CN117769430A - 药物可调控的转录阻遏物 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于药物调控的转录阻遏的嵌合多肽。还提供了抑制感兴趣的基因的阻遏的方法。本文提供了一种嵌合多肽，其包含(i)诱导型转录调节因子(ITM)，其中所述ITM包含转录阻遏物结构域和DNA结合结构域；和(ii)降解决定子，其中所述降解决定子可操作地连接至ITM。本文描述的嵌合多肽通过抑制响应于小分子药物的转录阻遏来提供可逆的遗传开启开关。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月6日提交的美国临时申请第63/171,551号的权益，所述临时申请特此通过引用整体并入用于所有目的。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经由EFS-Web提交并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于20XX年XX月XX日，命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，大小为X,XXX,XXX字节。
背景技术
当前可用的细胞和基因疗法产品可能缺乏表达控制，这可能导致安全性问题，诸如在接受此类疗法的受试者中产生毒性。因此，这些疗法需要表达控制和调控的额外方法。
发明内容
本文提供了嵌合多肽，其包含(i)诱导型转录调节因子(ITM)，其中ITM包含转录阻遏物结构域和DNA结合结构域；和(ii)降解决定子，其中降解决定子可操作地连接至ITM。在一些方面，转录阻遏物结构域选自由以下组成的组：KRAB阻遏结构域、HDAC4结构域、SCXHLH结构域、ID1 HLH结构域、HERC2 Cyt-b5结构域、TWST1 HLH结构域、NKX22同源结构域、ID3 HLH结构域和TWST2 HLH结构域。
本文描述的嵌合多肽通过抑制响应于小分子药物的转录阻遏来提供可逆的遗传开启开关。
在一些方面，其中嵌合多肽的转录阻遏物结构域包含KRAB阻遏结构域。在一些方面，KRAB阻遏结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些方面，KRAB阻遏结构域包括minKRAB。在一些方面，KRAB阻遏结构域是SEQ ID NO:2的KRAB阻遏物结构域变体，并且包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：W27L、K28L、D31A、T32A、Q34A、Q35A、R39E、L43S、T57C、K58C、P59C、V61Y、I62Y、I62A、L63W、L63Y、L63E、R64F、R64W、R64E、L65F、L65E、L65W、E66V、K67F、G68F和E69Fv。在一些方面，KRAB阻遏结构域是SEQ ID NO:2的KRAB阻遏物结构域变体，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸取代：Q34A/Q35A、I62A、T57C/K58C/P59C、D31A/T32A、L63W/R64W/L65W、E66V、L63E/R64E/L65E、R64F/L65F、W27L/K28LKRAB、R39E、K67F/G68F/E69F和V61Y/I62Y/L63Y。
在一些方面，KRAB阻遏结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些方面，转录阻遏物结构域包含HDAC4阻遏结构域。在一些方面，HDAC4阻遏结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些方面，嵌合多肽的DNA结合结构域包含锌指(ZF)蛋白结构域。在一些方面，ZF蛋白结构域在设计上是模块化的，并且由锌指阵列(ZFA)构成。在一些方面，ZF蛋白结构域包含一至十个ZFA。在一些方面，ZF蛋白结构域包含十个ZFA。
在一些方面，转录阻遏物结构域在DNA结合结构域的N末端。在其他方面，转录阻遏物结构域在DNA结合结构域的C末端。
在一些方面，转录阻遏物结构域和DNA结合结构域由第一肽接头隔开。在一些方面，第一肽接头包含GGGGSGGT(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
在一些方面，嵌合多肽的降解决定子选自由以下组成的组：HCV NS4降解决定子、PEST(人IκBα的残基277-307的两个拷贝)、GRR(人类p105的残基352-408)、DRR(酵母Cdc34的残基210-295)、SNS(SP2和NB的串联重复序列(甲型流感或乙型流感的SP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPB残基1688-1702的四个拷贝)、SPmix(SP1和SP2的串联重复序列(甲型流感病毒M2蛋白的SP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(甲型流感病毒NS蛋白的残基79-93的三个拷贝)、ODC(鸟氨酸脱羧酶的残基106-142)、Nek2A、小鼠ODC(残基422-461)、小鼠ODC_DA(mODC的残基422-461，包括D433A和D434A点突变)、APC/C降解决定子、COP1 E3连接酶结合降解决定子基序、CRL4-Cdt2结合PIP降解决定子、actinfilin结合降解决定子、KEAP1结合降解决定子、KLHL2和KLHL3结合降解决定子、MDM2结合基序、N-降解决定子、缺氧信号传导中的羟脯氨酸修饰、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、SCF泛素连接酶结合磷酸降解决定子、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、DSGxxS磷酸依赖性降解决定子、Siah结合基序、SPOPSBC对接基序和PCNA结合PIP盒。在一些方面，降解决定子包含小脑蛋白(CRBN)多肽底物结构域，所述结构域能够响应于免疫调节药物(IMiD)结合CRBN，从而促进泛素途径介导的所述嵌合多肽的降解。在一些方面，所述CRBN多肽底物结构域选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787和ZN827，或其能够进行药物诱导CRBN结合的片段。在一些方面，所述CRBN多肽底物结构域是天然CRBN多肽序列的嵌合融合产物。在一些方面，所述CRBN多肽底物结构域是IKZF3/ZFP91/IKZF3嵌合融合产物，具有氨基酸序列FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL(SEQ ID NO:6)。在一些方面，IMiD是经FDA批准的药物。在一些方面，IMiD选自由以下各项组成的组：沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
在一些方面，诱导型转录调节因子(ITM)在降解决定子的N末端。在其他方面，ITM在降解决定子的C末端。
在一些方面，ITM通过第二个肽接头与降解决定子隔开。在一些方面，第二肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GSGSGSGS(SEQ ID NO:7)、KEGS(SEQ ID NO:8)、EGK、EAAAK(SEQ ID NO:9)和AAPAKQE(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，第二肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AAPAKQEAAAPAKQEAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKA(SEQ ID NO:12)和AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:13)。
还提供了一种表达盒，其包含可操作连接至编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子。在一些方面，可操作连接至编码嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子包含组成型启动子。在一些方面，组成型启动子选自由以下各项组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1a、hCAGG、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
在一些方面，可操作连接至编码嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子包含诱导型启动子。在一些方面，诱导型启动子包含最小启动子和应答元件，所述应答元件选自由以下各项组成的组：NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合体、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答启动子及其串联重复序列、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合体、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答启动子及其串联重复序列。
在一些方面，可操作连接至编码嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子是合成启动子。
在一些方面，编码嵌合多肽的多核苷酸序列还编码包含mRNA去稳定元件的3’非翻译区(UTR)。在一些方面，mRNA去稳定元件选自由以下组成的组：富含AU的元件和茎-环去稳定元件。
还提供了一种表达系统，其包含：(i)包含可操作连接至编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子的表达盒，和(ii)包含与感兴趣的基因可操作连接的ITM应答启动子的靶表达盒。在一些方面，ITM应答启动子包含启动子序列和结合ITM的DNA结合结构域的序列。在一些方面，结合DNA结合结构域的序列包含一个或多个锌指结合位点。在一些方面，结合DNA结合结构域的序列包含四个或更多个锌指结合位点。在一些方面，ITM应答启动子的启动子序列包含组成型启动子序列。在一些方面，组成型启动子序列选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、EF1a、hCAGG、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。在一些方面，ITM应答启动子的启动子序列包含最小启动子。在一些实施方案中，ITM应答启动子包含合成启动子。
在一些实施方案中，感兴趣的基因编码治疗性多肽。在一些实施方案中，感兴趣的基因编码选自由以下组成的组的多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂a、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
在一些实施方案中，表达系统包含异源构建体，所述异源构建体包含以下两者：(i)包含可操作连接编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子的表达盒，和(ii)靶表达盒。
在一些实施方案中，表达系统包含：(i)包含表达盒的第一异源构建体，所述表达盒包含可操作连接编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子，和(ii)包含靶表达盒的第二异源构建体。
还提供了一种分离的细胞，其包含：(i)表达盒，其包含可操作连接编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子，或(ii)本文所述的表达系统。在一些实施方案中，分离的细胞是人细胞。在一些方面，分离的细胞是干细胞。在一些方面，分离的细胞是免疫细胞。在一些方面，所述细胞选自由以下各项组成的组：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC来源的细胞、多能干细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC来源的细胞。
还提供了用于抑制感兴趣的基因的阻遏的遗传开关，其包含：本文所述的嵌合多肽和配体，其中配体与降解决定子的结合诱导嵌合多肽的降解，从而抑制感兴趣的基因的阻遏。在一些方面，遗传开关的配体包含促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解的免疫调节药物(IMiD)。在一些方面，IMiD是经FDA批准的药物。在一些方面，IMiD选自由以下各项组成的组：沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
还提供了抑制感兴趣的基因的阻遏的方法，其包括：(a)用表达系统转化细胞，所述表达系统包含(i)编码本文所述的嵌合多肽的表达盒，和(ii)包含可操作连接至感兴趣的基因的ITM应答启动子的靶表达盒；(b)在适合表达嵌合多肽的条件下培养转化的细胞；和(c)通过使转化的细胞与促进嵌合多肽的降解的配体接触来诱导嵌合多肽的降解。
附图说明
关于以下描述和附图，将更好地理解本公开的这些和其他特征、方面和优点。
图1显示了用泊马度胺处理后各种降解决定子连接的DNA结合物的降解效率。左栏代表“无药物”，并且右栏代表“+1uM泊马度胺”。
图2显示了各种降解决定子连接的转录阻遏物降解后报告基因表达的诱导。左栏代表“无药物”，并且右栏代表“+1uM泊马度胺”。
图3显示了在表达各种降解决定子连接的转录阻遏物的细胞中，与用泊马度胺处理后相比，在不存在泊马度胺时报告基因表达之间的差异。
图4A显示了在存在或不存在泊马度胺的情况下并与未转导的细胞(缺乏报告基因)和未用阻遏物转导的报告基因细胞相比，用两种降解决定子连接的转录阻遏物构建体(分别为SB03758和SB03759)转导的细胞的报告基因表达的直方图。
图4B显示了在存在或不存在泊马度胺的情况下并与未转导的细胞(缺乏报告基因)和未用阻遏物转导的报告基因细胞相比，用两种降解决定子连接的转录阻遏物构建体(分别为SB03758和SB03759)转导的细胞的报告基因表达的直方图。
图5显示了在用泊马度胺处理后，两种降解决定子连接的DNA结合物的降解效率，每种结合物都包含mRNA去稳定标签。左栏代表“无药物”，并且右栏代表“1uM泊马度胺”。
图6A显示在存在或不存在泊马度胺的情况下，在表达在N末端具有降解决定子的各种降解决定子连接的转录阻遏物的细胞中的报告基因表达。显示了与仅表达报告基因但不表达降解决定子连接的转录阻遏物的细胞相比，表达报告基因和降解决定子连接的转录阻遏物的细胞中报告基因表达的几何平均荧光强度(gMFI)的倍数变化。左栏代表“无药物”，右栏代表“1uM泊马度胺”。
图6B显示在存在或不存在泊马度胺的情况下，在表达在N末端具有降解决定子的各种降解决定子连接的转录阻遏物的细胞中的报告基因表达。显示了表达图6A的每个降解决定子连接的转录阻遏物的细胞的报告基因表达的倍数变化，从而比较了存在泊马度胺时的表达与不存在泊马度胺时的表达。
图7A显示在存在或不存在泊马度胺的情况下，在表达在C末端具有降解决定子的各种降解决定子连接的转录阻遏物的细胞中的报告基因表达。显示了与仅表达报告基因但不表达降解决定子连接的转录阻遏物的细胞相比，表达报告基因和降解决定子连接的转录阻遏物的细胞中报告基因表达的几何平均荧光强度(gMFI)的倍数变化。左栏代表“无药物”，右栏代表“1uM泊马度胺”。
图7B显示在存在或不存在泊马度胺的情况下，在表达在C末端具有降解决定子的各种降解决定子连接的转录阻遏物的细胞中的报告基因表达。显示了表达图7A的每个降解决定子连接的转录阻遏物的细胞的报告基因表达的倍数变化，从而比较了存在泊马度胺时的表达与不存在泊马度胺时的表达。
图8显示了在包括降解决定子连接的阻遏物的系统中，IL-12的IMiD调节的开启开关的控制表达。上图显示了在无药物条件下或用泊马度胺滴定的条件下(1nM、10nM、100nM和1uM)，由三种所示的降解决定子连接的阻遏物调节的IL-12表达水平。下图显示了IL-12水平，显示为用组成型IL-12报告基因转导的细胞中定量的IL12表达水平的分数。
图9显示了在1uM的泊马度胺和1uM的伊比度胺下的IMiD开启开关的开启与关闭动力学。显示了在从1uM泊马度胺(上图)或1uM伊比度胺(下图)处理开始的指定流逝时间，从细胞中收集的上清液中的IL-12表达水平。仅SB04640(右栏)用作仅报告基因对照，其中IL-12表达是组成型的且不受降解决定子连接的阻遏物调节(左栏)。
图10显示了在12小时和16小时的另外的时间点下，在1uM泊马度胺下的IMiD开启开关的开启与关闭动力学。在从1uM泊马度胺处理开始的指定流逝时间，从细胞中收集上清液中的IL-12表达水平。显示了在用仅报告基因对照SB04640转导的细胞中标准化为IL-12表达水平的IL-12的表达水平，其中IL-12表达是组成型的，并且不受降解决定子连接的阻遏物调节。
具体实施方式
除非另有说明，否则权利要求和说明书中使用的术语定义如下。
术语“体内”是指发生在活生物体内的过程。
如本文使用的术语“哺乳动物”包括人和非人，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。
术语百分比“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，是指两个或更多个序列或子序列，当比较和比对最大对应性时，具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，如使用下述序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)或通过目视检查测量的。根据应用，百分比“同一性”可以存在于进行比较的序列的一个区域中，例如，存在于功能结构域中，或者可替代地，存在于要比较的两个序列的全长中。
对于序列比较而言，通常一个序列用作参考序列，将测试序列与其做比较。在使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机，如有必要，则指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后所述序列比较算法基于指定程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或通过目视检查(通常参见Ausubel等人，见下文)。
适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，所述算法在Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中有描述。可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得用于进行BLAST分析的软件。
术语“足量”意指足以产生所需效果的量，例如足以抑制细胞中的转录阻遏的量。
必须指出的是，如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述”包括复数指示物。
可降解转录阻遏物嵌合多肽
本公开提供了嵌合多肽，其包括诱导型转录调节因子(ITM)和降解决定子。一般而言，降解决定子可操作地连接至ITM，以允许嵌合多肽的基于降解决定子的降解，从而调节ITM的活性。
诱导型转录调节因子
本文描述的嵌合多肽包括诱导型转录调节因子(ITM)。ITM包括DNA结合结构域和转录阻遏物结构域。
在一些实施方案中，转录阻遏物结构域可以包括但不限于Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域、组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)结构域、Scleraxis(SCX)HLH结构域、DNA结合抑制剂1(ID1)HLH结构域、含有HECT结构域和RCC1样结构域的蛋白2(HERC2)Cyt-b5结构域、扭曲相关蛋白1(TWST1)HLH结构域、同源盒蛋白Nkx-2.2(NKX22)同源结构域、DNA结合抑制剂1(ID3)HLH结构域或扭曲相关蛋白2(TWST2)HLH结构域。
在一些实施方案中，转录阻遏物结构域包括Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域。本文所用的“KRAB阻遏结构域”是指KRAB结构域的野生型、变体或片段，当其可操作地连接至DNA结合结构域时，能够阻遏转录。C2H2/Krüppel型锌指(ZNF)蛋白是转录因子，其包括KRAB结构域和结合DNA的锌指的C末端阵列。KRAB结构域由标准亚结构域-A(KRAB-A)组成，有或没有辅助亚结构域，例如KRAB-b、KRAB-BL、KRAB-B或KRAB-C。在一些实施方案中，KRAB阻遏物结构域包含锌指蛋白ZNF10的KRAB结构域。示例性的ZNF10序列提供为SEQ ID NO:1。ZNF10的KRAB结构域包括ZNF10的残基2-81并提供为SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，KRAB阻遏物结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAB阻遏物结构域包含minKRAB。“MinKRAB”是指KRAB阻遏结构域的45个氨基酸片段，已经被鉴定为存在于KRAB阻遏结构域中的最小阻遏结构域。示例性的minKRAB阻遏物结构域提供为SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，KRAB阻遏物结构域包含KRAB阻遏物结构域变体。本文所用的“KRAB阻遏物结构域变体”是指保留阻遏物活性但具有一个或多个氨基酸取代的KRAB结构域(例如，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，KRAB阻遏物结构域包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列，并且包括一个或多个选自以下的氨基酸取代：W27L、K28L、D31A、T32A、Q34A、Q35A、R39E、L43S、T57C、K58C、P59C、V61Y、I62Y、I62A、L63W、L63Y、L63E、R64F、R64W、R64E、L65F、L65E、L65W、E66V、K67F、G68F和E69F。
在一些实施方案中，KRAB阻遏结构域包括SEQ ID NO:2的KRAB阻遏物结构域变体，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸取代：Q34A/Q35A、I62A、T57C/K58C/P59C、D31A/T32A、L63W/R64W/L65W、E66V、L63E/R64E/L65E、R64F/L65F、W27L/K28L KRAB、R39E、K67F/G68F/E69F和V61Y/I62Y/L63Y。
在一些实施方案中，转录阻遏物结构域包括组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)结构域。示例性的HDAC4结构域提供为SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中，DNA结合结构域包括锌指(ZF)蛋白结构域。包含ZF蛋白结构域允许通过诱导型转录调节因子(ITM)进行靶向核酸结合。
在一些实施方案中，ZF蛋白结构域在设计上是模块化的，并且由锌指阵列(ZFA)构成。
锌指阵列(ZFA)包含多个连接在一起的锌指蛋白基序，任选地被柔性接头序列隔开。每个锌指基序与不同的核酸基序结合。这导致ZFA对任何所需的核酸序列具有特异性。ZF基序可以彼此直接相邻，或由灵活的接头序列隔开。在一些实施方案中，ZFA包括串联布置的ZF基序的阵列、串或链。ZFA可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个锌指基序。ZFA可以具有1-10、1-15、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10或5-15个锌指基序。
ZF蛋白结构域可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个ZFA。ZF结构域可以具有1-10、1-15、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、10-15、10-20或10-25个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含一至十个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少一个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少两个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少三个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少四个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少五个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少十个ZFA。
在一些实施方案中，ZFA包括六个锌指图案。由包括六个锌指基序的ZFA构成的示例性ZF蛋白结构域在序列SRPGERPFQCRICMRNFSRRHGLDRHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSDHSSLKRHLRTHTGSQKPFQCRICMRNFSVRHNLTRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSDHSNLSRHLKTHTGSQKPFQCRICMRNFSQRSSLVRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSESGHLKRHLRTHLRGS(SEQ ID NO:5)中示出。
降解决定子
在一些实施方案中，本文描述的嵌合多肽包括降解决定子。在一些实施方案中，降解决定子能够诱导ITM的降解。在一些实施方案中，降解决定子可包括但不限于：HCV NS4降解决定子、PEST(人IκBα的残基277-307的两个拷贝)、GRR(人类p105的残基352-408)、DRR(酵母Cdc34的残基210-295)、SNS(SP2和NB的串联重复序列(甲型流感或乙型流感的SP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPB残基1688-1702的四个拷贝)、SPmix(SP1和SP2的串联重复序列(甲型流感病毒M2蛋白的SP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(甲型流感病毒NS蛋白的残基79-93的三个拷贝)、ODC(鸟氨酸脱羧酶的残基106-142)、Nek2A、小鼠ODC(残基422–461)、小鼠ODC_DA(mODC的残基422-461，包括D433A和D434A点突变)、APC/C降解决定子、COP1 E3连接酶结合降解决定子基序、CRL4-Cdt2结合PIP降解决定子、actinfilin结合降解决定子、KEAP1结合降解决定子、KLHL2和KLHL3结合降解决定子、MDM2结合基序、N-降解决定子、缺氧信号传导中的羟脯氨酸修饰、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、SCF泛素连接酶结合磷酸降解决定子、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、DSGxxS磷酸依赖性降解决定子、Siah结合基序、SPOP SBC对接基序或PCNA结合PIP盒。
在一些实施方案中，降解决定子包含能够响应于免疫调节药物(IMiD)结合CRBN的小脑蛋白(CRBN)多肽底物结构域，从而促进泛素途径介导的ITM降解。在一些实施方案中，CRBN多肽底物结构域可以包括但不限于IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSSE4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787或ZN827，或其能够进行药物诱导CRBN结合的片段。在一些实施方案中，CRBN多肽底物结构域包含天然CRBN多肽序列的嵌合融合产物。在一些实施方案中，CRBN多肽底物结构域包含具有氨基酸序列FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL(SEQ ID NO:6)的IKZF3/ZFP91/IKZF3嵌合融合产物。降解决定子描述于国际申请公开号WO2019/089592Al中，其以引用方式并入本文以用于所有目的。
肽接头
在一些实施方案中，嵌合多肽包括至少一个肽接头。
肽接头可以是隔开两个多肽结构域(例如，诱导型转录调节子和降解决定子)而不干扰多肽结构域的功能的任何多肽序列。肽接头的实例包括GSGSGSGS(SEQ ID NO:7)、KEGS(SEQ ID NO:8)、EGK、EAAAK(SEQ ID NO:9)、AAPAKQE(SEQ ID NO:10)、GSGSGSGSGGAEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:11，在本文中称为“串联的Max Jen接头”或“ConMJ”)、AAPAKQEAAAPAKQEAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKA(SEQ ID NO:12，在本文中称为“ecpd”)、AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:13)和GGGGSGGT(SEQ ID NO:60)。
在一些实施方案中，转录阻遏物结构域和DNA结合结构域由肽接头隔开。
在一些实施方案中，诱导型转录调节因子(ITM)和降解决定子由肽接头隔开。在一些实施方案中，ITM和降解决定子之间的肽接头包含选自以下的氨基酸序列：GSGSGSGS(SEQID NO:7)、KEGS(SEQ ID NO:8)、EGK、EAAAK(SEQ ID NO:9)、AAPAKQE(SEQ ID NO:10)和GGGGSGGT(SEQ ID NO:60)。在一些实施方案中，ITM和降解决定子之间的肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGT(SEQ ID NO:60)。
在一些实施方案中，ITM和降解决定子之间的肽接头包括选自以下的氨基酸序列：GSGSGSGSGGAEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:11，在本文中称为“串联的Max Jen接头”或“ConMJ”)、AAPAKQEAAAPAKQEAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKA(SEQ ID NO:12，在本文中称为“ecpd”)、AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:13)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:7)、KEGS(SEQ IDNO:8)和EGK。
在一些实施方案中，ITM和降解决定子之间的肽接头包括选自以下的氨基酸序列：AAPAKQEAAAPAKQEAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKA(SEQ ID NO:12，在本文中称为“ecpd”)和AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:13)。
在一些实施方案中，转录阻遏物结构域、DNA结合结构域由肽接头隔开，并且降解决定子各自由肽接头隔开。在一些实施方案中，转录阻遏物结构域、DNA结合结构域由肽接头隔开，并且降解决定子各自由不同的肽接头隔开。
遗传开关
本文还提供了用于抑制感兴趣的基因的阻遏的遗传开关。遗传开关可以包括(a)嵌合多肽，其包括降解决定子和能够阻遏感兴趣的基因的转录的诱导型转录调节因子，和(b)结合嵌合多肽的降解决定子并诱导嵌合多肽的降解的配体。嵌合多肽的降解释放了诱导型转录调节因子的阻遏物活性。
在一些实施方案中，配体包括促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解的免疫调节药物(IMiD)。
在一些实施方案中，IMiD是经FDA批准的药物。
在一些实施方案中，IMiD可以包括但不限于沙利度胺、来那度胺或泊马度胺。
分离的多核苷酸分子和表达盒
本文还提供了编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸分子(例如，分离的多核苷酸分子)和表达盒。在一些实施方案中，本公开提供了表达盒，其包含可操作连接至编码嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子。
“分离的”核酸分子或多核苷酸是指已经从其天然环境中去除的多核苷酸分子，例如DNA或RNA。例如，包含在异源构建体中的编码嵌合多肽的多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外的实例包括异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的多核苷酸还包括包含在通常含有多核苷酸分子的细胞中的多核苷酸分子，但所述多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
分离的多核苷酸分子包括但不限于cDNA多核苷酸、RNA多核苷酸、RNAi寡核苷酸(例如，siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、shRNA等)、mRNA多核苷酸、环状质粒、线性DNA片段、载体、微环、ssDNA、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及寡核苷酸。
在一些实施方案中，分离的多核苷酸分子可以包括但不限于DNA、cDNA、RNA、mRNA和裸质粒(线性或环状)。
具有与本发明的参考核苷酸序列至少95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，除了多核苷酸序列可包含参考核苷酸序列的每100个核苷酸最多五个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可以缺失或被另一个核苷酸取代，或者参考序列中多达5％的核苷酸可以被插入到参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或这些末端位置之间的任何地方，或者单独散布在参考序列的残基中，或者散布在参考序列的一个或多个连续组中。实际上，任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可以使用已知的计算机程序常规确定。
术语“表达盒”指重组或合成产生的多核苷酸，具有一系列允许特定多核苷酸在靶细胞中转录的核酸元件。表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子等序列。
在一些实施方案中，包含编码嵌合多肽的多核苷酸序列的表达盒还编码3’非翻译区(UTR)，其包含可操作连接至编码嵌合多肽的多核苷酸序列的mRNA去稳定元件。在一些实施方案中，mRNA去稳定元件包括富含AU的元件和/或茎-环去稳定元件(SLDE)。
在一些实施方案中，mRNA去稳定元件包括富含AU的元件。在一些实施方案中，富含AU的元件包括序列ATTTA(SEQ ID NO:14)的至少两个重叠基序。在一些实施方案中，富含AU的元件包括ATTTATTTATTTATTTATTTA(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方案中，mRNA去稳定元件包括茎-环去稳定元件(SLDE)。在一些实施方案中，SLDE包含CTGTTTAATATTTAAACAG(SEQ ID NO:16)。
在一些实施方案中，mRNA去稳定元件包含至少一个富含AU的元件和至少一个SLDE。本文所用的“AuSLIDE”是指可操作连接至茎-环去稳定元件(SLDE)的富含AU的元件。示例性的AuSLIDE序列提供为SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，mRNA去稳定元件包含2XAuSLIDE。示例性的AuSLDE序列提供为SEQ ID NO:18。
在一些实施方案中，本公开提供了包含编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸的表达盒。在一些实施方案中，本发明提供了一种表达系统，其包括编码如前所述的嵌合多肽的第一表达盒，以及包含可操作连接至感兴趣的基因的ITM应答启动子的靶表达盒。
“靶表达盒”指包含具有可诱导转录调节因子(ITM)可控表达的基因的表达盒。所述表达由基于配体(例如，泊马度胺)存在的ITM控制。
本文所述的分离的多核苷酸分子和异源构建体是工程化多核苷酸分子。“工程化多核苷酸”是自然界中不存在的多核苷酸。然而，应当理解，虽然工程化多核苷酸作为一个整体不是天然存在的，但它可以包含自然界中存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含来自不同生物体(例如，来自不同物种)的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。术语“工程化多核苷酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组多核苷酸”是指通过连接核苷酸分子构建的分子，并且在一些实施方案中，可以在活细胞中复制。“合成多核苷酸”是指扩增的或化学合成的或通过其他方式合成的分子。合成多核苷酸包括那些经过化学修饰或其他方式修饰，但可以与天然存在的核苷酸分子进行碱基配对的多核苷酸。修饰包括但不限于一个或多个修饰的核苷酸间键和非天然核酸。修饰更详细描述于美国专利第6,673,611号和美国申请公开2004/0019001中，这些文献中的每一个通过引用以其整体并入。经修饰的核苷酸间键可以是二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键。非天然核酸可以是锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、二醇核酸(GNA)、磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO或“吗啉代”)和苏糖核酸(TNA)。非天然核酸进一步详细描述于国际申请WO 1998/039352、美国申请公开第2013/0156849号和美国专利第6,670,461号、第5,539,082号、第5,185,444号中有更详细的描述，这些文献中的每一篇均全文以引用方式并入本文。重组多核苷酸和合成多核苷酸也包括由前述任一种复制产生的那些分子。本公开的工程化多核苷酸可以由单个分子(例如，包括在同一质粒或其他载体中)或由多个不同的分子(例如，多个不同的独立复制分子)编码。
可以使用标准分子生物学方法产生本公开的工程化多核苷酸(参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2012,Cold Spring HarborPress)。在一些实施方案中，使用GIBSON克隆产生工程化核酸构建体(参见例如Gibson,D.G.等人Nature Methods,343-345,2009；以及Gibson,D.G.等人NatureMethods,901-903,2010，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文)。GIBSON通常在单管反应中使用三种酶促活性：5'核酸外切酶、DNA聚合酶的′Y延伸活性和DNA连接酶促活性。5'核酸外切酶促活性回切5'端序列并暴露互补序列以用于退火。然后聚合酶促活性填补退火区域上的空位。随后DNA连接酶封闭切口并将DNA片段共价连接在一起。邻接片段的重叠序列比Golden Gate Assembly中使用的序列长得多，因此获得更高百分比的正确组装。在一些实施方案中，使用克隆(Clontech)产生经工程化的核酸构建体。
启动子
如本文所用，“启动子”是指核酸序列的控制区域，在所述区域控制核酸序列的剩余部分的起始和转录速率。启动子也可以包含调节蛋白和分子(诸如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合的亚区域。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或它们的任何组合。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或转录。在本文中，当启动子相对于其调节以控制(“驱动”)所述序列的转录起始和/或表达的核酸序列处于正确的功能位置和取向时，所述启动子被认为是“可操作地连接的”。
启动子可以是与基因或序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于给定基因或序列的编码片段上游的5'非编码序列来获得。这种启动子可以称为“内源性的”。在一些实施方案中，编码核酸序列可以位于重组或异源启动子的控制下，所述启动子是指在其天然环境中通常不与编码序列缔合的启动子。此类启动子可以包括其他基因的启动子；从任何其他细胞分离的启动子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，例如通过本领域已知的遗传工程方法来包含改变表达的不同转录调节区的不同元件和/或突变的启动子或增强子。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术产生序列，包括聚合酶链式反应(PCR)(参见例如美国专利第4,683,202号和美国专利第5,928,906号)。
如本文所用，“诱导型启动子”是指当存在信号、受信号影响或接触信号时，以调节(例如启动或活化)转录活性为特征的启动子。信号可以是内源性的或正常的外源性条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或蛋白质(例如，细胞因子)，其以一定方式与诱导型启动子接触，由此活跃调节诱导型启动子的转录活性。转录的活化可牵涉直接作用于启动子以驱动转录或通过使阻止启动子驱动转录的阻遏因子灭活来间接作用于启动子。相反，转录失活可能涉及直接作用于启动子以阻止转录或通过活化阻遏因子(所述阻遏因子随后作用于启动子)来间接作用于启动子。
如本文所用，如果在存在局部肿瘤状态(例如，炎症或缺氧)或信号的情况下，启动子的转录被活化、失活、增加或减少，则启动子“对所述状态或信号作出应答”或“受所述状态或信号调节”。在一些实施方案中，启动子包含应答元件。“应答元件”是启动子区内的DNA短序列，其结合调节(调控)由启动子进行的基因表达的特定分子(例如，转录因子)。可以根据本公开使用的应答元件包括但不限于根皮素可调控制元件(PEACE)、锌指DNA结合结构域(DBD)、干扰素-γ活化序列(GAS)(Decker,T.等人J Interferon Cytokine Res.1997年3月；17(3):121-34，所述文献以引用方式并入本文)、干扰素刺激应答元件(ISRE)(Han,K.J.等人J Biol Chem.2004年4月9日；279(15):15652-61，所述文献以引用方式并入本文)、NF-κB应答元件(Wang,V.等人Cell Reports.2012；2(4):824-839，所述文献以引用方式并入本文)和STAT3应答元件(Zhang,D.等人J of Biol Chem.1996；271:9503-9509，所述文献以引用方式并入本文)。本文涵盖其他应答元件。应答元件还可以含有串联重复序列(例如，编码应答元件的相同核苷酸序列的连续重复序列)以通常增加应答元件对其同源结合分子的敏感性。串联重复序列可以标记为2X、3X、4X、5X等以指示存在的重复序列数目。
表1中列出了应答启动子(也称为“诱导型启动子”)(例如，TGF-β应答启动子)的非限制性实例，所述表示出了启动子和转录因子的设计，以及诱导分子对转录因子(TF)的影响并且示出了转基因转录(T)(B，结合；D，解离；n.d.，未确定)(A，活化；DA，失活；DR，去阻遏)(参见Horner,M.和Weber,W.FEBS Letters 586(2012)20784-2096m，以及其中引用的参考文献)。诱导型启动子组分的非限制性实例包括表2中所示的那些。
表1
表2
如本文所用，“组成型启动子”是指允许连续或不受调控的转录活性的启动子。
组成型启动子的非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子以及EF1a变体hEF1aV1和hEF1aV2、延伸因子(EFS)启动子、MND启动子(一种合成启动子，含有带有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的改良MoMuLV LTR的U3区)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和泛素C(UbC)启动子。组成型启动子氨基酸序列的实例示于表3中。
表3
可操作地连接至编码嵌合多肽的多核苷酸的启动子
在一些实施方案中，本公开提供了异源构建体，其包含可操作连接至编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子。
在一些实施方案中，可操作连接至编码嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子和/或合成启动子。
在一些实施方案中，可操作连接至编码嵌合多肽的多核苷酸的启动子包括组成型启动子。组成型启动子的实例示于表3中。在一些实施方案中，组成型启动子可以包括但不限于CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、EF1a(例如，野生型或变体，例如hEF1aV1或hEF1aV2)、hCAGG、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
异源构建体
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸分子包含在异源构建体中。术语“载体”或“表达载体”与“异源构建体”同义，并且指用于在靶细胞中引入和指导一个或多个与构建体可操作相关的基因的表达的多核苷酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的构建体以及掺入宿主细胞基因组中的载体，所述构建体已被引入宿主细胞中。本文所述的异源构建体包括表达盒。在一些实施方案中，本文提供了包含表达盒的异源构建体，所述表达盒包含编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸分子。在一些实施方案中，异源构建体还包括靶表达盒，所述靶表达盒包括诱导型转录调节因子应答(ITM应答)启动子。在一些实施方案中，本文提供了包含表达盒的第一异源构建体，所述表达盒包含编码嵌合多肽的多核苷酸分子，和包含靶表达盒的第二异源构建体，所述靶表达盒包含诱导型转录调节因子应答(ITM应答)启动子。
包括诱导型转录调节因子应答启动子的表达系统
在一些实施方案中，本文提供了表达系统，其包括编码本文所述的嵌合多肽的第一表达盒和包括可操作连接至感兴趣的基因的诱导型转录调节因子应答(ITM应答)启动子的靶表达盒。
感兴趣的基因
在一些实施方案中，感兴趣的基因包括治疗性蛋白质。治疗性蛋白质是当提供给受试者时提供临床益处的任何多肽。可以通过施用多肽，施用能够表达多肽的细胞或施用编码多肽的多核苷酸来提供治疗性蛋白质。
在一些实施方案中，感兴趣的基因编码选自以下的多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂a、受体、配体、抗体、肽和酶。
在一些实施方案中，感兴趣的基因包括细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子可以包括但不限于IL1-β、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合蛋白、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型干扰素、干扰素-γ和TNF-α。
在一些实施方案中，感兴趣的基因包括细胞死亡调控因子。细胞死亡调控因子包括细胞死亡诱导多肽和细胞存活多肽。
在一些实施方案中，感兴趣的基因包括细胞死亡诱导多肽。细胞死亡诱导多肽的实例包括：半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、白喉毒素片段A(DTA)、Bax、Bak、Bok、Bad、Bcl-xS，Bak、Bik、Bcl-2相互作用蛋白3(BNIP3)、Fas、Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域蛋白(TRADD)、TNF受体(TNF-R)、APAF-1、颗粒酶B、第二线粒体来源的半胱天冬酶活化因子(SMAC)、Omi、Bmf、Bid、Bim、p53上调凋亡调节因子(PUMA)、Noxa、Blk、Hrk、细胞色素c、Arts、TNF相关细胞死亡诱导配体(TRAIL)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)、病毒刺突蛋白、羧基酯酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶Fksb、羧肽酶G2、羧肽酶A、辣根过氧化物酶、亚麻苦苷酶、肝细胞色素P450-2B1和嘌呤核苷磷酸化酶。在一些实施方案中，细胞死亡诱导多肽是半胱天冬酶9或其功能性截短。在一些实施方案中，细胞死亡诱导多肽包含SEQID NO:49的胱天蛋白酶9氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞死亡诱导多肽是白喉毒素片段A(DTA)。在一些实施方案中，细胞死亡诱导多肽包含SEQ ID NO:50的DTA氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞死亡诱导多肽是颗粒酶B。在一些实施方案中，细胞死亡诱导多肽包含SEQ ID NO:51的颗粒酶B氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞死亡诱导多肽是Bax。在一些实施方案中，细胞死亡诱导多肽包含SEQ ID NO:52的Bax氨基酸序列。
在一些实施方案中，感兴趣的基因包括细胞存活多肽。细胞存活多肽的实例包括：XIAP、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-2相关蛋白A1(BCL2A1)、Mcl-1、FLICE样抑制蛋白(c-FLIP)和腺病毒E1B-19K蛋白。在一些实施方案中，细胞存活多肽是XIAP。在一些实施方案中，细胞存活多肽包含SEQ ID NO:53的XIAP氨基酸序列。
诱导型转录调节因子应答启动子
在一些实施方案中，本公开提供了编码感兴趣的基因的多核苷酸分子，所述感兴趣的基因可操作地连接至诱导型转录调节因子应答启动子(ITM应答启动子)。在一些实施方案中，ITM应答启动子是对包括ITM的嵌合多肽作出应答的合成启动子，并且ITM对感兴趣的基因的阻遏可以通过配体(例如泊马度胺)的存在来控制。
在一些实施方案中，ITM应答启动子包含启动子序列和ITM结合结构域，所述结构域被本文所述的诱导型转录调节因子(ITM)特异性识别。如本文所用的“核心启动子序列”是指启动子的一部分，包括核心(即“最小”)启动子序列，其与RNA聚合酶II相互作用并足以启动转录。在一些实施方案中，ITM应答启动子包括合成启动子，所述合成启动子包括核心启动子序列(由启动子序列提供)和转录调节因子应答序列(由结合结构域提供)，它们在启动子区域内不天然共存。
结合结构域可以包括一个或多个锌指结合位点。锌指结合位点是能够结合锌指蛋白结构域(例如，SEQ ID NO:5的锌指蛋白结构域)的多核苷酸序列。结合结构域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个锌指结合位点。示例性的锌指结合位点包含GGCGTAGCCGATGTCGCG(SEQ ID NO:54)。在一些实施方案中，结合结构域包含一个锌指结合位点。在一些实施方案中，结合结构域包含一个以上的锌指结合位点。锌指结合位点可以由DNA接头隔开。在一些实施方案中，DNA接头的长度可以是5-40、5-30、10-40、10-30个碱基对。在一些实施方案中，结合结构域包含两个锌指结合位点。在一些实施方案中，结合结构域包含三个锌指结合位点。在一些实施方案中，结合结构域包含四个锌指结合位点。包含锌指结合位点的示例性结合结构域在序列中示出：cgggtttcgtaacaatcgcatgaggattcgcaacgccttcGGCGTAGCCGATGTCGCGctcccgtctcagtaaaggtcGGCGTAGCCGATGTCGCGcaatcggactgccttcgtacGGCGTAGCCGATGTCGCGcgtatcagtcgcctcggaacGGCGTAGCCGATGTCGCG(SEQ ID NO:55)。SEQ ID NO:55的结合结构域包括四个结合位点，每个结合位点结合SEQ ID NO:5的锌指蛋白结构域，每个结合位点由DNA接头隔开。
在一些实施方案中，核心启动子序列包括最小启动子。在一些实施方案中，核心启动子序列衍生自选自以下的启动子：minP、minCMV、YB_TATA和minTK。示例性核心启动子序列包含TCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCA(SEQ ID NO:56)。
在一些实施方案中，核心启动子序列包含组成型启动子序列。组成型启动子序列的实例示于表3中。在一些实施方案中，组成型启动子序列可以包括但不限于CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、EF1a、hCAGG、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
示例性的ITM应答启动子包括序列：cgggtttcgtaacaatcgcatgaggattcgcaacgccttcGGCGTAGCCGATGTCGCGctcccgtctcagtaaaggtcGGCGTAGCCGATGTCGCGcaatcggactgccttcgtacGGCGTAGCCGATGTCGCGcgtatcagtcgcctcggaacGGCGTAGCCGATGTCGCGcattcgtaagaggctcactctcccttacacggagtggataACTAGTTCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCA(SEQ ID NO:57)。
另一个示例性的ITM应答启动子包括序列：cgggtttcgtaacaatcgcatgaggattcgcaacgccttcGGCGTAGCCGATGTCGCGctcccgtctcagtaaaggtcGGCGTAGCCGATGTCGCGcaatcggactgccttcgtacGGCGTAGCCGATGTCGCGcgtatcagtcgcctcggaacGGCGTAGCCGATGTCGCGcattcgtaagaggctcactctcccttacacggagtggataACTAGTGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC(SEQ ID NO:67)。
多顺反子和多启动子系统
在一些实施方案中，本公开的工程化多核苷酸或构建体被配置为产生多种多肽。例如，多核苷酸可以被配置成产生两种不同的多肽。多核苷酸分子可被配置成产生多肽，所述多肽包括本文所述的嵌合蛋白和感兴趣的多肽，所述多肽在对嵌合蛋白作出应答的启动子的控制下表达。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合多肽和可被所述嵌合多肽转录阻遏的感兴趣的基因可由相同的多核苷酸分子或异源构建体编码。
在一些实施方案中，工程化核酸可以是多顺反子的，即，可以从单个转录物产生多于一种单独的多肽(例如，多个外源多核苷酸或效应分子)。通过使用各种接头，工程化核酸可以成为多顺反子的，例如编码第一外源多核苷酸的多核苷酸序列可以连接至编码第二外源多核的核苷酸序列，例如呈第一基因:接头:第二基因5’至3’取向。接头多核苷酸序列可以编码一个或多个2A核糖体跳跃元件，例如T2A。其他2A核糖体跳跃元件包括但不限于E2A、P2A和F2A。2A核糖体跳跃元件允许在翻译期间产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。接头可以编码可切割接头多肽序列，如弗林蛋白酶切割位点或TEV切割位点，其中在表达后可切割接头多肽被切割，从而产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。可切割的接头可以包含进一步促进切割的多肽序列，如这种柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。
接头可以编码内部核糖体进入位点(IRES)，使得在翻译期间产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。接头可以编码剪接受体，如病毒剪接受体。
接头可以是接头的组合，诸如弗林蛋白酶-2A接头，其可以通过2A核糖体跳跃，然后进一步切割弗林蛋白酶位点以允许完全去除2A残基来产生单独的多肽。在一些实施方案中，接头的组合可以包含弗林蛋白酶序列、柔性接头和2A接头。因此，在一些实施方案中，接头包括弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-2A融合多肽。在一些实施方案中，接头包括弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-T2A融合多肽。
一般而言，多顺反子系统可以使用任意数目的接头或接头的组合，以表达任意数目的基因或其部分(例如，工程化核酸可以编码第一效应分子、第二效应分子和第三效应分子，各自由接头隔开，使得产生由第一效应分子、第二效应分子和第三效应分子编码的单独多肽)。
如本文所用，“接头”可以指连接第一多肽序列和第二多肽序列的肽接头或上述多顺反子接头。
转录后调控元件
在一些实施方案中，本公开的工程化多核苷酸分子包含转录后调控元件(PRE)。PRE可以例如通过去稳定RNA(例如，如前所述的AU-slide)或通过稳定RNA调节RNA稳定性。在一些实施方案中，PRE可通过实现三级RNA结构稳定性和3’末端形成来增强基因表达。PRE的非限制性实例包括乙型肝炎病毒PRE(HPRE)和土拨鼠肝炎病毒PRE(WPRE)。在一些实施方案中，转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在一些实施方案中，WPRE包含WPRE元件的α、β和γ组分。在一些实施方案中，WPRE包括WPRE元件的α组分。WPRE序列的实例包括SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
工程化细胞
本文还提供了细胞和产生细胞的方法，其包含本公开的一种或多种多核苷酸分子、表达盒或构建体。这些细胞在本文中称为“工程化细胞”。这些通常含有一种或多种工程化核酸的细胞在自然界中不存在。在一些实施方案中，细胞是重组表达一种或多种工程化多核苷酸的分离的细胞。在一些实施方案中，工程化多核苷酸从一个或多个载体或细胞基因组的选定基因座表达。在一些实施方案中，细胞经工程化以包含可操作地连接至核苷酸序列的启动子的多核苷酸。
本公开的工程化细胞可包含整合到细胞基因组中的一种或多种工程化多核苷酸(例如，包括诱导型转录调节因子(ITM)应答启动子的表达系统)。工程化细胞可以包含能够在不整合到细胞基因组中的情况下表达的一种或多种工程化多核苷酸，例如，用瞬时表达系统(诸如质粒或mRNA)工程化的多核苷酸。
工程化细胞类型
本公开的工程化细胞可以是人细胞。工程化细胞可以是人原代细胞。工程化原代细胞可以是任何体细胞。工程化原代细胞可以是任何干细胞。在一些实施方案中，工程化细胞源自受试者。在一些实施方案中，工程化细胞相对于受试者是同种异体的。
本公开的工程化细胞可以分离自受试者，诸如已知或怀疑患有癌症的受试者。细胞分离方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于基于细胞表面标志物表达的分选技术，诸如FACS分选、阳性分离技术和阴性分离、磁性分离及它们的组合。对于接受治疗的受试者而言，经工程化的细胞可以是同种异体的。同种异体修饰的细胞可以与接受治疗的受试者HLA匹配。经工程化的细胞可以是培养的细胞，如离体培养的细胞。经工程化的细胞可以是离体培养的细胞，如从受试者分离的原代细胞。培养的细胞可以与一种或多种细胞因子一起培养。
在一些实施方案中，本公开的工程化细胞可包括但不限于：T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调控性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、先天性淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、巨噬细胞(例如，M1巨噬细胞或M2巨噬细胞)、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、基板来源的细胞，雪旺细胞(Schwann cell)、心肌细胞、内皮细胞、结节细胞、小胶质细胞、肝细胞、胆管细胞、β细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC来源的细胞、多能干细胞、间充质基质细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC来源的细胞。
在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是调控性T细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是自然杀伤T(NKT)细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是B细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是先天性淋巴样细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是肥大细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是嗜碱性粒细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是骨髓细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是巨噬细胞，例如M1巨噬细胞或M2巨噬细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是单核细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞或分离的细胞是树突细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是红细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是血小板细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞是神经元。在一些实施方案中，本公开的细胞是小胶质细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞是少突胶质细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞是星形胶质细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞是基板来源的细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是雪旺细胞(Schwann cell)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是内皮细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是结节细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是小胶质细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是肝细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是胆管细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是β细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是人胚胎干细胞(ESC)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是ESC来源的细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是多能干细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是间充质基质细胞(MSC)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是iPSC来源的细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是自体的。在一些实施方案中，工程化细胞是同种异体的。在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是CD34+细胞、CD3+细胞、CD8+细胞、CD16+细胞和/或CD4+细胞。
在一些实施方案中，本公开的细胞是选自以下的肿瘤细胞：腺癌细胞、膀胱肿瘤细胞、脑肿瘤细胞(例如，神经胶质瘤细胞或成胶质细胞瘤细胞)、乳腺肿瘤细胞、宫颈肿瘤细胞、结直肠肿瘤细胞、食道肿瘤细胞、神经胶质瘤细胞、肾肿瘤细胞、肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、黑色素瘤细胞、间皮瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、皮肤肿瘤细胞、甲状腺肿瘤细胞和子宫肿瘤细胞。
本文还提供了包括培养本公开的工程化细胞的方法。培养本文所述的经工程化的细胞的方法是已知的。本领域技术人员将认识到培养条件将取决于特定的目标经工程化的细胞。本领域技术人员将认识到，培养条件将取决于经工程化的细胞的特定下游用途，例如，用于后续将经工程化的细胞施用于受试者的特定培养条件。
对细胞进行工程改造的方法
本文还提供了用本文所述的任何多核苷酸分子或构建体工程化细胞的组合物和方法。
一般而言，通过引入(即递送)本公开的一种或多种多核苷酸对细胞进行工程改造。递送方法包括但不限于病毒介导的递送、脂质介导的转染、纳米颗粒递送、电穿孔、超声处理和通过物理手段的细胞膜变形。本领域技术人员将理解，递送方法的选择可以取决于待工程化的特定细胞类型。
病毒介导的递送
基于病毒载体的递送平台可用于对细胞进行工程改造。一般而言，基于病毒载体的递送平台通过引入(即，递送)至宿主细胞中对细胞进行工程改造。例如，基于病毒载体的递送平台可以通过引入本文所述的任何工程化核酸来对细胞进行工程改造。基于病毒载体的递送平台可以是核酸，因此工程化核酸也可以涵盖工程化的病毒衍生核酸。此类工程化的病毒衍生核酸也可以称为重组病毒或工程化病毒。
基于病毒载体的递送平台可以在同一核酸内编码超过一种工程化核酸、基因或转基因。例如，工程化的病毒衍生核酸，例如重组病毒或工程化病毒，可以编码一种或多种转基因，包括但不限于编码一种或多种效应分子的本文所述的任何工程化核酸。编码一种或多种效应分子的一种或多种转基因可以构造为表达一种或多种效应分子。除了一种或多种转基因(例如，编码一种或多种效应分子的转基因)以外，基于病毒载体的递送平台还可以编码一种或多种基因，诸如病毒感染性和/或病毒产生所需的病毒基因(例如，衣壳蛋白、包膜蛋白、病毒聚合酶、病毒转录酶等)，称为顺式作用元件或基因。
基于病毒载体的递送平台可包含多于一种病毒载体，诸如编码本文所述的工程化核酸、基因或转基因并且称为反式作用元件或基因的单独病毒载体。例如，除了编码一种或多种效应分子的载体以外，基于辅助依赖性病毒载体的递送平台可以在一个或多个另外的单独载体上提供病毒感染性和/或病毒产生所需的另外的基因。一种病毒载体可以递送多于一种工程化核酸，诸如一种递送构造为产生两种或更多种效应分子的工程化核酸的载体。多于一种病毒载体可以递送多于一种工程化核酸，诸如多于一种递送构造为产生两种或更多种效应分子的一种或多种工程化核酸的载体。所用病毒载体的数量可以取决于上述基于病毒载体的疫苗平台的包装容量，并且本领域技术人员可以选择适当数量的病毒载体。
一般而言，任何基于病毒载体的系统都可用于体外产生分子(诸如效应分子)，或用于体内和离体基因治疗程序，例如，用于体内递送编码一种或多种效应分子的工程化核酸。选择适当的基于病毒载体的系统将取决于多种因素，诸如货物/有效载荷大小、病毒系统的免疫原性、目标靶细胞、基因表达强度和时间，以及本领域技术人员了解的其他因素。
基于病毒载体的递送平台可以是基于RNA的病毒或基于DNA的病毒。示例性基于病毒载体的递送平台包括但不限于单纯疱疹病毒、腺病毒、麻疹病毒(measles virus)、流感病毒、印第安纳水泡病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒、马拉巴病毒、狂犬病毒、轮状病毒、肝炎病毒、风疹病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、呼吸道合胞病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、麻疹病毒(morbillivirus)、慢病毒、复制型逆转录病毒、弹状病毒、塞尼卡谷病毒、辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。其他示例性的基于病毒载体的递送平台在本领域中有描述，诸如牛痘、鸡痘、自我复制甲病毒、马拉巴病毒、腺病毒(参见，例如，Tatsis等人，Adenoviruses,MolecularTherapy(2004)10,616—629)，或慢病毒，包括但不限于第二代慢病毒、第三代慢病毒或混合的第二代/第三代慢病毒和设计为靶向特定细胞类型或受体的任何一代重组慢病毒(参见，例如，Hu等人，Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer andInfectious Diseases,Immunol Rev.(2011)239(1):45-61,Sakuma等人，Lentiviralvectors:basic to translational,Biochem J.(2012)443(3):603-18,Cooper等人，Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviralvectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl.Acids Res.(2015)43(1):682-690,Zufferey等人，Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe andEfficient In vivo Gene Delivery,J.Virol.(1998)72(12):9873-9880)。
这些序列前面可以有一个或多个靶向亚细胞区室的序列。在引入(即递送)到宿主细胞中后，受感染的细胞(即，工程化细胞)可以表达一种或多种效应分子并且在一些情况下分泌一种或多种效应分子。可用于免疫方案的牛痘载体和方法描述于例如美国专利第4,722,848号中。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover等人(Nature 351:456-460(1991))。根据本文的描述，可用于引入(即，递送)工程化核酸的多种其他载体(例如，伤寒沙门菌(Salmonella typhi)载体等)对于本领域技术人员将是显而易见的。
基于病毒载体的递送平台可以是靶向肿瘤细胞的病毒，本文称为溶瘤病毒。溶瘤病毒的实例包括但不限于溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印第安纳水泡病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革热病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒及它们的任何变体或衍生物。本文所述的任何溶瘤病毒可以是包含编码一种或多种效应分子的一种或多种转基因(例如，工程化核酸)的重组溶瘤病毒。编码一种或多种效应分子的转基因可以构造为表达一种或多种效应分子。
在一些实施方案中，病毒可以包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和病毒样颗粒(VLP)。
基于病毒载体的递送平台可以是基于逆转录病毒的。一般而言，逆转录病毒载体由顺式作用的长末端重复序列组成，其包装能力高达6-10kb的外来序列。最小顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后载体用于将一种或多种工程化核酸(例如，编码一种或多种效应分子的转基因)整合到靶细胞中以提供永久性转基因表达。基于逆转录病毒的递送系统包括但不限于基于以下的那些：鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及它们的组合(参见，例如，Buchscher等人，J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等人，J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommnerfelt等人，Virol.176:58-59(1990)；Wilson等人，J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等人，J,Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。其他逆转录病毒系统包括Phoenix逆转录病毒系统。
基于病毒载体的递送平台可以是基于慢病毒的。一般来讲，慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。基于慢病毒的递送平台可以是基于HIV的，诸如ViraPower系统(ThermoFisher)或pLenti系统(Cell Biolabs)。基于慢病毒的递送平台可以是基于SIV或FIV的。其他示例性基于慢病毒的递送平台在美国专利第7,311,907号、第7,262,049号、第7,250,299号、第7,226,780号、第7,220,578号、第7,211,247号、第7,160,721号、第7,078,031号、第7,070,993号、第7,056,699号、第6,955,919号中有更详细的描述，这些专利中的每一篇均以引用方式并入本文以用于所有目的。
基于病毒载体的递送平台可以是基于腺病毒的。一般而言，基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有非常高的转导效率，不需要细胞分裂，实现高的滴度和表达水平，并且可以在相对简单的系统中大量生产。一般而言，腺病毒可用于在受感染的细胞内瞬时表达转基因，因为腺病毒通常不会整合到宿主的基因组中。基于腺病毒的递送平台在Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人，Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984和WO 95/00655中有更详细的描述，各自通过引用并入本文用于所有目的。其他示例性的基于腺病毒的递送平台在美国专利第5585362、6,083,716、7,371,570、7,348,178、7,323,177、7,319,033、7,318,919和7,306,793号以及国际专利申请WO96/13597中有更详细的描述，每个专利通过引用并入本文用于所有目的。
基于病毒载体的递送平台可以是基于腺相关病毒(AAV)的。腺相关病毒(“AAV”)载体可以用于用工程化核酸(例如，本文所述的任何工程化核酸)转导细胞。AAV系统可用于体外产生效应分子，或用于体内和离体基因治疗程序中，例如用于体内递送编码一种或多种效应分子的工程化核酸(参见，例如，West等人，Virology 160:38-47(1987)；美国专利第4,797,368、5,436,146、6,632,670、6,642,051、7,078,387、7,314,912、6,498,244、7,906,111号；美国专利公布US2003-0138772、US 2007/0036760和US2009/0197338；Gao等人，J.Virol,78(12):6381-6388(2004年6月)；Gao等人，Proc Natl Acad Sci USA,100(10):6081-6086(2003年5月13日)；以及国际专利申请WO 2010/138263和WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)，各自通过引用并入本文用于所有目的)。用于构建重组AAV载体的示例性方法在美国专利第5,173,414号；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等人,Mol.Cell,Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&；Muzyczka,PNAS 81:64666470(1984)；和Samuiski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)，所述文献各自出于所有目的通过引用在此并入。一般而言，基于AAV的载体包含具有对应于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11及它们的变体中的任一种的氨基酸序列的衣壳蛋白。
基于病毒载体的递送平台可以是病毒样颗粒(VLP)平台。一般而言，VLP是通过产生病毒结构蛋白并纯化所得病毒颗粒而构造的。然后，纯化后，将货物/有效载荷(例如，本文所述的任何工程化核酸)离体包封在纯化的颗粒内。因此，VLP的产生保持编码病毒结构蛋白的核酸与编码货物/有效载荷的核酸分开。用于产生VLP的病毒结构蛋白可以在多种表达系统中产生，包括哺乳动物、酵母、昆虫、细菌或体内翻译表达系统。可以使用本领域技术人员已知的方法在所需货物的存在下使纯化的病毒颗粒变性和重新形成以产生VLP。VLP的产生在Seow等人(Mol Ther.2009年5月；17(5):767–777)中有更详细的描述，通过引用并入本文用于所有目的。
基于病毒载体的递送平台可以工程改造为靶向(即，感染)一系列细胞，靶向一小部分细胞或靶向特定细胞。一般而言，针对基于病毒载体的递送平台选择的包膜蛋白将决定病毒嗜性。基于病毒载体的递送平台中使用的病毒可以假型化以靶向特定的目标细胞。基于病毒载体的递送平台可以是泛嗜性的并且感染一系列细胞。例如，基于泛嗜性病毒载体的递送平台可以包括VSV-G包膜。基于病毒载体的递送平台可以是兼嗜性的并且感染哺乳动物细胞。因此，本领域技术人员可以选择适当的嗜性、假型和/或包膜蛋白以靶向期望的细胞类型。
脂质结构递送系统
可以使用脂质介导的递送系统将本公开的工程化核酸(例如，编码嵌合多肽的多核苷酸分子)引入细胞中。一般来讲，脂质介导的递送系统使用由包围内部区室的外部脂质膜构成的结构。基于脂质的结构的实例包括但不限于基于脂质的纳米颗粒、脂质体、胶束、外泌体、囊泡、胞外囊泡、细胞或组织。脂质结构递送系统可以体外、体内或离体递送货物/有效载荷(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)。
基于脂质的纳米颗粒可包含但不限于单层脂质体、多层脂质体和脂质制剂。如本文所用，“脂质体”是一个通用术语，其涵盖通过将期望的货物(例如工程化核酸，诸如本文所述的任何工程化核酸)包封在脂质壳或脂质聚集体内而形成的脂质媒介物的体外制剂。脂质体的特征可以是具有带双层膜的囊泡结构，通常包括磷脂，以及通常包括水性组合物的内部介质。脂质体包含但不限于乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片状层等。脂质体可以是单层脂质体。脂质体可以是多层脂质体。脂质体可以是多泡脂质体。脂质体可以带正电荷、带负电荷或不带电荷。在某些实施方案中，脂质体电荷是中性的。脂质体可以由标准的囊泡形成脂质形成，这些脂质通常包含中性和带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。通常通过考虑期望的目的(例如，体内递送的标准，诸如脂质体大小、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性)来指导脂质的选择。多种方法可用于制备脂质体，如在例如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9；467(1980)、美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,501,728号、第4,837,028号和第5,019,369号中所述，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。
当包括磷脂的脂质悬浮在过量的水溶液中使得多个脂质层被水性介质隔开时，自发生成多层脂质体。在脂质组分经历自我重排后，水和溶解的溶质被截留在脂质双层之间的封闭结构中。期望的货物(例如，多肽、核酸、小分子药物、工程化核酸，诸如本文所述的任何工程化核酸、病毒载体、基于病毒的递送系统等)可以被包封在脂质体的水性内部，通过与脂质体和多肽/核酸都相连的连接分子连接到脂质体，散布在脂质体的脂质双层内，被截留在脂质体中，与脂质体复合，或者以其他方式与脂质体相连，使得可以将其递送到靶实体。亲脂性分子或具有亲脂性区域的分子也可以溶解在脂质双层中或与脂质双层缔合。
根据本实施方案使用的脂质体可以通过不同的方法制备，如本领域的普通技术人员所知。脂质体的制备在WO 2016/201323、国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040以及美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706中有更详细的描述；各自通过引用并入本文用于所有目的。
脂质体可以是阳离子脂质体。阳离子脂质体的实例在美国专利第5,962,016号、第5,030,453号、第6,680,068号、美国申请2004/0208921以及国际专利申请WO03/015757A1、WO04029213A2和WO02/100435A1中有更详细的描述，这些文献中的每一篇据此全文以引用方式并入。
脂质介导的基因递送方法例如在WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino&Gould-Fogerite,BioTechniques 6(7):682-691(1988)；美国专利第5,279,833号；Rose美国专利第5,279,833号；WO91/06309；及Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7414(1987)中有描述，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。
外来体是内吞来源的小膜囊泡，在多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体的大小在30nm与100nm直径之间的范围内。它们的表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，并且它们包含来自产生外泌体的细胞的细胞质，并在表面上展示来自亲代细胞的膜蛋白。用于递送核酸的外泌体是本领域技术人员已知的，例如，美国专利第9,889,210号中更详细描述的外泌体，所述专利以引用方式并入本文以用于所有目的。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”或“EV”是指包括包裹内部空间的膜的细胞来源的囊泡。一般而言，细胞外囊泡包括所有膜结合囊泡，这些囊泡的直径小于它们所来源的细胞。通常细胞外囊泡的直径范围为20nm至1000nm，并且可以包括处于内部空间内，展示在细胞外囊泡的外表面上，和/或跨越膜的各种大分子货物。货物可以包括核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。作为实例而非限制，胞外囊泡包含凋亡小体、细胞碎片、通过直接或间接操纵(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)而衍生自细胞的囊泡、囊泡化细胞器和由活细胞(例如，通过直接细胞质膜出芽或晚期内体与细胞质膜的融合)产生的囊泡。细胞外囊泡可源自于活的或死的生物体、外植组织或器官和/或培养的细胞。
如本文所用，术语“外来体”是指细胞来源的小(直径在20-300nm之间，更优选直径在40-200nm之间)囊泡，所述囊泡包括包裹内部空间的膜，并且所述囊泡通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜融合从细胞生成。外泌体包括脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包括有效载荷(例如，治疗剂)、受体(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸、RNA或DNA，如本文所述的任何经工程化的核酸)、糖(例如，单糖、多糖或聚糖)或其他分子。外来体可源自于生产细胞，并基于其大小、密度、生物化学参数或其组合从生产细胞分离。外来体是一种细胞外囊泡。通常，外来体的产生/生物发生不会导致生产细胞的破坏。外来体和外来体的制备在WO 2016/201323中有更详细的描述，其特此通过引用整体并入。
如本文所用，术语“纳米囊泡”(也称为“微囊泡”)是指细胞来源的小(直径在20-250nm之间，更优选直径在30-150nm之间)囊泡，所述囊泡包括包裹内部空间的膜，并且所述囊泡通过直接或间接操纵从细胞产生，使得在没有所述操纵的情况下所述生产细胞不会产生所述纳米囊泡。一般而言，纳米囊泡是细胞外囊泡的亚种。对生产细胞的适当操纵包含但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声处理或其组合。在一些情况下，纳米囊泡的产生可导致所述生产细胞的破坏。优选地，纳米囊泡群基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期核内体与质膜融合而从生产细胞得到的囊泡。纳米囊泡包括脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包括有效载荷(例如，治疗剂)、受体(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸、RNA或DNA，如本文所述的任何经工程化的核酸)、糖(例如，单糖、多糖或聚糖)或其他分子。纳米囊泡一旦根据所述操纵从生产细胞中得到，就可以基于其大小、密度、生物化学参数或其组合从生产细胞分离。
一般而言，脂质纳米颗粒(LNP)是合成脂质结构，依赖于脂质的两亲性形成膜和囊泡样结构(Riley 2017)。一般而言，这些囊泡通过吸收到靶细胞的膜中并将货物释放到胞质溶胶中来递送货物/有效载荷，如本文所述的任何经工程化的核酸或病毒系统。LNP形成中使用的脂质可以是阳离子、阴离子或中性的。脂质可以是合成的或天然来源的，并且在一些情况下是可生物降解的。脂质可以包含脂肪、胆固醇、磷脂、脂质缀合物，包含但不限于聚乙二醇(PEG)缀合物(PEG化脂质)、蜡、油、甘油酯和脂溶性维生素。脂质组合物通常包含限定的材料混合物，如阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质和两亲性脂质。在一些情况下，包含特定脂质以防止LNP聚集、防止脂质氧化或提供促进附加部分附接的功能性化学基团。脂质组合物可影响整体LNP大小和稳定性。在一个实例中，脂质组合物包括二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(MC3)或MC3样分子。可以将MC3和MC3样脂质组合物配制成包含一种或多种其他脂质，如PEG或PEG缀合脂质、固醇或中性脂质。另外，LNP可进一步设计或功能化，以促进特定细胞类型的靶向。LNP设计中的另一个考虑因素是靶向效率和细胞毒性之间的平衡。
一般来说，胶束是使用单链脂质形成的球形合成脂质结构，其中单链脂质的亲水头部形成外层或膜，并且单链脂质的疏水尾部形成胶束中心。胶束通常是指仅含脂质单层的脂质结构。胶束在Quader等人(Mol Ther.2017Jul 5；25(7):1501–1513)中，所述文献出于所有目的通过引用并入本文。
直接暴露于血清的核酸载体，如表达载体，可能有几种不良后果，包括血清核酸酶对核酸的降解或游离核酸对免疫系统的脱靶刺激。类似地，直接暴露于血清的病毒递送系统可以触发不期望的免疫反应和/或病毒递送系统的中和。因此，经工程化的核酸和/或病毒递送系统的封装可用于避免降解，同时也避免潜在的脱靶影响。在某些实例中，经工程化的核酸和/或病毒递送系统被完全封装在递送媒剂内，如在LNP的水性内部。可以通过本领域技术人员熟知的技术，如在微流体液滴生成装置上进行的微流体混合和液滴生成，将经工程化的核酸和/或病毒递送系统封装在LNP内。此类装置包含但不限于标准T形接头装置或流量聚焦装置。在一个实例中，将所需的脂质制剂，如含有MC3或MC3样组合物，与经工程化的核酸或病毒递送系统和任何其他所需的试剂并行地提供给液滴生成装置，使得递送载体和所需的试剂完全封装在基于MC3或MC3样的LNP内部。在一个实例中，液滴生成装置可以控制所产生的LNP的大小范围和大小分布。例如，LNP的大小可以在直径为1至1000纳米的范围内，例如1、10、50、100、500或1000纳米。液滴产生后，可以进一步对包封货物/有效载荷(例如，经工程化的核酸和/或病毒递送系统)的递送媒剂进行处理或工程化，以使其作好施用的准备。
纳米颗粒递送
纳米材料可用于递送工程化核酸(例如，编码嵌合多肽的多核苷酸分子)。重要的是，纳米材料媒介物可以由非免疫原性材料制成，并且通常避免引发对递送载体本身的免疫。这些材料可包含但不限于脂质(如前所述)、无机纳米材料和其他聚合材料。纳米材料颗粒在Riley等人(Recent Advances in Nanomaterials for Gene Delivery—AReview.Nanomaterials 2017,7(5),94)中有更详细的描述，所述文献以引用方式并入本文以用于所有目的。
基因组编辑系统
基因组编辑系统可用于工程化宿主基因组以编码工程化核酸，诸如编码本公开的嵌合多肽的多核苷酸分子。一般来讲，“基因组编辑系统”是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中的任何系统。基因组编辑系统包括但不限于转座子系统、核酸酶基因组编辑系统和基于病毒载体的递送平台。
转座子系统可用于将工程化核酸，诸如本公开的工程化核酸，整合到宿主基因组中。转座子通常包含位于货物/有效载荷核酸和转座酶两侧的末端反向重复序列(TIR)。转座子系统可以为TIR侧翼货物提供顺式或反式转座子。转座子系统可以是逆转录转座子系统或DNA转座子系统。一般来讲，转座子系统将货物/有效载荷(例如，经工程化的核酸)随机整合到宿主基因组中。转座子系统的实例包括使用Tc1/mariner转座子超家族的转座子的系统，诸如睡美人转座子系统，这些系统在Hudecek等人(Crit Rev Biochem MolBiol.2017Aug；52(4):355-380)和美国专利第6,489,458号、第6,613,752号和第7,985,739号中，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。转座子系统的另一个实例包括PiggyBac转座子系统，其在美国专利第6,218,185和6,962,810号中有更详细的描述，各自通过引用并入本文用于所有目的。
核酸酶基因组编辑系统可用于工程化宿主基因组以编码工程化核酸，诸如本公开的分离的多核苷酸或异源构建体。不希望受理论束缚，一般来讲，用于引入外源基因的核酸酶介导的基因编辑系统利用了细胞的天然DNA修复机制，特别是同源重组(HR)修复途径。简言之，在对基因组DNA产生损伤(通常是双链断裂)之后，细胞可以通过在DNA合成期间使用在其5'末端和3’末端具有相同或基本上相同的序列的另一DNA来源作为模板来修复损害而解决损伤。在自然情况下，HDR可以使用细胞中存在的其他染色体作为模板。在基因编辑系统中，将外源多核苷酸引入细胞中，用作同源重组模板(HRT或HR模板)。一般来讲，在模板化HDR期间，可以将在HRT内5’和3’互补末端之间包含有损伤的染色体中最初未发现的任何额外外源序列(例如，基因或基因的一部分)掺入(即，“整合”)到给定的基因组座位中。因此，给定的基因组基因座的典型HR模板具有与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列，与内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，以及编码货物/有效载荷核酸(例如，本文所述的任何工程化核酸，诸如编码一种或多种效应分子的任何工程化核酸)的核苷酸序列。
在一些实例中，HR模板可以是线性的。线性HR模板的实例包含但不限于线性化质粒载体、ssDNA、合成DNA和PCR扩增DNA。在特定实例中，HR模板可以是环状的，如质粒。环状模板可以包含超螺旋模板。
相对于要引入的外源序列，在HR模板的5'和3'末端发现的相同或基本上相同的序列通常称为臂(HR臂)。HR臂可以与内源基因组靶基因座的区域相同(即，100％相同)。一些实例中的HR臂可以与内源基因组靶基因座的区域基本上相同。虽然可以使用基本上相同的HR臂，但HR臂相同可能是有利的，因为HDR通路的效率可能受到具有小于100％同一性的HR臂的影响。
每条HR臂，即5'和3'HR臂，可以是相同大小或不同大小。每条HR臂的长度可以各自大于或等于50、100、200、300、400或500个碱基。尽管HR臂通常可以是任意长度，但是也可以考虑实际因素，如HR臂长度和整体模板大小对整体编辑效率的影响。HR臂可以与紧邻切割位点的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同。每条HR臂可以与紧邻切割位点的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同。每条HR臂可以与切割位点一定距离内的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同，所述距离如彼此相距1个碱基对、小于或等于10个碱基对、小于或等于50个碱基对，或小于或等于100个碱基对。
核酸酶基因组编辑系统可以使用多种核酸酶切割靶基因组基因座，包括但不限于成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶或其衍生物、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物，以及归巢核酸内切酶(HE)或其衍生物。
CRISPR介导的基因编辑系统可用于工程改造宿主基因组以编码工程化核酸，诸如编码本文所述的一种或多种效应分子的工程化核酸。CRISPR系统在M.Adli(“The CRISPRtool kit for genome editing and beyond”Nature Communications；volume 9(2018),Article number:1911)中有更详细的描述，其教导的所有内容通过引用并入本文。一般来讲，CRISPR介导的基因编辑系统包含CRISPR相关(Cas)核酸酶和将切割引向特定靶序列的RNA。示例性的CRISPR介导的基因编辑系统是由Cas9核酸酶和RNA构成的CRISPR/Cas9系统，所述RNA具有CRISPR RNA(crRNA)结构域和反式活化CRISPR(tracrRNA)结构域。crRNA通常具有两个RNA结构域：通过与靶序列(“确定的核苷酸序列”，例如基因组序列)的碱基对杂交来指导特异性的向导RNA序列(gRNA)；和与tracrRNA杂交的RNA结构域。tracrRNA可以与核酸酶(例如，Cas9)相互作用，从而促进核酸酶向基因组座位的募集。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是单独的多核苷酸。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是单个多核苷酸，也称为单向导RNA(sgRNA)。虽然此处说明了Cas9系统，但也可以使用其他CRISPR系统，如Cpf1系统。核酸酶可以包含其衍生物，如Cas9功能突变体，例如Cas9“切口酶”突变体，其通常仅介导确定的核苷酸序列的单链的切割，而不是通常由Cas9酶产生的完全双链断裂。
一般而言，CRISPR系统的组分彼此相互作用形成核糖核蛋白(RNP)复合物以介导序列特异性切割。在一些CRISPR系统中，每个组分都可以单独产生并用于形成RNP复合物。在一些CRISPR系统中，每个组分都可以在体外单独产生，并在体外彼此接触(即“复合”)以形成RNP复合物。然后可以将体外产生的RNP引入(即，“递送”)到细胞的细胞质和/或细胞核(例如，T细胞的细胞质和/或细胞核)中。体外产生的RNP复合物可以通过多种方式递送到细胞，这些方式包括但不限于电穿孔、脂质介导的转染、通过物理方式的细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和超声处理。在一个特定的实例中，可以使用基于电穿孔的递送系统将体外产生的RNP复合物递送到细胞中。其他电穿孔系统包含但不限于MaxCyte电穿孔系统、Miltenyi CliniMACS电穿孔系统、Neon电穿孔系统和BTX电穿孔系统。可以使用本领域技术人员已知的多种蛋白质生产技术在体外产生(即，合成和纯化)CRISPR核酸酶(例如，Cas9)。可以使用本领域技术人员已知的多种RNA生产技术(诸如体外转录或化学合成)在体外产生(即，合成和纯化)CRISPR系统RNA(例如，sgRNA)。
体外产生的RNP复合物可以以不同的核酸酶与gRNA比率复合。体外产生的RNP复合物也可以在CRISPR介导的编辑系统中以不同的量使用。例如，根据需要编辑的细胞数目，可以调整添加的RNP总量，如在反应中编辑大量细胞时减少添加的RNP复合物的量。
在一些CRISPR系统中，每种组分(例如，Cas9和sgRNA)可以由多核苷酸单独编码，其中每种多核苷酸一起或单独引入细胞中。在一些CRISPR系统中，每个组分都可以由单个多核苷酸编码(即，多启动子或多顺反子载体，见下文示例性多顺反子系统的描述)并引入细胞中。在每种多核苷酸编码的CRISPR组分在细胞内表达(例如，核酸酶的翻译和CRISPRRNA的转录)后，RNP复合物可以在细胞内形成，然后可以指导位点特异性切割。
一些RNP可以工程改造成具有促进RNP递送到细胞核中的部分。例如，Cas9核酸酶可以具有核定位信号(NLS)结构域，使得如果Cas9RNP复合物被递送到细胞的细胞质中，或者在Cas9翻译和随后RNP形成之后，NLS可以促进Cas9 RNP进一步运输到细胞核中。
本文所述的细胞可以使用非病毒方法进行工程化，例如，本文所述的核酸酶和/或CRISPR介导的基因编辑系统可以使用非病毒方法递送至细胞。本文所述的细胞可以使用病毒方法进行工程化，例如，本文所述的核酸酶和/或CRISPR介导的基因编辑系统可以使用病毒方法诸如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或本文所述的任何其他基于病毒的递送方法递送至细胞。
在一些CRISPR系统中，可以提供超过一种CRISPR组合物，使得每种组合物单独地靶向不止靶核苷酸序列处的相同基因或一般基因组座位。例如，可以提供两种单独的CRISPR组合物以指导在彼此一定距离内的两个不同靶核苷酸序列处切割。在一些CRISPR系统中，可以提供一种以上CRISPR组合物，使得每个组合物单独靶向相同基因或一般基因组基因座的相反链。例如，可以提供两种单独的CRISPR“切口酶”组合物以指导在相同基因或一般基因组基因座的相反链处切割。
一般来讲，本文所述的CRISPR介导的编辑系统的特征可以应用于其他基于核酸酶的基因组编辑系统。TALEN是经工程化的位点特异性核酸酶，其由TALE(转录活化因子样效应物)的DNA结合结构域和限制性内切核酸酶Fokl的催化结构域构成。通过改变DNA结合结构域的单体的高度可变残基区中存在的氨基酸，可以形成不同的人工TALEN来靶向各种核苷酸序列。DNA结合结构域随后将核酸酶指导至靶序列并产生双链断裂。基于TALEN的系统更详细描述于美国序列号12/965,590；美国专利第8,450,471号；美国专利第8,440,431号；美国专利第8,440,432号；美国专利第10,172,880号；以及美国序列号13/738,381中，所有这些都通过引用以其整体并入本文。基于ZFN的编辑系统更详细描述于美国专利第6,453,242号、第6,534,261号、第6,599,692号、第6,503,717号、第6,689,558号、第7,030,215号、第6,794,136号、第7,067,317号、第7,262,054号、第7,070,934号、第7,361,635号、第7,253,273号；和美国专利公布第2005/0064474号、第2007/0218528号、第2005/0267061号中；所述文献全部出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
其他工程改造递送系统
将工程化核酸(例如，编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸分子)引入细胞或其他靶受体实体(诸如本文所述的任何脂质结构)的各种额外方式。
电穿孔可用于将多核苷酸递送至受体实体。电穿孔是一种通过施加电场以使靶细胞或实体的外膜或外壳瞬时透化，将货物/有效载荷内化到靶细胞或实体的内部区室的方法。一般来讲，所述方法包括将细胞或靶实体置于含有所关注货物(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)的溶液中的两个电极之间。然后通过施加允许货物进入实体内部(诸如细胞的细胞质)的瞬态设定电压来破坏细胞的脂质膜，即透化。在细胞的实例中，即使不是大多数，也至少有一些细胞保持活力。细胞和其他实体可以在体外、体内或离体进行电穿孔。电穿孔条件(例如，细胞数量、货物浓度、恢复条件、电压、时间、电容、脉冲类型、脉冲长度、体积、电转杯长度、电穿孔溶液组成等)根据若干因素而变化，这些因素包括但不限于细胞或其他受体实体的类型、待递送的货物、期望的内化效率和期望的活力。此类标准的优化在本领域技术人员的范围内。多种装置和方案可用于电穿孔。实例包括但不限于转染系统、Flow ElectroporationTM、NucleofectorTM系统和电穿孔系统。
用于将工程化核酸(例如，编码本文所述的嵌合多肽的多核苷酸分子)引入细胞或其他靶受体实体中的其他方式包括但不限于超声处理、基因枪、流体动力学注射和通过物理方式的细胞膜变形。
用于在体内递送工程化mRNA(例如裸质粒或mRNA)的组合物和方法在Kowalski等人(Mol Ther.2019Apr 10；27(4):710–728)和Kaczmarek等人(Genome Med.2017；9:60.)中有详细描述，各自通过引用并入本文用于所有目的。
使用方法
使用本文所述的嵌合多肽、多核苷酸分子或细胞的方法也涵盖在本公开内容中。
在一些实施方案中，所述方法包括抑制感兴趣的基因的阻遏。抑制阻遏的方法可包括：提供包含表达系统的转化细胞，所述表达系统包含(i)编码本文所述的嵌合多肽的表达盒，和(ii)包含可操作连接至感兴趣的基因的ITM应答启动子的靶表达盒；在适于表达嵌合多肽的条件下培养转化的细胞；和通过使转化的细胞与促进嵌合多肽的降解的配体接触来诱导嵌合多肽的降解。
在一些实施方案中，抑制阻遏是可测量的，在转化细胞与配体接触后，与未接触配体的等价转化细胞中感兴趣的基因的表达相比，在转化细胞中可操作连接至ITM应答启动子的感兴趣的基因的表达增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。
在一些实施方案中，与不存在ITM时的表达水平相比，在不存在配体时，感兴趣的基因的表达水平被ITM阻遏至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少10倍。
体内方法
本文提供的方法还包括例如通过递送诱导嵌合多肽在体内降解的配体来体内抑制转录阻遏。
在一些实施方案中，转化的细胞在人或动物中，并且使转化的细胞与配体接触包括向人或动物施用药理学剂量的配体。在一些实施方案中，配体向受试者施用免疫调节药物(IMiD)，其促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解。在一些实施方案中，IMiD可以包括但不限于沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。在一些实施方案中，IMiD是泊马度胺，并且以约1mg/天至约50mg/天的浓度施用给受试者。在特定的实施方案中，非内源性配体以约4mg/天的浓度施用给受试者。
药物组合物
本公开的嵌合多肽、分离的多核苷酸和细胞可以配制成药物组合物。除了一种或多种工程化核酸或工程化细胞外，这些组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应无毒并且不应干扰活性成分的功效。载剂或其他材料的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌肉内、腹膜内途径。
无论是给予个体的细胞、多肽、核酸、小分子还是根据本公开的其他药学上有用的化合物，优选以“治疗有效量”或“预防有效量”施用(如这种情况可以，尽管可以认为预防是治疗)，这也足以显示对个体有益。实际施用的量及施用速率和时程将取决于所治疗的蛋白质聚集疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如对剂量的决定等)在一般从业者和其他医师的职责内，并且通常考虑了待治疗的病症、个别患者的病状、递送部位、施用方法和从业者已知的其他因素。上面提到的技术和方案的实例可见于Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.(编),1980。
组合物可单独施用或与其他治疗组合，同时施用或顺序施用，这取决于待治疗的病状。
附加实施方案
以下段落提供了额外列举的实施方案：
实施方案1:一种嵌合多肽，其包含：
(a)诱导型转录调节因子(ITM)，其中ITM包含转录阻遏物结构域和DNA结合结构域；和
(b)降解决定子，
其中所述降解决定子可操作地连接至所述ITM，并且
其中所述转录阻遏物结构域选自由以下组成的组：KRAB阻遏结构域、HDAC4结构域、SCX HLH结构域、ID1 HLH结构域、HERC2 Cyt-b5结构域、TWST1 HLH结构域、NKX22同源结构域、ID3 HLH结构域和TWST2 HLH结构域。
实施方案2:如实施方案1所述的嵌合多肽，其中所述转录阻遏物结构域包含所述KRAB阻遏结构域。
实施方案3:如实施方案2所述的嵌合多肽，其中所述KRAB阻遏结构域包含minKRAB。
实施方案4:如实施方案1至3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述KRAB阻遏结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
实施方案5:如实施方案4所述的嵌合多肽，其中所述KRAB阻遏结构域包含SEQ IDNO:2的KRAB阻遏物结构域变体，并且包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：W27L、K28L、D31A、T32A、Q34A、Q35A、R39E、L43S、T57C、K58C、P59C、V61Y、I62Y、I62A、L63W、L63Y、L63E、R64F、R64W、R64E、L65F、L65E、L65W、E66V、K67F、G68F和E69F。
实施方案6:如实施方案4所述的嵌合多肽，其中所述KRAB阻遏结构域包含SEQ IDNO:2的KRAB阻遏物结构域变体，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸取代：Q34A/Q35A、I62A、T57C/K58C/P59C、D31A/T32A、L63W/R64W/L65W、E66V、L63E/R64E/L65E、R64F/L65F、W27L/K28L KRAB、R39E、K67F/G68F/E69F和V61Y/I62Y/L63Y。
实施方案7:如实施方案1至3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述KRAB阻遏结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
实施方案8:如实施方案1所述的嵌合多肽，其中所述转录阻遏物结构域包含所述HDAC4阻遏结构域。
实施方案9:如实施方案8所述的嵌合多肽，其中所述HDAC4阻遏结构域包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列。
实施方案10:如实施方案1至9中任一项所述的嵌合多肽，其中所述DNA结合结构域包含锌指(ZF)蛋白结构域。
实施方案11:如实施方案10所述的嵌合多肽，其中所述ZF蛋白结构域在设计上是模块化的，并且由锌指基序的锌指阵列(ZFA)构成。
实施方案12:如实施方案11所述的嵌合多肽，其中所述ZF蛋白结构域包含一至十个锌指基序。
实施方案13:如实施方案11所述的嵌合多肽，其中所述ZF蛋白结构域包含六个锌指基序。
实施方案14:如实施方案13所述的嵌合多肽，其中所述ZF蛋白结构域包含SEQ IDNO:5。
实施方案15:如实施方案1至14中任一项所述的嵌合多肽，其中所述转录阻遏物结构域在所述DNA结合结构域的N末端。
实施方案16:如实施方案1至14中任一项所述的嵌合多肽，其中所述转录阻遏物结构域在所述DNA结合结构域的C末端。
实施方案17:如实施方案1至16中任一项所述的嵌合多肽，其中所述转录阻遏物结构域和所述DNA结合结构域由第一肽接头隔开。
实施方案18:如实施方案17所述的嵌合多肽，其中所述第一肽接头包含GGGGSGGT(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
实施方案19:如实施方案1至18中任一项所述的嵌合多肽，其中所述ITM是合成转录调节因子。
实施方案20:如实施方案1至19中任一项所述的嵌合多肽，其中所述降解决定子选自由以下组成的组：HCV NS4降解决定子、PEST(人IκBα的残基277-307的两个拷贝)、GRR(人类p105的残基352-408)、DRR(酵母Cdc34的残基210-295)、SNS(SP2和NB的串联重复序列(甲型流感或乙型流感的SP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPB残基1688-1702的四个拷贝)、SPmix(SP1和SP2的串联重复序列(甲型流感病毒M2蛋白的SP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(甲型流感病毒NS蛋白的残基79-93的三个拷贝)、ODC(鸟氨酸脱羧酶的残基106-142)、Nek2A、小鼠ODC(残基422-461)、小鼠ODC_DA(mODC的残基422-461，包括D433A和D434A点突变)、APC/C降解决定子、COP1 E3连接酶结合降解决定子基序、CRL4-Cdt2结合PIP降解决定子、actinfilin结合降解决定子、KEAP1结合降解决定子、KLHL2和KLHL3结合降解决定子、MDM2结合基序、N-降解决定子、缺氧信号传导中的羟脯氨酸修饰、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、SCF泛素连接酶结合磷酸降解决定子、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、DSGxxS磷酸依赖性降解决定子、Siah结合基序、SPOP SBC对接基序和PCNA结合PIP盒。
实施方案21:如实施方案1至20中任一项所述的嵌合多肽，其中所述降解决定子包含能够响应于免疫调节药物(IMiD)而结合CRBN的小脑蛋白(CRBN)多肽底物结构域。
实施方案22:如实施方案21所述的嵌合多肽，其中所述CRBN多肽底物结构域选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787和ZN827，或其能够进行药物诱导CRBN结合的片段。
实施方案23:如实施方案21或实施方案22所述的嵌合多肽，其中所述CRBN多肽底物结构域包含天然CRBN多肽序列的嵌合融合产物。
实施方案24:如实施方案21所述的嵌合多肽，其中所述CRBN多肽底物结构域包含具有FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的IKZF3/ZFP91/IKZF3嵌合融合产物。
实施方案25:如实施方案21至24中任一项所述的嵌合多肽，其中所述IMiD是经FDA批准的药物。
实施方案26:如实施方案21至25中任一项所述的嵌合多肽，其中所述IMiD选自由以下组成的组：沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
实施方案27:如实施方案1至26中任一项所述的嵌合多肽，其中所述ITM在降解决定子的N末端。
实施方案28:如实施方案1至26中任一项所述的嵌合多肽，其中所述ITM在去降解决定子的C末端。
实施方案29:如实施方案1至28中任一项所述的嵌合多肽，其中所述ITM通过第二肽接头与降解决定子隔开。
实施方案30:如实施方案29所述的嵌合多肽，其中所述第二肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GSGSGSGS(SEQ ID NO:7)、KEGS(SEQ ID NO:8)、EGK、EAAAK(SEQID NO:9)和AAPAKQE(SEQ ID NO:10)。
实施方案31:如实施方案29所述的嵌合多肽，其中所述第二个肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AAPAKQEAAAPAKQEAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKA(SEQ IDNO:12)和AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:13)。
实施方案32:一种表达盒，其包含可操作连接至编码如实施方案1至0中任一项所述的嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子。
实施方案33:如实施方案32所述的表达盒，其中所述启动子包含组成型启动子。
实施方案34:如实施方案33所述的表达盒，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1a、hCAGG、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
实施方案35:如实施方案32所述的表达盒，其中所述启动子包含诱导型启动子。
实施方案36:如实施方案35所述的表达盒，其中所述诱导型启动子包含最小启动子和选自由以下组成的组的应答元件：NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合体、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导物分子应答启动子以及它们的串联重复序列。
实施方案37:如实施方案36所述的表达盒，其中所述启动子包含合成启动子。
实施方案38:如实施方案32至37中任一项所述的表达盒，其中编码所述嵌合多肽的所述多核苷酸序列还编码包含mRNA去稳定元件的3’非翻译区(UTR)。
实施方案39:如实施方案38所述的表达盒，其中所述mRNA去稳定元件选自富含AU的元件和茎-环去稳定元件。
实施方案40:一种表达系统，其包含如实施方案32至39中任一项所述的表达盒和包含可操作连接至感兴趣的基因的ITM应答启动子的靶表达盒。
实施方案41:如实施方案40所述的表达系统，其中所述ITM应答启动子包含启动子序列和结合所述ITM的所述DNA结合结构域的序列。
实施方案42:如实施方案41所述的表达系统，其中结合所述DNA结合结构域的序列包含一个或多个锌指结合位点。
实施方案43:如实施方案42所述的表达系统，其中结合所述DNA结合结构域的序列包含一个或多个具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的锌指结合位点。
实施方案44:如实施方案42或实施方案43所述的表达系统，其中结合所述DNA结合结构域的序列包含四个或更多个锌指结合位点。
实施方案45:如实施方案44所述的表达系统，其中结合所述DNA结合结构域的序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
实施方案46:如实施方案40至45中任一项所述的表达系统，其中所述ITM应答启动子的启动子序列包含组成型启动子序列。
实施方案47:如实施方案46所述的表达系统，其中所述组成型启动子序列选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、EF1a、hCAGG、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
实施方案48:如实施方案40至47中任一项所述的表达系统，其中所述ITM应答启动子的启动子序列包含最小启动子。
实施方案49:如实施方案40至48中任一项所述的表达系统，其中所述ITM应答启动子包含合成启动子。
实施方案50:如实施方案40至49中任一项所述的表达系统，其中所述感兴趣的基因编码治疗性多肽。
实施方案51:如实施方案40至50中任一项所述的表达系统，其中所述感兴趣的基因编码选自由以下组成的组的多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂a、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案52:如实施方案40至51中任一项所述的表达系统，其包含异源构建体，所述异源构建体包含以下两者：(i)如实施方案28至35中任一项所述的表达盒和(ii)所述靶表达盒。
实施方案53:如实施方案40至51中任一项所述的表达系统，其包含含有如实施方案32至39中任一项所述的表达盒的第一异源构建体和包含所述靶表达盒的第二异源构建体。
实施方案54:一种分离的细胞，其包含如实施方案32至39中任一项所述的表达盒。
实施方案55:一种分离的细胞，其包含如实施方案40至53中任一项所述的表达系统。
实施方案56:如实施方案54或55所述的分离的细胞，其中所述细胞是人细胞。
实施方案57:如实施方案54至56中任一项所述的分离的细胞，其中所述细胞是干细胞。
实施方案58:如实施方案54至56中任一项所述的分离的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
实施方案59:如实施方案54至56中任一项所述的分离的细胞，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC衍生细胞、多能干细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC衍生细胞。
实施方案60:一种用于抑制感兴趣的基因的阻遏的遗传开关，其包含：如实施方案1至31中任一项所述的嵌合多肽和配体，其中所述配体与所述降解决定子的结合诱导所述嵌合多肽的降解，从而抑制所述感兴趣的基因的阻遏，其中所述感兴趣的基因可操作地连接至ITM应答启动子。
实施方案61:如实施方案60所述的遗传开关，其中所述配体包含促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解的免疫调节药物(IMiD)。
实施方案62:如实施方案61所述的遗传开关，其中所述IMiD是经FDA批准的药物。
实施方案63:如实施方案61或62所述的遗传开关，其中所述IMiD选自由以下组成的组：沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
实施方案64:一种抑制感兴趣的基因的阻遏的方法，其包括：
(a)提供包含表达系统的细胞，所述表达系统包含(i)编码如实施方案1至31中任一项所述的嵌合多肽的表达盒，和(ii)包含可操作连接至感兴趣的基因的ITM应答启动子的靶表达盒；和
(b)通过使转化的细胞与促进所述嵌合多肽的降解的配体接触来诱导所述嵌合多肽的降解。
实施方案65:如实施方案64所述的方法，其中所述方法还包括在适合表达嵌合多肽的条件下培养所述细胞。
实施方案66:如实施方案64或实施方案65所述的方法，其中编码所述嵌合多肽的所述表达盒包含如实施方案32至39中任一项所述的表达盒。
实施方案67:如实施方案64至66中任一项所述的方法，其中所述表达系统包含如实施方案40至53中任一项所述的表达系统。
实施方案68:一种产生能够进行药物调控的转录阻遏的细胞的方法，所述方法包括用如实施方案32至39中任一项所述的表达盒或如实施方案40至56中任一项所述的表达系统转化所述细胞。
实施例
下面是用于实施本公开的具体实施方案的实施例。提供实施例仅仅是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本公开的范围。已经努力确保所用的数字的准确性(例如，数量，温度等)，但是当然应允许一些实验误差和偏差。
除非另有说明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。此类技术在文献中有全面解释。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.，当前新增)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.)；Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A卷和B卷(1992)。
实施例1：降解决定子连接的DNA结合物的有效降解
评估了药物处理后降解决定子连接的DNA结合物的降解效率。
材料和方法
用编码如表4中所示的每种构建体的慢病毒(每种50,000pg，通过p24测定滴定)转导U87-MG细胞(50,000个细胞/转导)。每个构建体格式从5’到3’(ORF从N末端到C末端)描述，序列描述在表4中。
表4测试降解效率的构建体
| 构建体名称 | 描述 |
| SB03433 | ZF10-BFP-A(EAAAK)3A-降解决定子 |
| SB03434 | ZF10-BFP-(GS)4GG-降解决定子 |
| SB03435 | ZF10-BFP-ecpd接头-降解决定子 |
| SB03436 | 降解决定子-A(EAAAK)3A-BFP-ZF10 |
| SB03437 | 降解决定子-(GS)4GG-BFP-ZF10 |
| SB03438 | ZF10-BFP-KEGS-降解决定子 |
| SB03439 | ZF10-BFP-EGK-降解决定子 |
| SB03440 | ZF10-BFP-ConMJ-降解决定子 |
| SB03441 | 降解决定子-KEGS-BFP-ZF10 |
| SB03442 | 降解决定子-EGK-BFP-ZF10 |
| SB03443 | 降解决定子-ConMJ-BFP-ZF10 |
| SB03444 | 降解决定子-(GS)4GG-BFP-ZF10-A(EAAAK)3A-降解决定子 |
| SB03445 | 降解决定子A(EAAAK)3A-降解决定子-(GS)4GG-BFP-ZF10 |
| SB02863 | 降解决定子-A(EAAAK)3A-ZF10-BFP |
| SB02861 | ZF10-BFP(阴性对照) |
在转导后的第2天，在存在1μM泊马度胺或不存在药物的情况下，将每个细胞组培养7天，并且通过荧光活化细胞分选(FACS)评估蓝色荧光蛋白(BFP)表达。图1中显示了每个细胞组(具有或不具有药物)的BFP表达。
结果
针对包括小脑蛋白(CRBN)多肽底物结构域(在表4中称为“降解决定子”)的构建体，在不同的取向上并使用不同的接头，评估响应于免疫调节药物(IMiD)泊马度胺的泛素途径介导的降解。如图1中所示，对于每个测试的构建体，在不存在药物时，至少40％的细胞为BFP阳性，而在存在泊马度胺时，10％或更少的细胞为BFP阳性。对于每个构建体，将存在药物时BFP阳性细胞的百分比与不存在药物时BFP阳性细胞的百分比进行比较，以确定降解百分比。表5显示了每个测试构建体的降解百分比。结果证明了构建体的IMiD依赖性降解。
表5药物处理后的降解效率
| 构建体名称 | 降解％ |
| SB03433 | 96.1 |
| SB03434 | 95.2 |
| SB03435 | 94.8 |
| SB03436 | 96.2 |
| SB03437 | 96.0 |
| SB03438 | 82.3 |
| SB03439 | 86.0 |
| SB03440 | 85.4 |
| SB03441 | 93.8 |
| SB03442 | 93.3 |
| SB03443 | 94.8 |
| SB03444 | 92.1 |
| SB03445 | 92.7 |
| SB02863 | 94.5 |
| SB02861 | -0.98 |
实施例2：降解降解决定子连接的阻遏物以诱导转录
通过用编码连接至SEQ ID NO:56的ITM应答启动子的mCherry的慢病毒转导U87-MG细胞产生报告基因细胞系，所述启动子包括EF1α核心启动子序列，所述核心启动子序列具有由核心启动子序列上游的四个ZF10-1结合位点构成的锌指结合结构域。
通过转导测定评估降解决定子连接的阻遏物调节报告基因的蛋白质表达的能力。
材料和方法
通过用编码连接至SEQ ID NO:56的ITM应答启动子的mCherry的慢病毒转导U87-MG细胞产生报告基因细胞系，所述启动子包括EF1a核心启动子序列，所述核心启动子序列具有由核心启动子序列上游的四个ZF10-1结合位点构成的锌指结合结构域。用编码如表6中所示的每种构建体的慢病毒(每种50,000pg，通过p24测定滴定)转导报告基因细胞(50,000个细胞/转导)。每个构建体格式从5’到3’(ORF从N末端到C末端)描述。构建体SB03757和SB03760包括针对大肠杆菌(E.coli)和构建体SB03758和SB03761密码子优化的minKrab阻遏结构域。对于构建体SB03758和SB03761，整个构建体针对大肠杆菌进行了密码子优化。
表6用于转导报告基因细胞的构建体
| 构建体名称 | 描述 |
| SB03747 | 降解决定子-A(EAAAK)3A-ZF10-BFP-AuSLDE |
| SB03750 | BFP-ZF10-ecpd-降解决定子-AuSLDE |
| SB03757 | 降解决定子-A(EAAAK)3A-ZF10-minKrab.大肠杆菌密码子优化 |
| SB03758 | 所有大肠杆菌密码子优化：降解决定子-A(EAAAK)3A-ZF10-minKrab |
| SB03759 | 降解决定子-A(EAAAK)3A-ZF10-minKrab-AuSLDE |
| SB03760 | 大肠杆菌密码子优化minKrab-ZF10-ecpd-降解决定子 |
| SB03761 | 所有大肠杆菌密码子优化：minKrab-ZF10-ecpd-降解决定子 |
| SB03762 | minKrab-ZF10-ecpd-降解决定子-AuSLDE |
| SB03255 | ZF10-minKrab-A(EAAAK)3A接头-降解决定子 |
| SB02131 | 降解决定子-A(EAAAK)3A-ZF10-minKrab |
在转导后的第2天，在存在1μM泊马度胺或不存在药物的情况下孵育细胞。在药物处理的第5天，通过荧光活化细胞分选(FACS)分析细胞的mCherry表达。
结果
使用不同的Krab衍生的阻遏结构域、接头和mRNA去稳定元件，在不同取向上评估包括小脑蛋白(CRBN)多肽底物结构域(d913)的构建体的降解决定子连接的启动子调控。各条件下mCherry的几何平均荧光强度(MFI)示于图2中。如图3中所示，计算无药物条件下相比于泊马度胺处理条件下mCherry的几何MFI之间的倍数差异。如图3中所示，响应于泊马度胺处理，用构建体SB03758和SB03759进行药物诱导的阻遏释放是可能的。图4A显示了在存在或不存在泊马度胺的情况下，并且与未转导的细胞(缺少报告基因)和未用阻遏物转导的报告基因细胞相比，SB03758转导的细胞的mCherry表达的直方图。图4B显示了在存在或不存在泊马度胺的情况下，并且与未转导的细胞(缺少报告基因)和未用阻遏物转导的报告基因细胞相比，SB03759转导的细胞的mCherry表达的直方图。图4A和图4B中显示的直方图证明SB03758和SB03759的阻遏可以以药物依赖的方式调控
实施例3：优化降解决定子连接的阻遏物的降解
对工程化以优化药物诱导的阻遏释放的构建体进行分析，以直接测试降解效率。
材料和方法
实施例2中所述的报告基因细胞用编码表7中所示的每种构建体的慢病毒(每种50,000pg，通过p24测定滴定)转导(50,000个细胞/转导)，或者作为阴性对照不进行转导。每个构建体格式从5’到3’(ORF从N末端到C末端)描述。SB03747和SB03750都在3’端包含mRNA去稳定标签AuSLDE。转导后七天，在1μM泊马度胺存在下或在不存在药物的情况下处理5天，通过荧光活化细胞分选(FACS)分析测量BFP。
表7针对阻遏的可逆性而优化的构建体
| 构建体 | 描述 |
| SB03747 | 降解决定子-A(EAAAK)3A-ZF10-1-BFP-AuSLDE |
| SB03750 | BFP-ZF10-1-ecpd-降解决定子-AuSLDE |
结果
如图5中所示，构建体SB03747和SB03750在用1μM泊马度胺处理后分别表现出81.3％和72.5％的降解百分比。因此，两种构建体在泊马度胺处理后都被有效降解。
实施例4：具有不同构建取向的降解决定子连接的阻遏物的降解诱导转录
通过转导测定评估具有不同取向的降解决定子连接的阻遏物调节报告基因表达的能力。
材料和方法
如实施例2中所述产生报告基因细胞系。用编码构建体的慢病毒(每种50,000pg，通过p24测定滴定)转导(50,000个细胞/转导)报告基因细胞，所述构建体具有诱导型转录调节因子(ITM)的降解决定子N末端(表8)，或具有ITM的降解决定子C末端(表9)。如实施例2中所述的构建体SB03758和SB03759也包括在本实验中。每个构建体格式从5’到3’(ORF从N末端到C末端)描述。
表8具有N末端降解决定子的构建体
表9具有C末端降解决定子的构建体
| 构建体名称 | 构建体描述 |
| SB03944 | ZF10-SCX-ecpd-降解决定子 |
| SB03945 | ZF10-ID1-ecpd-降解决定子 |
| SB03946 | ZF10-HERC2-ecpd-降解决定子 |
| SB03947 | ZF10-TWST1-ecpd-降解决定子 |
| SB03948 | ZF10-NKX22-ecpd-降解决定子 |
| SB03949 | ZF10-ID3-ecpd-降解决定子 |
| SB03950 | ZF10-TWST2-ecpd-降解决定子 |
| SB03951 | ZF10-KRABQ354A/Q36A-ecpd-降解决定子 |
| SB03952 | ZF10-KRABI62A-ecpd-降解决定子 |
| SB03937 | ZF10-HDAC4-ecpd-降解决定子 |
在转导后的第2天，在存在1μM泊马度胺或不存在药物的情况下孵育用每种构建体转导的细胞。在药物处理的第5天，通过荧光活化细胞分选(FACS)分析细胞的mCherry表达。图6A显示了在N末端具有降解决定子的每个构建体的mCherry的几何平均荧光强度(MFI)。如图图6B中所示计算在N末端具有降解决定子的每个构建体的无药物条件相比于泊马度胺处理条件的mCherry的几何MFI之间的倍数差异。图7A中显示了在C末端具有降解决定子的每个构建体的mCherry的几何平均荧光强度(MFI)。如图图7B所示计算在C末端具有降解决定子的每个构建体的无药物条件相比于泊马度胺处理条件的mCherry的几何MFI之间的倍数差异。
结果
使用不同的阻遏结构域、接头和mRNA去稳定元件，在不同取向上评估包括小脑蛋白(CRBN)多肽底物结构域(d913)的构建体的降解决定子连接的启动子调控。如图图6A中所示，具有HDAC4阻遏物结构域并在N末端具有降解决定子的降解决定子连接的阻遏物能够在不存在药物的情况下阻遏报告基因表达，并且如在药物存在下诱导的报告基因表达所示，阻遏被释放。此外，图6A证实了构建体SB03758和SB03759的阻遏的可逆性，如实施例2中所证明的。如图6B中所示，具有HDAC4阻遏物结构域并在N末端具有降解决定子的降解决定子连接的阻遏物，以及构建体SB03758和SB03759均显示与不存在药物相比，在药物存在下报告基因表达增加至少4倍。如图7A所示，具有HDAC4阻遏物结构域并在C末端具有降解决定子的降解决定子连接的阻遏物能够在不存在药物的情况下阻遏报告基因表达，并且如在药物存在下诱导的报告基因表达所示，所述阻遏是可逆的。此外，图7A提供了如图6A所示并且也在实施例2中证明的构建体SB03758和SB03759的另一个确认。如图7B所示，具有HDAC4阻遏物结构域并在C末端具有降解决定子的降解决定子连接的阻遏物，以及构建体SB03758和SB03759均显示与不存在药物相比，在药物存在下报告基因表达增加至少4倍。因此，数据证明构建体能够以药物依赖的、可调控的方式阻遏转录。
表10序列
实施例5：IMiD调控的IL-12有效载荷在IMiD-开启系统中的表达
在系统中评估了IMiD调控的IL-12有效载荷表达的效率，在所述系统中，添加IMiD通过降解降解决定子连接的阻遏物来增加IL-12的表达。
材料和方法
在转导前18-14小时，将50,000个U87MG细胞接种在24w培养皿中，然后用25k pg的降解决定子连接的阻遏物(SB03759、SB03936或SB04397)和25k pg的IL12报告基因构建体(SB04640)转导(通过p24ELISA定量病毒)。将连接至ITM应答启动子的编码IL-12的构建体用作报告基因，所述启动子包括具有锌指结合结构域的EFS启动子序列，所述结构域由EFS启动子序列(SEQ ID NO:67)上游的四个ZF10-1结合位点构成。
对于泊马度胺滴定实验，转导后两天，将细胞分成无药物培养基或1uM泊马度胺条件。然后3天后，将每种条件下的100k细胞接种到24w板中，并且在24小时后，收集上清液并使用IL12 p70 ELISA试剂盒(#D1200 R&D Systems)测定以定量IL-12。
对于动力学实验研究，将转导的细胞以每孔100k细胞接种在24w板中。然后24小时后，用不含药物或1uM泊马度胺或伊比度胺替换上清液。在药物处理后指定的经过时间(3小时、6小时、12小时、16小时和24小时)收获上清液。
评估的构建体示于表11中。每个构建体格式从5’到3’(ORF从N末端到C末端)描述，序列描述在表11中。构建体的序列示于表12中。
表11针对IMiD-开启调控的IL-12有效载荷表达测试的构建体
结果
对于包含不同取向的d913降解决定子的构建体和使用药物可调控系统的不同接头，评估了对免疫调节药物(IMiD)泊马度胺作出应答的受调控的IL-12表达，在所述系统中，添加IMiD导致降解决定子连接的阻遏物降解，导致有效载荷表达增加(“IMiD开启”)。
构建降解决定子连接的阻遏物以通过诱导型转录调节因子(ITM)在无药物条件下阻遏有效载荷IL-12的表达，所述诱导型转录调节因子具有转录阻遏物和在无药物存在时结合可操作连接至IL-12的启动子的DNA结合结构域，。ITM连接至降解决定子，使得当添加IMiD泊马度胺后降解决定子连接的ITM降解时，转录阻遏被释放。
评估了三种不同的降解决定子连接的阻遏物在无药物条件下或增加泊马度胺浓度(1nM、10nM、100nM和1uM)下调控IL-12表达的能力。如图8中所示，在添加用于构建体SB03936和SB04397的IMiD后，IL-12表达增加。IL-12水平显示在上图中。下图显示的是当降解决定子连接的阻遏物随着增加的泊马度胺浓度的添加而降解时，IL-12恢复表达到非阻遏水平的定量。IL-12水平显示为用组成型IL-12报告基因转导的细胞中定量的IL12表达水平的分数。在由SB04397降解决定子连接的阻遏物调控并用10nM或更高浓度的泊马度胺处理的细胞中，IL-12表达恢复到仅有报告基因的水平。结果证明了IL-12产生的IMiD依赖性调节，其中IMiD的添加增加了IL-12在“IMiD-开启”系统中的表达，所述系统具有降解决定子连接的阻遏物。
然后评估降解决定子连接的阻遏物SB04397的动力学。还比较了IMiD泊马度胺和伊比度胺。如图9中所示，对于用IL-12报告基因SB04640和降解决定子连接的阻遏物SB04397转染的细胞(左栏)，对于1uM泊马度胺(上图)和1uM伊比度胺(下图)处理，与仅报告基因对照(右栏)相比，IL-12表达水平在从细胞收集的上清液中随时间增加。在额外的时间点进一步评估降解决定子连接的阻遏物SB04397和IMiD泊马度胺的动力学。如图10中所示，IL-12表达水平(在仅用SB04640报告基因转导的细胞中标准化为IL-12表达水平进行评估)在添加1uM泊马度胺后的第12小时和第16小时显示增加的IL-12表达。这些结果证明了IMiD开启开关的快速活化，在添加IMiD并开始降解降解决定子连接的阻遏物的24小时内检测到IL-12的表达。
表12序列
虽然本公开已经参考优选实施方案和各种替代实施方案具体地示出和描述，但是相关领域的技术人员将理解，在不脱离本公开和所附权利要求的精神和范围的情况下可以在其中做出形式和细节上的各种变化。
本说明书正文中引用的所有参考文献、颁发的专利和专利申请均通过引用整体并入本文用于所有目的。
Claims (14)
1.一种嵌合多肽，其包含：
(a)诱导型转录调节因子(ITM)，其中ITM包含转录阻遏物结构域和DNA结合结构域；和
(b)降解决定子，
其中所述降解决定子可操作地连接至所述ITM，并且
其中所述转录阻遏物结构域选自由以下组成的组：KRAB阻遏结构域、HDAC4结构域、SCXHLH结构域、ID1 HLH结构域、HERC2 Cyt-b5结构域、TWST1 HLH结构域、NKX22同源结构域、ID3 HLH结构域和TWST2 HLH结构域。
2.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述转录阻遏物结构域包含所述KRAB阻遏结构域，
任选地其中所述KRAB阻遏结构域包含minKRAB，
任选地其中所述KRAB阻遏结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，
任选地其中所述KRAB阻遏结构域包含SEQ ID NO:2的KRAB阻遏物结构域变体，并且包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：W27L、K28L、D31A、T32A、Q34A、Q35A、R39E、L43S、T57C、K58C、P59C、V61Y、I62Y、I62A、L63W、L63Y、L63E、R64F、R64W、R64E、L65F、L65E、L65W、E66V、K67F、G68F和E69F，任选地其中所述KRAB阻遏物结构域包含SEQ ID NO:2的KRAB阻遏结构域变体，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸取代：Q34A/Q35A、I62A、T57C/K58C/P59C、D31A/T32A、L63W/R64W/L65W、E66V、L63E/R64E/L65E、R64F/L65F、W27L/K28L KRAB、R39E、K67F/G68F/E69F和V61Y/I62Y/L63Y，
任选地其中所述KRAB阻遏结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述转录阻遏物结构域包含所述HDAC4阻遏结构域，
任选地其中所述HDAC4阻遏结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述DNA结合结构域包含锌指(ZF)蛋白结构域，
任选地其中所述ZF蛋白结构域在设计上是模块化的并由锌指基序的锌指阵列(ZFA)构成，
任选地其中所述ZF蛋白结构域包含一个至十个锌指基序，
任选地其中所述ZF蛋白结构域包含六个锌指基序，
任选地其中所述ZF蛋白结构域包含SEQ ID NO:5。
5.如权利要求1至4中任一项所述的嵌合多肽，其中：
a.所述转录阻遏物结构域在所述DNA结合结构域的N末端或所述DNA结合结构域的C末端；和/或
b.所述转录阻遏物结构域和所述DNA结合结构域由第一肽接头隔开，
任选地其中所述第一肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GGGGSGGT(SEQID NO:60)；和/或
c.所述ITM是合成的转录调节因子。
6.如权利要求1至5中任一项所述的嵌合多肽，其中：
(a)所述降解决定子选自由以下组成的组：HCV NS4降解决定子、PEST(人IκBα的残基277-307的两个拷贝)、GRR(人类p105的残基352-408)、DRR(酵母Cdc34的残基210-295)、SNS(SP2和NB的串联重复序列(甲型流感或乙型流感的SP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPB残基1688-1702的四个拷贝)、SPmix(SP1和SP2的串联重复序列(甲型流感病毒M2蛋白的SP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(甲型流感病毒NS蛋白的残基79-93的三个拷贝)、ODC(鸟氨酸脱羧酶的残基106-142)、Nek2A、小鼠ODC(残基422-461)、小鼠ODC_DA(mODC的残基422-461，包括D433A和D434A点突变)、APC/C降解决定子、COP1 E3连接酶结合降解决定子基序、CRL4-Cdt2结合PIP降解决定子、actinfilin结合降解决定子、KEAP1结合降解决定子、KLHL2和KLHL3结合降解决定子、MDM2结合基序、N-降解决定子、缺氧信号传导中的羟脯氨酸修饰、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、SCF泛素连接酶结合磷酸降解决定子、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、DSGxxS磷酸依赖性降解决定子、Siah结合基序、SPOP SBC对接基序和PCNA结合PIP盒；并且/或者
(b)所述降解决定子包含能够响应于免疫调节药物(IMiD)而结合CRBN的小脑蛋白(CRBN)多肽底物结构域，
任选地其中所述CRBN多肽底物结构域选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787和ZN827，或其能够进行药物诱导CRBN结合的片段，
任选地其中所述CRBN多肽底物结构域包含天然CRBN多肽序列的嵌合融合产物，
任选地其中所述CRBN多肽底物结构域包含具有FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的IKZF3/ZFP91/IKZF3嵌合融合产物；和/或
(c)所述IMiD是FDA批准的药物，
任选地其中所述IMiD选自由以下组成的组：沙利度胺、来那度胺和泊马度胺，
任选地其中所述ITM在降解决定子的N末端或降解决定子的C末端，
任选地其中所述ITM通过第二肽接头与降解决定子隔开，
任选地其中所述第二肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GSGSGSGS(SEQID NO:7)、KEGS(SEQ ID NO:8)、EGK、EAAAK(SEQ ID NO:9)和AAPAKQE(SEQ ID NO:10)，或所述第二肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AAPAKQEAAAPAKQEAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKA(SEQ ID NO:12)和AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:13)。
7.一种表达盒，其包含可操作连接至编码如权利要求1至6中任一项所述的嵌合多肽的多核苷酸序列的启动子，
任选地其中所述启动子包含选自由以下组成的组的组成型启动子：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1a、hCAGG、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb，或
所述启动子包含诱导型启动子，任选地其中所述诱导型启动子包含最小启动子和选自由以下组成的组的应答元件：NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合体、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答启动子及其串联重复序列，任选地其中所述启动子包含合成启动子，
任选地其中编码所述嵌合多肽的所述多核苷酸序列还编码包含mRNA去稳定元件的3’非翻译区(UTR)，
任选地其中所述mRNA去稳定元件选自由以下组成的组：富含AU的元件和茎-环去稳定元件。
8.一种表达系统，其包含如权利要求7所述的表达盒和包含可操作连接至感兴趣的基因的ITM应答启动子的靶表达盒，
任选地其中所述ITM应答启动子包含启动子序列和结合所述ITM的所述DNA结合结构域的序列，
任选地其中结合所述DNA结合结构域的所述序列包含一个或多个锌指结合位点，
任选地其中结合所述DNA结合结构域的所述序列包含一个或多个具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的锌指结合位点，
任选地其中结合所述DNA结合结构域的所述序列包含四个或更多个锌指结合位点，
任选地其中结合所述DNA结合结构域的所述序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
任选地其中所述ITM应答启动子的所述启动子序列包含选自由以下组成的组的组成型启动子序列：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、EF1a、hCAGG、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb，
任选地其中所述ITM应答启动子的所述启动子序列包含最小启动子，
任选地其中所述ITM应答启动子包含合成启动子，
任选地其中所述感兴趣的基因编码选自由以下组成的组的治疗性多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂a、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶，任选地其中所述表达系统包含异源构建体，所述异源构建体包含：(i)如权利要求7所述的表达盒和(ii)所述靶表达盒，
任选地其中所述表达系统包含含有如权利要求7所述的表达盒的第一异源构建体和含有所述靶表达盒的第二异源构建体。
9.一种分离的细胞，其包含如权利要求7所述的表达盒或如权利要求8所述的表达系统。
10.如权利要求9所述的分离的细胞，其中：
a.所述细胞是人细胞；和/或
b.所述细胞是干细胞；和/或
c.所述细胞是免疫细胞；和/或
d.所述细胞选自由以下各项组成的组：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调控性T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC来源的细胞、多能干细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC来源的细胞。
11.一种用于抑制感兴趣的基因的阻遏的遗传开关，其包含：如权利要求1至6中任一项所述的嵌合多肽和配体，其中所述配体与所述降解决定子的结合诱导所述嵌合多肽的降解，从而抑制所述感兴趣的基因的阻遏，其中所述感兴趣的基因可操作地连接至ITM应答启动子，任选地其中所述配体包含促进泛素途径介导的所述嵌合多肽的降解的免疫调节药物(IMiD)，
任选地其中所述IMiD是FDA批准的药物，
任选地其中所述IMiD选自由以下组成的组：沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
12.一种抑制感兴趣的基因的阻遏的方法，其包括：
a.提供包含表达系统的细胞，所述表达系统包含(i)编码如权利要求1至6中任一项所述的嵌合多肽的表达盒，和(ii)包含可操作连接至所述感兴趣的基因的ITM应答启动子的靶表达盒；和
b.通过使转化的细胞与促进所述嵌合多肽的降解的配体接触来诱导所述嵌合多肽的降解。
13.如权利要求12所述的方法，其中：
a.所述方法还包括在适合表达所述嵌合多肽的条件下培养所述细胞；和/或
b.编码所述嵌合多肽的所述表达盒包含如权利要求7所述的表达盒；和/或
c.所述表达系统包含如权利要求8所述的表达系统。
14.一种产生能够进行药物调控的转录阻遏的细胞的方法，所述方法包括用如权利要求7所述的表达盒或如权利要求8所述的表达系统转化所述细胞。
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| Shi et al. | In: Gene Therapy and Cancer Research Progress ISBN: 978-1-60021-811-8© 2008 Nova Science Publishers, Inc. Editor: Jessica L. Lewis, pp. 23-129 |
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