CN117756887A

CN117756887A - 仿刺参卵黄蛋白特征肽及其在鉴别仿刺参真伪方面的应用

Info

Publication number: CN117756887A
Application number: CN202311804657.9A
Authority: CN
Inventors: 李彦伸; 张玉顺; 傅怡; 郝倩; 毛馨; 尤艳莉; 李启燕
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2023-12-26
Filing date: 2023-12-26
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2043-12-26
Also published as: CN117756887B

Abstract

本发明涉及仿刺参卵黄蛋白特征肽及其在鉴别仿刺参真伪方面的应用，属于食品检测领域，所述特征肽段的序列为：RGMCEPDCLDD、RDFLLQPIMMQDPVM和CLAPVVQNAPENITK，其中，RGMCEPDCLDD作为定量肽段，RDFLLQPIMMQDPVM和CLAPVVQNAPENITK作为定性肽段。本发明还提供所述特征肽在鉴别仿刺参真伪方面的应用。本发明能够鉴别仿刺参及其产品的真伪。

Description

仿刺参卵黄蛋白特征肽及其在鉴别仿刺参真伪方面的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种仿刺参卵黄蛋白特征肽及其在鉴别仿刺参真伪方面的应用。

背景技术

仿刺参(Apostichopus japonicus)属棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲(Holothu-roidea)，楯手目(Aspidochirota)，刺参科(Stichopodidae)，属于后口动物中的高等类群，是连接无脊椎动物向脊椎动物进化的重要节点。仿刺参体呈圆筒状，背面疣足发达，体壁厚而柔软，腹面平坦，管足密集，主要分布于我国的渤海和黄海，以及日本、韩国和俄罗斯远东沿海地区，是海洋无脊椎动物的代表之一，也是具有较高食用价值和药用价值的海产珍品。仿刺参多了一个“仿”字，就会有人感觉是冒牌货，其实不然，它几乎是市面上最主流的食用海参了，体壁韧厚而软糯，品质上乘，被誉为“参中之冠”，颇受食客追捧。

发明内容

本发明针对上述技术问题提供一种仿刺参卵黄蛋白特征肽及其在鉴别仿刺参真伪方面的应用，用于鉴别仿刺参及其产品的真伪。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

本发明的第一目的在于提供一种仿刺参卵黄蛋白特征肽，所述特征肽段的序列为：RGMCEPDCLDD、RDFLLQPIMMQDPVM和CLAPVVQNAPENITK，其中，RGMCEPDCLDD作为定量肽段，RDFLLQPIMMQDPVM和CLAPVVQNAPENITK作为定性肽段。

本发明的第二方面在于提供所述特征肽在鉴别仿刺参真伪方面的应用，所述应用方法为检测样品中是否含有所述的定性肽段；若含有所述定性肽段，则判定所述样品中含有仿刺参；若不含有所述定性肽段，则判定所述样品中不含有仿刺参，然后根据定量肽段确定样品中的刺参的含量。

作为优选，采用液相色谱串联质谱进行所述检测，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z 627.23340的质荷比；子离子包含质荷比为m/z 1097.35841和m/z 806.28728的子离子，其允许偏差在5ppm以内。

样品中只有在精确m/z 627.23340值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定所检测的该样品中的特征肽含量可信，根据此含量的高低鉴别样品质量。

作为优选，所述样品的前处理包括：对待测样品中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述仿刺参样品进行酶解。

作为优选，采用UHPLC-Q Exactive plus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明中的特征肽段为仿刺参卵黄蛋白1的特征肽段在鉴别仿刺参卵黄蛋白1真伪方面的应用提供了技术和方法参考。借由该特征肽段，本发明提供的仿刺参卵黄蛋白1含量的检测方法具有特异性强、准确度和精确度好等优点。该方法对消费者选择真正的仿刺参及其制品提供了方法支撑，保护了消费者权益。

附图说明

图1为仿刺参样品中特征肽段的离子流图；

图2为仿刺参样品特征肽段的质谱图；

图3为仿刺参样品特征肽段的二级碎片质谱图；

图4为仿刺参样品内标(IS)肽段的离子流图；

图5为仿刺参样品内标(IS)肽段的质谱图；

图6为仿刺参样品内标(IS)肽段的二级碎片质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中涉及的仪器与试剂：

1、UHPLC-Q Exactive plus；

2、磁力搅拌器；

3、pH计；

4、组织破碎机；

5、高速离心机；

6、摇床；

7、电子天平；

8、冰箱；

9、10kDa透析袋

氯化钠；氯化钾；磷酸氢二钠；磷酸二氢钾；1M盐酸；1M氢氧化钠；10％三氯乙酸；丙酮；硫酸铵；碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)；二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)；氯仿、正丁醇；8M尿素；NH₄HCO₃；胰蛋白酶；0.5M三(2-羧乙基)膦(TCEP)；100mM四乙基溴化铵(TEAB)；乙腈；0.1％甲酸

溶液配制：

0.01M PBS：8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，用400mL超纯水溶解，用1M盐酸或者1M氢氧化钠调节pH至7.4，用超纯水定容至500mL，在4℃条件下保存待用。

40mM NH₄HCO₃溶液：称取0.316g NH₄HCO₃，用超纯水定容100mL，4℃冰箱保存待用。

100mM DTT溶液：称取DTT 0.308g，用40mM NH₄HCO₃溶液溶解、混匀并定容至20mL，-20℃冰箱保存待用。

100mM IAA溶液：称取IAA 0.39g，用40mM的NH₄HCO₃溶液定溶至20mL，-20℃冰箱保存待用。

Sevage试剂：在通风橱中取氯仿800mL，后加入正丁醇200mL混合均匀后，密封贮藏。

实施例1仿刺参卵黄蛋白1特征肽段的发掘。

第一步、多步沉淀法提取仿刺参卵黄蛋白：

仿刺参体壁可溶性卵黄蛋白的提取：将仿刺参体壁用预冷的蒸馏水清洗，置于组织破碎机中，加入3倍体积预冷的0.01M PBS(pH＝7.4，内含10mM DTT)，在组织破碎机中匀浆3次，每次20s，中间间隔15s，在4℃低速搅拌13h，采用低温9000r/min离心20min，取上清液，然后将未提取彻底的仿刺参体壁沉淀用同样的方法重新提取一次，合并两次离心后的上清液，即得到非胶原蛋白质的粗提物，此步骤目的是将可溶性的非胶原蛋白和难溶解胶原蛋白进行分离；

蛋白等电点沉淀：向非胶原蛋白中添加10％三氯乙酸和1倍体积的丙酮，使溶液的pH值缓慢降到3.7。充分混匀后，4℃下继续搅拌20min，静置4.5h，8000r离心10min。收集沉淀，此步骤主要是沉降目的蛋白，提纯蛋白质；

Sevage试剂除去杂蛋白：将上步的沉淀复溶在中性的PBS，用1M氢氧化钠调节pH至7.6，添加Sevage试剂，使得PBS溶液：Sevage溶液＝5：1，此目的除去非糖蛋白，此步骤重复三次；

硫酸铵纯化目标蛋白：将上步的沉淀溶于10倍质量的PBS(pH 7.4)，用1M氢氧化钠调节pH至7.6，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使终溶液的浓度达40％后继续搅拌，使卵黄蛋白质沉淀备用，此过程计算蛋白质的提取率和复溶率。将蛋白质重新溶于10倍体积的PBS中，按上步重复，离心，取上清液；

除色素杂质：将上述步骤的上清液过0.45μm水系膜，除去色素等杂质；

透析除盐：将上步的蛋白质置于10kDa的透析袋中，在超纯水中浸泡，于4℃磁力搅拌下透析48h，每5-8h更换一次超纯水，直至电位恒定；

冷冻干燥：冷冻干燥透析除去盐离子的卵黄蛋白质备用。

第二步、取100μg目标蛋白于低吸附性EP管中，用8M尿素溶解并调至100μL。在卵黄蛋白溶解液中添加2μL 0.5M三(2-羧乙基)膦(TCEP)37℃下反应1h，还原目标蛋白二硫键，随后避光加入4μL 1M碘乙酰胺，室温避光反应40min，此处目的是保证目标蛋白中含二硫键的氨基酸全部烷基化，进而保证目标蛋白完全变性并保持在还原状态。随后，按照溶液体积比在样品中加入4倍体积的预冷丙酮，并于-20℃下沉淀蛋白12h，紧接着通过高速离心(11800×g，20min，4℃)，收集沉淀蛋白。同样重复上述步骤，即加入1mL丙酮，继续清洗沉淀。在通风橱中干燥沉淀，将其表面的有机溶剂完全挥发。将上步干燥的蛋白重溶于100μL100mM四乙基溴化铵(TEAB)，按测序级胰蛋白酶：底物蛋白(质量比)为1：50的量加入反应体系中，室温摇床中震荡酶解12h。将酶解后的蛋白肽样品采用C18除盐柱除盐后冷冻干燥待用。

第三步、第二步所得样品使用UHPLC-Q Exactive plus对肽段进行正离子模式下的Full MS-ddMS2测序和鉴定。

质谱生成的数据收集并存储于Xcalibur软件，质谱采集的raw数据导入PEAKS 8.0定性分析。检索参数设置如下：母离子质量误差(The precursor mass tolerances)为15ppm，子离子质量误差(The fragmentmass tolerances)为0.05Da，酶为：Trypsin酶切，最大漏切位点数为2；可变修饰为oxidation(M，+15.99)，固定修饰为carbamidomethyl(C，+57.02)。所有检索结果采用正反库融合的算法控制蛋白和肽段的假阳性率(Falsediscovery rate FDR)，FDR<1％。

第四步、UHPLC-Q Exactive plus分析期间得到三种候选肽段，带电状态和相应的分子量与其理论值良好一致。最终确定RGMCEPDCLDD、RDFLLQPIMMQDPVM和CLAPVVQNAPENITK肽段序列。通过UniProt搜索验证三种候选肽段特异性最终选择肽段RGMCEPDCLDD作为定量肽段，RDFLLQPIMMQDPVM和CLAPVVQNAPENITK作为定性肽段。

实施例2仿刺参卵黄蛋白1特征肽段的确立及检测方法的开发。

第一步、将实施例1中筛选出所有具有特征的肽段一一在NCBI及Uniprot网站进行验证，筛选只存在于仿刺参卵黄蛋白1的特征肽段，查看实施例1产生的质谱数据，挑选得到了响应高且无其他物质影响的特征肽段为最终定量肽段，即RGMCEPDCLDD。

第二步、合成特征肽段RGMCEPDCLDD和稳定同位素内标(IS)肽段RGMCEPDCLDD*，R*表示精氨酸中所有C置换为¹³C，所有N置换为¹⁵N，纯度超过98％，储存在-20℃备用。

图4-图6依次为稳定同位素内标肽段RGMCEPDCLDD*的离子流、质谱图和二级碎片质谱图。

第三步、标准曲线的绘制

在初始流动相(97：3v/v，水/ACN，含0.1％甲酸)中制备一系列特征肽段标准品(10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，60ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，600ng/mL和1000ng/mL)，然后向配置好的每个浓度的标准品中加入的稳定同位素内标肽段使其浓度为100μg/mL。通过特征肽段和稳定同位素内标肽段峰面积的比值及该比值对应的特征肽段浓度来绘制标准曲线。

第四步、仿刺参样本的前处理。

(1)多步沉淀法提取仿刺参卵黄蛋白：

仿刺参体壁可溶性卵黄蛋白的提取：将仿刺参体壁用预冷的蒸馏水清洗，置于组织破碎机中，加入3倍体积预冷的0.01M PBS(pH＝7.4，内含10mM DTT)，在组织破碎机中匀浆3次，每次20s，中间间隔15s，在4℃低速搅拌13h，采用低温9000r/min离心20min，取上清液，然后将未提取彻底的仿刺参体壁沉淀用同样的方法重新提取一次，合并两次离心后的上清液，即得到非胶原蛋白质的粗提物，此步骤的目的就是将可溶性的非胶原蛋白和难溶解胶原蛋白进行分离；

除色素杂质：将上步骤的上清液过0.45μm水系膜，除去色素等杂质；

冷冻干燥：冷冻干燥透析除去盐离子的卵黄蛋白质备用。

(2)取100μg目标蛋白于低吸附性EP管中，用8M尿素溶解并调至100μL。在卵黄蛋白溶解液中添加2μL 0.5M三(2-羧乙基)膦(TCEP)37℃下反应1h，还原目标蛋白二硫键，随后避光加入4μL 1M碘乙酰胺，室温避光反应40min，此处目的是保证目标蛋白中含二硫键的氨基酸全部烷基化，进而保证目标蛋白完全变性并保持在还原状态。随后，按照溶液体积比在样品中加入4倍体积的预冷丙酮，并于-20℃下沉淀蛋白12h，紧接着通过高速离心(11800×g，20min，4℃)，收集沉淀蛋白。同样重复上述步骤，即加入1mL丙酮，继续清洗沉淀。在通风橱中干燥沉淀，将其表面的有机溶剂完全挥发。将上步干燥的蛋白重溶于100μL 100mM四乙基溴化铵(TEAB)，按测序级胰蛋白酶酶：底物蛋白(质量比)为1：50的量加入反应体系中，室温摇床中震荡酶解12h。将酶解后的蛋白肽样品采用C18除盐柱除盐后冷冻干燥待用。采用UHPLC-QExactive Plus进样分析。

第五步、仿刺参样本的数据处理。

根据特征肽段/稳定同位素内标肽段峰面积比带入公式求得特征肽段浓度，再根据式1得到特征肽段RGMCEPDCLDD的含量：

X＝(ФcV)/m 式1

其中，X为(ng/g)是仿刺参样品中特征肽段RGMCEPDCLDD的含量，Ф是酶解蛋白体积占总样品体积比例，c(ng/mL)是特征肽段在胰蛋白酶消化物中的浓度，V(mL)是胰蛋白酶消化物的体积，m(g)是仿刺参样品的质量。以达到对仿刺参样品中特征肽段RGMCEPDCLDD定量的目的。

经过对仿刺参样品的检测，特征肽段的离子流图、质谱图和二级碎片质谱图分别如图1-图3所示，内标(IS)肽段的离子流图、质谱图和二级碎片质谱图分别如图4-图6所示，仿刺参样本的图谱中应该含有特征肽段RGMCEPDCLDD的精确质量数为m/z 627.23340；样本的图谱中应该含有稳定同位素内标肽段特征肽段RGMCEPDCLDD*的精确质量数为m/z633.24536，其允许偏差应在5ppm以内。仿刺参样本中只有在精确m/z值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定所求的该仿刺参样本中的特征肽段RGMCEPDCLDD含量可信。可以根据此含量的高低鉴别仿刺参质量。

实施例3仿刺参卵黄蛋白1特征肽段检测方法在实际中的应用。

从正规市场购买仿刺参、梅花参、花刺参、即食刺参、海参肽粉、海参肽饮品等样本进行实际样品的检测。

(1)多步沉淀法提取卵黄蛋白：

海参体壁可溶性卵黄蛋白的提取：将不同品种海参体壁用预冷的蒸馏水清洗，置于组织破碎机中，加入3倍体积预冷的0.01M PBS(pH＝7.4，内含10mM DTT)，在组织破碎机中匀浆3次，每次20s，中间间隔15s，在4℃低速搅拌13h，采用低温9000r/min离心20min，取上清液，然后将未提取彻底的体壁沉淀用同样的方法重新提取一次，合并两次离心后的上清液，即得到非胶原蛋白质的粗提物，此步骤的目的就是将可溶性的非胶原蛋白和难溶解胶原蛋白进行分离；

冷冻干燥：冷冻干燥透析除去盐离子的卵黄蛋白质备用。

(2)取100μg目标蛋白于低吸附性EP管中，用8M尿素溶解并调至100μL。在卵黄蛋白溶解液中添加2μL 0.5M三(2-羧乙基)膦(TCEP)37℃下反应1h，还原目标蛋白二硫键，随后避光加入4μL 1M碘乙酰胺，室温避光反应40min，此处目的是保证目标蛋白中含二硫键的氨基酸全部烷基化，进而保证目标蛋白完全变性并保持在还原状态。随后，按照溶液体积比在样品中加入4倍体积的预冷丙酮，并于-20℃下沉淀蛋白12h，紧接着通过高速离心(11800×g，20min，4℃)，收集沉淀蛋白。同样重复上述步骤，即加入1mL丙酮，继续清洗沉淀。在通风橱中干燥沉淀，将其表面的有机溶剂完全挥发。将上步干燥的蛋白重溶于100μL 100mM四乙基溴化铵(TEAB)，按测序级胰蛋白酶：底物蛋白(质量比)为1：50的量加入反应体系中，室温摇床中震荡酶解12h。将酶解后的蛋白肽样品采用C18除盐柱除盐后冷冻干燥待用。采用UHPLC-QExactive Plus进样分析。

经检测，如表1，只在仿刺参样本中检测到特征肽段信息，其他样本并未检测出特征肽段信息。

表1不同品种海参样本中仿刺参卵黄蛋白1的检出情况

基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和准确度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种仿刺参卵黄蛋白特征肽，其特征在于，所述特征肽段的序列为：RGMCEPDCLDD、RDFLLQPIMMQDPVM和CLAPVVQNAPENITK，其中，RGMCEPDCLDD作为定量肽段，RDFLLQPIMMQDPVM和CLAPVVQNAPENITK作为定性肽段。

2.权利要求1所述特征肽在鉴别仿刺参真伪方面的应用，其特征在于，所述应用方法为检测样品中是否含有所述的定性肽段；若含有所述定性肽段，则判定所述样品中含有仿刺参；若不含有所述定性肽段，则判定所述样品中不含有仿刺参，然后根据定量肽段确定样品中的仿刺参的含量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用液相色谱串联质谱进行所述检测，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z 627.23340的质荷比；子离子包含质荷比为m/z 1097.35841和m/z 806.28728的子离子，其允许偏差在5ppm以内；样品中只有在精确m/z 627.23340值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，才能够肯定所检测的该样品中的特征肽含量可信，根据此含量的高低鉴别样品质量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，样品的前处理包括：对待测样品中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述仿刺参样品进行酶解。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用UHPLC-Q Exactive plus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。