CN117731787A - 含EGFR-TKIs的药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物联用领域，具体涉及含EGFR‑TKIs的药物组合物及其应用。本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括EGFR‑TKIs和IL‑1β。本发明揭示了EGFR‑TKIs通过激活NLRP3炎症小体释放IL‑1β增强奥希替尼的抗肿瘤免疫，提出外源补充IL‑1β能增强奥希替尼的抗肿瘤免疫，并最终证实IL‑1β和EGFR‑TKIs联用具有协同抗肿瘤的效果，具有极强的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物联用领域，具体涉及含EGFR-TKIs的药物组合物及其应用。
背景技术
酪氨酸激酶(Tyrosinekinase)是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。目前市面上已围绕酪氨酸激酶开发了数种酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)抗肿瘤药物。
其中，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是一种小分子药物，它通过与ATP竞争结合于细胞膜表皮生长因子受体的酪氨酸区域，阻止酪氨酸磷酸化，抑制细胞内一系列与肿瘤细胞的形成、增殖、凋亡相关的信号通路联级反应，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
2005年，全球首个EGFR-TKIs靶向药物吉非替尼的上市，开启了肺癌靶向治疗的新时代。此后，EGFR-TKIs研究蓬勃发展，厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、阿美替尼等一代、二代、三代EGFR-TKIs相继上市，为NSCLC的临床治疗带来新的希望。然而，如何进一步增强EGFR-TKIs的药效，降低EGFR-TKIs的毒副作用一直是临床工作者面临的难题。
发明内容
(一)解决的技术问题
本发明要解决的技术问题是如何增强EGFR-TKIs的药效，降低EGFR-TKIs的毒副作用。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明在一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括EGFR-TKIs和IL-1β。
在一个实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
在一个实施例中，所述EGFR-TKIs包括厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、阿美替尼或其药学上可接受的盐、晶型、溶剂化物。
第二方面，本发明提供了一种药物制剂，所述药物组合物包括EGFR-TKIs和IL-1β。
在一个实施例中，所述EGFR-TKIs包括厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、阿美替尼或其药学上可接受的盐、晶型、溶剂化物。
在一个实施例中，所述药物制剂的类型包括固体制剂、半固体制剂、液体制剂、气体制剂。
在一个实施例中，所述液体剂型包括溶液剂、注射剂；所述固体剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂；所述半固体剂型包括软膏剂、凝胶剂；所述气体剂型包括气雾剂、喷雾剂。
第四方面，本发明提供了上述药物组合物或药物制剂在制备用于预防或治疗肿瘤药物中的应用。
在一个实施例中，所述肿瘤选自肺癌。
在一个实施例中，所述肺癌选自非小细胞肺癌。
(三)有益效果
本发明揭示了EGFR-TKIs通过激活NLRP3炎症小体释放IL-1β增强奥希替尼的抗肿瘤免疫，提出外源补充IL-1β能增强奥希替尼的抗肿瘤免疫，并最终证实IL-1β和EGFR-TKIs联用具有协同抗肿瘤的效果，具有极强的临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明实施例1中在构建的小鼠肺癌皮下移植瘤模型中，奥希替尼能抑制肿瘤生长，但是在NLRP3缺陷鼠中，奥希替尼无明显抑制作用。其中图1A是给药期间肿瘤体积的增长情况，图1B是给药后剥除肿瘤的肿瘤重量情况，图1C是各组剥除肿瘤的照片；
图2本发明实施例1中奥希替尼促进抗肿瘤免疫，但在NLRP3缺陷鼠中，奥希替尼无法促进肿瘤中IL-1β的分泌以及激活抗肿瘤免疫。其中，图2A是肿瘤组织中IL-1β的分泌情况，图2B是T细胞比例情况，图2C是CD4+T细胞比例情况，图2D是CD8+T细胞比例情况，图2E是分泌干扰素CD4+T细胞比例情况，图2F是分泌干扰素CD8+T细胞比例情况；
图3本发明实施例2中在小鼠肺癌皮下移植瘤模型中，瘤周注射IL-1β对肿瘤治疗疗效微弱，但是与奥希替尼联合应用，能显著增强奥希替尼的抗肿瘤作用。其中图3A是给药期间肿瘤体积的增长情况，图3B是给药后剥除肿瘤的肿瘤重量情况，图3C是各组剥除肿瘤的照片；
图4本发明实施例2中外源补充IL-1β与奥希替尼联合应用进一步促进抗肿瘤免疫。其中，图4A是是CD4+T细胞比例情况，图4B是CD8+T细胞比例情况，图4C是分泌干扰素CD4+T细胞比例情况，图4D是分泌干扰素CD8+T细胞比例情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面通过具体的实施例进行详细的说明。
本发明中使用的仪器和试剂、材料均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获得。本发明所使用的方法，如ELISA等均为本领域公知的方法，可通过教科书或相关文献的描述进行，不再赘述，本发明说明书中有描述的，参照本发明中描述的方法进行。
实施例1奥希替尼抗肿瘤作用依赖NLRP3
一、奥希替尼抑制肿瘤生长
1、选取8周的WT鼠和NLRP3缺陷鼠，分成四组(野生型+DMSO，野生型+奥希替尼，NLRP3-/-+DMSO，NLRP3-/-+奥希替尼)，每组5只。
2、剃除小鼠右侧后腋窝毛发随后用乙醚将小鼠进行全身麻醉，左手用尖镊提起小鼠中央皮肤，右手用胰岛素注射针在提起的皮肤下方缓慢注入肿瘤细胞系悬液100μL具体细胞数目为LLC Lewis肺癌细胞系5×105个/mL。
3、5天后小鼠灌胃给药，每次灌胃100μL，连续28天，奥希替尼给药剂量为30mg/kg/天，给药期间每3-4天测量肿瘤长径与短径。
4、28天后牺牲小鼠，剥出肿瘤拍照、称重。
如图1A-C所示，其中图1A是给药期间肿瘤体积的增长情况，图1B是给药后剥除肿瘤的肿瘤重量情况，图1C是各组剥除肿瘤的照片。从图1A-C的结果看，奥希替尼能抑制小鼠皮下移植瘤的生长，但在NLRP3缺陷后，抑制作用消失。提示奥希替尼的抗肿瘤作用依赖NLRP3。
二、奥希替尼促进抗肿瘤免疫
1、小鼠肿瘤淋巴细胞的分离。将肿瘤剪成芝麻粒大小，随后转至装有消化液1mg/mLⅣ胶原酶+2％ FBS+0.005％ DNaseⅠ+5mL RPMI 1640培养基的50mL离心管中。置于37℃摇床250rpm消化30min。将消化好的肿瘤组织使用vortex进行震荡混匀随后加入20mL 1×PBS进行终止，混匀后通过200目钢网过滤(无需研磨)，离心2200rpm 10min。小心吸掉上清，加入5mL 40％ Percoll液重悬并转移至离心管中按照升4降1的程序，2300rpm离心20min。用真空泵小心吸取上清加入1mL 1×PBS含0.2％ FBS重悬过滤至离心管，放置在冰上，为下一步实验做准备。
2、流式检测细胞表面分子和功能分子。使用大鼠血清对分离获得的淋巴细胞进行封闭，30min后加入抗体标记缓冲液30μL/样品混匀，4℃避光标记。加入1mL 1×PBS洗去未标上的抗体，按照3500rpm 5min进行离心。吸掉上清，加入1×PBS将细胞进行重悬，流式上机检测。另取一份淋巴结细胞，使用100μL固定液对细胞进行破核和穿膜，室温固定40min。加入500μL 1×Perm buffer洗涤液，将细胞吹开随后按11,000rpm 3min进行离心。去除上清，加入30μL×Perm buffer配制的抗体混合液，4℃避光标记30min后清洗并离心，随后300μL 1×PBS重悬细胞。把细胞分至孔板中，使用PMA50ng/mL、离子霉素1μg/mL和莫能霉素5μg/mL刺激4h。收集细胞，利用Fixable Viability Stain 620抗体进行死细胞标记。室温避光孵育10min，标记结束后使用1×PBS(含0.2％ FBS)进行洗涤。流式细胞仪上机检测。
3、取收集细胞上清液和细胞裂解液，ELISA检测上清中IL-1β的分泌。
如图2A-F所示，其中，图2A是肿瘤组织中IL-1β的分泌情况，图2B是T细胞比例情况，图2C是CD4+T细胞比例情况，图2D是CD8+T细胞比例情况，图2E是分泌干扰素CD4+T细胞比例情况，图2F是分泌干扰素CD8+T细胞比例情况。
从上述结果可以看到，奥希替尼能诱导野生型小鼠皮下移植瘤中IL-1β分泌、T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量和分泌干扰素的功能。但在NLRP3缺陷后，上述抑制作用消失。提示奥希替尼的抗肿瘤免疫功能依赖NLRP3炎症小体。
实施例2补充IL-1β增强奥希替尼的抗肿瘤作用
一、奥希替尼+IL-1β联合应用具有协同抑制肿瘤生长的效果
1、选取8周C57BL/6小鼠，分成四组(对照组，奥希替尼组，重组IL-1β组，奥希替尼+重组IL-1β联合组)，每组4只。所述重组IL-1β购自义翘神州(货号50101)鼠源性的重组蛋白产品，蛋白序列：Val118-Ser269，所述序列具体如SEQ ID NO:1所示：
VPIRQLHYRLRDEQQKSLVLSDPYELKALHLNGQNINQQVIFSMSFVQGEPSNDKIPVALGLKGKNLYLSCVMKDGTPTLQLESVDPKQYPKKKMEKRFVFNKIEVKSKVEFESAEFPNWYISTSQAEHKPVFLGNNSGQDIIDFTMESVSS。
2、剃除小鼠右侧后腋窝毛发随后用乙醚将小鼠进行全身麻醉，左手用尖镊提起小鼠中央皮肤，右手用胰岛素注射针在提起的皮肤下方缓慢注入肿瘤细胞系悬液100μL具体细胞数目为LLC Lewis肺癌细胞系5×105个/mL；
3、5天后奥希替尼组和联合组小鼠行奥希替尼灌胃给药，每次灌胃100μL，连续28天，奥希替尼给药剂量为30mg/kg/天。重组IL-1β组和联合组小鼠行重组IL-1β瘤周注射，200ng/只，隔天给药1次。给药期间每3-4天测量肿瘤长径与短径。
4、28天后牺牲小鼠，剥出肿瘤拍照、称重。
如图3A-C所示，其中图3A是给药期间肿瘤体积的增长情况，图3B是给药后剥除肿瘤的肿瘤重量情况，图3C是各组剥除肿瘤的照片。
从图3A-C的结果看，重组IL-1β抑制效果较弱，与对照组相比无统计学差异，奥希替尼能抑制小鼠皮下移植瘤的生长，联合组显著抑制肿瘤的生长，与单药组相比均有统计学差异。提示重组IL-1β增强奥希替尼的抗肿瘤作用。
二、IL-1β增强奥希替尼抗肿瘤免疫机制研究
1、小鼠肿瘤淋巴细胞的分离。将肿瘤剪成芝麻粒大小，随后转至装有消化液1mg/mLⅣ胶原酶+2％ FBS+0.005％ DNaseⅠ+5mL RPMI 1640培养基的50mL离心管中。置于37℃摇床250rpm消化30min。将消化好的肿瘤组织使用vortex进行震荡混匀随后加入20mL 1×PBS进行终止，混匀后通过200目钢网过滤(无需研磨)，离心2200rpm 10min。小心吸掉上清，加入5mL 40％ Percoll液重悬并转移至离心管中按照升4降1的程序，2300rpm离心20min。用真空泵小心吸取上清加入1mL 1×PBS含0.2％ FBS重悬过滤至离心管，放置在冰上，为下一步实验做准备。
2、流式检测细胞表面分子和功能分子。使用大鼠血清对分离获得的淋巴细胞进行封闭，30min后加入抗体标记缓冲液30μL/样品混匀，4℃避光标记。加入1mL 1×PBS洗去未标上的抗体，按照3500rpm5min进行离心。吸掉上清，加入1×PBS将细胞进行重悬流式上机检测。另取一份淋巴结细胞，使用100μL固定液对细胞进行破核和穿膜，室温固定40min。加入500μL 1×Perm buffer洗涤液将细胞吹开随后按11,000rpm 3min进行离心。去除上清，加入30μL 1×Perm buffer配制的抗体混合液，4℃避光标记30min后清洗并离心，随后300μL 1×PBS重悬细胞。把细胞分至孔板中，使用PMA 50ng/mL、离子霉素1μg/mL和莫能霉素5μg/mL刺激4h。收集细胞，利用Fixable Viability Stain 620抗体进行死细胞标记。室温避光孵育10min，标记结束后使用1×PBS(含0.2％ FBS)进行洗涤。流式细胞仪上机检测。
如图4A-4D所示，其中，图4A是CD4+T细胞比例情况，图4B是CD8+T细胞比例情况，图4C是分泌干扰素CD4+T细胞比例情况，图4D是分泌干扰素CD8+T细胞比例情况。
从上述结果看，重组IL-1β和奥希替尼联合应用能显著提高肿瘤微环境中CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量和CD8+T细胞分泌干扰素的功能。提示补充IL-1β能增强奥希替尼的抗肿瘤免疫。IL-1β能诱导促炎基因的表达，包括COX-2、iNOS、MMPs、IL-6和其它趋化因子/细胞因子等。这些促炎基因的表达引起基质细胞和免疫细胞的快速激活，产生大量的前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、NO和细胞因子。IL-1还可以增强高亲和力粘附分子在内皮细胞、基质细胞和白细胞中的表达，包括整合素和免疫球蛋白超家族类粘附分子，并通过这一机制促进免疫细胞从血液到组织的浸润，诱导肿瘤中CD8+T和CD8+T细胞的浸润产生大量IFN-γ杀伤肿瘤细胞。
综上所述，本发明提供的技术方案具有如下有益技术效果：
本发明以奥希替尼为研究对象，首先在小鼠肺癌模型中考察了奥希替尼抗肿瘤作用与NLRP3的关系。结果显示与野生型小鼠对比，NLRP3缺陷鼠中，奥希替尼的抗肿瘤作用减弱，且肿瘤中IL-1β的分泌减少，进一步分析肿瘤组织中免疫细胞发现具有抗肿瘤作用的免疫细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量和功能下降。最后在小鼠肺癌模型中应用奥希替尼的同时补充重组IL-1β，发现能显著增强奥希替尼的抗肿瘤作用。本发明揭示了奥希替尼通过激活NLRP3炎症小体释放IL-1β增强奥希替尼的抗肿瘤免疫。提出外源补充IL-1β能增强奥希替尼的抗肿瘤免疫，并最终证实IL-1β和EGFR-TKIs联用具有协同抗肿瘤的效果，具有极强的临床应用价值。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括EGFR-TKIs和IL-1β。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
3.一种药物制剂，其特征在于，所述药物组合物包括EGFR-TKIs和IL-1β。
4.如权利要求1所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的类型包括固体制剂、半固体制剂、液体制剂、气体制剂。
5.如权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，所述液体剂型包括溶液剂、注射剂；所述固体剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂；所述半固体剂型包括软膏剂、凝胶剂；所述气体剂型包括气雾剂、喷雾剂。
6.如权利要求1-2中任一项所述的药物组合物或权利要求3-5中任一项所述的药物制剂，其特征在于，所述EGFR-TKIs包括厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、阿美替尼或其药学上可接受的盐、晶型、溶剂化物。
7.如权利要求1-2中任一项所述的药物组合物或权利要求3-5中任一项所述的药物制剂，其特征在于，所述EGFR-TKIs选自奥希替尼或其药学上可接受的盐、晶型、溶剂化物。
8.如权利要求1-2中任一项所述的药物组合物或权利要求3-5中任一项所述的药物制剂在制备用于预防或治疗肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肺癌选自非小细胞肺癌。
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