CN117737165A - 黑水虻鲜虫酶解抗菌肽产品的制备方法与在南美白对虾饲料中的应用 - Google Patents
黑水虻鲜虫酶解抗菌肽产品的制备方法与在南美白对虾饲料中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种黑水虻鲜虫酶解抗菌肽产品的制备方法,以副溶血性弧菌抑菌活性为主要指标，通过优化工艺提高黑水虻鲜虫虫浆酶解产物对副溶血性弧菌抑菌活性，确定最佳酶解工艺条件为：将黑水虻鲜虫和蒸馏水按比例混合成虫浆后，添加木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或多种进行酶解，酶解时间7小时、酶解温度50℃、底物加水比例2：1，酶底物比值5000U/g（鲜虫重）得到天然抗菌肽。将最佳酶解条件下酶解后的产物与鱼粉、豆粕、黑水虻干虫粉等制成对虾饲料，投喂南美白对虾，成活率显著提高，饵料系数减低，饲料成本降低，同时提高对虾血液非特异性免疫指标，提高抗病能力。
Description
技术领域
本发明涉及到抗菌产品的制备技术领域，特别是涉及到一种黑水虻鲜虫酶解抗菌肽产品的制备方法和在南美白对虾饲料中的应用。
背景技术
黑水虻，学名亮斑扁角水虻，是一种全世界广泛分布的资源昆虫，属于昆虫纲，双翅目，短角亚目，水虻科，扁角水虻属。黑水虻是食腐性昆虫，具有繁殖速度快、养殖成本低，无毒无污染的特点，被广泛应用于医学、餐厨垃圾和畜禽粪便的无害化处理、动物性蛋白饲料生产等各个领域，应用前景广阔。幼虫体内不仅富含粗蛋白质和粗脂肪，还含有丰富的必需氨基酸、必需脂肪酸和微量元素，是联合国粮农组织推荐的可饲用昆虫之一。黑水虻幼虫干中粗蛋白质含量占42.0%～48.1%，其中16种水解氨基酸占蛋白质总量36.16%，其中必需氨基酸9种，含量占16.76%，粗脂肪含量占12.9%～35.0%。
抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）又称为宿主防御肽（host defensepeptide，HDPs），是一类普遍存在于自然界中的小分子多肽，其长度通常为20-60个氨基酸残基, 具有两亲性、带正电的特征。这一特性使得AMPs很容易被整合到细胞膜中或通过细胞膜进入细 胞质, 进而表现出良好的抵抗外来病原体活性。抗菌肽的来源广泛， 涉及几乎所有生命体，2023年1月更新的抗菌肽数据库(Antimicrobial Peptide Database,APD3)中共记录了3569 种 AMPs。
作为机体先天免疫系统的重要组成部分，抗菌肽对细菌、真菌、病毒、寄生虫、癌细胞等均表现出了广泛的抑制作用，成为保护宿主抵御外源病原体入侵的重要屏障。值得注意的是，抗生素主要通过作用于病原体特定分子受体或靶点来发挥抑菌活性，而抗菌肽则主要是通过非受体介导的细菌细胞膜物理破坏作用来发挥抗菌活性。这种快速而独特的作用机制使得病原微生物很难对抗菌肽产生耐药性，因此无论是对抗生素敏感菌株还是耐药性菌株，抗菌肽均能表现出相似的抑菌活性，并且从已报道的研究结果来看，微生物对抗菌肽产生耐药性的概率非常低。除了对病原体有杀灭活性之外，某些抗菌肽还具有促进细胞因子生成、激活不同类型的免疫细胞并介导趋化、激活先天性免疫及适应性免疫反应等作用；抗菌肽分子还可以与细菌内毒素相结合，抑制中和由内毒素所引起的严重炎症反应。此外，抗菌肽还具有介导细胞凋亡、促进伤口愈合、参与免疫调节等多方面的生物学功能。昆虫不具备脊椎动物的免疫系统，体内不含抗体和补体，其独特的无细胞免疫系统，主要是抗菌肽在发挥作用。抗菌肽也是最早从昆虫体内发现的，主要分为4类：天蚕素、防御素、富含脯氨酸类、富含甘氨酸类，以昆虫蛋白为原料分解获取抗菌肽具天然优势。
黑水虻含有多达50种AMPs，经蛋白酶和几丁质酶酶解黑水虻后得到的酸溶蛋白和小肽含量（相对分子质量：180-2000）分别为21.62%和71.20%，比黑水虻虫浆中的酸溶蛋白和小肽含量（11.06%和59.36%）高约10个百分点，有更高比例的生物活性多肽，更易被消化及吸收。
抗菌肽在畜禽行业的实际应用较少，主要是因为成本方面的原因，不管分离纯化还是人工修饰合成获取的抗菌肽都很难具实际应用价值。
抗生素滥用曾是危害水产养殖发展的主要问题，在全面禁用抗生素后水产细菌性疾病缺乏有效的控制手段。南美白对虾是我国重要养殖品种，其高密度养殖中副溶血弧菌感染引起的细菌性疾病危害巨大，目前缺乏有效防治手段。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)不仅是引起世界范围内水产养殖安全问题的主要病原菌之一,更是人工养殖南美白对虾的主要危害病原菌，会导致急性肝胰腺坏死，发病快，致死率高，也是最常见的食源性病原菌。人体若食用被副溶血弧菌感染的水产品，会引发急性肠胃炎,严重者会发生败血症,导致多系统器官衰竭和死亡。
黑水虻是当前餐厨垃圾综合处置的主要手段，其蛋白质和油脂含量丰富,氨基酸比例均衡,有成为新型饲料蛋白质资源的潜力，但养殖得到的鲜虫含有70%左右水分，虫体死亡后极易腐败，难以保存，目前一般有两种应用方式。一：冰冻后出售给终端水产养殖户，用于饲喂鱼类、蟹、虾的水产养殖动物。此种方式的优点是处理简单，后处置成本低。缺点是直接饲喂虫体营养没有得到充分利用，运输和储存成本高，且严重受水产养殖季节性影响，全国大部分地区只有半年能采用这种方式。二：将鲜虫烘干后作为饲料原料使用。此种方式的优点是存放时间长，运输成本较低。缺点是加工能耗大，成本高，由于黑水虻鲜虫含水量高，且水分集中在虫体内部，脱水难度大，加工得到1吨干虫成品所需能耗和人工一般需要2500元左右，高昂的成本大大限制黑水虻鲜虫的应用。所以目前黑水虻鲜虫售价只有2000元/吨左右，导致黑水虻处置餐厨垃圾工艺利润低下，许多工厂需要政府补贴才能正常运营，大大的限制了餐厨垃圾综合利用产业发展，开发黑水虻下游产品，提高附加值是解决这一问题的有效途径。
发明内容
本发明解决的技术问题是，如何简便高效转化黑水虻鲜虫，使其抗菌肽产物发挥更好的作用，当该产物应用于南美白对虾的饲养时，可以显著提高南美白对虾的成活率，且同时减少饲料的使用量，降低了使用成本。
为解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
一种黑水虻鲜虫酶解抗菌肽产品的制备方法，包括以下步骤：
S1、洗净晾干的黑水虻鲜虫和蒸馏水按照2：1重量比制成虫浆；
S2、在上述虫浆中加入蛋白酶制成混合液，调整上述混合液的PH值和温度进行酶解；
S3、酶解完成后，将上述混合液的容器放置到水浴锅中95℃下灭活15min后冷却；
S4、灭活完成后，将容器置于离心泵中以5000转/min进行离心分离，其上清液即为含黑水虻抗菌肽产品的酶解液。
进一步的，上述步骤S2中的蛋白酶可以是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或多种，该蛋白酶的总添加量为5000U/g（鲜虫重）。
更进一步的，上述组合酶采用中性蛋白酶和菠萝蛋白酶的组合时酶解后抑菌活性最高。
进一步的，上述步骤S2中酶解PH值为7.5，酶解温度为50℃，酶解时间为7小时。
采用上述酶解方式降解黑水虻鲜虫浆，加工成本低，水解度高，抑菌活性强。
进一步的，本发明还提供采用前述制备方法得到的天然抗菌肽在南美白对虾饲料中的应用。
本发明以副溶血性弧菌抑菌活性为主要指标，通过优化工艺提高黑水虻鲜虫虫浆酶解产物对副溶血性弧菌抑菌活性，确定最佳酶解工艺条件为：酶制剂组合中性蛋白酶、菠萝蛋白酶 1：1，酶解时间7小时、酶解温度50℃、底物加水比例2：1，酶底物比值5000U/g（鲜虫重）。
将最佳酶解条件下酶解后的产物与鱼粉、豆粕、黑水虻干虫粉等制成对虾饲料，投喂南美白对虾，成活率显著提高，饵料系数减低，饲料成本降低，同时提高对虾血液非特异性免疫指标，提高抗病能力。
具体实施方式
为了使本发明的目的、特征和优势更加易懂，下面结合具体实施实例进一步详细说明本发明所采用的技术方案及达到的技术效果。
实施例1：单一酶酶解黑水虻虫体后抑菌活性比较
（1）酶解液制备
分别称取洗净晾干的黑水虻鲜虫200g加入100ml蒸馏水制成虫浆，每个试验组分别加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶7种蛋白酶。蛋白酶添加量为5000U/g（鲜虫重），即每个试验组蛋白酶添加量均为1*106U，调节各试验组pH值到酶较适pH，50℃下酶解5h，酶解完成后于水浴锅中95℃灭酶活15min后冷却，转速5000转/分离心5分钟，上清液即为酶解液。
表1：不同蛋白酶酶解pH值
| 蛋白酶 | 对照组 | 木瓜蛋白酶 | 胰蛋白酶 | 中性蛋白酶 | 碱性蛋白酶 | 菠萝蛋白酶 | 风味蛋白酶 | 酸性蛋白酶 |
| pH值 | 7.5 | 6.0 | 7.5 | 7.5 | 8.5 | 7.5 | 7.0 | 4.0 |
（2）酶解液抑菌活性比较
1）培养基的制备：培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基。
2）菌悬液的制备：用接种环挑取3～4环培养24h的副溶血弧菌菌种，溶于灭菌生理盐水中，配制成菌体浓度为108 ～109 CFU /ml 的菌悬液。
3）滤纸片的制作：采用滤纸片扩散法筛选酶解液的抑菌活性，以不添加蛋白酶黑水虻虫浆为对照组。用打孔器将定性滤纸制成直径6mm的圆形滤纸片，经灭菌处理后放置于酶解液中浸泡30min。
4）抑菌活性分析在无菌操作台上，在培养皿中倒入已经灭菌的培养基20ml，使之均匀平铺于培养皿底部，待其凝固后，准确移取100ul的副溶血弧菌菌悬液注入培养皿中，用三角涂布棒将其涂抹匀后，用灭菌镊子夹出浸泡好的滤纸片贴于含菌平板上，每个培养皿贴4片，每个样品做3次平行实验。将培养皿置于培养箱中在37℃培养24 h。取出培养皿，采用十字交叉法测定抑菌圈的直径，计算3次试验的平均值。
表2：不同酶解产物抑菌圈
| 试验组 | 对照组 | 木瓜蛋白酶 | 胰蛋白酶 | 中性蛋白酶 | 碱性蛋白酶 | 菠萝蛋白酶 | 风味蛋白酶 | 酸性蛋白酶 |
| 抑菌圈大小（mm） | 11.95 | 15.69 | 13.47 | 16.23 | 12.37 | 15.32 | 12.94 | 13.47 |
注：抑菌直径＜10mm为耐药，10-15mm为中度敏感，>15mm为高度敏感。
由此可见单一酶解条件下木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶三种酶的酶解产物抗菌活性最高。
实施例2：复合酶解效果解黑水虻虫体后抑菌活性和水解度比较
（1）复合酶酶解黑水虻鲜虫后抑菌活性比较：
选择实施1中抑菌活性较强的三种蛋白酶：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶对黑水虻鲜虫进行酶解，每个试验组总蛋白酶添加量不变，均为1*106U，酶解液制备方法同实施例1，组合方式及酶解条件如下表3：
表3：酶解组合及对应pH值
| 复合方式 | pH值 |
| 木瓜蛋白酶：中性蛋白酶=1：1 | 7.0 |
| 木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶=1：1 | 7.0 |
| 中性蛋白酶：菠萝蛋白酶=1：1 | 7.5 |
| 木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：菠萝蛋白酶=1：1：1 | 7.5 |
同实施例1所述的酶解液抑菌活性比较方法比较三种酶解产物抑菌活性，以不添加蛋白酶黑水虻虫浆为对照组，结果如下：
表4：组合蛋白酶及其抑菌圈
| 试验组 | 抑菌圈大小（mm） |
| 黑水虻对照组 | 11.23 |
| 木瓜蛋白酶：中性蛋白酶=1：1 | 17.38 |
| 木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶=1：1 | 16.46 |
| 中性蛋白酶：菠萝蛋白酶=1：1 | 18.47 |
| 木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：菠萝蛋白酶=1：1：1 | 14.86 |
由此可见，以中性蛋白酶、菠萝蛋白酶组合酶解后抑菌活性最高。
（2）水解度测定：通过测定酶解液中氨基酸态氮的含量X1和原料中总氮的含量X2，按公式1进行蛋白水解度(DH)计算。其中，氨基酸态氮的测定采取甲醛电位滴定法；总氮的测定参照《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，按凯氏定氮法测定。
公式1：DH=X1/X2×100%
表5：不同组合水解度比较
| 试验组 | 水解度（%） |
| 木瓜蛋白酶：中性蛋白酶=1：1 | 42.64 |
| 木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶=1：1 | 41.26 |
| 中性蛋白酶；菠萝蛋白酶=1：1 | 45.83 |
| 木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：菠萝蛋白酶=1：1：1 | 54.06 |
结合表4可知，虽然木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶三种酶组合水解度最高，但其抑菌圈大小仅为中度敏感，故选取水解度仅次于这三种组合，抑菌圈最大的中性蛋白酶、菠萝蛋白酶组合为最佳酶解组合。
实施例3：酶解条件优化
（1）样品溶液制备。按照表6的底物浓度比值分别称取洗净晾干的黑水虻鲜虫加入蒸馏水制成虫浆，每个试验组加入实施例2中最佳酶解组合即中性蛋白酶、菠萝蛋白酶组合酶。总蛋白酶添加量为4000、5000、6000U/g（鲜虫重），调节各试验组pH值为7.5，设置45℃、50℃、55℃温度下酶解5-7小时，酶解完成后将混合液容器置于水浴锅中95℃灭酶活15 min后冷却，再在离心泵中以转速5000转/分离心5分钟，上清液即为样品溶液。
（2）采用试管法检测抗菌活性。首先进行菌种活化，在无菌操作下，将保存的副溶血弧菌接种于已经配制好的MH肉汤培养基中培养，在37 ℃培养箱中培养18～24h，传3代后在4℃条件下备用；采用平板菌落计数法计算出原菌液的菌体浓度（CFU/ml）并测定相应的吸光度值OD600nm值；根据测定的菌悬液OD560nm值，用85%的无菌生理盐水稀释该菌悬液，使其最终的菌体浓度调到107CFU/ml。在8ml灭菌MH肉汤培养基中加入1ml稀释后的菌悬液，再加入1 ml步骤（1）中所制备的样品溶液，混匀后，在37 ℃条件下培养24h后测定OD560nm值。
（3）正交试验优化酶解条件。以8ml灭菌MH肉汤培养基中加入1ml稀释后的菌悬液，再加入加1ml无菌水为空白对照组，根据公式2计算1-9组试验组的抗菌活性。
公式2：抗菌率=（OD对照-OD样品）/OD对照×100%
说明：OD值为3次平行实验平均值。
对酶解时间、温度、底物浓度和酶底物比值进行4因素3水平正交试验，试验设计及抗菌率测定结果如下：
表6：正交试验优化酶解条件对比表
| 序号 | 酶解时间（h） | 温度（℃） | 底物浓度（虫水比） | 酶底物比值（U/g） | 抗菌率（%） |
| 1 | 5 | 45 | 2：1 | 4000 | 63.25 |
| 2 | 5 | 50 | 3：2 | 5000 | 75.86 |
| 3 | 5 | 55 | 1：1 | 6000 | 75.24 |
| 4 | 6 | 45 | 3：2 | 6000 | 74.96 |
| 5 | 6 | 50 | 1：1 | 4000 | 72.25 |
| 6 | 6 | 55 | 2：1 | 5000 | 80.38 |
| 7 | 7 | 45 | 1：1 | 5000 | 76.39 |
| 8 | 7 | 50 | 2：1 | 6000 | 85.63 |
| 9 | 7 | 55 | 3：2 | 4000 | 69.34 |
| 均值1 | 71.450 | 71.533 | 76.420 | 68.280 | |
| 均值2 | 75.863 | 77.913 | 73.387 | 77.543 | |
| 均值3 | 77.120 | 74.987 | 74.627 | 78.610 | |
| 极差 | 5.670 | 6.380 | 3.033 | 10.330 |
由上表可知，对抗菌率影响最大的因素是酶底物比值，其次是酶解温度，最终选择最佳酶解条件为酶解时间7小时、温度50℃、底物加水比例2：1，酶底物比值5000U/g，6000U/g和5000U/g结果差距不大，从成本考虑，选5000U/g为最佳工艺。
实施例4：饲养试验优化饲料配方
（1）虾饲料制备。以鱼粉15%、黑水虻干虫粉10%、豆粕24%、花生粕10%、肉骨粉10%、高筋面粉25%、大豆磷脂油2%、鱼油1%、磷酸二氢钙2%、多维0.5%、多矿0.5%的重量比为基础配方，将各饲料原料进行粉碎、过80目筛后，分别添加不同量的酶解虫浆替代鱼粉或黑水虻干虫粉，混合均匀，加水调质，经膨化挤压制成直径2mm的沉性颗粒饲料，55℃烘干，破碎成0.5mm破碎料，密封保存备用。
其中，酶解虫浆替代鱼粉、黑水虻干虫粉的比例如表7，以基础配方为对照组，测量各试验组配方的总粗蛋白和总粗脂肪含量，发现随着酶解虫浆替代占比增加，总粗蛋白含量有所下降，而总粗脂肪含量在酶解虫浆替代5%的鱼粉时提高了0.34%。
表7：试验饲料组成（以干物质计）
| 组分 | 对照 | 试验组1 | 试验组2 | 试验组3 | 试验组4 |
| 虫浆酶解产物（%） | 0 | 5 | 5 | 10 | 10 |
| 鱼粉（%） | 15 | 15 | 10 | 10 | 7.5 |
| 黑水虻干虫粉（%） | 10 | 5 | 10 | 5 | 7.5 |
| 豆粕（%） | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 |
| 花生粕（%） | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 肉骨粉（%） | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 高筋面粉（%） | 25 | 25 | 25 | 25 | 25 |
| 大豆磷脂油（%） | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 鱼油（%） | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷酸二氢钙（%） | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 多维（%） | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 多矿（%） | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 总粗蛋白（%） | 41.23 | 40.94 | 40.73 | 40.27 | 39.84 |
| 总粗脂肪（%） | 8.93 | 8.12 | 9.27 | 8.25 | 8.53 |
（2）投饲比较。购进南美白对虾虾苗，经过60天的暂养，选择初始体重为（1.2±0.05）ｇ的健康对虾1000尾，分为5组，每组4个重复，每个重复50尾虾，以重复为基本单位分置于20个网箱（1.5m×1.0m×1.2m）中。 各组对虾投喂对应的试验饲料， 每天投喂4次（7时、12时、17时和22时），共持续8周，日投喂总量约为虾体重的3%-8%，前期投喂比高，后期投喂比低，每日的四次平均投喂。饲养过程根据摄食情况、天气等适当调整投喂量，确保投喂后2h内饲料被采食完。每周1次采用虹吸法除去池底污物，并换水1/3，水源为经过滤和暗沉淀后的池塘水。养殖期间，采用自然光照，各水质指标如下：水温28—33℃，盐度0.5‰—1.0‰，溶氧浓度＞5.8mg/L，pH7.8-8.5，氨氮浓度≤0.2 mg/L，亚硝酸盐浓度≤0.05 mg/L。
养殖试验结束后，停止投喂24h，记录对虾终末体重和存活数目，计算存活率、增重率和饵料系数。
公式3：存活率（%）＝(试验结束时虾尾数 /试验开始时虾尾数)×100%；
公式4：增重率（%）＝[（终末均体重－初始均体重）/初始均体重]×100%；
公式5：饲料系数＝总投喂量/（终末总体重－初始总体重）；
表8：不同试验组南美白对虾生长情况
| 组分 | 对照 | 试验组1 | 试验组2 | 试验组3 | 试验组4 |
| 初始均重（g/尾） | 1.21 | 1.22 | 1.21 | 1.20 | 1.21 |
| 结束均重（g/尾） | 12.37 | 12.87 | 11.86 | 12.17 | 11.59 |
| 平均存活数（尾/组） | 42.25 | 45.5 | 46.25 | 47.75 | 48.25 |
| 存活率（%） | 84.5 | 91.0 | 92.5 | 95.5 | 96.5 |
| 增重率（%） | 922.31 | 954.92 | 880.17 | 914.17 | 857.85 |
| 总投喂量（g/组） | 670 | 700 | 690 | 700 | 720 |
| 饵料系数 | 1.45 | 1.33 | 1.41 | 1.34 | 1.44 |
（3）虾体非特异性免疫指标检测。从每个网箱中取5尾对虾，用2ml注射器从虾头胸甲后插入围心腔取血淋巴液，5000r/min离心10min取上清液测定超氧化物歧化酶(SOD)，溶菌酶 (LSZ)，碱性磷酸酶(AKP)，均采用试剂盒检测。
表9：不同试验组南美白对虾血液非特异性免疫指标
| 组分 | 对照 | 试验组1 | 试验组2 | 试验组3 | 试验组4 |
| 超氧化物歧化酶(SOD)（u/L） | 122.74 | 180.73 | 184.45 | 176.58 | 192.49 |
| 溶菌酶 (LSZ) （u/ml） | 61.25 | 64.36 | 57.64 | 61.39 | 58.95 |
| 碱性磷酸酶(AKP) （u/ml） | 28.54 | 42.65 | 47.93 | 37.64 | 39.85 |
结合表8和表9的试验数据可以得出结论：各试验组比对照组相比，成活率均明显提高，且各试验组南美白对虾血液中超氧化物歧化酶( SOD)和碱性磷酸酶( AKP)均明显高于对照中，其中试验组1和试验组3饵料系数最低，分别为1.33和1.34，但试验组3对虾成活率明显高于试验1，故选择试验3饲料配方组分为最佳组份，即鱼粉10%、黑水虻干虫粉5%、鲜虫酶解产物10%、豆粕24%、花生粕10%、肉骨粉10%、高筋面粉25%、大豆磷脂油2%、鱼油1%、磷酸二氢钙2%、多维0.5%、多矿0.5%。采用试验3饲料配方，虾体非特异性免疫能力更佳，对虾成活率更高。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (5)
1.黑水虻鲜虫酶解抗菌肽产品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、洗净晾干的黑水虻鲜虫和蒸馏水按照2：1重量比制成虫浆；
S2、在上述虫浆中加入蛋白酶制成混合液，调整上述混合液的pH值和温度进行酶解；
S3、酶解完成后，将上述混合液的容器放置到水浴锅中95℃下灭活15min后冷却；
S4、灭活完成后，将容器置于离心泵中以5000转/min进行离心分离，其上清液即为含黑水虻抗菌肽产品的酶解液。
2.如权利要求1所述的黑水虻鲜虫酶解抗菌肽产品的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中蛋白酶是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或多种，该蛋白酶的总添加量为5000U/g（鲜虫重）。
3.如权利要求2所述的一种黑水虻酶解抗菌肽产品的制备方法，其特征在于，采用中性蛋白酶和菠萝蛋白酶的组合酶酶解后抑菌活性最高。
4.如权利要求3所述的黑水虻鲜虫酶解抗菌肽产品的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中酶解pH值为7.5，酶解温度为50℃，酶解时间为7小时。
5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的天然抗菌肽在饲养南美白对虾中的应用，其特征在于，饲料配方为黑水虻酶解液10%、鱼粉10%、黑水虻干虫粉5%、豆粕24%、花生粕10%、肉骨粉10%、高筋面粉25%、大豆磷脂油2%、鱼油1%、磷酸二氢钙2%、多维0.5%、多矿0.5%，上述占比按照干物质重量比计量。
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