CN117757772A - 一种脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酶突变体及其应用。本发明公开的脂肪酶突变体为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；A2)将序列表中序列4中第188和279位外的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明利用定点突变技术将原有的野生型脂肪酶(spsc)进行突变，得到了其突变体，改变了原有野生型spsc水解BHET活性较低的问题，有效提高了spsc降解BHET的活性，提升spsc的降解效果，本发明的脂肪酶突变体大大提高了BHET的降解效率，工业应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中，一种脂肪酶突变体及其应用。
背景技术
从二十世纪开始出现的各式塑料制品，给人们的生活提供了不少便利，但也因为难降解等特性，给环境造成了巨大的负担。
占全球所有废物的12％的PET塑料(学名聚对苯二甲酸乙二醇酯)，就需要上百年的时间才能自然降解，如今的微塑料污染更是已经侵入人体，解决塑料污染已经迫在眉睫。
多年来人们一直在想办法消灭这些废弃的塑料制品。虽然回收利用是减少塑料垃圾最明显的方式，但全球只有不到10％的塑料能被回收，其他的废塑料不是被扔进填埋场，就是被燃烧。不但成本高，耗能大，还会产生有毒气体。在热解、利用甲醇等多种尝试中，科学家发现了一个有效的方法—利用酶来分解废塑料。
目前，科学家已经从酯酶(esterase)和角质酶(cutinase)等水解酶中发现了它们对PET降解的活力，证明了PET生物降解的可能性，但是降解活力却很低。采用定点突变、加入金属离子等方法提高酶活，结果也并不理想。对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)是PET水解的中间产物，反应中间产物的累积是限制PET水解酶降解效率的一个重要因素。所以提高降解BHET酶的活性，为PET降解研究提供更多理论基础和实验依据，对推进PET的绿色降解具有积极意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种脂肪酶(spsc)突变体，具有BHET水解活性的蛋白。得到的突变体有效提高spsc降解BHET的活性，提升spsc的降解效果。
本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质名称为spsc-V188L/A279V，spsc-V188L/A279V为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；
A2)将序列表中序列4中第188和279位外的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述A2)中的spsc-V188L/A279V蛋白质，为与序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的spsc-V188L/A279V蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的spsc-V188L/A279V蛋白质的编码基因可通过将序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列3所示的DNA分子编码序列4所示的spsc-V188L/A279V蛋白质。
具体的，A2)所述蛋白质可为序列8所示的蛋白质。
本发明还提供了与spsc-V188L/A279V相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码spsc-V188L/A279V的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列3所示的DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码spsc-V188L/A279V的cDNA分子或DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码spsc-V188L/A279V的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码spsc-V188L/A279V蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的spsc-V188L/A279V蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码spsc-V188L/A279V蛋白质且具有spsc-V188L/A279V蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码spsc-V188L/A279V蛋白质的核酸分子的表达盒(spsc-V188L/A279V基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达spsc-V188L/A279V蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动spsc-V188L/A279V基因转录的启动子，还可包括终止spsc-V188L/A279V基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述spsc-V188L/A279V基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET32a(+)载体。
B3)所述重组载体具体可为pET32a-TEV-spsc-V188L/A279V。所述pET32a-TEV-spsc-V188L/A279V为将pET32a(+)载体的BamHI和HindIII识别序列间的DNA片段替换为序列7的第502-1515位所示的TEV-spsc-V188L/A279V融合基因得到的重组载体。所述pET32a-TEV-spsc-V188L/A279V含有TEV-spsc-V188L/A279V融合基因，能表达序列8所示的TEV-spsc-V188L/A279V融合蛋白。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)trxB。
本发明还提供了一种水解PET的方法，所述方法包括：利用spsc-V188L/A279V处理PET实现PET的水解。
上述方法中，所述处理可在50℃下进行。
上述方法中，利用spsc-V188L/A279V处理PET可在50mM PBS，pH8.0的缓冲液中进行。
本发明还提供了一种制备MHET的方法，所述方法包括：利用spsc-V188L/A279V水解PET，得到MHET。
上述方法中，所述处理可在50℃下进行。
上述方法中，利用spsc-V188L/A279V水解PET可在50mM PBS，pH8.0的缓冲液中进行。
spsc-V188L/A279V的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
1)作为PET水解酶或BHET水解酶；
2)催化PET水解；
3)降解PET；
4)催化PET水解为MHET和/或TPA；
5)制备PET降解剂；
6)制备催化PET水解产品；
7)制备降解PET产品；
8)制备催化PET水解为MHET和/或TPA产品。
所述生物材料的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
1)催化PET水解；
2)降解PET；
3)催化PET水解为MHET和/或TPA；
4)制备PET降解剂；
5)制备催化PET水解产品；
6)制备降解PET产品；
7)制备催化PET水解为MHET和/或TPA产品。
上文中，PET可为BHET。
本发明利用定点突变技术将原有的脂肪酶(spsc)进行突变，得到了其突变体，改变了原有spsc水解BHET活性较低的问题，有效提高了spsc降解BHET的活性，提升spsc的降解效果。BHET(短链PET)在可以解除PET降解中产物抑制的作用，本发明的突变体大大提高了BHET的降解效率，工业应用前景良好。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为脂肪酶及其突变体蛋白的活性分析。WT表示野生型脂肪酶，V188L/A279V和A279T表示突变体。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、脂肪酶突变体的制备、表达纯化及活性检测
为增加脂肪酶的工业应用价值，本发明合成了来源于sporisorium scifamineum的脂肪酶spsc的基因，并对其进行了突变，获得了酶活性提高的突变体。
一、野生型脂肪酶重组质粒和其突变体重组质粒的构建
1、野生型脂肪酶重组质粒的构建
野生型脂肪酶为来源于sporisorium scifamineum的spsc，野生型spsc的核苷酸序列为序列表中序列1，其编码的氨基酸序列为序列表中序列2。
合成含有TEV酶切位点的野生型脂肪酶基因，并将其插入pET32a(+)载体中BamHI和HindIII酶切位点中，获得重组质粒，记为pET32a-TEV-spsc；该重组质粒诱导表达后编码的氨基酸序列除了野生型spsc的序列外，其N端还有一段载体序列和TEV酶切位点，诱导表达后氨基酸序列如序列6所示，命名为含有野生型脂肪酶的融合蛋白(记为TEV-spsc融合蛋白)，其编码基因(记为TEV-spsc融合基因)为序列表中5所示。
含有TEV酶切位点的TEV-spsc融合基因的核苷酸序列从5′末端起依次由甲硫氨酸，His标签和TEV酶切位点(序列5的第502-543位)、无功能氨基酸编码核酸(序列5的第544-570位)和序列表中序列1所示的脂肪酶基因(序列5的第571-1515位)组成。
TEV-spsc融合蛋白的氨基酸序列从N末端起依次由pET32a载体部分片段(序列6的第1-167位)，甲硫氨酸、His标签和TEV酶切位点(序列6的第168-181位)，无功能氨基酸(序列6的第182-190位)和序列表中序列2所示的脂肪酶spsc(序列6的第191-504位)组成。
具体的，pET32a-TEV-spsc为将pET32a(+)载体的BamHI和HindIII识别序列间的DNA片段替换为TEV-spsc融合基因得到的重组载体，含有序列表中序列5所示的TEV-spsc融合基因，能表达序列表中序列6所示的TEV-spsc融合蛋白。
2、表达脂肪酶突变体的重组质粒
脂肪酶突变体为将序列2所示的脂肪酶按照如下突变得到的蛋白(将所得蛋白记为spsc-V188L/A279V)：其氨基酸序列的第188位由野生型脂肪酶的缬氨酸(Valine)突变为亮氨酸(Leucine)；第279位由野生型脂肪酶的丙氨酸(Alanine)突变为缬氨酸(Valine)。脂肪酶突变体spsc-V188L/A279V的氨基酸序列为序列4，其编码基因(即spsc-V188L/A279V基因)的核苷酸序列为序列3。
利用定点突变技术(site-directed mutagenesis)，以pET32a-TEV-spsc质粒为模板，用表1所示的引物进行PCR，得到表达脂肪酶突变体的质粒；进而加入限制性内切酶DpnI于37℃下反应以去除原始模板。将纯化后的反应产物转化大肠杆菌感受态细胞中，用抗生素进行初步筛选，进行DNA测序以确定成功突变的基因，得到表达脂肪酶突变体的质粒，记为pET32a-TEV-spsc-V188L/A279V。
具体的，pET32a-TEV-spsc-V188L/A279V为将pET32a-TEV-spsc中的spsc基因替换为spsc-V188L/A279V基因得到的重组质粒，该重组质粒含有TEV-spsc-V188L/A279V融合基因(该基因为将TEV-spsc融合基因中的spsc基因替换为spsc-V188L/A279V基因得到的DNA片段，TEV-spsc-V188L/A279V融合基因的序列为序列7)，能表达TEV-spsc-V188L/A279V融合蛋白(该蛋白为将TEV-spsc融合蛋白中的spsc蛋白替换为spsc-V188L/A279V蛋白得到的蛋白质，TEV-spsc-V188L/A279V融合蛋白的序列为序列8)。
利用定点突变技术(site-directed mutagenesis)，以pET32a-TEV-spsc质粒为模板，用表1所示的引物进行PCR，得到表达脂肪酶突变体的质粒；进而加入限制性内切酶DpnI于37℃下反应以去除原始模板。将纯化后的反应产物转化大肠杆菌感受态细胞中，用抗生素进行初步筛选，进行DNA测序以确定成功突变的基因，得到表达脂肪酶突变体的质粒，记为pET32a-TEV-spsc-A279T。
具体的，pET32a-TEV-spsc-A279T为将pET32a-TEV-spsc中的spsc基因替换为spsc-A279T基因得到的重组质粒，该重组质粒含有TEV-spsc-A279T融合基因(该基因为将TEV-spsc融合基因中的spsc基因替换为spsc-A279T基因得到的DNA片段)，能表达TEV-spsc-A279T融合蛋白(该蛋白为将TEV-spsc融合蛋白中的spsc蛋白替换为spsc-A279T蛋白得到的蛋白质)。
其中，spsc-A279T基因的序列为序列9，spsc-A279T蛋白的氨基酸序列为序列10。
表1、定点突变引物
上述表中，V188L指序列2中的第188个氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，以此类推。
二、脂肪酶突变体和野生型脂肪酶的制备
1、野生型脂肪酶及脂肪酶突变体的表达纯化
将上述一制备的表达野生型脂肪酶的重组质粒pET32a-TEV-spsc和表达脂肪酶突变体的重组质粒pET32a-TEV-spsc-V188L/A279V、pET32a-TEV-spsc-A279T分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在含有100μg/ml Ampicillin的LB培养皿中筛选菌株。把筛选出的菌株接种到5ml LB内培养，再放大菌量至200ml LB培养，最终放大到5L的LB培养基中培养(37℃，220rpm)。在OD值到达0.6至0.8时，将培养物冷却至16℃，并在16℃和220rpm下，加入终浓度0.4mM的IPTG诱导酶蛋白的大量表达。经过18小时的蛋白质诱导表达后，将菌液以6000rpm转速离心15分钟将细胞收集下来。用缓冲液(25mM tris，150mM NaCl，pH7.5)将菌体进行重悬，利用超声波细胞破碎机(sonicator)破菌，再以16000rpm转速在4℃下离心60分钟，收集上清液用以准备下一步的纯化。
为了得到高纯度的酶蛋白，用快速蛋白质液相层析仪(fast protein liquidchromatography；FPLC)依次利用镍离子层析柱底物洗脱目的蛋白(buffer A：25mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑，pH7.5；buffer B：25mM Tris，150mM NaCl，250mM咪唑，pH7.5)，收集目的蛋白。将目的蛋白中加入300微升TEV蛋白酶进行酶切，目的是切掉载体上的His标签，并同时将目的蛋白透析在5L透析液(25mM tris，150mM NaCl，pH7.5)中，更换一下透析液，4℃透析过夜。酶切过后的目的蛋白再过一次镍柱，收集流穿出的不含His标签的目的蛋白。将两次纯化后的目的蛋白透析在25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5的缓冲液中，浓缩收集，保存于-80℃，备用。
三、脂肪酶突变体和野生型脂肪酶的相对活性比较
为验证野生型脂肪酶与脂肪酶突变体的差异，发明人进一步测定二者对BHET的降解活力。脂肪酶的活性测试步骤如下：
每个反应体系的混合物(1mL)处于50mM PBS，pH8.0的缓冲液中，该反应体系含有1mM底物双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(BHET)(PET的低聚物，sigma，cas：959-26-2)和30μL酶(1mg/mL上述二制备的脂肪酶突变体或野生型脂肪酶)，余量为100mM PBS，pH8.0的缓冲液。将所得反应体系置于摇床50℃、100rpm反应24小时。每个反应均做3次重复。反应后混合物先热激(80℃，10min)终止反应，然后经过12000rpm离心10分钟，取上清反应液通过0.22μm过滤器进行过滤；收集滤液进行高效液相色谱(HPLC，Agilent 1200)产物测定与分析，分析柱为Welch Ultimate XB-C18 column(4.6×250mm,5μm,月旭科技(上海)股份有限公司)。流动相为81％纯水，18％乙腈，1％甲酸，流速0.8ml/min，波长254nm，柱温箱30℃，直接洗脱，20min。
野生型脂肪酶和突变体的高效液相色谱(HPLC)检测结果为MHET出峰时间12min左右，对其出峰进行质谱检测分析(负离子，Mass range 50-1000m/z)，为MHET。。
通过比较野生型脂肪酶或其突变体的水解产物MHET的峰面积，来确定野生型和突变型酶活。
活性测定原理如下：HPLC实验中，溶液中化合物的量与峰面积成线性关系，因此可以通过峰面积来计算溶液中化合物的量；本实验中，由产物的峰面积来定义突变体蛋白对底物的催化效果；产物越多(因为底物无法溶解，因此难以进行定量)，则说明该突变体蛋白具有越好的活性。
以野生型脂肪酶的水解的MHET的峰面积记作100％，脂肪酶突变体的水解产物MHET的峰面积与野生型脂肪酶的水解产物MHET的峰面积相比，记作相对酶活。
检测结果表明，本发明的脂肪酶及其突变体均可将BHET水解为MHET，但突变体spsc-V188L/A279V对BHET降解活性高于野生型蛋白，产生的产物MHET比野生型提高了约3倍；而spsc-A279T对BHET降解活性低于野生型蛋白，如图1所示。表明，突变体spsc-V188L/A279V具有很好的应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质，为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；
A2)将序列表中序列4中第188和279位外的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列3所示的DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
4.一种水解PET的方法，包括：利用权利要求1所述蛋白质处理PET实现PET的水解。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述处理在50℃下进行。
6.一种制备MHET的方法，包括：利用权利要求1所述蛋白质水解PET，得到MHET。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述处理在50℃下进行。
8.权利要求1所述蛋白质的下述任一应用：
1)作为PET水解酶或BHET水解酶；
2)催化PET水解；
3)降解PET；
4)催化PET水解为MHET和/或TPA；
5)制备PET降解剂；
6)制备催化PET水解产品；
7)制备降解PET产品；
8)制备催化PET水解为MHET和/或TPA产品。
9.权利要求2或3所述生物材料的下述任一应用：
1)催化PET水解；
2)降解PET；
3)催化PET水解为MHET和/或TPA；
4)制备PET降解剂；
5)制备催化PET水解产品；
6)制备降解PET产品；
7)制备催化PET水解为MHET和/或TPA产品。
10.根据权利要求4-7中任一所述的方法，或权利要求8或9所述应用，其特征在于：PET为BHET。
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