CN117752815A - 一种靶向衰老BMSCs的纳米递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向衰老BMSCs的纳米递送系统及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117752815A CN202311224505.1A CN202311224505A CN117752815A CN 117752815 A CN117752815 A CN 117752815A CN 202311224505 A CN202311224505 A CN 202311224505A CN 117752815 A CN117752815 A CN 117752815A
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刘昌胜
袁媛
王颖
解方茹
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East China University of Science and Technology
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East China University of Science and Technology
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Abstract

本发明提供了一种靶向衰老骨髓间充质干细胞(BMSCs)的纳米递药系统。该纳米递药系统为核壳结构的纳米粒子，其结构包括：衰老相关半乳糖苷酶响应性降解的半乳糖基亲水外壳；主要成分为DL‑α‑生育酚琥珀酸酯的疏水内核；修饰表面的抗Kremen1抗体，用于靶向衰老BMSCs。本发明所制备的纳米递送系统可以靶向将药物递送至衰老BMSCs内部，并在溶酶体中SA‑β‑gal的作用下快速释药；在负载药物后，可有效延缓BMSCs的衰老并促进老龄骨质疏松性骨缺损的再生。本发明为与BMSCs相关的退行性疾病的治疗提供了靶向性平台，增强了相关药物在衰老BMSCs内的利用度，应用前景广阔。

Description

一种靶向衰老BMSCs的纳米递送系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种靶向衰老BMSCs的纳米递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
随着人口老龄化加剧，骨组织退化、老化，老龄个体易发骨质疏松和骨质疏松性骨折，且骨修复速度慢、效果差，严重影响中老年患者的健康和生活质量。BMSCs(骨髓间充质干细胞)是骨修复过程中最为重要的干细胞之一，具有自我更新能力和多系分化能力，能够诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞和成骨脂肪细胞。然而，随着年龄增长，BMSCs也会经历细胞衰老，出现溶酶体内SA-β-gal高活性、p16/p53/p21升高和表面标志物改变等衰老特征，并引起自我更新能力降低、成骨/软骨分化能力降低和成脂肪能力升高等功能异常，最终导致老龄患者骨修复能力下降、骨修复效果变差。针对衰老BMSCs的疗法有望解决老龄骨修复能力差的难题。
针对衰老细胞的疗法主要分为通过抗衰老药物清除衰老细胞，和通过抗衰老药物延缓/逆转细胞衰老疗法，两种方法均能取得一定的治疗效果。然而，无论哪种疗法，均缺乏对目标细胞的靶向治疗性，这将在非靶标细胞和组织带来潜在的安全问题，也限制了药物或活性成分的治疗功效。鉴于此，开发能够靶向衰老细胞的疗法有望解决上述问题，是潜在的治疗老龄相关疾病和促进老龄个体组织修复的有效手段。
目前，由于不同衰老细胞之间存在很大的异质性，各类型衰老细胞表面生物标志物仍然不统一。Kremen1是一种跨膜蛋白，相较于非衰老BMSCs，其在衰老的BMSCs细胞膜表面高度表达，且其表达量随着BMSCs衰老程度的增加而升高。
因此，基于Kremen1这一衰老BSMCs特异性表面标志物，开发靶向衰老BMSCs的疗法有望促进老龄骨再生。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向衰老BMSCs的纳米递送系统，以避免抗衰老药物对非靶标细胞和组织产生潜在副作用，并提高抗衰老药物在衰老BMSCs内的生物利用率。
本发明还提供了上述靶向衰老BMSCs的纳米递送系统的制备方法和在老龄骨修复中的应用。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种靶向衰老BMSCs的纳米递送系统，其结构包括以下成分：
(a)衰老相关半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)响应性降解的半乳糖基亲水外壳；
(b)主要成分为DL-α-生育酚琥珀酸酯(DTS)的疏水内核，和
(c)修饰于表面的靶向配体。
在另一优选例中，所述纳米递送系统为纳米颗粒。
在另一优选例中，所述纳米颗粒为核壳结构的纳米颗粒。
在另一优选例中，所述纳米递送系统的粒径在10-100nm之间，优选为10-50nm之间，优选为20-30nm。
在另一优选例中，所述半乳糖基亲水外壳与疏水内核的摩尔比为0.5-2:0.5-2，优选0.8-1.5:1-2，更优选为1:2。
在另一优选例中，所述亲水外壳与疏水内核的质量之和，与靶向配体的质量比为500:1～5000:1，例如2000:1。
在另一优选例中，所述半乳糖基亲水外壳包括接枝烟酰胺核糖(NR)的低聚半乳糖外壳。
在另一优选例中，所述半乳糖基亲水外壳中NR的接枝率不超过90％，优选不超过80％，更优选不超过70％。
在另一优选例中，所述半乳糖基亲水外壳可以在衰老BMSCs溶酶体内高活性的SA-β-gal作用下响应性降解。
在另一优选例中，所述疏水内核中，DTS的含量不低于80mol％，优选不低于90mol％。
在另一优选例中，所述靶向配体为抗Kremen1抗体。
在另一优选例中，所述抗Kremen1抗体通过酰胺化作用修饰在所述纳米递送系统的表面。
在另一优选例中，所述抗Kremen1抗体与衰老BMSCs表面特异性高表达的Kremen1跨膜蛋白发生抗原-抗体结合作用，达到靶向衰老BMSCs的效果。
在另一优选例中，所述纳米递送系统具有选自下组的一个或多个特征：
i.具备优异的生物相容性：浓度在低于5mg/mL时，溶血率小于5％，优选小于3％；
ii.具有优异的靶向性：与细胞共孵育12h后，衰老细胞的摄取率达到非衰老细胞的摄取率的1.5倍以上，优选2倍以上。
在另一优选例中，所述纳米递送系统通过以下方法制备：
DL-α-生育酚琥珀酸酯与半乳糖发生共聚反应，形成双嵌段共聚物，之后依次连接连接分子、烟酰胺核糖进一步得到接枝的双嵌段共聚物，最后自组装形成纳米粒子。
在另一优选例中，所述连接分子为二酸酐，优选为丁二酸酐、己二酸酐的一种或多种。
在另一优选例中，所述纳米递送系统通过如本发明第二方面所述的方法制备。
在本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的靶向衰老BMSCs纳米递送系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备双嵌段共聚物1：将半乳糖和DTS分别溶解在第一溶剂中，在第一活化剂和第一催化剂存在下，将半乳糖溶液逐滴加入DTS溶液中，混合反应得到双嵌段共聚物1；
其中，DTS与半乳糖之间的摩尔比为0.5-2:0.5-2，优选0.8-1.5:1-2，更优选为1:2
(2)制备连接分子接枝的中间物质2：在第二溶剂中，在第二催化剂存在下，将步骤(1)制备的双嵌段共聚物1与连接分子混合，反应得到中间物质2；
其中，所述双嵌段共聚物1与连接分子的摩尔量之比为1:2～1:30，优选为1:8-20更优选为1:10；
(3)制备接枝NR的双嵌段共聚物3：在第三溶剂中，在第二活化剂存在下，将NR与步骤(2)制备的中间物质2混合，反应得到双嵌段共聚物3；
其中，所述中间物质2和NR的摩尔量之比为1:2～1:20，优选为1:10；
(4)制备接枝靶向配体的纳米粒子：在第四溶剂中，双嵌段共聚物3进行自组装，之后加入抗Kremen1抗体和第三活化剂，混合得到所述靶向衰老BMSCs纳米递送系统；
其中，所述双嵌段共聚物3与抗Kremen1抗体的质量之比为500:1～5000:1。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述第一溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氯乙烷。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述第一溶剂为DMF。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述第一催化剂为亲核催化剂。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述第一催化剂选自下组：吡啶、咪唑、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，或其组合。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述第一活化剂为羧基活化剂，优选为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和任选地N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述半乳糖为半乳糖Gal粉末。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述DTS与半乳糖的质量比为1:2-10，优选1:2-5。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述第一催化剂与DTS的质量比为1:50-500，优选1:100-200。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述第一活化剂与DTS的质量比为1:1-10，优选1:1-3。
在另一优选例中，所述步骤(1)在室温下进行，优选为10-40℃，更优选为25℃。
在另一优选例中，所述混合包括搅拌混合。
在另一优选例中，所述步骤(1)的反应包括i.羧基活化反应，和ii.DTS与半乳糖的聚合反应。
在另一优选例中，所述羧基活化反应的时间为0.2-1h，例如0.5h。
在另一优选例中，所述聚合反应的时间为16-30h，例如24h。
在另一优选例中，所述步骤(1)在无水条件下进行。
在另一优选例中，所述步骤(1)包括：将第一活化剂和第一催化剂用第一溶解后，再加入DTS和半乳糖，搅拌0.2-1h进行羧基活化反应，之后在室温下反应16-30h。
在另一优选例中，所述步骤(1)包括：将半乳糖和DTS分别溶解在第一溶剂中待用，将第一活化剂和第一催化剂用第一溶解后，再将半乳糖溶液逐滴加入DTS溶液中，搅拌0.2-1h进行羧基活化反应，之后在室温下反应16-30h。
在另一优选例中，所述步骤(1)还包括后处理步骤。
在另一优选例中，所述步骤(1)还包括：将反应后的混合物后用乙醇和水交替透析3天，以除去未反应的低聚半乳糖及其他杂质，冻干48小时后得到双嵌段共聚物1。
在另一优选例中，所述步骤(1)制得的双嵌段共聚物1在无水条件下保存。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述第二溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氯乙烷。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述第二溶剂为DMF。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述第二催化剂为亲核催化剂。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述第二催化剂选自下组：吡啶、咪唑、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，或其组合。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述连接分子选自下组：丁二酸酐、己二酸酐，或其组合。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述连接分子与所述第二催化剂的摩尔比为1:2-20，例如1:10。
在另一优选例中，所述步骤(2)在80-150℃下进行，例如100℃。
在另一优选例中，所述步骤(2)的反应时间为1-10h，例如3h、6h。
在另一优选例中，所述步骤(2)包括：将嵌段共聚物1、连接分子和第二催化剂溶解于第二溶剂中，80-150℃反应1-5小时。
在另一优选例中，所述步骤(2)还包括后处理步骤。
在另一优选例中，所述步骤(2)还包括：将反应后的混合物后在乙醇和水溶液中交替透析3天，冻干48小时后得到中间物质2。
在另一优选例中，所述步骤(2)得到的中间物质2在无水条件下保存。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述第三溶剂为有机溶剂和水的混合溶剂。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述有机溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氯乙烷。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述第三溶剂为DMF和水的混合溶剂，其中所述DMF和水的体积比为0.8-1.2:0.8-1.2，优选1:1。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述第二活化剂为羧基活化剂，优选为EDC和NHS的组合。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述EDC与NHS的质量比为0.5-1:0.5-1，优选1:0.5-1，例如1:0.65。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述中间物质与EDC的质量比为0.8-1.2:0.8-1.2，优选1:1。
在另一优选例中，所述步骤(3)在室温下进行，例如10-40℃，优选为25℃。
在另一优选例中，所述步骤(3)的反应包括i.羧基活化反应，和ii.中间物质2与NR的反应。
在另一优选例中，所述步骤(3)包括：在第三溶剂中，先将第二活化剂与中间物质2共同混合进行羧基活化反应，再加入NR继续反应，得到双嵌段共聚物3。
在另一优选例中，所述羧基活化反应的时间为0.2-1h，例如0.5h。
在另一优选例中，之后加入NR继续反应的时间为16-30h，例如24h。
在另一优选例中，所述混合包括搅拌混合。
在另一优选例中，所述步骤(3)的反应时间为24-72h，例如48h。
在另一优选例中，所述步骤(3)包括：将中间物质2、NR和第二活化剂溶解于第三溶剂中，室温反应24-72小时。
在另一优选例中，所述步骤(3)还包括后处理步骤。
在另一优选例中，所述步骤(3)还包括：将反应后的混合物后在乙醇和水溶液中交替透析3天，冻干48小时后得到双嵌段共聚物3。
在另一优选例中，所述步骤(3)得到的双嵌段共聚物3在4℃、无水条件下保存。
在另一优选例中，在步骤(4)中，所述第四溶剂选自下组：水、PBS溶液、生理盐水。
在另一优选例中，在步骤(4)中，所述第四溶剂为水。
在另一优选例中，在步骤(4)中，所述第三活化剂为羧基活化剂，优选为EDC和NHS的组合。
在另一优选例中，在步骤(4)中，所述EDC与NHS的质量比为0.5-1:0.5-1，优选0.5-1:1，例如0.5-0.8:1。
在另一优选例中，在步骤(4)中，所述双嵌段共聚物3与EDC的质量比为1-5:1。
在另一优选例中，所述步骤(4)在室温下进行，例如10-40℃，优选25℃。
在另一优选例中，所述步骤(4)包括：将双嵌段共聚物3溶于第四溶剂中充分自组装，随后加入抗Kremen1抗体、第三活化剂，在室温下搅拌反应。
在另一优选例中，所述步骤(4)包括：将双嵌段共聚物3溶于第四溶剂中，与第三活化剂混合进行羧基活化反应，再加入抗Kremen1抗体进行反应。
在另一优选例中，所述羧基活化反应的时间为0.2-1h，例如0.5h。
在另一优选例中，所述加入抗Kremen1抗体后进行反应的时间为24h。
在另一优选例中，所述步骤(4)还包括后处理步骤。
在另一优选例中，所述步骤(4)还包括：用截留分子量为50000的透析袋除去未反应完全的抗体和双嵌段共聚物3，将透析袋内的液体在12000转/分钟下超速离心得到靶向衰老BMSCs的纳米递送系统。
在另一优选例中，所述步骤(4)得到的纳米递送系统在4℃下保存。
在本发明的第三方面，提供了一种纳米载药系统，所述药物包括：
a)如本发明第一方面所述的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统；和
b)药物，所述药物用于预防和/或治疗骨组织退化、骨质疏松和骨质疏松性骨折，或者用于骨修复。
在另一优选例中，所述药物选自下组：白藜芦醇、槲皮素、非瑟酮、二甲双胍、雷帕霉素、SRT1720，或其组合。
在另一优选例中，所述纳米载药系统中，所述药物的载药量为10％以上，优选20％以上，更优选30％以上。
在另一优选例中，所述纳米载药系统中，所述药物的包封率为30％以上，优选40％以上，更优选50％以上。
在另一优选例中，所述纳米载药系统通过如本发明第四方面所述的方法制备。
在另一优选例中，所述纳米载药系统具备选自下组的一个或多个特征：
1、延缓BMSCs的衰老：所述纳米载药系统降低p16和/或p53衰老相关基因的表达，相比对照组下降了至少8倍，更佳地下降了至少10倍；
2、提高骨体积和/或骨微结构的完整性；
3、提高了药物的生物利用度：所述纳米载药系统降低p16和/或p53衰老相关基因的表达，相比游离药物下降了2倍以上，更佳地下降了至少4倍。
在另一优选例中，所述提高骨体积包括相比对照组，骨体积分数提高了100％以上。
在另一优选例中，所述提高骨微结构的完整性包括提高骨小梁厚度、降低骨小梁分离度、提高骨小梁数量的一种或多种。
在另一优选例中，所述纳米载药系统的粒径在10-100nm之间，优选为10-50nm之间，优选为20-30nm。
在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第三方面所述的纳米载药系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(s1)提供靶向衰老BMSCs的纳米递送系统；
(s2)将含药物的溶液与上述靶向衰老BMSCs的纳米递送系统混合，得到所述纳米载药系统。
在另一优选例中，在步骤(s1)中，所述纳米递送系统使用如本发明第二方面所述的方法制备。
在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述含药物的溶液中，溶剂为乙醇。
在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述药物与所述靶向衰老BMSCs的纳米递送系统的质量比为0.5-5:1，优选2:1。
在另一优选例中，所述方法还包括后处理步骤。
在另一优选例中，所述后处理步骤包括：将反应后的混合物放入透析袋中，透析12小时以除去游离药物，最后通过超速离心法得到所述纳米载药系统。
在本发明的第五方面，提供了一种水凝胶，包括：
a)如本发明第三方面所述的纳米载药系统；和
b)水凝胶载体。
在另一优选例中，所述水凝胶载体为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)水凝胶。
在本发明的第六方面，提供了如本发明第五方面所述的水凝胶的制备方法，所述方法包括步骤：将如本发明第三方面所述的纳米载药系统与水凝胶载体混合，得到所述水凝胶。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，包括：
a)如本发明第三方面所述的纳米载药系统、或本发明第五方面所述的水凝胶；和
b)药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统、如本发明第三方面所述的纳米载药系统、或本发明第五方面所述的水凝胶的用途，用于制备一药物组合物，所述药物组合物用于预防和/或治疗与BMSCs相关的退行性疾病。
在另一优选例中，所述与BMSCs相关的退行性疾病选自下组：骨质疏松、骨质疏松性骨折及骨缺损、骨关节炎，或其组合。
在另一优选例中，所述药物组合物用于延缓BMSCs的衰老。
在另一优选例中，所述药物组合物用于促进老龄骨质疏松性骨缺损的再生。
在另一优选例中，所述药物组合物用于预防和/或治疗骨组织退化、骨质疏松和骨质疏松性骨折。
在另一优选例中，在另一优选例中，所述药物组合物用于骨修复。
在本发明的第九方面，提供了一种预防和/或治疗骨组织退化、骨质疏松和骨质疏松性骨折，或者骨修复的方法，所述方法包括：将如本发明第三方面所述的纳米载药系统、或本发明第五方面所述的水凝胶施用于有此需要的对象。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为靶向衰老BMSCs的纳米递送系统的透射电镜图像和粒径统计图。
图2为不同浓度的纳米递送系统、曲拉通和PBS溶血后的图像，和纳米递送系统的溶血率。
图3为靶向性纳米递送系统与衰老BMSCs和非衰老BMSCs共同培养12小时后的(a)激光共聚焦图像、(b)流式分析图和(c)统计图(以不偶联抗Kremen1抗体、由双嵌段共聚物3自组装的纳米粒子为对照组)。
图4为靶向性纳米递送系统与衰老BMSCs作用3天后衰老相关基因p16和p53的表达变化(以不偶联抗Kremen1抗体、由双嵌段共聚物3自组装的纳米粒子为对照组)。
图5为GelMA水凝胶混合靶向性纳米载药系统修复老龄骨缺损的(a)高分辨率X射线断层扫描成像(Micro-CT)重构图像和(b-e)定量统计(以GelMA水凝胶混合非靶向性纳米粒子为对照组)。
图6为本发明的纳米递送系统的工作原理。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种靶向衰老BMSCs的纳米递送系统，该纳米递送系统可以靶向将药物递送至衰老BMSCs内部，并在溶酶体中SA-β-gal的作用下快速释药；在负载药物后，可有效延缓BMSCs的衰老并促进老龄骨质疏松性骨缺损的再生。本发明为与BMSCs相关的退行性疾病的治疗提供了靶向性平台，增强了相关药物在衰老BMSCs内的利用度，应用前景广阔。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明的纳米递送系统
本发明提供了一种靶向衰老BMSCs的纳米递送系统，其结构包括SA-β-gal响应性降解的半乳糖基亲水外壳、DTS构成的疏水内核和修饰于纳米粒子表面的靶向配体。所述半乳糖基亲水外壳由低聚半乳糖接枝烟酰胺核糖合成而来，能够在衰老BMSCs溶酶体内高活性的SA-β-gal作用下响应性降解，其中的烟酰胺核糖可以作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体补充剂；所述DTS构成的疏水内核通过酯化作用与低聚半乳糖连接形成双嵌段共聚物，进而自组装形成纳米粒子；所述靶向配体为抗Kremen1抗体，通过酰胺化作用偶联在纳米粒子表面，与衰老BMSCs表面特异性高表达的Kremen1跨膜蛋白发生抗原-抗体结合作用，达到靶向衰老BMSCs的效果。
本发明还提供了上述靶向衰老BMSCs纳米递送系统的制备方法：
(1)制备双嵌段共聚物1：取1份DTS和1份Gal粉末充分溶解，搅拌混合后进行酯化反应，制得的双嵌段共聚物1在无水条件下保存；
(2)制备丁二酸酐接枝的中间物质2：取双嵌段共聚物1和丁二酸酐充分溶解并混合均匀，其中双嵌段共聚物1与丁二酸酐摩尔量之比为1:2～1:20，通过酸酐与Gal段中的羟基发生酯化反应将丁二酸酐接枝到双嵌段分子上，制备得到的中间物质2在无水条件下保存；
(3)制备接枝NR的双嵌段共聚物3：取中间物质2和NR充分溶解，搅拌混合后进行酰胺化反应，其中中间物质2和NR的摩尔量之比为1:2～1:20，制备得到的双嵌段共聚物3在4℃、无水条件下保存；
(4)制备接枝靶向配体的纳米粒子：取双嵌段共聚物3溶于水中并充分自组装，加入抗Kremen1抗体，其中双嵌段共聚物3与抗Kremen1抗体的质量之比为500:1～5000:1，室温搅拌混合进行酰胺化反应，制备得到的纳米粒子溶液在4℃下保存。
本发明的有益效果在于：
本发明所提供的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统具有均一、适合进入细胞的粒径，生物安全性良好；与衰老BMSCs具有较强的结合力，从而使得衰老BMSCs对所述纳米递送系统的摄取能力更强，从而实现了抗衰老药物在衰老BMSCs内的靶向累积；进一步地，所述靶向性纳米递送系统提高了抗衰老药物的生物利用度，有效促进了老龄骨修复，解决了老龄骨修复能力受损、修复效果差的难题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
以双嵌段共聚物1与丁二酸酐摩尔量之比为1:20、中间物质2和NR的摩尔量之比为1:10、双嵌段共聚物3与抗Kremen1抗体的质量之比为2000:1的比例，制备得到所述靶向衰老BMSCs的纳米递送系统，具体步骤如下：
(1)室温、无水条件下，将2.88g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和0.06g亲核催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)用适量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解后，加入5.31g用适量DMF溶解的DTS和18.28g Gal(半乳糖)粉末，搅拌0.5小时使羧基活化，随后在室温条件下使其反应24小时，后用乙醇和水交替透析3天，以除去未反应的低聚半乳糖及其他杂质，冻干48小时后得到双嵌段共聚物1；
(2)将10g双嵌段共聚物1、13.7g丁二酸酐和1.7g DMAP充分溶解于DMF中，100℃反应3小时。充分反应后，收集产物，在乙醇和水溶液中交替透析3天，冻干48小时得到中间物质2；
(3)将1g中间物质2、1.15g NR、1g EDC和0.65g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)充分溶解于水和DMF的混合溶液中，水与DMF比例为1:1，室温反应48小时。充分反应后，收集淡黄色产物，在乙醇和水溶液中交替透析3天，冻干48小时得到双嵌段共聚物3；
(4)将20mg双嵌段共聚物3溶于水中充分自组装，随后加入10μg抗Kremen1抗体、7.6mg EDC和11mg NHS，在室温下搅拌反应，随后用截留分子量为50000的透析袋除去未反应完全的抗体和双嵌段共聚物3，将透析袋内的液体在12000转/分钟下超速离心得到靶向衰老BMSCs的纳米递送系统。
通过透射电子显微镜观察上述纳米递送系统的形貌，并通过ImageJ软件统计粒径和粒径分布，结果如图1所示。由图1可知，本发明制备得到的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统粒径约为25.4nm，粒径分布较均一。
实施例2
将大鼠全血以3000转/分钟的速度离心15分钟后，去除上清液、白细胞和血小板，得到红细胞。用PBS将红细胞溶液稀释成5v/v％悬浮液。将所述靶向衰老BMSCs的纳米递送系统溶解在PBS溶液中，分别得到0.75、1、2和3mg/mL的纳米递送系统。分别将不同浓度的纳米递送系统、PBS或0.1％曲拉通与红细胞悬液等体积混合，于37℃孵育4小时后，离心15分钟，测定上清液在540nm处的OD值，并根据下列公式计算溶血率：
溶血后的照片和溶血率计算结果如图2所示。由图2可知，制备得到的纳米粒子在浓度小于等于3mg/mL时，溶血率仍然小于5％，这说明本发明制备的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统具有良好的生物相容性。
实施例3
在共聚焦培养皿中，每个孔接种5×104个衰老BMSCs或非衰老BMSCs。随后，向培基中加入浓度均为0.375mg/mL的靶向纳米递送系统(实验组)或非靶向纳米粒子(不偶联抗Kremen1抗体、由双嵌段共聚物3自组装形成的纳米粒子，对照组)，与衰老BMSCs共同孵育12小时，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析细胞对纳米粒子的摄取情况，结果如图3所示。
由图3可知，与对照组相比，实验组纳米递系统对衰老BMSCs表现出明显更高的靶向效率，共孵育12小时后，细胞摄取率达到82.5％。相比之下，对照组纳米颗粒的摄取率较低，仅为39.5％。非衰老BMSCs对两种纳米粒子的摄取率差异相对较小，12小时时对照组为48.7％，实验组为60.7％。以上结果表明，偶联Kremen1抗体提高了纳米粒子对衰老BMSCs的靶向性。
实施例4
将白藜芦醇粉末溶于乙醇中，配成50mg/mL的母液，取1mg白藜芦醇加入2mL0.375mg/mL实施例3中的实验组或对照组纳米递送系统中，搅拌均匀后，将载药胶束放入截留分子量为500的透析袋中以除去游离白藜芦醇，透析12小时，最后通过超速离心法得到包载白藜芦醇的纳米载药系统。测得白藜芦醇的包封率为53.8％，载药量为36.2％。根据白藜芦醇浓度为1μmol/L来确定上述纳米载药系统的用量，并将游离白藜芦醇和对应浓度的游离NR(0.5mmol/L)混合于培养基中，命名为游离药物组。没有接枝靶向性抗Kremen1抗体的纳米粒子载药系统组(与游离药物组同等浓度的白藜芦醇)命名为对照组，加入接枝了靶向性抗Kremen1抗体的纳米粒子载药系统组(与游离药物组同等浓度的白藜芦醇)命名为实验组，没有加入药物和纳米粒子的组为空白组。在6孔板中，每孔接种1×105个衰老BMSCs，将上述不同组的纳米载药系统与衰老BMSCs共培养3天，随后通过定量逆转录聚合酶链式反应实验来分析BMSCs衰老相关基因的表达情况，结果如图4所示。
由图4可知，靶向性纳米载药系统可以显著降低衰老BMSCs中p16和p53衰老相关基因的表达，p16降低了约16倍，p53降低了约13倍；相较于对照组或游离药物组，接枝了抗Kremen1抗体的实验组纳米载药系统的效果更佳。这些结果表明，本发明所制备的靶向性纳米递送系统可以显著提高抗衰老药物白藜芦醇的生物利用度，更有效地延缓BMSCs的衰老。
实施例5
在体内，将白藜芦醇的局部浓度设置为1mg/mL，根据实施例4中测得的载药量，相应的纳米粒子浓度计算为2.76mg/mL。按照实施例4中的方法，制备偶联或不偶联抗Kremen1抗体的靶向或非靶向性的纳米载药系统，并将所得的纳米载药系统物理混入甲基丙烯酰化明胶(GelMA)水凝胶中，得到实验组水凝胶(GelMA水凝胶+偶联抗Kremen1抗体的靶向纳米载药系统)、对照组水凝胶(GelMA水凝胶+未偶联抗Kremen1抗体的非靶向纳米载药系统)和空白GelMA组，制备得到直径为2.5mm、高度为2.5mm的圆柱体。随后通过股骨远端缺损模型，来研究所制备的纳米递送系统对老龄骨缺损修复的治疗效果。
用1％戊巴比妥钠溶液将老龄大鼠麻醉后，在侧卧位下，按照外科手术要求，划开皮肤和肌肉组织，剔去骨膜，露出股骨远端，通过微型骨钻在远端股骨处制作一个直径为2.5mm的单侧不对穿股骨缺损。骨组织切除后，用生理盐水洗净缺损部位，并植入上述水凝胶。通过高分辨率X射线断层扫描成像(Micro-CT)评价支架在体内的促骨再生性能，结果如图5所示。
由图5可知，植入水凝胶后，与单独的GelMA和对照组相比，实验组的水凝胶明显增加了缺损区域新生骨的体积和骨微结构的完整性。定量分析的结果表明，与GelMA组相比，在4周和8周时，对照组的骨体积分数分别增加了约160％和120％，骨小梁数量增加了约100％和73％，骨小梁厚度增加了39％和58％，骨小梁分离度降低了18％和19％。此外，相比于对照组，实验组表现更优异，在4周和8周时的骨体积分数分别增加了约42％和44％。这些结果表明，本发明所制备的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统可以有效促进老龄大鼠骨缺损的修复，解决了老龄骨修复能力受损、修复效果差的难题。
本发明的纳米递送系统的工作原理如图6所示。该纳米递送系统可以靶向将药物递送至衰老BMSCs内部，并在溶酶体中SA-β-gal的作用下快速释药；在负载药物后，可有效延缓BMSCs的衰老并促进老龄骨质疏松性骨缺损的再生。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种靶向衰老骨髓间充质干细胞(BMSCs)的纳米递送系统，其结构包括以下成分：
(a)衰老相关半乳糖苷酶响应性降解的半乳糖基亲水外壳；
(b)主要成分为DL-α-生育酚琥珀酸酯(DTS)的疏水内核，和
(c)修饰于表面的靶向配体。
2.如权利要求1所述的纳米递送系统，其特征在于，所述半乳糖基亲水外壳包括接枝烟酰胺核糖(NR)的低聚半乳糖外壳。
3.如权利要求1所述的纳米递送系统，其特征在于，所述靶向配体为抗Kremen1抗体。
4.如权利要求1所述的纳米递送系统，其特征在于，所述纳米递送系统通过以下方法制备，所述方法包括以下步骤：
(1)制备双嵌段共聚物1：在第一溶剂中，在第一活化剂和第一催化剂存在下，将D-α-生育酚琥珀酸酯与半乳糖混合，反应得到双嵌段共聚物1；
其中，DTS与半乳糖之间的摩尔比为0.5-2:0.5-2；
(2)制备连接分子接枝的中间物质2：在第二溶剂中，在第二催化剂存在下，将步骤(1)制备的双嵌段共聚物1与连接分子混合，反应得到中间物质2；
其中，所述双嵌段共聚物1与连接分子的摩尔量之比为1:2～1:30；
(3)制备接枝NR的双嵌段共聚物3：在第三溶剂中，在第二活化剂存在下，将NR与步骤(2)制备的中间物质2混合，反应得到双嵌段共聚物3；
其中，所述中间物质2和NR的摩尔量之比为1:2～1:20；
(4)制备接枝靶向配体的纳米粒子：在第四溶剂中，双嵌段共聚物3进行自组装，之后加入抗Kremen1抗体和第三活化剂，混合得到所述靶向衰老BMSCs纳米递送系统；
其中，所述双嵌段共聚物3与抗Kremen1抗体的质量之比为500:1～5000:1。
5.一种如权利要求1所述的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备双嵌段共聚物1：在第一溶剂中，在第一活化剂和第一催化剂存在下，将DTS与半乳糖混合，反应得到双嵌段共聚物1；
其中，DTS与半乳糖之间的摩尔比为0.5-2:0.5-2；
(2)制备连接分子接枝的中间物质2：在第二溶剂中，在第二催化剂存在下，将步骤(1)制备的双嵌段共聚物1与连接分子混合，反应得到中间物质2；
其中，所述双嵌段共聚物1与连接分子的摩尔量之比为1:2～1:30；
(3)制备接枝NR的双嵌段共聚物3：在第三溶剂中，在第二活化剂存在下，将NR与步骤(2)制备的中间物质2混合，反应得到双嵌段共聚物3；
其中，所述中间物质2和NR的摩尔量之比为1:2～1:20；
(4)制备接枝靶向配体的纳米粒子：在第四溶剂中，双嵌段共聚物3进行自组装，之后加入抗Kremen1抗体和第三活化剂，混合得到所述靶向衰老BMSCs纳米递送系统；
其中，所述双嵌段共聚物3与抗Kremen1抗体的质量之比为500:1～5000:1。
6.一种纳米载药系统，其特征在于，所述药物包括：
a)如权利要求1所述的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统；和
b)药物，所述药物用于预防和/或治疗骨组织退化、骨质疏松和骨质疏松性骨折，或者用于骨修复。
7.如权利要求6所述的纳米载药系统，其特征在于，所述药物选自下组：白藜芦醇、槲皮素、非瑟酮、二甲双胍、雷帕霉素、SRT1720，或其组合。
8.一种水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包括：
a)如权利要求6所述的纳米载药系统；和
b)水凝胶载体。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：
a)如权利要求6所述的纳米载药系统、或权利要求8所述的水凝胶；和
b)药学上可接受的载体。
10.如权利要求1所述的靶向衰老BMSCs的纳米递送系统、如权利要求6所述的纳米载药系统、或权利要求8所述的水凝胶的用途，其特征在于，用于制备一药物组合物，所述药物组合物用于预防和/或治疗与BMSCs相关的退行性疾病。
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