CN117731008A - 用于改善肠道屏障的组合物 - Google Patents

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CN117731008A
CN117731008A CN202311228313.8A CN202311228313A CN117731008A CN 117731008 A CN117731008 A CN 117731008A CN 202311228313 A CN202311228313 A CN 202311228313A CN 117731008 A CN117731008 A CN 117731008A
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intestinal barrier
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intestinal
lactobacillus delbrueckii
bacteria
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小林杏辅
指原纪宏
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Meiji Co Ltd
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Abstract

本发明提供用于改善肠道屏障的组合物。通过物理性的肠道屏障的强化、紧密连接的强化来实现肠道屏障功能的改善。使已经下降的物理性的肠道屏障恢复、强化或维持。提供用于改善肠道屏障的组合物，其包含选自属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的菌及属于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的菌中的任意者。

Description

用于改善肠道屏障的组合物
技术领域
本发明涉及用于改善肠道屏障的组合物。
背景技术
健康的肠道具有防御功能，即，被称为肠道屏障功能的防止来自有害物质、致病菌等的攻击的功能。肠道上皮细胞除了形成紧密连接而作为物理性的屏障起作用，还通过形成黏蛋白层、分泌抗菌肽等发挥防御宿主的作用。
对于特定的乳酸菌，有关于肠道屏障功能的报道。专利文献1记载了以保藏号：NITE P-313进行了保藏的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，记载了以该乳酸菌为有效成分的肠道屏障功能恢复剂或功能恢复用食品组合物。另外，专利文献2记载了一种抗菌肽诱导剂，其特征在于，以乳酸菌或利用乳酸菌发酵而得的材料或这两者作为有效成分来诱导抗菌肽的基因表达。该文献公开了如下实验结果：在摄取了包含德氏乳杆菌保加利亚亚种及唾液链球菌嗜热亚种的试验饲料的高龄小鼠的空肠及回肠中，由衰老导致的抗菌肽基因表达下降得到了抑制。进而，非专利文献1记载了：利用鼠李糖乳杆菌OLL2838，使Caco-2的由TNF-α引起的经上皮电阻值下降和紧密连接蛋白表达下降得到恢复。另外，非专利文献2记载了：利用植物乳杆菌HY7714，使Caco-2的由TNF-α引起的紧密连接蛋白表达下降得到恢复。
进而，对于短乳杆菌SBC8803(保藏号：FERM BP-10632)菌株的菌体或其处理物(专利文献3)、面包乳杆菌的菌体或菌体处理物(专利文献4)、鼠李糖乳杆菌GG(专利文献5)、副干酪乳杆菌PS23(专利文献6)、植物乳杆菌(专利文献7)、包含长双歧杆菌CNCM I-2618及乳双歧杆菌CNCM I-3446的组合(专利文献8)、乳杆菌株、进一步规定为罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌(专利文献9)，与肠道屏障功能有关的用途是已知的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-212006号公报(日本专利第5046682号)
专利文献2：国际公开WO2015/087919
专利文献3：日本特开2010-83881号公报(日本专利第5526320号)
专利文献4：国际公开WO2015/068809(日本专利第6557605号)
专利文献5：日本特开2018-537473号公报
专利文献6：日本特开2020-162595号公报
专利文献7：日本特表2021-509811号公报
专利文献8：日本特表2022-504096号公报
专利文献9：日本特表2022-506081号公报
非专利文献
非专利文献1：E Miyauchi,H Morita,S Tanabe.Lactobacillus rhamnosusalleviates intestinal barrier dysfunction in part by increasing expression ofzonula occludens-1and myosin light-chain kinase in vivo.J Dairy Sci.2009Jun；92(6):2400-8.
非专利文献2：Bora Nam,Soo AKim,Woo Nam,Woon Hee Jeung,Soo-Dong Park,Jung-Lyoul Lee,Jae-Hun Sim,Sung Sik Jang.Lactobacillus plantarum HY7714Restores TNF-αInduced Defects on Tight Junctions.Prev Nutr Food Sci.2019Mar；24(1):64-69.
发明内容
发明要解决的问题
肠道屏障功能的物理性破坏会导致肠道透过性亢进、发生慢性炎症。慢性炎症不仅是炎症性肠道疾病，还可能对各种脏器造成不良影响。因此，如果存在强化物理性的肠道屏障、强化紧密连接而实现改善肠道屏障功能的手段，则是理想的。
另外，如果存在对于已经下降的物理性肠道屏障，不仅使其恢复、对其强化、另外还用于维持的手段，则是理想的。
用于解决问题的方案
本发明提供以下方案。
[1]一种用于改善肠道屏障的组合物，其包含选自属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的菌及属于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的菌中的任意者。
[2]根据1所述的组合物，其中，肠道屏障的改善为选自肠道屏障的维持、肠道屏障的强化、肠道屏障破坏的进展抑制及肠道屏障的恢复中的任意种。
[3]根据1或2所述的组合物，其中，肠道屏障的改善是通过改善肠道细胞的紧密连接而进行的。
[4]根据1～3中任一项所述的组合物，其供希望改善紧密连接的对象摄取。
[5]根据1～4中任一项所述的组合物，其用于肠漏(Leaky gut)的处置。
[6]根据1～5中任一项所述的组合物，其中，属于德氏乳杆菌的菌为属于德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)的菌。
[7]根据1～6中任一项所述的组合物，其中，选自属于德氏乳杆菌的菌及属于嗜热链球菌的菌中的任意者为选自德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株、德氏乳杆菌保加利亚亚种JCM1002T株、嗜热链球菌1131株、以及嗜热链球菌NCIMB8510T株中的任意者。
[8]用于在改善肠道屏障的方法中使用的、包含选自属于德氏乳杆菌的菌及属于嗜热链球菌的菌中的任意者的组合物。选自属于德氏乳杆菌的菌及属于嗜热链球菌的菌中的任意者的、制造用于改善肠道屏障的组合物的应用。改善肠道屏障的方法，其包括下述工序：向对象给予包含选自属于德氏乳杆菌的菌及属于嗜热链球菌的菌中的任意者的组合物。包含选自属于德氏乳杆菌的菌及属于嗜热链球菌的菌中的任意者的组合物的、用于改善肠道屏障的应用。
[9]根据8所述的组合物、制造中的应用、方法、或应用，其中，肠道屏障的改善为选自肠道屏障的维持、肠道屏障的强化、肠道屏障破坏的进展抑制、及肠道屏障的恢复中的任意者。
[10]根据8或9所述的组合物、制造中的应用、方法、或应用，其中，肠道屏障的改善是通过改善肠道细胞的紧密连接而进行的。
[11]根据8～10中任一项所述的组合物、制造中的应用、方法、或应用，供希望改善紧密连接的对象摄取。
[12]根据8～11中任一项所述的组合物、制造中的应用、方法、或应用，用于肠漏的处置。
[13]根据8～12中任一项所述的组合物、制造中的应用、方法、或应用，其中，属于德氏乳杆菌的菌为属于德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus)的菌。
[14]根据8～13中任一项所述的组合物、制造中的应用、方法、或应用，其中，选自属于德氏乳杆菌的菌及属于嗜热链球菌的菌中的任意者为选自德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株、德氏乳杆菌保加利亚亚种JCM1002T株、嗜热链球菌1131株、以及嗜热链球菌NCIMB8510T株中的任意者。
发明的效果
根据本发明，可以提供新的用于改善肠道屏障的组合物。由此，可以期待可降低基于肠道屏障破坏的疾病的发生风险等。
附图说明
图1：L.bulgaricus 2038及S.thermophilus 1131抑制由TNF-α和IFN-γ引起的TEER值下降。
平均值±SE(n＝5/组)。示出相对于添加菌、TNF-α、IFN-γ前的TEER值的、反应18小时后的TEER值的比例。*p<0.05(Tukey-Kramer法)。
图2：L.bulgaricus 2038及S.thermophilus 1131抑制由TNF-α和IFN-γ引起的FD-4透过亢进。
平均值±SE(n＝5/组)。膜透过系数Papp如下计算。*p<0.05(Tukey-Kramer法)。Papp(cm/sec)＝(dQ/dt)/(C0×S)、dQ/dt：透过速度(每单位时间出现在底(basal)侧的药物量nmol/sec)、C0：管腔(Apical)侧的药物初始浓度(μmol/L)、S：单层膜的表面积。
图3：L.bulgaricus 2038及S.thermophilus 1131抑制由TNF-α和IFN-γ引起的TJ蛋白(OCCLUDIN、ZO-1)的基因表达下降。
平均值±SE(n＝8-9/组)。通过GAPDH的表达进行标准化，示出将对照组的表达设为1时的相对表达量。*p<0.05(Tukey-Kramer法)。
图4：L.bulgaricus 2038及S.thermophilus 1131抑制由TNF-α和IFN-γ引起的TJ蛋白的破坏。
图5：在钙开关试验中，L.bulgaricus 2038及S.thermophilus 1131促进TEER值的上升。
平均值±SE(n＝8/组)。示出相对于交换为不含钙的培养基之前的TEER值的、各时间点下的TEER值的比例。*p<0.05(Tukey-Kramer法)。
图6：FD-4的透过抑制作用。
虚线表示对照组的值，实线表示TNF-α+IFN-γ组的值。以n＝3来实施，仅JCM1002T中n＝2。
图7：德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株的16S rRNA基因的序列(SEQ ID NO：1)及嗜热链球菌1131株的16S rRNA基因的序列(序列号2)。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
本发明涉及包含特定的菌的组合物。更详细而言，涉及以特定的菌为有效成分的、用于改善肠道屏障的组合物。
[有效成分]
本发明的组合物中，作为有效成分，包含选自属于乳杆菌(Lactobacillus)属的菌及属于嗜热菌(Streptococcus)属的菌中的任意者。
属于乳杆菌属的菌优选为属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的菌。属于链球菌属的菌优选属于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的菌。以下，指代在组合物中作为有效成分使用的这些菌中的任意者时，有时称为有效菌。需要说明的是，对于本发明而言称为任意者时，是指数量及种类是任意的。
根据本发明人们的研究，乳酸菌中的、属于乳酸乳球菌乳亚种的菌株在实验条件下未观察到目标功能。
在组合物中，只要是属于德氏乳杆菌的菌、属于嗜热链球菌的菌则亚种、菌株没有限定，可以使用各种作为有效成分。
作为属于德氏乳杆菌的菌的优选例，可列举属于德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)的菌，作为更特定的例子，可列举2038株、JCM1002T株及与这些在分类学上同等的菌株。2038株可以从明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治，在中国以“明治保加利亚式酸奶”销售，该制品和其中所含的菌株的相关信息可参照以下网址：https://www.meijibulgaria.cn/brand.html。该网页具体为：不使用稳定剂的酸奶_不使用防腐剂的酸奶_安全的健康无糖酸奶_低脂肪酸奶_明治酸奶官网(meijibulgaria.cn)。下文也同样。)中分离。JCM1002T株可以从国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心微生物材料开发室(〒305-0074日本茨城县筑波市高野台3-1-1)购买。
作为属于嗜热链球菌属的菌的例子，可使用1131株、NCIMB8510T株及与这些在分类学上同等的菌株。1131株可以从明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治)中分离。NCIMB8510T株可以从国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心微生物材料开发室(〒305-0074日本茨城县筑波市高野台3-1-1)购买。
与某一菌株(以下记作菌株S)在分类学上同等的菌株例如是指下述任意者。
·与菌株S属于同一属的菌株、优选与菌株S属于同一种的菌株，并且其16S rRNA基因的序列的全部或特征性的某一部分(V1区域、V2区域、或V1区域及V2区域的全部或一部分)与菌株S的序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上、进一步优选98.5％以上、进一步优选高于98.7％、进一步优选99％以上、进一步优选100％的序列同一性；
·与菌株S属于同一属的菌株、优选与菌株S属于同一种的菌株，并且与菌株S具有相同的菌学性质。
需要说明的是，关于基于16S rRNA基因序列判断种的异同的判断基准，本领域技术人员可以参考Stackebrandt E,Ebers J.Taxonomic parameters revisited:tarnishedgold standards.Microbiol Today 2006；33:152-155。
(德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株)
将2038株的菌学性质示于以下。
形态：杆菌、不利用葡萄糖来产气、GC含量49.7％、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、乳酸旋光性D型、15℃下不生长、同化葡萄糖和乳糖等并生成酸、不形成胞子、无运动性。
将2038株的16S rRNA基因的序列示于序列表的序列号1及图7。
(嗜热链球菌1131株)
将1131株的菌学性质示于以下。
形态：链球菌、不利用葡萄糖来产气、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、乳酸旋光性L型、45℃下可生长、同化葡萄糖、乳糖和果糖等并生成酸、不形成胞子、无运动性。
将1131株的16S rRNA基因的序列示于序列表的序列号2及图7。
需要说明的是，组合物中，可以在不损害目标功能的限度内包含除属于乳杆菌属的菌及属于链球菌属的菌以外的乳酸菌。另外，组合物可以包含目标乳酸菌以外的酵母等微生物。优选方式之一中，组合物包含1种或多种乳酸菌，不含其以外的微生物、例如酵母。
(有效菌的制造、获得)
组合物中所含的有效菌可以通过培养来制造。作为培养条件，只要可发挥目标效果则没有特别限定。德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株可以从明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治)中分离。德氏乳杆菌保加利亚亚种JCM1002T株可以从国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心微生物材料开发室(〒305-0074日本茨城县筑波市高野台3-1-1)购买。
作为属于嗜热链球菌属的菌的例子，可使用1131株、NCIMB8510T株及与这些在分类学上同等的菌株。嗜热链球菌1131株可以从明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治)中分离。嗜热链球菌NCIMB8510T株可以从NCIMB研究所(The National Collections ofIndustrial of Industrial,Food and Marine Bacteria,Ltd.,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland,UK)购买。
(有效菌的形态)
本发明的组合物中，有效菌只要可发挥目标效果则可以以任意状态包含。例如，有效菌除了为有效菌菌体本身的情况以外，有时也为有效菌的培养物(包含有效菌菌体和培养上清。)。菌体只要可发挥目标效果则可以为存活状态(活菌体)，也可以为死亡状态(死菌体)。
有效菌可以以死菌体形态包含在组合物中。死菌体可以通过对有效菌进行杀菌处理而得到。杀菌处理只要可发挥目标效果则没有特别限定，可以利用加热、杀菌灯(UV)、臭氧、药剂、高渗透压等。
死菌体优选为对活菌体进行加热处理而得到的加热处理死菌体。用于得到加热处理死菌体的加热处理只要可发挥目标效果则没有特别限定，可以以足以使所使用的有效菌死亡的温度及时间来实施。这样的条件也取决于所使用的有效菌，但是加热处理温度为例如55℃以上，优选60℃以上，更优选65℃以上，进一步优选70℃以上，可以设为80℃以上，可以设为90℃以上。加热处理温度的上限可适宜设定，例如121℃以下，可以设为100℃以下，可以设为90℃以下、80℃以下。另外，根据加热处理温度，加热处理时间可以设为1分钟以上，可以设为3分钟以上，可以设为10分钟以上、15分钟以上、30分钟以上、45分钟以上。加热处理时间的上限可以设为例如120分钟以下，可以为100分钟以下，可以为90分钟以下，可以为80分钟以下。
用于包含在组合物中的有效菌，不论是活菌体还是死菌体，都可以以干燥物、悬浮物、糊状、凝胶状等形态来制备。
[用途]
本发明的组合物可以用于改善肠道屏障。本发明称为肠道屏障时，只要没有特别声明则是指肠道中的物理性屏障。肠道的上皮细胞彼此通过称为紧密连接的牢固粘附而形成了物理性屏障。紧密连接由CLAUDIN、OCCLUDIN、连接粘附分子(JAM-A)、封闭小带(Zonulaoccluden，ZO)等构成。另外，本发明称为肠道屏障的改善时，是指直接改善肠道屏障。直接改善肠道屏障例如是有效成分直接作用于构成肠道屏障的上皮细胞，与有效成分使肠道内的特定细菌的分泌成分增加、由于该成分的作用而肠道屏障得到改善之类的间接性改善肠道屏障的情况不同。
肠道屏障的改善包括肠道屏障的维持、肠道屏障的强化、肠道屏障破坏的进展抑制及肠道屏障的恢复。肠道屏障的强化包括：使已被破坏的肠道屏障接近正常状态及使正常的肠道屏障得到加强。肠道屏障的破坏包括肠道屏障变得松弛。肠道屏障破坏的进展有时伴有肠道屏障的透过性的亢进。需要说明的是，已知衰老、饮食、过敏、压力等会使肠道屏障松弛。本发明的组合物可以用于改善因衰老、饮食、过敏、压力等而松弛的肠道屏障。肠道屏障的改善包括：由医生及接受医生指示的护士、助产士等所进行的治疗目的的改善；以及，医生以外的人、例如药剂师、营养师(包括管理营养师、运动营养师)、保健师、助产士、看护人员、临床检查技师、运动指导员、药物制造商、药物销售者、食品制造商、食品销售者等所进行的非治疗目的的改善。非治疗目的的改善包括例如医生以外的人向对象者通过推荐摄取特定食品、营养指导、饮食支持等而进行的用于美容、健康维持、疾病风险降低、安慰等的改善。
某种成分是否改善肠道屏障可由本领域技术人员通过各种方法来确认。例如，对形成了屏障的培养细胞层根据需要进行添加TNF-α或IFN-γ、暴露于不含钙的培养基等将已形成的屏障破坏掉的处理，在此基础上添加该成分，通过电阻值(TEER值)测定、物质透过试验、紧密连接(TJ)蛋白的基因表达分析、TJ蛋白的免疫染色等，由此可以确认肠道屏障的改善。作为适合于分析的TJ蛋白的例子，可列举CLAUDIN-1、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、OCCLUDIN、F11R(JAM-A)、TJP1(ZO-1)。
[组合物]
(食品组合物等)
本发明的组合物可以为食品组合物或药物组合物。除非特别声明，否则食品和药物不仅包括用于人类的食品和药物，还包括用于人以外的动物的食品和药物。除非特别声明，否则食品包括常规食品、功能性食品、营养组合物，另外包括治疗食品(发挥治疗目的的食品。医生开出的膳食处方，营养师等依据其制作菜单，基于该菜单烹调出的食品。)、饮食疗法食品、配方食品、护理食品、治疗辅助用食品。除非特别声明，否则食品不仅包括固态物，还包括液态的食品，例如饮料、保健饮料、流食和汤。功能性食品是指能对生物体赋予规定的功能性的食品，例如包括：特定保健用食品(包括附加条件的特保[特定保健用食品])、功能性标示食品、包括营养功能食品在内的保健功能食品、特殊用途食品、营养辅助食品、健康辅助食品、营养强化剂(例如，片剂、包衣片剂、糖衣片剂、胶囊、液剂等各种剂型的食品)、美容食品(例如，减肥食品)等全部健康食品。另外，本发明中“功能性食品”包括应用了食品法典委员会(FAO/WHO联合食品标准委员会)的食品标准的健康声明(Health claim)的健康食品。
(对象)
本发明的组合物适合于优选要改善肠道屏障的对象进行摄取。另外，本发明的组合物适合于想保持肠道健康的对象、想维持肠道恒常性的对象；想保持肠道屏障健康的对象；想降低肠道炎症风险的对象进行摄取。任意对象均优选是健康的(例如，肠道屏障健康、无肠道炎症)。
上述那样的对象包括成人(15岁以上)、中高年人、老年人(65岁以上(根据世界卫生机构(WHO)的定义))、病中病后人士、孕妇、产妇、婴幼儿、儿童。另外，本发明的组合物由于有效成分为食用经验丰富的菌，因此适合于长期摄取，因此特别适合于想要在日常生活中维持肠道屏障的对象。
优选方式中，给予组合物的对象为希望改善肠道屏障者。这样的希望改善肠道屏障者包括希望改善肠道细胞的紧密连接者、肠漏综合征者、老年人(高龄者)、因饮食、过敏、压力、肥胖等而肠道屏障松弛者、有这样的风险者(例如老年人、过敏者、处于压力下者、肥胖者)。另外，给予组合物的对象包括摄取较多的小麦或以小麦为原料的饮食品(面包类、面类、烘焙点心类等)者。已知来自小麦的麸质蛋白(蛋白质的一种)会使肠道屏障松弛。从有效成分直接作用于肠道屏障的观点出发，组合物适合于给予希望尽快发挥效果的对象。另外，组合物适合于给予优选构成紧密连接的蛋白质、例如CLAUDIN-1、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、OCCLUDIN、F11R(JAM-A)、TJP1(ZO-1)的基因表达(包括向mRNA的转录、向蛋白质的翻译。)上调的对象。
优选方式中，要给予组合物的对象者中，可以排除给予前述专利文献2记载的用于通过抗菌肽来防止肠道被病原菌攻击、侵入的组合物的对象。
(给予途径)
关于本发明的组合物，可以将其非经口、例如经管(胃瘘、肠瘘)给予，可以经鼻给予，可以经口给予，优选经口给予。
(有效成分的含量·用量)
本发明的组合物中的有效菌的含量只要为发挥目标效果的量即可。可以考虑要摄取·给予的对象的年龄、体重、症状等各种因素适当地设定组合物中的有效菌的含量。组合物的一个单位可以为1天或1次(可以一天一次地给予·摄取，也可以一天多次、例如3次地给予。)地进行摄取·给予的量。组合物的每一个单位中的有效菌的含量例如可以设为1×107个以上，可以设为1×108个以上、5×108个以上、1×109个以上、5×109个以上，优选设为1×1010个以上，更优选为1×1011个以上，进一步优选设为2×1011个以上。上限值可以适当，下限值在任意情况下均可以设为例如1×1014个以下、可以设为1×1013个以下、可以设为1×1012个以下。
另外，如上设定有效菌的含量时，任意情况下，一个单位可以设为例如0.5g以上，可以设为1g以上、5g以上、10g以上、20g以上、30g以上。组合物制成发酵乳之类的食品的形态时，一个单位可以是容易作为食品一次性摄取的量，例如可以设为50g以上，可以设为60g以上、70g以上、80g以上、90g以上、100g以上。上限值可以适当，下限值在任意情况下均可以设为500g以下，可以设为400g以下、300g以下、200g以下、150g以下、125g以下。
组合物以食用经验丰富的有效菌作为有效成分。因此，本发明的组合物可以重复或长期摄取，例如可以连续给予/摄取3天以上，优选1周以上，更优选4周以上，特别优选1个月以上。
(其它成分、添加剂)
本发明的组合物可以包含容许作为食品或药物的其它有效成分、营养成分。这样的成分的例子是氨基酸类(例如，赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、糖类(葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、赤藓糖醇、麦芽糖醇、帕拉金糖、木糖醇、糊精)、电解质(例如，钠、钾、钙、镁)、维生素(例如，维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、生物素、叶酸、泛酸和烟酸类)、矿物质(例如，铜、锌、铁、钴、锰)、抗生素、食物纤维、蛋白质、脂质等。
另外，组合物可以进一步包含容许作为食品或药物的添加物。这样的添加物的例子是非活性载体(固体载体、液体载体)、赋形剂、表面活性剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、助溶剂、悬浮剂、涂布剂、着色剂、保存剂、缓冲剂、pH调节剂、乳化剂、稳定剂、甜味剂、抗氧化剂、香料、酸味剂、天然物质。更具体而言，为水、其它水性溶剂、制药上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、藻酸钠、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、三氯蔗糖、甜菊糖、阿斯巴甜、安赛蜜、柠檬酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、磷酸、醋酸、果汁、蔬菜汁等。
(剂型/形态)
本发明的食品组合物可以制成固体、液体、混合物、悬浮液、粉末、颗粒、糊剂、啫喱、凝胶、胶囊等任意的形态。另外，本发明的食品组合物可以制成乳制品、营养强化剂、点心、饮料、保健饮料、调味剂、加工食品、配菜、汤等任意的形态。更具体而言，本发明的组合物可以制成发酵乳、乳酸菌饮料、乳性饮料、乳饮料、清凉饮料、冰激凌、片状物、乳酪、面包、饼干、薄脆饼干、比萨饼皮、配方奶粉、流食、病人食品、营养食品、冷冻食品、加工食品等形式，另外也可以是用于混合在饮料、食品中摄取的颗粒、粉末、糊、浓缩液等形式。发酵乳是指日本的“关于乳及乳制品的成分标准等的省令(以下简称为“乳等省令”。)”中所定义的发酵乳及乳酸菌饮料。乳等省令中的发酵乳为将乳或包含与其同等以上的非脂乳固体成分的乳等用乳酸菌或酵母发酵而呈糊状或液状的物质或这些的冷冻物。
本发明的药物组合物可以制成适合于经口给予的片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂等固体制剂、液剂、悬浮剂、糖浆剂等液体制剂、凝胶剂、气雾剂等任意剂型。
另外，就本发明而言，由于有效成分直接改善肠道屏障，因此食品或药物组合物优选有效成分直接到达肠道那样的方式，例如实施了肠溶性覆膜的胶囊、压片、颗粒等固体的方式以及配合了这样的固体的组合物的方式。
(其它)
本发明的组合物的制造中，配合有效菌的阶段可以适当选择。只要不显著损害有效菌的特性，则配合的阶段没有特别限制。例如，可以如下制造组合物：将乳、乳制品和水混合，根据需要均质化，杀菌，接种有效菌，发酵，由此以包含足够量的有效菌的发酵乳形式制造组合物。作为原料的乳及乳制品可以根据发酵中使用的有效菌适当选择。优选方式之一是，作为原料的乳及乳制品包括源自动物的乳及乳制品。另外，作为原料的乳及乳制品可以不含植物性的乳，例如豆奶、杏仁奶、燕麦奶、椰子奶、米奶、麻奶。
组合物可以标示使用目的(用途)，另外可以标示推荐特定对象进行摄取的主旨。标示可以直接或间接进行，作为直接标示的例子，包括在制品自身、包装、容器、标签、标牌等实体物上记载，间接标示的例子包括利用网站、店铺、产品宣传手册、展示会、媒体研讨会等研讨会、书籍、报纸、杂志、电视、广播、邮寄物、电子邮件、音频等场所或手段进行的广告/宣传活动。
关于标示于作为食品的组合物的用途/功能的例子，可列举肠道屏障的改善、肠道屏障的维持、肠道屏障的强化、肠道屏障破坏的进展抑制、肠道屏障透过性亢进的抑制、肠道屏障的恢复(修复)、肠道屏障的正常化、使肠道屏障维持正常、保护肠道屏障、肠道屏障的完整性(integrity)的维持、肠漏综合征(leaky gut syndrome)的预防、肠漏综合征的改善、肠道细胞的紧密连接的强化(使之牢固)、紧密连接的维持、紧密连接的正常化、保护紧密连接、促进紧密连接的形成、紧密连接的完整性(integrity)的维持等。
【实施例】
[实施例1]
将人结肠癌来源的细胞株Caco-2在Transwell培养板(制品名：Transwell12孔0.4μm、细胞培养表面处理后、灭菌后、制造商：Corning、型号：3401)的插件上培养2周，使其单层化。使用以最低必需培养基(Thermo Fisher Scientific)为基础并包含10％胎牛血清(Biowest)、1％MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific)的培养基。
L.bulgaricus 2038在MRS培养基中培养18小时，S.thermophilus 1131在含1％乳糖的M17培养基中培养18小时。用PBS清洗后在PBS中以OD600＝10方式悬浮，相对于培养基添加1％。另外，为了破坏屏障，以终浓度各10ng/mL的方式添加TNF-α(制品名：RecombinantHuman TNF-alpha、制造商：R&DSystems、型号：210-TA-020)和IFN-γ(制品名：IFN-γ,Human,Recombinant、制造商：R&D Systems、型号：285-IF-100)。
测定培养18小时后的经上皮电阻值(TEER值)。实施荧光物质FITC-dextran分子量4,000(FD-4)透过试验。进一步通过实时PCR测定紧密连接(TJ)蛋白的基因表达，实施TJ蛋白的免疫染色。
关于TEER值，与对照组相比，TNF-α+IFN-γ组显著下降，通过L.bulgaricus 2038或S.thermophilus 1131，显著抑制下降(图1)。另外，在不添加TNF-α和IFN-γ且添加了2038或1131的体系中，TEER值上升。
关于FD-4的透过量，与对照组相比，TNF-α+IFN-γ组显著增加，通过L.bulgaricus2038或S.thermophilus 1131，透过亢进得到显著抑制(图2)。
关于TJ蛋白的基因表达，测定了OCLN(OCCLUDIN)、TJP1(ZO-1)。与对照组相比，TNF-α+IFN-γ组的基因表达显著下降，通过L.bulgaricus 2038或S.thermophilus 1131，显著抑制下降(图3)。该结果表明，通过L.bulgaricus2038或S.thermophilus 1131抑制了TJ蛋白的表达下降，由此能够抑制屏障破坏。
TJ蛋白的免疫染色以CLAUDIN-1、CLAUDIN-4、OCCLUDIN、JAM-A、ZO-1为对象。与对照组相比，TNF-α+IFN-γ组中观察到了TJ蛋白的结构被破坏的情况，通过L.bulgaricus2038或S.thermophilus 1131，破坏得到了抑制(图4)。
[实施例2]
将Caco-2细胞在Transwell培养板(与实施例1相同)的插件上培养2周(与实施例1相同)，使其单层化。测定TEER值后，在不含钙的培养基中培养16小时而使细胞粘附松弛。交换为含有钙的普通培养基，并且添加L.bulgaricus2038或S.thermophilus 1131。需要说明的是，菌的制备和浓度与实施例1相同。此后每隔1小时经时测定TEER值，直至8小时后为止。
8小时后，与对照组相比，L.bulgaricus 2038添加组观察到TEER值的显著上升(图5)。与对照组相比，S.thermophilus 1131添加组的TEER值也上升(图5)。
[实施例3]
将Caco-2细胞在Transwell培养板(与实施例1相同)的插件上培养2周(与实施例1相同)，使其单层化。将表1所示的菌株在各自的条件下培养18小时。用PBS清洗后，在PBS中以OD600＝10方式悬浮，相对于培养基添加1％。另外，为了破坏屏障，以终浓度各10ng/mL的方式添加TNF-α和IFN-γ。培养18小时后，实施FD-4透过试验。
【表1】
所使用的菌株和培养条件
菌种名 保藏机构编号等 培养基 温度 好氧/厌氧
L.bulgaricus 2038*1 MRS 37℃ 厌氧
S.thermophilus 1131*2 LM17 37℃ 厌氧
L.bulgaricus JCM1002T MRS 37℃ 厌氧
S.thermophilus NCIMB8510T LM17 37℃ 厌氧
乳酸乳球菌乳亚种 P2202601 MRS 30℃ 厌氧
*1：从明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治)中分离
*2：从明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治)中分离
与对照组相比，TNF-α+IFN-γ组中FD-4的透过量增加，L.bulgaricus、S.thermophilus抑制了FD-4的透过量，特别是L.bulgaricus 2038或S.thermophilus1131，强烈抑制FD-4的透过量(图6)。关于L.Bulgaricus，除了2038以外JCM1002T也抑制透过亢进。关于S.thermophilus，除了1131以外，NCIMB85 10T也抑制透过亢进。
此次作为对象的乳酸菌菌种中，也存在不抑制FD-4的透过亢进的乳酸菌菌种，推测是菌种特异性的。
[小结]
此次，在将人结肠癌来源Caco-2细胞的单层屏障用TNF-α和IFN-γ破坏而成的体系中，发现属于德氏乳杆菌的菌(进一步规定的话，属于Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus(德式乳杆菌保加利亚亚种)的菌)或属于嗜热链球菌的菌有抑制该屏障破坏的作用。另外发现，不破坏人结肠癌来源Caco-2细胞的单层屏障或不强制使其松弛的情况下，通过将属于德氏乳杆菌的菌(进一步规定的话，属于Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus(德式乳杆菌保加利亚亚种)的菌)或属于嗜热链球菌的菌添加到培养基中，这些菌使屏障得到强化。另外，在上述体系中，发现上述菌有抑制TJ蛋白基因表达下降的作用以及抑制TJ蛋白破坏的作用。
另外发现如下作用：在不含钙的培养基中培养Caco-2细胞的单层屏障、并且使细胞间粘附强制松弛的体系中，通过交换为含钙的普通培养基并向培养基中添加属于德氏乳杆菌的菌(进一步规定的话，属于Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus(德式乳杆菌保加利亚亚种)的菌)或属于嗜热链球菌的菌，这些菌促进肠道屏障的恢复。
因此，上述的菌可以用于物理性的肠道屏障的改善、特别是肠道细胞的紧密连接的改善。另外，可以说上述的菌尤其能够有效用于选自肠道屏障的维持、肠道屏障的强化、肠道屏障破坏的进展抑制、及肠道屏障的恢复中的任意者。
已知由于肠道屏障的破坏、肠道屏障的松弛而导致LPS等物质流入体内、引起炎症、引发各种疾病的肠漏综合征(肠漏)。因此，通过上述的菌，可期待肠漏的预防及改善。
[实施例中使用的方法]
(经上皮电阻值(TEER值)的测定)
TEER使用MILLICELL(注册商标)-ERS voltohmmeter(Millipore)来测定。
(FD-4透过试验)
将平均分子量4,000的FITC-葡聚糖(Sigma-Aldrich)以终浓度1mg/mL的方式添加到管腔侧。1小时后，回收底外(basolateral)侧的培养基，用荧光酶标仪Synergy H1(BioTek)测定透过量(荧光波长535nm、激发波长480nm)。
(紧密连接(TJ)蛋白的基因表达试验)
利用Maxwell RSC simpleRNACells Kit(Promega)提取Caco-2细胞的总RNA。用Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific)测定总RNA的浓度。使用1μg的总RNA，利用PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa Bio)制备互补DNA。使用SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa Bio)，通过QuantStudio 3Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific)实施实时PCR。
引物使用下述引物。定量比较通过ΔΔCT法实施。另外，通过GAPDH的表达来实施标准化。
OCCLUDIN(OCLN)：
正向5’-TCAGGGAATATCCACCTATCACTTCAG-3’(序列号3)
反向5’-CATCAGCAGCAGCCATGTACTCTTCAC-3’(序列号4)
ZO-1(TJP1)：
正向5’-CGGTCCTCTGAGCCTGTAAG-3’(序列号5)
反向5’-GGATCTACATGCGACGACAA-3’(序列号6)
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)：
正向5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(序列号7)
反向5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(序列号8)
(TJ蛋白的免疫染色)
向Caco-2细胞加入4％多聚甲醛(Wako)，在室温下孵育10分钟而进行固定。用PBS清洗后加入包含0.2％ Triton X-100的PBS(PBST)，在室温下孵育5分钟。加入1滴Image-iTFX signal enhancer(Thermo Fisher Scientific)，在室温下孵育30分钟。加入10％山羊血清，在室温下孵育20分钟。之后添加抗CLAUDIN-4抗体(MAB42191-SP；R&D Systems)、抗OCCLUDIN抗体(GTX114949；Genetex)、抗JAM-A抗体(NBP2-71876；Novus Biologicals)、以及抗ZO-1抗体(GTX108627；Genetex)，在室温下孵育2小时。然后，加入荧光标记的山羊来源抗IgG抗体(ab150087and ab150117；abcam)，在室温下孵育1小时。切下插件，置于载玻片上，用共聚焦激光显微镜LSM880(Zeiss)观察。
[发酵乳制品(原味酸奶)的制造]
将牛乳、乳制品(牛乳来源)和水以最终制品的非脂乳固体成分为9.5％、乳脂成分为3.0％的方式混合，制备酸奶基础混合物。然后，将制备的酸奶基础混合物均质化后，以95℃、5分钟进行加热杀菌，之后冷却到约40℃。向该杀菌后的酸奶基础混合物中接种从“明治保加利亚酸奶(株式会社明治)”中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株及嗜热链球菌1131株的混合起子，发酵，制造用于改善肠道屏障的酸奶。
[序列表中记载的序列]
序列号1 16S rRNA基因,德氏乳杆菌保加利亚亚种2038
序列号2 16S rRNA基因,嗜热链球菌1131
序列号3正向引物，用于OCCLUDIN
序列号4反向引物，用于OCCLUDIN
序列号5正向引物，用于ZO-1
序列号6反向引物，用于ZO-1
序列号7正向引物，用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶
序列号8反向引物，用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶

Claims (8)

1.选自属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的菌及属于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的菌中的任意者的、制造用于改善肠道屏障的组合物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，肠道屏障的改善为选自肠道屏障的维持、肠道屏障的强化、肠道屏障破坏的进展抑制及肠道屏障的恢复中的任意者。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，肠道屏障的改善是通过改善肠道细胞的紧密连接而进行的。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述组合物是用于供希望改善紧密连接的对象摄取的组合物。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述组合物用于肠漏的处置。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，属于德氏乳杆菌的菌为属于德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)的菌。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，选自属于德氏乳杆菌的菌及属于嗜热链球菌的菌中的任意者为选自德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株、德氏乳杆菌保加利亚亚种JCM1002T株、嗜热链球菌1131株、以及嗜热链球菌NCIMB8510T株中的任意者。
8.一种非治疗目的的、对象的肠道屏障的改善方法，其包括下述工序：向对象给予包含选自属于德氏乳杆菌的菌及属于嗜热链球菌的菌中的任意者的组合物的工序。
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