药后，西曲瑞克治疗组(10mg/kg)能够显著降低脑组织中MMP-2/9的表达水平。结果表明，西曲瑞克对MCAO/R模型小鼠的血脑屏障功能紊乱具有改善作用。

实施例4：激动剂西曲瑞克对MCAO/R诱导小鼠脑组织中NAGK表达的影响

1、实验方法

(1)Westernblotting技术检测小鼠脑组织中NAGK的表达量

建立MCAO/R模型后，动物分为假手术组(Sham组)、模型组、假手术+给药组(Sham+西曲瑞克10mg/kg)、模型+给药组(MCAO/R+西曲瑞克10mg/kg)，除假手术组和假手术+给药组不插入线栓外，其余处理同其他组。各组小鼠于脑缺血再灌注手术后24h处死，1×PBS缓冲溶液进行心脏灌注，取脑，于生理盐水中洗去残留血丝，取缺血半暗带脑组织进行蛋白质免疫印迹，分析各组小鼠脑组织中NAGK的表达水平。

组织蛋白提取方法：各组小鼠MCAO/R24 h后，断头处死，取缺血侧皮层固体组织0.1g提取蛋白，加入组织裂解液匀浆，于4℃条件下裂解30min。在4℃离心机中13000rpm离心10min，取上清液，测定蛋白含量。剩余的上清液加入5ⅹloadingbuffer，蛋白变性后，分别上样于10％SDS-PAGE凝胶中进行分析。湿法转膜后的条带孵育对应的一抗过夜，然后孵育对应的二抗，最后利用ECL试剂盒显影，采用凝胶成像仪进行条带曝光，目标蛋白表达量表示为相应内参蛋白表达量的相对值。

(2)q-PCR技术检测小鼠脑组织中NAGK基因的表达量

①RNA提取与纯化

将各组脑组织放入液氮，称取0.1g右侧大脑组织，在2mL无酶管中加入1mLTrizol，采用研磨机进行研磨，加入氯仿200μL，剧烈震荡15s成乳浊液，静置5min，然后离心(4℃，12000rpm，15min)。转移上层水相(约450μL)到1.5ml的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，静置10min，离心(4℃，12000rpm，10min)。弃上清液，加预冷的75％乙醇1ml，涡旋，离心(4℃，12000rpm，5min)。弃上清并将残余乙醇挥发，加入20μL的DEPC水溶解RNA沉淀，以上步骤均在冰盒上操作，使用Nano-100微量核酸检测仪测定RNA浓度。

②逆转录反应以及qRT-PCR

根据说明书操作采用1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，最后采用ChamQTM/>qPCR MasterMix进行实时荧光定量PCR。PCR的扩增参数为：95℃下5min，激活DNA聚合酶，变性，95℃(10s)；退火，60℃(30s)，共进行39次循环。反应结束后，查看引物和目的基因的扩增曲线以及融解曲线(65℃、0.05s，95℃、0.5s)。通过计算/>值来表示目的基因NAGK mRNA表达进行相对定量。基因表达归一化为β-actin，在单独的试管中进行评估，以便定量靶基因。其中Ct值为循环次数的平均值，ΔCt为目的基因Ct值减去内参基因β-actin Ct值。本实验中使用的引物如下：NAGK前引：CACGGTCCAAAGTCCTTTTACT后引：GTCTGTGCCAATCAGCCAGT；β-actin前引：GGCTGTATTCCCCTCCATCG后引：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT。

2、实验结果

采用Western blotting技术考察西曲瑞克对小鼠脑缺血再灌注后脑组织中NAGK表达的影响，如图9(A)所示，MCAO/R组相较于Sham组，脑组织中NAGK表达显著降低，经统计，与Sham组相比，具有显著性差异(P＜0.01)。缺血后给予西曲瑞克(10mg/kg)可促进脑组织中NAGK的表达，经统计，与MCAO/R组相比，具有显著性差异(P＜0.01)。与Sham组相比，Sham+CTX组对NAGK的表达没有显著性差异。采用q-PCR检测MCAO/R小鼠脑组织中NAGK mRNA的表达，如图9(B)所示，MCAO/R组相较于Sham组，脑组织中NAGK mRNA表达显著降低，经统计，与Sham组相比，具有显著性差异(P＜0.01)。缺血后给予西曲瑞克(10mg/kg)可促进脑组织中NAGK mRNA的表达，经统计，与MCAO/R组相比，具有显著性差异(P＜0.01)。与Sham组相比，Sham+CTX组对NAGK mRNA的表达没有显著性差异。上述结果说明，西曲瑞克能够显著地增加MCAO/R模型小鼠脑组织中NAGK的表达水平。

Claims (10)

1.西曲瑞克在制备预防或/和治疗脑血管疾病、神经退行性疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物预防或/和治疗脑卒中的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为预防或/和治疗缺血性脑卒中的药物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为预防或/和治疗脑缺血再灌注损伤的药物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为N-乙酰葡萄糖胺激酶激动剂药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物能够提高N-乙酰葡萄糖胺激酶活性或/和表达水平，改善血脑屏障功能紊乱。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物能够减少脑梗死体积，缓解神经功能障碍，改善脑组织损伤。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物能够上调脑组织中紧密连接蛋白的表达水平。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物能够下调金属基质蛋白酶的表达水平。

10.一种以西曲瑞克作为活性成分的药物组合在制备预防或/和治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。