CN117761184A - 基于质谱联用技术的非标农药检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非标农药检测技术领域，且公开了基于质谱联用技术的非标农药检测方法，经无水MgSO4与NaCl盐析除水后，取上清液进行净化处理，即提取液经装有150mgN－丙基乙二胺(PSA)填料、900无水mgMgSO4的净化管净化，除去样品中大部分的色素及有机酸等干扰基质，再经LC－MS/MS分析，有效地降低了样品中的复杂基质所带来的背景干扰，该方法简单快速、重复性好、材料易得、成本低廉，并且结果均符合欧盟农药残留分析质量控制程序要求与日本和欧盟对农残“一律标准”中农药限量要求，为国内食品安全检测此类农药的残留以及出口蔬菜时对此类农残的检测提供参考检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及非标农药检测技术领域，具体为基于质谱联用技术的非标农药检测方法。
背景技术
我国作为农药生产和使用大国，农药在农作物的增产增收方面发挥着重要作用，但大量农药的不合理应用，已对生态环境和人体健康造成极大威胁。农药是指在农业生产活动中能够保证农业产量，通过化学合成或来源于生物、天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂，主要用于预防、控制危害农业、林业的病、虫、草、鼠和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长。喷洒在蔬菜上的农药经过代谢后，有效成分逐渐降解，但不能全部消失，其中一部分附着在蔬菜上被吸收，通过食物链传递给人，从而危害人体健康。同时我国作为农业大国，农药残留已成为我国蔬菜出口的一大障碍，蔬菜因农药残留超标经常被进口国拒之门外，给种植户造成严重损失，也严重影响我国农产品出口竞争力。
QuEChERS方法具有操作简便、耗时短、有机溶剂消耗少、成本低等优势，已广泛应用于多农药残留分析。
其中，基于分散固相萃取技术的净化过程是决定方法准确度和灵敏度的关键。净化过程利用净化吸附剂对杂质成分进行吸附、分离，将目标分析物保留在提取液中，从而做到去除杂质，纯化目标分析物的目的。
目前，N－丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷(C18)和石墨化炭黑(GCB)是常用的净化吸附剂，它们分别对一些极性化合物、非极性化合物和色素有很好的去除作用。然而，QuEChERS净化某些基质存在局限性，传统的净化材料不能达到理想的净化效果，杂质成分在提取过程中可能与目标分析物一起被提取，影响目标分析物定量结果的准确性。
如何快速、准确地检测农产品农药残留是控制农药残留危害需首先解决的问题，因此，开发高效快捷、精准的农残检测方法至关重要。
发明内容
本发明提供了基于质谱联用技术的非标农药检测方法，解决了上述背景技术所提出的问题。
本发明提供如下技术方案：基于质谱联用技术的非标农药检测方法，包括以下步骤：
步骤S1：样品提取，称取10g样品于50mL塑料离心管中,加入15mL乙腈、4gMgSO4、1gNaCl、NaCI 1g、TSCD1g和DHS0.5g,剧烈振荡10min,后于8000r/min离心5min,静置；
步骤S2：样品净化，吸取6mL提取上清液于15mL塑料离心管中,加入900mgMgSO4、150mgPSA、0mgGCB,涡旋混匀2min,后于8000r/min离心5min，吸取上清液经0.22μm针头滤器过滤后供LC－MS/MS分析；
步骤S3：空白基质溶液的配制；
称取10g空白样品，按照步骤S1、步骤S2的处理备用；
步骤S4：溶液的配制，
(1)标准储备液，准确移取农药标准品1mL,根据农药物质溶解度性质,分别采用溶剂溶解,定容至10mL，配制得质量浓度为100μg/mL的标准储备液,–20℃或4℃下冷藏避光密闭保存；
(2)混合标准中间液，分别移取一定量的各个标准储备液用乙腈定容至刻度线，配制成混合标准物质中间液，4℃避光密闭保存；
(3)空白基质标准溶液，取适量体积的混合标准物质中间液，用空白基质提取液稀释成标准系列工作曲线溶液，上机测试。
优选的，具体包括液相色谱条件：色谱柱：A4IB50040C18(2.0×150mm，5μm)；流动相：A为乙腈，B为10mmo l/L乙酸铵(含0.1％甲酸)水溶液；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL；洗脱梯度：0～0.01min，95％B；0.01～2.50min，10％B；2.50～8.50min，10％B；80～10.00min，95％B。
优选的，具体包括质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子多反应监测(MRM)扫描模式采集数据；
以全扫描、子离子扫描等方式优化每种农药的母离子和子离子的强度；
优化后的质谱分析条件：喷雾电压(I S)5000V；离子源温度(TEM)600℃；气帘气压力(CUR)：2.5×105Pa；雾化气压力(Gas1):6.0×105Pa；辅助加热气(Gas2)：6.0×105Pa；碰撞气(CAD)：9。
优选的，步骤S1具体包括10g样品的精确误差为0.01g；
乙腈：如测加标水平下平均回收率,须在加入提取溶剂之前完成加标。
优选的，步骤S3具体包括空白样品为已检测不含目标化合物的样品。
优选的，步骤S4中溶剂为甲醇、乙腈、丙酮或正己烷中一种或多种。
本发明具备以下有益效果：
该基于质谱联用技术的非标农药检测方法，改进QuEChERS与超高效液相色谱-质谱联用法(LC－MS/MS)相结合，建立了测定蔬菜中9种农药残留的分析方法，为虫脒盐酸盐、环溴虫酰胺、吡唑酰苯胺等农药残留的检测提供了新的理论依据；
之前有研究人员利用高效液相色谱-质谱联用技术建立了农药苯噻菌胺异丙酯的检测方法，其得到的检出限为0.16μg/kg，定量限为0.53μg/kg，而本发明得到的检出限为0.112μg/kg，定量限为0.373μg/kg，对比可知，本实验检测方法更加灵敏高效，该方法的回收率、相对标准偏差和检出限都符合日本及欧盟对果蔬农药残留限量的要求，从而更高效的为有关部门精准检测提供技术支撑，为出口蔬菜对此类农残的检测提供参考，促进农产品的出口贸易。
附图说明
图1为本发明定量和定性离子数据图；
图2为本发明标准溶液中9种化合物的色谱图；
图3为本发明不同提取剂农药的回收率；
图4为本发明不同提取剂剂量农药的回收率；
图5为本发明PSA用量对农药回收率的影响；
图6为本发明GCB用量对农药回收率的影响；
图7为本发明9种农药的基质效应表格；
图8为本发明9种农药的定量限(LOQ)结果图；
图9为本发明9种农药混合标准品添加量、平均回收率、精密度数据图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-9，基于质谱联用技术的非标农药检测方法，包括以下步骤：
步骤S1：样品提取，称取10g样品于50mL塑料离心管中,加入15mL乙腈、4gMgSO4、1gNaC l、NaCI 1g、TSCD1 g和DHS0.5g,剧烈振荡10min,后于8000r/min离心5min,静置；
步骤S2：样品净化，吸取6mL提取上清液于15mL塑料离心管中,加入900mgMgSO4、150mgPSA、0mgGCB,涡旋混匀2min,后于8000r/min离心5min，吸取上清液经0.22μm针头滤器过滤后供LC－MS/MS分析；
步骤S3：空白基质溶液的配制；
称取10g空白样品，按照步骤S1、步骤S2的处理备用；
步骤S4：溶液的配制，
(1)标准储备液，准确移取农药标准品1mL,根据农药物质溶解度性质,分别采用溶剂溶解,定容至10mL，配制得质量浓度为100μg/mL的标准储备液,–20℃或4℃下冷藏避光密闭保存；
(2)混合标准中间液，分别移取一定量的各个标准储备液用乙腈定容至刻度线，配制成混合标准物质中间液，4℃避光密闭保存；
(3)空白基质标准溶液，取适量体积的混合标准物质中间液，用空白基质提取液稀释成标准系列工作曲线溶液，上机测试。
其中，具体包括液相色谱条件：色谱柱：A4IB50040C18(2.0×150mm，5μm)；流动相：A为乙腈，B为10mmo l/L乙酸铵(含0.1％甲酸)水溶液；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL；洗脱梯度：0～0.01min，95％B；0.01～2.50min，10％B；2.50～8.50min，10％B；80～10.00min，95％B。
其中，具体包括质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子多反应监测(MRM)扫描模式采集数据；
以全扫描、子离子扫描等方式优化每种农药的母离子和子离子的强度；
优化后的质谱分析条件：喷雾电压(I S)5000V；离子源温度(TEM)600℃；气帘气压力(CUR)：2.5×105Pa；雾化气压力(Gas1):6.0×105Pa；辅助加热气(Gas2)：6.0×105Pa；碰撞气(CAD)：9。
其中，步骤S1具体包括10g样品的精确误差为0.01g；
乙腈：如测加标水平下平均回收率,须在加入提取溶剂之前完成加标。
其中，步骤S3具体包括空白样品为已检测不含目标化合物的样品。
其中，步骤S4中溶剂为甲醇、乙腈、丙酮或正己烷中一种或多种。
分别取适量储备液用乙腈稀释成浓度约为100μg/L的单个标准使用液进入质谱，分别选择正、负离子模式进行一级全扫描，确定各目标化合物的母离子。
本发明涉及的目标药物在正离子模式下离子强度更高，如苯噻菌胺异丙酯、吡菌苯威、吡唑酰苯胺更易形成带正电荷的离子，如[M+H]+。
将得到的母离子施加一定的碰撞能量进行。
Product Ion(MS2)扫描，获得各自的二级碎片离子，选择2个信号较强且干扰小的碎片离子与其母离子组成监测离子对。
再将得到的母离子和碎片离子，采用多反应监测模式进行仪器自动优化各化合物的四级杆1电压、碰撞电压和四级杆3电压，定量和定性离子见图1。
在优化条件下得到的9种农药残留标准色谱图见图2(注:*为定量离子对)
在选择提取溶剂时,要考虑目标分析物在溶剂中的溶解度、溶剂与基质的浸透效果等因素,使用QuEChERS法对样品进行提取净化时常用到的提取溶剂有甲醇、丙酮、乙腈、1％醋酸乙腈、乙酸乙酯和正己烷。
根据目标农药物质性质,本发明选取乙腈、丙酮和乙酸乙酯3种有机试剂作为提取剂，
参考图3，实验结果表明,当使用丙酮作为提取剂时,9种农药的回收率均低于80％,这是由于丙酮易将样品中色素、脂肪等杂质萃取出来,导致样品提取液颜色较深,影响样品的净化效果；
当使用乙酸乙酯作为提取剂时，有7种农药的回收率在80％～110％范围内，但是伐虫脒盐酸盐与嘧氟磺草胺未能提取出来,因此对此提取剂不予考虑；
当乙腈作为提取剂时,9种农药的回收率均在70％～100％的范围内，符合欧盟农药残留分析质量控制程序：农药平均回收率在70％～120％之间的要求。
蔬菜、水果作为含水量较高的农产品,乙腈相较于乙酸乙酯和丙酮对果蔬基质中的农药有更强的选择性,不易提取出多余的杂质,且较易通过盐析与基质中的水分分离，同时在质谱分析中避免了和流动相产生的溶剂扩散现象。
综上,本研究选取乙腈作为提取剂。
提取剂的用量也是影响样品回收率的重要因素,提取剂用量过低会导致目标农药物质提取不充分,用量过多则会造成污染与试剂浪费，最终导致样品回收率不佳。
因此,本发明考察了5mL、10mL、15mL、20mL的提取剂水平对样品回收率的影响,每个水平做三个平行，其他前处理步骤相同(前处理步骤为步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4)；
参考图4，结果表明,随着提取剂用量的增大，各农药物质回收率呈上升趋势，在提取剂用量为15ml和20mL时各样品回收率均能够达到最优。
将提取剂用量提高至20mL时,各物质回收率增长不明显,甚至有3个物质回收率下降。
综上，为避免提取不充分或造成溶剂浪费,本研究选取15mL作为提取剂用量。
PSA是一种应用广泛的吸附剂,它是在高纯硅胶基质上键合N-丙基乙二胺，对有机酸、色素、糖和脂肪酸等干扰物质具有较强的吸附能力，净化每克样品所需PSA的用量与提取液中干扰基质的性质有关，适量的PSA添加能够对样品提取液起到净化作用，提高样品回收率，但由于PSA含有两个氨基，能够使净化液呈碱性，同时PSA还会使含羟基、氨基、巯基等官能团的农药化合物形成氢键作用，过量添加会使某些农药化合物回收率下降。
为了考察PSA用量对方法回收率的影响，在保持其他净化剂数量不变基础上，改变PSA的数量分别为100、125、150、175、200mg，其他实验过程均相同。
参考图5，结果表明，随着PSA用量的增加，大部分农药的回收率呈先上升后下降的趋势，当PSA用量达到150mg时，大部分的农药物质回收率达到最高，而将PSA用量增至200mg,9种农药物质回收率均下降,因此为保证大多数农药物质回收率达到最高，选取PSA用量为150mg。
GCB是一种强吸附剂,通过负离子交换、与分析物的疏水相互作用和氢键的形成进行净化,它能够除去样品中色素、维生素、甾醇等物质，由于其表面存在六元环结构，所以对对称及平面结构分子吸附性较强，对相似结构农药物质具有高度保留作用，从而导致一些农药物质回收率降低。
因此，GCB用量过多可能会导致农药回收率偏低，需对GCB用量进行优化。
本实验设置5个GCB添加水平：0、5、10、15、20mg，来探究GCB的最佳用量，其他前处理步骤相同，
参考图6，结果表明，9种农药的回收率均在70％～120％之间，符合欧盟农药残留分析质量控制程序：
农药平均回收率在70％～120％之间的要求。目标化合物中只有环溴虫酰胺在GCB添加量为15mg时与联苯吡嗪菌胺在GCB添加量为20mg时，回收率达到最大，其他7种农药的回收率与GCB用量之间的相关性不大。
因此，考虑到添加GCB对大部分农药的回收率影响不大和节约试剂耗材，故不添加GCB。
ME是指样品基质中除目标农药物质外的其他成分能够影响目标化合物离子化,导致目标农药物质响应增强或被抑制,在一定程度上能够反映样品的前处理效果。
为探究本研究所用样品的ME,按照如上方法制备空白基质溶液绘制标准曲线,按公式(1)计算ME:ME/％＝[(A/B)-1]×100％(1)
其中A、B分别为基质标准曲线斜率、纯溶剂标准曲线斜率。
∣ME∣＜20％为弱基质效应，可无需采取措施；
20％≤∣ME∣≤50％为中等基质效应，
∣ME∣＞50％为强基质效应，须采取措施抵消基质效应
参考图7，结果表明,其中5种农药物质|ME|值在3.17％～17.4％之间,低于20％可认为无影响，另外4种农药物质|ME|值在21.92％-35.22％之间,表现为中等基质效应。
因此,为抵消影响保证数据准确性,本研究采用空白基质溶液匹配标准曲线进行定量。
本发明采用空白基质将混合标准工作液稀释成0.0002～0.02μg/mL共6个浓度梯度，以MRM定量离子的色谱峰面积(Y)对分析物质量浓度(X，μg/L)建立标准曲线，以3倍信噪比(S/N)确定检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)确定定量限(LOQ)结果。
参考图8，结果表明，各目标化合物在相应浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9988，9种目标化合物检出限为0.028～1.493μg/kg，定量限为0.093～4.975μg/kg,符合日本和欧盟对农残“一律标准”中农药限量低于10μg/kg的要求。
取空白样品按1、5、20μg/kg三个添加水平加入混合标准工作液，按1.2.1方法进行提取净化，每个添加水平重复6次以此来测定精密度及准确度,
参考图9，9种农药残留加标回收率70.60％～108.75％之间，所测定的相对标准偏差在0.69％～12.99％之间，实验结果均符合欧盟农药残留分析质量控制程序要求：农药平均回收率在70％～120％之间，重复性低于20％。
以乙腈为提取剂，经无水MgSO4与NaCl盐析除水后，取上清液进行净化处理，即提取液经装有150mgN－丙基乙二胺(PSA)填料、900无水mgMgSO4的净化管净化，除去样品中大部分的色素及有机酸等干扰基质，再经LC－MS/MS分析，有效地降低了样品中的复杂基质所带来的背景干扰。
九种农药物质在0.0002～0.02μg/mL范围内线性关系良好,相关系数(r)均大于0.9988,方法检出限(RSN＝3)为0.028～1.493μg/kg，定量限(RSN＝10)为0.093-4.975μg/kg,,均小于10μg/kg,在加标水平为1、5、20μg/kg时，平均回收率为70.60％～108.75％，相对标准偏差为0.69％～12.99％。
该方法简单快速、重复性好、材料易得、成本低廉，并且结果均符合欧盟农药残留分析质量控制程序要求与日本和欧盟对农残“一律标准”中农药限量要求，为国内食品安全检测此类农药的残留以及我国出口蔬菜时对此类农残的检测提供参考检测方法。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.基于质谱联用技术的非标农药检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：样品提取，称取10g样品于50mL塑料离心管中,加入15mL乙腈、4gMgSO4、1gNaCl、NaCI 1g、TSCD1g和DHS0.5g,剧烈振荡10min,后于8000r/min离心5min,静置；
步骤S2：样品净化，吸取6mL提取上清液于15mL塑料离心管中,加入900mgMgSO4、150mgPSA、0mgGCB,涡旋混匀2min,后于8000r/min离心5min，吸取上清液经0.22μm针头滤器过滤后供LC－MS/MS分析；
步骤S3：空白基质溶液的配制；
称取10g空白样品，按照步骤S1、步骤S2的处理备用；
步骤S4：溶液的配制，
(1)标准储备液，准确移取农药标准品1mL,根据农药物质溶解度性质,分别采用溶剂溶解,定容至10mL，配制得质量浓度为100μg/mL的标准储备液,–20℃或4℃下冷藏避光密闭保存；
(2)混合标准中间液，分别移取一定量的各个标准储备液用乙腈定容至刻度线，配制成混合标准物质中间液，4℃避光密闭保存；
(3)空白基质标准溶液，取适量体积的混合标准物质中间液，用空白基质提取液稀释成标准系列工作曲线溶液，上机测试。
2.根据权利要求1所述的基于质谱联用技术的非标农药检测方法，其特征在于：具体包括液相色谱条件：色谱柱：A4IB50040C18(2.0×150mm，5μm)；流动相：A为乙腈，B为10mmol/L乙酸铵(含0.1％甲酸)水溶液；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL；洗脱梯度：0～0.01min，95％B；0.01～2.50min，10％B；2.50～8.50min，10％B；80～10.00min，95％B。
3.根据权利要求1所述的基于质谱联用技术的非标农药检测方法，其特征在于：具体包括质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子多反应监测(MRM)扫描模式采集数据；
以全扫描、子离子扫描等方式优化每种农药的母离子和子离子的强度；
优化后的质谱分析条件：喷雾电压(IS)5000V；离子源温度(TEM)600℃；气帘气压力(CUR)：2.5×105Pa；雾化气压力(Gas1):6.0×105Pa；辅助加热气(Gas2)：6.0×105Pa；碰撞气(CAD)：9。
4.根据权利要求1所述的基于质谱联用技术的非标农药检测方法，其特征在于：步骤S1具体包括10g样品的精确误差为0.01g；
乙腈：如测加标水平下平均回收率,须在加入提取溶剂之前完成加标。
5.根据权利要求1所述的基于质谱联用技术的非标农药检测方法，其特征在于：步骤S3具体包括空白样品为已检测不含目标化合物的样品。
6.根据权利要求1所述的基于质谱联用技术的非标农药检测方法，其特征在于：步骤S4中溶剂为甲醇、乙腈、丙酮或正己烷中一种或多种。
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