CN117757915A - 新冠病毒感染康复的生物标志物及筛选方法、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及新冠病毒感染康复的生物标志物及筛选方法、试剂盒。所述生物标志物包括TAC1、CDO1、HOXA9、ZFP42、SOX17、RASSF1A、SHOX2。本发明的标志物及检测方法能够动态监测血浆游离DNA甲基化，可以间接提示肺部损伤情况以及康复进展，经大量实验验证，与“长新冠”相关症状具有一定的相关性，能够为后续的相关研发提供理论和数据支持。

Description

新冠病毒感染康复的生物标志物及筛选方法、试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及新冠病毒感染康复的生物标志物及筛选方法、试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒感染，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”。长期COVID即长新冠是一种经常使人衰弱的疾病，目前已经确定了COVID-19的200多种症状，对多个器官系统有影响。据估计，全世界至少有65万人患有长期COVID，且病例每天都在增加。表观遗传机制似乎是COVID-19病理生理学和疾病严重程度的重要组成部分，这些机制已在SARS-CoV-2以及其他病毒感染中发现，如果这些机制得到证实，那么影响DNA甲基化的表观遗传干预可以作为一级和/或二级预防选择。

早至2020年5月，就有文章报道：DNA甲基化在SARS-CoV-2感染中发挥重要作用，DNA甲基化具体包括：ACE2甲基化和合胞体基因DNA甲基化。病毒感染后合胞体的形成在新冠病毒感染后非常普遍，合胞体与高传染性和细胞因子风暴的形成也存在一定的关联；部分人群的ACE2，Syncytin 1和Syncytin 2基因启动子区CpG岛出现去甲基化，导致这些基因的高表达，从而这一类人群更易感。相关文章研究发现，通过DNA甲基化芯片比较分析新冠病毒感染者和未感染者，发现外周循环血DNA全基因组水平的CpG甲基化并没有显著差异；病毒感染相关的DMRs 75％都位于启动子区或近启动子区；DMRs相关基因与免疫应答、病毒感染和白细胞激活等信号通路相关；发现77个DMRs可以预测COVID-19的严重程度；还有研究显示，通过850K甲基化芯片差异甲基化分析，筛选出来35个“标志物”基因甲基化可以指示SARS-CoV-2感染；“标志物”基因参与的信号通路包括：信号转导，免疫应答，细胞学过程等；通过比较重症和轻症差异基因，筛选出核心4基因(GNG7，GNAS，PRKCZ，PRKAG2)甲基化预测重症患者；此外，还有文献报道，病毒急性感染期间诱发1505个DMRs，90％以上的DMRs是在基因的启动子区或者近启动子区；感染病毒1年后，还有71个DMRs持续，平均每个DMR有7个CpG位点；其中64个DMRs是高甲基化，7个DMRs是低甲基化。

发明内容

本发明的第一个方面提供了新冠病毒感染康复的生物标志物，所述生物标志物包括TAC1、CDO1、HOXA9、ZFP42、SOX17、RASSF1A、SHOX2。

本发明的第二个方面提供了含有新冠病毒感染康复的生物标志物的检测试剂。

本发明的第三个方面提供了新冠病毒感染康复的生物标志物的检测试剂在检测新冠病毒感染后康复程度中的应用。

本发明的第四个方面提供了含有新冠病毒感染康复的生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，阴性参考品和阳性参考品。

本发明的第五个方面提供了新冠病毒感染康复的生物标志物的试剂盒的使用方法，

S1.抽提游离DNA；

S2.甲基化检测前样本处理；

S3.PCR荧光检测检测权利要求1所述的生物标志物的含量：荧光PCR试剂准备，PCR扩增，PCR检测；

S4.结果判定。

本发明的第六个方面提供了新冠病毒感染康复的生物标志物的试剂盒在检测新冠病毒感染后康复程度中的应用。

本发明的第七个方面提供了新冠病毒感染后康复程度的检测方法，所述检测方法包括：

S1.采样；

S2.DNA甲基化检测权利要求1所述的生物标志物的含量；

S3.结果判定。

本发明的第八个方面提供了新冠病毒感染后康复程度的检测方法在检测新冠病毒感染后康复程度中的应用。

在一些实施方式中，所述结果判定的具体标准均为：0.1-0.4为较低；0.4-0.628为偏低；0.628-0.9为中等；0.9-0.95为偏高；0.95-1为较高。

游离DNA生物标志物检测是通过检测肺部细胞受损伤或死亡后释放到血浆中的片段化DNA，这些片段化DNA携带有细胞受病毒侵染后损伤的相关信息。新冠病毒通过结合细胞表面ACE2受体，经细胞内吞进入细胞后，诱发细胞多基因的异常表达包括Syncytin1和Syncytin2并诱导合胞体的形成，从而在短时间内释放大量的病毒颗粒，引发炎症因子风暴，招引大量免疫细胞攻击受感染细胞，进而导致细胞损伤或死亡。这些细胞死亡后就会释放携带有相关细胞表观遗传学变化信息的片段化DNA。通过检测血浆游离DNA的这些生物标志物，可以辅助判断新冠感染后是否造成了肺部相关细胞的损伤以及功能恢复情况。

许多研究已经表明，新冠病毒侵染呼吸道上皮细胞，免疫细胞在病毒侵染部位聚集攻击病毒感染细胞，并产生大量IL-6，IL-1，TNF，IFNs等细胞因子，造成呼吸道上皮细胞的损伤甚至死亡。DNA甲基化在病毒的内吞和合胞体形成过程中发挥重要作用，这些被病毒侵染的上皮细胞死亡后，携带甲基化标志物的DNA片段被释放进入血液循环。游离DNA检测通过提取样本血浆游离DNA，采用高灵敏度的特异性多重荧光定量PCR技术对多靶标标志物进行检测，分析得出相关基因DNA甲基化水平，该检测结果可以间接反应肺部呼吸道上皮细胞损伤情况，并提示康复进展。

所述结果判定的具体标准均为：甲基化分值0.1-0.4为较低；甲基化分值0.4-0.628为偏低；甲基化分值0.628-0.9为中等；甲基化分值0.9-0.95为偏高；甲基化分值0.95-1为较高。

如果检测结果是阳性，表示该血液样本检测出与相关基因的甲基化DNA，提示患者在新冠病毒感染后依然存在一定的呼吸道上皮细胞的损伤，这些损伤可能会使新冠相关症状持续，如：呼吸急促、易疲劳、咳嗽、运动后胸闷胸疼等呼吸道症状。因此，建议患者要高度重视，并注意多休息，不熬夜，避免从事高强度体力劳动，增强营养摄入并均衡饮食，保持良好生活习惯。如果患者已经出现相关临床症状，如：运动后呼吸急促、易疲劳、咳嗽、胸闷、胸痛等，请及时到医院做相应的影像学检查，如：肺部CT检查等，以防患于未然。同时也建议患者在本次检测两至三周后进行本项检测的复查，以让患者能够更全面掌握身体健康恢复情况。

如果检测结果是阳性，表示该血液游离DNA样本中未检测出相关基因的DNA甲基化，提示患者在新冠病毒感染后呼吸道上皮损伤程度较低或恢复良好，或者相关病变还未发展到足以在血浆游离DNA样本中检测到的程度，而不足以在血浆游离DNA中检测到相关DNA甲基化标志物。建议患者保持良好的生活习惯和饮食结构，每3-6个月筛查一次，以让患者能够更全面掌握身体健康状况。

由于DNA甲基化是一种表观遗传学修饰，受多因素影响，如：药物治疗、酗酒、抽烟、睡眠不足、病毒感染、肺部微小结节等其他基础疾病，都有可能诱发体内有关细胞出现异常的DNA甲基化。因此，本发明的检测结果仅供辅助参考，不作为临床诊断依据。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明的标志物及检测方法能够动态监测血浆游离DNA甲基化，可以间接提示肺部损伤情况以及康复进展。

2.本发明的检测方法所需样本量低至1mL，相比于现有技术中通过CT影像学检测康复程度来说，检测过程无辐射，对患者的伤害更小。

3.本发明的检测方法中结果判定方法清晰，判定逻辑合理，经临床试验证明准确度高。

4.本发明的检测方法中所用试剂来源易得，检测方法耗时短、易操作，检测成本低，适用于临床推广。

5.本发明的标志物经大量实验验证，与“长新冠”相关症状具有一定的相关性，能够为后续的相关研发提供理论和数据支持。

附图说明

图1为患者血浆游离DNA甲基化标志物检测数据和甲基化检测结果(Marker 1–Marker 7分别代表甲基化标志物：TAC1、CDO1、HOXA9、ZFP42、SOX17、RASSF1A、SHOX2)。

图2为患者康复后2周内的血浆游离DNA甲基化标志物检测数据和甲基化检测结果。

图3为患者康复后2-4周内的血浆游离DNA甲基化标志物检测数据和甲基化检测结果。

图4为未曾感染新冠病毒受试者的血浆游离DNA甲基化标志物检测数据和甲基化检测结果。

图5为患者康复超过6个月后的血浆游离DNA甲基化标志物检测数据和甲基化检测结果。

图6为对图1、2、3、4中不同类别样本的血浆游离DNA甲基化检测结果M值进行综合分析。

图7为患者-15住院治疗期间外周血血浆游离DNA甲基化检测结果。

图8为患者-15住院期间CT影像学显示肺部渗出较多炎症明显。

图9为患者-15住院期间治疗后CT影像学显示肺部炎症仍然明显。

图10为患者(82岁)经包括激素在内的治疗后10天，肺部影像学显示明显缓解。

图11为新冠患者核酸转阴3周后血浆游离DNA甲基化检测结果，检测显示仍有1个标志物检出，M值为0.197，提示轻度甲基化。

图12为新冠患者核酸转阴3周后CT影像学复查，显示小片状模糊阴影，提示肺部损伤尚未完全修复。

图13为应用全光谱流式细胞分析技术评估免疫功能的免疫细胞评估项目(总体分析、淋巴细胞亚群、免疫分群分析、免疫衰老状态分析)。

图14为应用全光谱流式细胞分析技术评估免疫功能的免疫细胞评估项目(免疫检查点分析、CD64感染指数、免疫细胞活化状态分析)。

图15为患者(82岁)经包括激素在内的治疗2周后免疫细胞功能分析提示免疫力低下，轻度炎症。

图16为患者(编码67号)病毒核酸转阴2周后检测血浆游离DNA甲基化标志物显示甲基化阳性。

图17为患者(受试者编码67号)病毒核酸转阴2周后检测免疫细胞功能提示仍有炎症。

图18为未曾感染新冠病毒者(受试者编码15号，CT检查“肺结节”患者)血浆游离DNA甲基化标志物显示甲基化阳性。

图19为未曾感染新冠病毒者(受试者编码15号，CT检查“肺结节”患者)检测免疫细胞功能提示免疫力低下，免疫反应稍高。

图20为感染新冠病毒超过6个月者(受试者编码76号，CT检查“肺结节”患者)血浆游离DNA甲基化标志物显示甲基化阳性。

图21为感染新冠病毒超过6个月者(受试者编码76号，CT检查“肺结节”患者)检测免疫细胞功能提示有炎症，免疫反应高。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了新冠病毒感染后康复程度的检测方法。

所述检测方法包括如下步骤：

(1)血液样本cfDNA抽提前处理

登记血样信息，在离心管管盖和管壁上标记数字序号，室温(25±3℃)离心2000rpm、10min；离心后取3mL上清液(避免吸取中间白细胞层)置于已经做好标记的1.5mL离心管中，室温(25±3℃)离心12000rpm、10min；离心后取同一样本的上清液置于做好标记的15mL离心管中，得到血浆样本。

(2)cfDNA抽提操作步骤(使用康为试剂盒进行操作)

1.向离心管中加入1mL血浆样本、100μL Proteinase K、800μL Buffer CL，涡旋剧烈振荡30s，60℃孵育30min，孵育期间每隔5min将样品管上下颠倒4次；孵育完成后，加入1.8mL Buffer CB上下颠倒混匀10次，置于-20℃冰浴5min，得到混合溶液；

2.提前连接负压装置，将连接管(VacConnectors)插入到负压装置的插口上，将吸附柱(Spin Column DG)插入到连接管上，将延伸管插入到吸附柱中，将冰浴后的混合溶液全部倒入延伸管中，开启并调节负压至-850±50mber，待溶液完全吸走后，关闭负压开关，当压力恢复至0mber时，小心移去延伸管。

3.向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否加入无水乙醇)，开启并调节负压至-850±50mber，待溶液完全吸走后，关闭负压开关。

4.向吸附柱中加入750μL Buffer GW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，开启并调节负压至-850±50mber，待溶液完全吸走后，关闭负压开关。

5.向吸附柱中加入750μL无水乙醇，启并调节负压至-850±50mber，待溶液完全吸走后，关闭负压开关。

6.当压力恢复至0mber时，将吸附柱取下置于收集管(Collection Tube)中，溶液12000rpm离心3min，将吸附柱至于新的1.5mL管中，开盖室温(25±3℃)晾干5min，在吸附柱的中间部位加入30μL EBL buffer，12000rpm离心1min，弃掉吸附柱，留下洗脱后的DNA溶液，使用Qbit定量。

(3)重亚硫酸盐转化操作步骤(使用甲基化检测样本前处理试剂盒，)

1.向Binding Buffer(结合液)瓶中加入一倍体积的异丙醇(25mL异丙醇加入25mL结合液)，室温(25±3℃)保存；向Wash Buffer(洗涤液)瓶中加入150mL无水乙醇，室温(25±3℃)保存；向Desulfonation Buffer(处理液)瓶中加入24mL无水乙醇，室温(25±3℃)保存；

2.向1管Metabisulfite(重亚硫酸盐)粉末中加入955μL Buffer R1(亚硫酸氢盐转化液-1)，震荡混匀，充分溶解10分钟，配制亚硫酸氢盐溶液，现配现用；向0.2mL PCR管/96-well plate中先加入47μL已充分溶解的亚硫酸氢盐溶液，然后加入cfDNA样本10μL(体积不够可用无菌水或TE补齐)，最后加入17μL Buffer R2(亚硫酸氢盐转化液-2)，总体积74μL，充分震荡混匀形成乳浊液，稍离心3秒甩下管壁液体，避免过度离心导致溶液分层，利用PCR仪进行以下温度孵育转化：99℃，15min；50℃，30min；99℃，5min；50℃，90min。使用技特32位自动化仪器进行纯化。具体操作步骤见表1。

表1

(4)DNA甲基化检测操作步骤(使用新冠阳康游离DNA甲基化检测试剂盒)

1.预扩增引物Mix，PCR Master Mix(甲基化)室温(25±3℃)融化并混匀后，2000rpm离心10s，进行预扩增PCR，预扩增PCR反应体系见表2，预扩增PCR程序为：95℃，5min；95℃15s，60℃1min，72℃15s，10cycles；72℃，7min.4℃，Hold。

表2

2.预扩增后进行涡旋振荡混匀，离心，确定无气泡及液面一致后放入普通PCR仪器进行扩增。

(5)荧光定量PCR检测

1.反应液管-1(阳康体检)，反应液-管2(阳康体检)，PCR Master Mix(甲基化)在室温(25±3℃)融化并混匀后，2000rpm离心10s后取出预扩增PCR产物，荧光PCR反应液体系见表3。

表3

2.将以上配制的反应液分装到荧光PCR96孔板，20μL/孔，最后加入5μL预扩增后DNA样本。荧光定量PCR排版见表4。

表4

3.根据排版加入反应液1/2以及样品后，盖上盖子，涡旋振荡混匀，离心，确定无气泡及液面一致后放入天隆荧光PCR仪器进行检测，检测程序如下：95℃，5min；95℃15s，60℃30s，50cycles；荧光采集(选择FAM，VIC，Cy5和Texas Red荧光通道)；20℃，10s；4℃，Hold。

4.检测完成后将检测数据拷入U盘中整理数据，获得检测结果，结果判定。

结合实施例1的检测方法，展开临床试验，详见实验例1-5。

实验例1

使用本发明的方法，对18个患者进行检测。

实验例2

使用本发明的方法，对39个康复患者进行检测。

实验例3

使用本发明的方法，对30个康复患者进行检测。

实验例4

使用本发明的方法，对10个未曾感染受试者进行检测。

实验例5

使用本发明的方法，对2个康复患者康复6个月后进行检测。

实验例6

使用本发明的方法，对患者-15住院治疗期间进行检测。

实验例7

样本来源：82岁老人，肺部渗出较多，经包括激素在内的治疗后，10天肺部炎症基本缓解。

2周后，检测血浆游离DNA甲基化，检测M值为0.538，接近阈值线，提示肺部损伤尚未完全修复。经图10影像学佐证，检测结果准确。

实验例8

样本来源：49岁新冠患者，新冠转阴3周后，检测血浆游离DNA甲基化，检测显示仍有1个标志物检出，M值为0.197，提示轻度甲基化，肺部损伤尚未完全修复。经图11-12影像学佐证，检测结果准确。

Claims (10)

1.新冠病毒感染康复的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括TAC1、CDO1、HOXA9、ZFP42、SOX17、RASSF1A、SHOX2。

2.含有权利要求1所述的新冠病毒感染康复的生物标志物的检测试剂。

3.权利要求2所述的新冠病毒感染康复的生物标志物的检测试剂在检测新冠病毒感染后康复程度中的应用。

4.含有权利要求1所述的新冠病毒感染康复的生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，阴性参考品和阳性参考品。

5.权利要求4所述的新冠病毒感染康复的生物标志物的试剂盒的使用方法，其特征在于，

S1.抽提游离DNA；

S2.甲基化检测前样本处理；

S3.PCR荧光检测检测权利要求1所述的生物标志物的含量：荧光PCR试剂准备，PCR扩增，PCR检测；

S4.结果判定。

6.权利要求4所述的新冠病毒感染康复的生物标志物的试剂盒在检测新冠病毒感染后康复程度中的应用。

7.新冠病毒感染后康复程度的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

S1.采样；

S2.DNA甲基化检测权利要求1所述的生物标志物的含量；

S3.结果判定。

8.权利要求7所述的检测方法在检测新冠病毒感染后康复程度中的应用。

9.根据权利要求5所述的使用方法或权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述结果判定的具体标准均为：甲基化分值0.1-0.4为较低；甲基化分值0.4-0.628为偏低。

10.根据权利要求5所述的使用方法或权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述结果判定的具体标准均为：甲基化分值0.628-0.9为中等；甲基化分值0.9-0.95为偏高；甲基化分值0.95-1为较高。