CN117729848A - 用于冷冻和解冻哺乳动物细胞的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本公开尤其提供了一种冷冻保存和解冻细胞的方法，所述方法使解冻的细胞在解冻后具有高细胞活力和功能性。在一些实施方案中，提供了一种大规模冷冻保存细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述细胞与冷冻保存介质接触；(b)将所述细胞以最大限度地减少熔化潜热的控制速率冷却到‑80℃；以及(c)将所述细胞储存于液氮气相中，从而冷冻保存免疫细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年2月9日申请的美国临时专利申请序列号63/147,737和于2022年2月8日提出的PCT/US2022/015627的优先权，所述申请的内容以引用的方式整体并入本文中以用于达成所有目的。
背景技术
如细胞、组织、器官、血液制品、胚胎、精子、干细胞、鱼卵等生物材料的冷冻保存需要将生物材料冷冻到足够低的温度，使得可能会损坏材料的化学过程停止，从而保存材料。
冷冻保存领域通常不仅旨在冷冻生物材料，而且还旨在保留其活力，即其在解冻后恢复正常生物功能的能力。当冷冻生物材料时，内部的流体通常会经历相变，在此期间可能形成冰晶。冰晶的形成可能对生物材料造成损害，使其在解冻后可能无法生存。
因此，需要优化冷冻保存条件，特别是在冷冻保存用于疗法的细胞时，以确保可能需要运送以用于各种应用，例如用于细胞疗法、再生医学、组织工程和许多其它生物医学应用的细胞的生存。
欠佳的冷冻保存可导致细胞活力和功能性在批次间发生变化，细胞产量降低，还会导致可能选择具有与原始细胞不同的遗传或表观遗传特征的亚群。监管要求也对冷冻保存有影响，因为这些将要求对产品的冷冻、储存和解冻采取稳健并且可重复的方法。
发明内容
本申请至少部分基于用于有效冷冻和解冻哺乳动物细胞的方法和组合物。本发明部分基于大规模冷冻保存/解冻方法的开发，所述方法通常适用于哺乳动物细胞，例如免疫细胞，特别是适用于细胞疗法的工程化的免疫细胞。本申请公开了一种冷冻方法，所述方法包括各种冷却、加热和保持步骤，所述方法允许冷冻保存细胞，所述细胞在解冻后具有高活力和功能。此外，本文所述的冷冻/解冻方法能够在少于或约60分钟内大规模(例如，体积大于10mL)地一致冷冻含有细胞的样品，以及能够向有需要的受试者直接施用后续解冻的细胞样品，如本文所述。
举例来说，如下文更详细描述，本文所述的方法允许在体外和体内保留免疫细胞功能，至少与新鲜分离的细胞可比较。此外，本文提供的方法和组合物可用于保存大体积免疫细胞，尤其是适用于细胞疗法的同种异体的工程化的免疫细胞，例如用于储存和运输到细胞库或医院，在细胞库或医院，细胞可用于进一步培养和分析或可直接注射到有需要的患者中。因此，本申请提供了在保存大体积哺乳动物细胞，特别是适用于细胞疗法的工程化的免疫细胞方面极为有效的冷冻和解冻方法。
在一些方面，大规模冷冻保存免疫细胞的方法包括：(a)提供包含样品的容器，所述样品包含悬浮于冷冻保存介质中的免疫细胞，其中样品体积比容器的全容量体积小至少5％，并且其中样品体积是至少10ml；(b)在多步工艺中以最大限度地减少熔化潜热的控制速率将容器从高于样品的冷冻温度的温度冷却到约或低于-80℃的温度；以及(c)将细胞储存于液氮气相中，从而冷冻保存免疫细胞。
在一些实施方案中，最大限度地减少熔化潜热的控制速率包括将温度以0.75℃/分钟到30℃/分钟之间的速率降低到-80℃或更低的最终温度的两个或更多个步骤。
在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于120分钟、少于110分钟、少于100分钟、少于90分钟、少于80分钟、少于70分钟或少于60分钟。因此，在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于120分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于110分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于100分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于90分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于80分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于70分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于60分钟。
在一些实施方案中，免疫细胞是新鲜分离的或至少曾冷冻和解冻。
在一些实施方案中，免疫细胞是天然存在或工程化的自然杀伤(NK)细胞、αβT细胞、γδT细胞、调节性T细胞(Treg)、诱导性多能干细胞(iPSC)、iPSC来源的T或NK细胞、造血干细胞(HSC)、间充质基质细胞(MSC)、树突状细胞、巨噬细胞或B细胞。因此，在一些实施方案中，免疫细胞是天然存在或工程化的NK细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是工程化的NK细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是αβT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是γδ。在一些实施方案中，免疫细胞是Treg。在一些实施方案中，免疫细胞是iPSC。在一些实施方案中，免疫细胞是iPSC来源的T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是iPSC来源的NK细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是HSC。在一些实施方案中，免疫细胞是MSC。在一些实施方案中，免疫细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是B细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是经嵌合抗原受体(CAR)工程改造的脐带血来源的NK细胞。
在一些实施方案中，NK细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。NK细胞可包含任何CAR，包括例如以下中的一者或多者：CD19 CAR、B细胞成熟抗原(BCMA)CAR、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)CAR、CD22 CAR、间皮素CAR、MUC1 CAR、上皮细胞粘附分子(EpCAM)CAR、表皮生长因子受体(EGFR)CAR、CD123 CAR、CD20 CAR、HER2 CAR、GD2 CAR、CD133 CAR、EphA2 CAR和前列腺特异性膜抗原(PSMA)CAR。因此，在一些实施方案中，NK细胞包含CD19 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含BCMA CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含GPC3 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含CD22 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含间皮素CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含MUC1 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含EpCAM CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含EGFR CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含CD123 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含CD20CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含HER2 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含GD2 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含CD133 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含EphA2 CAR。在一些实施方案中，NK细胞包含PSMA CAR。
在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达IL-15、IL-15与IL-15Rα的复合物、IL-18、IL-12、IL-7、CCL19中的一者或多者。因此，在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达IL-15。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达IL-15与IL-15Rα的复合物。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达IL-18。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达IL-12。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达IL-7。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达CCL19。
在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达一种或多种自杀基因。举例来说，在一些实例中，NK细胞被工程化成表达iCaspase9、非分泌性TNFα、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRTase)、胞嘧啶脱胺酶(CD)中的一者或多者。因此，在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达一种或多种iCaspase9。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达非分泌性TNFα。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRTase)。在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达胞嘧啶脱胺酶(CD)。
在一些实施方案中，NK细胞被工程化成表达CD19 CAR、IL-15和iCaspase9。
在一些实施方案中，NK细胞是包括CD19-CAR的基因工程化的脐带血NK细胞，该CD19-CAR包含：抗CD19结合结构域；跨膜结构域，例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154；和细胞内信号传导结构域，例如细胞内信号传导结构域FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3-ζ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。CD-19结合结构域可以是单链抗体或单链抗体片段，例如scFv。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包括包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链可变区。在另一实施方案中，CD-19CAR可包括抗CD19结合结构域、CD28跨膜结构域(示例性CD28跨膜序列在SEQ IDNO:3中示出、CD3z信号传导结构域(示例性CD3z序列在SEQ ID NO:4中示出，还可包括自杀开关，例如iCaspase9和/或IL-15。
在一个实施方案中，基因工程化的脐带血NK细胞包括编码抗CD19结合结构域的重链可变区的核酸分子和/或编码抗CD19结合结构域的轻链可变区的核酸分子。
在一些实施方案中，容器的全容量体积是约50ml。
在一些实施方案中，容器的全容量体积是约50ml并且样品体积小于40ml。
在一些实施方案中，样品体积是约10ml、约15ml、约20ml、约25ml、约30ml、约31ml、约32ml、约33ml、约34ml、约35ml、约36ml、约37ml、约38ml、约39ml、约40ml、约41ml、约42ml、约43ml、约44ml或约45ml。因此，在一些实施方案中，样品体积是约10mL。在一些实施方案中，样品体积是约15mL。在一些实施方案中，样品体积是约20mL。在一些实施方案中，样品体积是约15mL。在一些实施方案中，样品体积是约25mL。在一些实施方案中，样品体积是约30mL。在一些实施方案中，样品体积是约35mL。在一些实施方案中，样品体积是约40mL。在一些实施方案中，样品体积是约45mL。
在一些实施方案中，容器是冷冻瓶或冷冻袋。因此，在一些实施方案中，容器是冷冻瓶。在一些实施方案中，容器是冷冻袋。
在一些实施方案中，冷冻瓶的内部尺寸介于10mm与18mm之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的外部尺寸介于15mm与40mm之间。
在一些实施方案中，冷冻瓶的内部尺寸是约13.5mm。
在一些实施方案中，冷冻瓶的高度介于约40mm与50mm之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度介于约30mm与90mm之间。
在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是约48.3mm。
在一些实施方案中，容器对DMSO有抗性。
在一些实施方案中，免疫细胞以约6×106与120×106个细胞/毫升之间的浓度存在。在一些实施方案中，免疫细胞以约6×106与25×106个细胞/毫升之间的浓度存在。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包含冷冻保护剂、白蛋白、二糖、和无热原且等渗的晶体溶液。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包含人血清白蛋白(HSA)、氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾、氯化镁、二甲亚砜(DMSO)和海藻糖。
在一些方面，提供了一种大规模解冻冷冻保存的免疫细胞的方法，所述方法包括：(a)将水浴加热到在37℃和70℃范围内的温度；(b)将包含冷冻保存的免疫细胞的容器转移到预热的水浴中；以及(c)将容器以约100RPM与约250RPM之间的速度搅动合适的时间段，从而获得解冻的免疫细胞。在一些实施方案中，水浴温度介于55℃与65℃之间。在一些实施方案中，将容器以约100RPM与150RPM之间的速度搅动。
在一些实施方案中，合适的时间段介于5-15分钟之间。
在一些实施方案中，合适的时间段是约10分钟。
在一些实施方案中，搅动发生在定轨振荡器水浴中。
在一些实施方案中，在定轨振荡器水浴中搅动细胞是在约120-150RPM的速度下。
在一个实施方案中，将细胞在60℃水浴中以125RPM搅动约10分钟。
在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃。因此，在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约50℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约55℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约60℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约65℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约70℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约75℃。
在一些实施方案中，容器具有约50mL的全容量体积和介于约8mL与45mL之间的样品体积。
在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有90％、95％、97％或更高的解冻后活力。因此，在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有90％的解冻后活力。在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有95％的解冻后活力。在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有97％的解冻后活力。在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有超过97％的解冻后活力。
在一些实施方案中，解冻的免疫细胞保留与新鲜分离的免疫细胞类似的体外和/或体内功能。
在一些实施方案中，方法还包括将解冻的免疫细胞施用到有需要的受试者的步骤。
在一些方面，提供了一种改变含有免疫细胞的样品的温度的方法，使温度从高于样品的冷冻温度的第一温度变成低于或等于-80℃的最终温度，从而将样品冷冻保存在最终温度下，所述方法包括以下步骤：(a)将样品放置于高于样品的冷冻温度的第一温度下；(b)将第一温度以第一控制速率降低到第二温度，其中第二温度比第一温度低至少2℃；(c)将第二温度以第二控制速率降低到第三温度，其中第三温度比第二温度低至少40℃；(d)将第三温度以第三控制速率升高到第四温度，其中第四温度比第三温度高至少20℃；(e)将第四温度以第四控制速率降低到第五温度，其中第五温度比第四温度低至少10℃；以及(f)将第五温度以第五控制速率降低到最终温度，其中最终温度低于或等于-80℃。
在一些实施方案中，第一温度是约4℃到1℃。在一些实施方案中，第一温度是约4℃。在一些实施方案中，第一温度是约3℃。在一些实施方案中，第一温度是约2℃。在一些实施方案中，第一温度是约1℃。
在一些实施方案中，第一控制速率介于约0.75℃与1.25℃/分钟之间。
在一些实施方案中，第二温度是约-2℃。
在一些实施方案中，第二控制速率介于约20℃与30℃/分钟之间。
在一些实施方案中，第三温度是约-60℃。
在一些实施方案中，第三控制速率介于约5℃与15℃/分钟之间。
在一些实施方案中，第四温度是约-25℃。
在一些实施方案中，第四控制速率介于0.75℃与1.25℃/分钟之间。
在一些实施方案中，第五温度是约-40℃。
在一些实施方案中，第五控制速率介于7℃与15℃/分钟之间。
在一些实施方案中，最终温度低于或等于-80℃。
在一些方面，提供了一种方法，所述方法包括冷冻保存适于细胞疗法的工程化的免疫细胞，所述方法包括：(1)提供包含样品的容器，所述样品包含悬浮于冷冻保存介质中的免疫细胞，其中样品体积比容器的全容量体积小至少5％，其中样品体积是至少10mL；和(2)以最大限度地减少熔化潜热的影响的控制速率逐步冷冻工程化的免疫细胞群，其中所述逐步冷冻包括将细胞以0.75℃/分钟到30℃/分钟之间的速率冷却到-80℃或更低的最终温度，从而冷冻保存细胞。
附图说明
图1A是展示具有可调节的旋转速度和温度的示例性定轨振荡器水浴的图。图1B是展示定轨振荡器的示例性样品室的图，所述定轨振荡器具有用于固持冷冻容器或冷冻瓶以快速解冻冷冻保存的细胞的支架。
图2是展示使用如实施例1中所述的大体积冷冻方案的45ml不含细胞的安慰剂配制溶液的冷冻概况的图。
图3是展示使用如本文，尤其是实施例2中所述的60分钟冷冻方案的36ml CAR-NK细胞的冷冻概况的图。CAR-NK细胞在控制速率冷冻装置中冷冻。
图4是展示五个50ml AT小瓶的冷冻概况的图，每个小瓶包含16mL、30mL和45mLiCART细胞(在本说明书中有时称为iCART)。左下角的图展示50ml小瓶在冷冻装置中的排列。USB名称是指小瓶在冷冻装置中的放置。
图5A是展示浓度为80×106个细胞/毫升的45ml和30ml冷冻iCART在60℃定轨振荡器水浴中的解冻概况的图，其中定轨振荡器的旋转速度设置为150rpm。图5B是展示浓度为120×106个细胞/毫升的45ml、30ml和16ml冷冻iCART在60℃定轨振荡器水浴中的解冻概况的图，其中定轨振荡器的旋转速度设置为150rpm。
图6是显示使用本文所述的冷冻和解冻顺序冷冻的iCART细胞的活力的图。
图7A描绘了一幅图，它展示了利用本文所述的冷冻和解冻顺序，在80×106和120×106/mL下不同填充体积的50mL AT小瓶中冷冻CAR-NK细胞与新鲜细胞相比可比较的体外杀死功效与E:T(效应细胞:靶细胞)比率的函数关系，以及2mL冷冻瓶和2mL AT小瓶的情况。图7B是描绘经冷冻、然后解冻的CAR-NK细胞的表型的表。
图8A描绘了一系列图，它们展示了利用本文所述的冷冻和解冻顺序，6×106和80×106个细胞/毫升的CAR-NK细胞与作为参考细胞的2mL冷冻瓶中的冷冻细胞可比较的体外杀死功效与E:T比率的函数关系。图8B和图8C是数据总结，展示了大体积50mL小瓶对比2mL冷冻瓶中的参考细胞具有高的(≥96％)和可比较的活力、杀死功效和表型。
图9A-C是一系列图，它们展示了施用曾冷冻、随后解冻的CAR-NK细胞的肿瘤小鼠模型的体内生存百分比。这些图展示了与媒介物(不含细胞的冷冻介质)相比以及与作为获救的新鲜CAR-NK细胞的细胞相比，施用曾冷冻、随后解冻的CAR-NK细胞(细胞悬浮液#1-#3)后的肿瘤小鼠模型动物生存率。图9A展示了施用CAR-NK细胞(“细胞悬浮液#1)后的动物生存百分比。图9B展示了将CAR-NK细胞施用到肿瘤小鼠模型后的动物生存百分比。图9C展示了将CAR-NK细胞施用到肿瘤小鼠模型后的动物生存百分比。
图9D-9F是一系列图，它们展示了与媒介物(不含细胞的冷冻介质)相比以及与获救的新鲜CAR-NK细胞相比，注射曾冷冻、随后解冻的CAR-NK细胞(细胞悬浮液#1-3)的肿瘤小鼠模型的体内荧光素酶荧光的总通量。
图9G是一系列图像，它们展示了与媒介物(不含细胞的冷冻介质)相比以及与获救的新鲜CAR-NK细胞相比，注射曾冷冻、随后解冻的NK细胞(细胞悬浮液#1-3)的小鼠中的荧光素酶活性。
定义
同种异体：如本文所用，同种异体是指源自与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不一致时，则称两个或多个个体彼此同种异体。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体材料可能在基因上完全不同，以致发生抗原性相互作用。
大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”在应用于一个或多个所关注值时是指所陈述的所关注值以及与所陈述的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另外说明或从上下文另外显而易见(除了这类数目超过可能值的100％)，否则术语“大约”或“约”是指所陈述的所关注值，以及在任一方向上(大于或小于)在所陈述的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。
生物样品：如本说明书中所用的术语“生物样品”包括细胞(真核和原核)、由细胞构成的器官和组织、病毒(都可以是天然的或在基因上或以其它方式进行修饰)，以及生物活性分子，例如大分子，例如包括细胞、核酸、蛋白质、糖蛋白、脂质、脂蛋白。本发明特别适用于人和其它哺乳动物的免疫细胞的冷冻保护。
新鲜细胞或获救的新鲜细胞：如本文所用，术语“新鲜”、“新鲜细胞”或“获救的新鲜细胞”是指从未冷冻和/或曾经冷冻但随后在培养基中再刺激、培养、然后作为新鲜细胞收获的哺乳动物细胞。
容器：如本文所用的术语“容器”应具有其普通含义，包括用于容纳、固持、施用、递送或运输例如冷冻保存的细胞和相关化合物的材料的托架、支架、外壳和导管。因此，在一个实施方案中，容器不与DMSO起反应。在另一实施方案中，本文所用的容器(例如，无菌冷冻瓶)既不含DEHP，亦对DMSO有抗性。示例性的合适容器包括冷冻瓶、冷冻袋等。各种冷冻瓶是已知的，并且包括例如冷冻瓶、NuncTM小瓶、玻璃小瓶等。
控制冷却或以控制速率冷却：如本文所用的术语“控制冷却”或“以控制速率冷却”和类似术语是应用外部冷却方案，以例如0.1℃/分钟与50℃/分钟之间的速率冷却，使生物样品温度降低的过程。在一些实施方案中，可使用市售冷冻机，例如控制速率冷冻机来实现控制冷却。控制速率冷冻机的各种实例包括例如但不限于CryoMedTM型号5474、StrexCytoSensei SB02-0920、Custom BioGenic Systems型号2101。
冷冻保护剂：如本文所用，术语“冷冻保护剂”是指用于保护生物组织免受冷冻损伤的物质。示例性冷冻保护剂包括例如二甲亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇和丙二醇。
冷冻保存：如本文所用，术语“冷冻保存”或“冷冻”通常是指冷冻细胞以维持细胞活力的方法。冷冻保存的细胞在冷冻状态下可长时间维持活力，例如在冷冻保存状态下可维持1年、5年、10年或更长时间。冷冻保存的细胞一旦解冻，将能够进行增殖，用于体外和体内应用。
免疫细胞：如本文所用的术语“免疫细胞”表示具有辅助、溶细胞或调节特性的淋巴细胞，例如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞、CD4+CD8暗T细胞、CD4+调节性T细胞、CD56+CD8+和CD56-CD57+CD8+NKT、CAR-T细胞以及CD16+CD56+NK细胞。然而，如本文所用的术语“免疫细胞”不仅意味着在体外在培养基中保持和繁殖的免疫细胞，并且还意味着取自健康献血者、患者或动物的免疫细胞群以及相应纯化的免疫细胞。在一些实施方案中，“免疫细胞”可用于定义通过表达嵌合抗原受体(CAR)而修饰的T细胞。在一些实施方案中，“免疫细胞”可用于定义通过表达CAR而修饰的NK细胞。在一些实施方案中，“免疫细胞”是HSC细胞。在一些实施方案中，“免疫细胞”是MSC细胞。在一些实施方案中，“免疫细胞”是脐带血来源的免疫细胞。在一些实施方案中，“免疫细胞”是iPS细胞来源的免疫细胞。在一些实施方案中，“免疫细胞”是调节性T细胞。在一些实施方案中，“免疫细胞”是γ-δT-细胞。在一些实施方案中，NK细胞包含抗CD19嵌合抗原受体(CAR)、IL-15和iCaspase9。因此，在一些实施方案中，NK细胞被工程改造(例如，使用病毒转导或非病毒方法)成表达自杀基因、抗CD19 CAR基因和IL-15基因。包含CD19 IL-15和iCaspase9的示例性CAR-NK细胞描述于Leukemia 32(2018)520-531中，其以引用的方式整体并入本文中。
在一特定实施方案中，示例性CAR-NK细胞包括包含抗CD19结合结构域的CD19CAR，所述抗CD19结合结构域包括包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的序列的轻链可变区和/或包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的序列的重链可变区。在一些实施方案中，基因工程化的脐带血NK细胞包括编码抗CD19结合结构域的重链可变区的核酸分子和/或编码抗CD19结合结构域的轻链可变区的核酸分子。
潜热或熔化潜热：术语“熔化潜热”和“潜热”以其最广泛的含义使用，指示如下任何物质或现象，其中，当在熔化过程中热量以基本均匀的速率施加于所述物质时，达到物质温度暂时停止上升的点，同时吸收热量以改变物质的分子结构和内能。在冷冻过程中，从液态到固态的相变过程中潜热的释放增加周围环境的温度，导致玻璃化停止。在一些实施方案中，熔化潜热可导致冰融化。在一些实施方案中，冰的融化引起糖、盐和冷冻保护剂(例如DMSO或甘油)的浓度增加，因此也引起未冷冻部分的渗透压迅速增加。在一些实施方案中，渗透强度的增加导致水从细胞中流出。在一些实施方案中，随着冷却继续，这些过程继续进行，直到未冷冻部分的粘度变得太高而不能进一步结晶。
最大限度地减少熔化潜热的影响：术语“最大限度地减少熔化潜热的影响(minimize effects of latent heat of fusion)”或“最大限度地减少熔化潜热的影响(minimize impact of latent heat of fusion)”是指涉及在生物样品中形成冰晶或在胞外诱导冰成核的过程。在一些实施方案中，通过连续平稳的温度下降、通过控制冷却来最大限度地减少熔化潜热的影响，以使得能够在细胞内水通过渗透移出的同时逐渐在胞外结冰。在一些实施方案中，冰成核支持胞外冰逐渐生长并限制过冷。在一些实施方案中，胞外冰的增加导致细胞中的水脱水。在一些实施方案中，形成的冰晶的量取决于溶液的初始组成。在一些实施方案中，冷冻保护剂通过降低冰点来延迟细胞内冷冻。在一些实施方案中，冷冻保护剂可穿透细胞，以延迟细胞内冷冻。
冰成核：术语“冰成核”是指在从溶液形成冰晶中发生的过程，并且在热力学上有利于从溶液中存在的水形成更多的冰晶。成核是一个随机过程，在系统表面的特定位置发生。可通过冷却温度或将水浓缩到液体或溶液的热力学稳定性明显低于晶体的条件来诱导成核。成核可通过在有利的温度下引入预先存在的冰晶来进一步诱导。在一些实施方案中，可通过使用铜线将冰晶引入容器中来诱导冰成核。在一些实施方案中，可通过降低温度来诱导冰成核。
定轨振荡器水浴：如本文所用的术语“定轨振荡器水浴”是指一种水浴设备，它以设定速度可靠地产生轨道或循环运动，持续预定的时间，它包括用于支撑有待搅动的物品的可移动托盘，所述物品例如烧杯、烧瓶、试管等中的临床分析物。
哺乳动物：如本文所用的术语“哺乳动物”是指哺乳纲的任何成员，包括但不限于人和非人灵长类动物，例如黑猩猩，以及其它猿类和猴类；农场动物，例如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语不表示特定年龄或性别。因此，成人和新生儿受试者以及胎儿，无论男性还是女性，皆意图包括在该术语的范围内。
储存温度：如本文所用，术语“储存温度”是指储存细胞的温度。在一些实施方案中，细胞储存于液氮气相中。在一些实施方案中，细胞储存于低于-60℃的温度下。在另一实施方案中，细胞储存于-60℃到-140℃范围内的温度下。在另一实施方案中，细胞储存于-60℃到-196℃范围内的温度下。在一些实施方案中，细胞储存于-140℃或更低的温度下。在一些实施方案中，细胞储存于低于-196℃的温度下。
运送温度：如本文所用，术语“运送温度”是指例如从可制造和/或冷冻保存细胞的第一位置运送或运输细胞到可解冻细胞和随后施用到有需要的受试者的第二位置的温度。在一些实施方案中，细胞在液氮气相中运送。在一些实施方案中，细胞在-140℃或低于-140℃的温度下运送。在一些实施方案中，细胞在-140℃或低于-140℃的温度下储存和/或运送。
玻璃化：术语玻璃化定义为快速冷冻样品，优选生物样品的过程。在一些实施方案中，玻璃化阻止冰的形成。在一些实施方案中，玻璃化过程需要冷冻保护剂的存在。在一些实施方案中，玻璃化过程需要快速冷却温度的手段。
本文中通过终点叙述数值范围包括该范围内的所有数目和分数(例如1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4和5)。还应了解，假设所有数目和其分数被术语“约”修饰。
在以下章节中详细描述了本发明的各个方面。章节的使用并不意味着限制本发明。每个章节可应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外说明，否则使用“或”意味着“和/或”。如本文所述，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括单数与多个提及物。
具体实施方式
冷冻保护过程对细胞的生存可能是致命的。当细胞周围的介质以缓慢速率冷却以保存细胞(例如免疫细胞)时，在介质冰点，很少发生细胞冷冻。样品可能过冷到低至-21℃的温度。当一些生物样品在结冰后留在同一容器中继续冷却时，过度冷却程度对其生存产生有害影响。
不希望受理论束缚，这种有害影响(低生存率)的原因相信如下。在结冰时，熔化潜热使样品温度升高到接近介质熔点的温度。同时，浴槽(或其它环境)的温度继续以恒定速率下降；因此，过冷程度愈大，结冰后冷却容器与样品之间存在的温差愈大。这又将增加样品的冷却速率，使其高于样品生存的正常最佳速率(特别是在免疫细胞的情况下)，直到与环境重新建立热平衡。
冷冻保存期间细胞面临的挑战并不是其忍受在极低温度(低于-120℃)下储存的能力；而是冷却-冷冻和升温-解冻过程的杀伤力。当细胞冷却到大约-5℃时，细胞和周围介质皆保持未冷冻和过冷。在-5℃与大约-15℃之间，在外部介质中结冰(自发地，或作为将冰晶、即晶种人工引入溶液中的结果)；然而，细胞的内容物仍保持未冷冻和过冷，这可能是因为质膜阻止冰晶生长到细胞质中。根据定义，细胞中的过冷水的化学势比部分冷冻的胞外溶液中的水大；因此，水渗透流出细胞并在外部冷冻。
细胞中的后续物理事件取决于冷却速率。如果细胞冷却得过快，则细胞内的水无法足够快地从细胞中移出到胞外空间来维持平衡；细胞变得愈加过冷，导致细胞内结冰(IIF)，从而杀死细胞。但是，如果细胞冷却得太慢，则其在达到共晶温度(当溶液中的所有组分皆固化时)前将经历严重脱水，使得体积收缩并且长时间暴露于高浓度溶质(主要由电解质构成)。细胞收缩和长时间暴露于高浓度电解质皆可导致细胞损伤(所谓“渗透性损伤”)。结果，细胞脱水并在细胞内不冷冻。因此，冷却速率过高或过低皆可能损坏细胞，尽管细胞损伤的机制有所不同。
只有当冷却控制在最佳速率，使得细胞能够足够快地失水以充分浓缩细胞内溶质从而消除过冷，同时防止细胞严重脱水时，细胞功能性方能得以保存。细胞功能性保存的最佳冷却速率应足够慢以避免IIF，但也足够快以最大限度地减少严重细胞脱水。
此外，如果一个细胞在冷却-冷冻到低温过程中生存，则由于在升温-解冻过程中的致命冰再结晶(LIR)，即细胞内的小冰晶生长成有害的大冰晶，细胞在升温-解冻过程中仍面临着巨大挑战。绝对需要最佳快速升温速率或程序与冷却速率/程序相结合来防止LIR，使细胞冷冻生存。
在研究实验室中很容易实现小样品(<5mL)的控制冷却速率和快速升温速率。然而，大规模治疗性细胞的现代工业制造正面临着一个很大的现有问题，即，在大体积样品(>25mL)的冷冻保存中如何实现和控制细胞最佳冷却和快速升温速率，这正成为大规模生产的治疗性细胞产品的冷冻保存和商业化和其运送以及临床实践的关键技术瓶颈。
本文公开的该方法包括(1)最佳冷却(利用特定冰成核接种程序以防过冷)与快速升温速率条件和程序相结合，用于冷冻保存哺乳动物细胞，包括免疫细胞(例如，天然免疫细胞和开发的CAR-T和CAR-NK细胞)；(2)使用液氮控制的冷冻机为大瓶样品(例如，在10mL或更大容器中的大体积细胞悬浮液)实现上述最佳冷却速率的方法和程序；和(3)对于在小瓶中填充体积是8至45mL并且细胞浓度为6-120×106个细胞/毫升范围内的细胞悬浮液，使用温度高于50℃的定轨振荡器水浴为大瓶样品(例如在50mL AT密闭小瓶中的大体积细胞悬浮液)实现上述最佳快速升温速率的方法和程序。在一些实施方案中，细胞浓度介于约6-25×106个细胞/毫升之间。
冷冻保存方法
通常，已知当液态水冷却时，它在临界温度下经历从液态到固态的相变。相变是一级转变，这意味着水在单位体积中吸收或释放一定量的能量，称为潜热。在相变期间，当添加或去除热时，水的温度将保持恒定，并且在此期间，水处于混合状态，其中一些水处于液态，一些水处于固态。发生相变的温度可称为相变临界温度。当水冷却时，水的温度降低，直到达到临界温度。在仍然进行冷却的同时，水的温度保持恒定，直到从水中去除潜热，之后水的温度(现在为固态)再次降低。这意味着在一段时间内从水中去除潜热。在冷冻过程中去除潜热的时间的可能形成冰晶的时间，这是在冷冻保存含有例如细胞的生物材料的样品时所不希望的。
本文所述的冷冻保存介质与本文所述的冷冻保存方法一起使用，最大程度地减少冷冻保存期间潜热的影响(即，成冰影响)，从而使已冷冻的细胞样品具有更高的活力。
对哺乳动物免疫细胞的细胞悬浮液进行本文所述的冷冻保存方法。在一些实施方案中，逐步低温冷冻顺序可扩展到多达30个小瓶或更多，每个小瓶具有10-40mL或更多的细胞样品体积。在一些实施方案中，冷冻序列可扩展到30个小瓶、50个小瓶或75个小瓶。在一些实施方案中，对冷冻瓶、冷冻袋、小瓶或NuncTM小瓶或玻璃小瓶中的哺乳动物免疫细胞悬浮液进行当前冷冻保存方法。在一些实施方案中，对冷冻瓶或/>小瓶或任何其它合适的容器中的哺乳动物免疫细胞悬浮液进行当前冷冻保存方法。在一些实施方案中，合适的容器是对DMSO不起反应的容器。在一些实施方案中，冷冻瓶、冷冻袋、/>小瓶或NuncTM小瓶、玻璃小瓶和其它用于冷冻保存的容器与同DMSO一起使用相容。在一些实施方案中，冷冻瓶、冷冻袋、/>小瓶或NuncTM小瓶、玻璃小瓶和其它用于冷冻保存的容器不含DEHP以及对DMSO有抗性。
各种容器可用于冷冻保存方法，包括例如冷冻瓶或冷冻袋。示例性冷冻瓶包括例如小瓶或NuncTM小瓶或玻璃小瓶。在一些实施方案中，对冷冻瓶或/>小瓶或任何其它合适的容器中的哺乳动物免疫细胞悬浮液进行当前冷冻保存方法。在一些实施方案中，合适的容器是对DMSO有抗性的容器。在一些实施方案中，冷冻瓶、冷冻袋、/>小瓶或NuncTM小瓶、玻璃小瓶和其它用于冷冻保存的容器与同DMSO一起使用相容。在一些实施方案中，冷冻瓶、冷冻袋、/>小瓶或NuncTM小瓶、玻璃小瓶和其它用于冷冻保存的容器不与DMSO进行化学反应。在一些实施方案中，用于冷冻保存的容器无DEHP并且对DMSO有抗性(例如，/>小瓶)。在各种实施方案中，本文所用的容器(例如，/>小瓶)促进细胞经由药瓶适配器直接无菌转移到有需要的受试者中。
本文所用的容器可具有各种尺寸，包括本文讨论的那些尺寸。在一些实施方案中，适用于如本文讨论的冷冻瓶的尺寸也适用于其它容器，例如小瓶或NuncTM小瓶。
在一些实施方案中，本文所述的冷冻/解冻方法允许以例如体积是10mL或更多的大规模一致地冷冻和解冻含有细胞的样品。在一些实施方案中，本文所述的冷冻/解冻方法可用于体积是10mL或更多的样品。在一些实施方案中，本文所述的冷冻/解冻方法可用于直径大于225mm/英寸的样品。在一些实施方案中，本文所述的冷冻/解冻方法可用于溶液高度大于225mm/英寸的样品。在一些实施方案中，本文所述的冷冻/解冻方法可用于溶液厚度大于225mm/英寸的样品。
在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸介于约5mm外径与100mm高度之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是约10mm外径和75mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是10mm外径和50mm高度。
在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是10mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是10.5mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是11.0mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸介于11.5mm外径与48.3mm高度之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是12.0mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是12.5mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是13.0mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是13.5mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是14.0mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的外部为14.5mm外径和48.3mm高度。在一些实施方案中，冷冻瓶的尺寸是15.0mm外径和48.3mm高度。
在一些实施方案中，冷冻瓶的高度介于约30mm到约85mm之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径介于约15mm到约40mm之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的最大体积容量介于约1mL与55mL之间。各种冷冻瓶适用于本文所述的组合物和方法。示例性冷冻瓶，包括冷冻瓶尺寸的描述可在http://www.aseptictech.com/sites/defa ult/files/brochure_vialslines_v3.0.pdf找到，其内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，冷冻瓶的高度介于约45mm与100mm之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是45.3mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是45.6mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是46mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是46.3mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是46.6mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是47mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是47.3mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是47.6mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是48mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是48.3mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是48.6mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是49mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是49.3mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是50mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是50mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是50mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是55mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是60mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是55mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是65mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是55mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是70mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是75mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是80mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是85mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是90mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是95mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是100mm。
在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是10mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是10.5mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是11mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是11.5mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是12mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是12.5mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是13mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是13.5mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是14mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是14.5mm。在一些实施方案中，冷冻瓶的外径是15mm。
在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是11cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是11.3cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是11.5cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是11.7cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是11.9cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是12.1cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是12.3cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是12.5cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是12.7cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是12.9cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是13.1cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是13.3cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是13.5cm。在一些实施方案中，冷冻袋的宽度是13.7cm。
在一些实施方案中，冷冻袋的长度是14.1cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是14.3cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是14.5cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是14.7cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是14.9cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是15.1cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是15.3cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是15.5cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是15.7cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是15.9cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是16.1cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是16.3cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是16.5cm。在一些实施方案中，冷冻袋的长度是16.7cm。
在一些实施方案中，冷冻瓶的体积(即，最大容量)可介于2ml至50ml之间，例如2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、21ml、22ml、23ml、24ml、25ml、26ml、27ml、28ml、29ml、30ml、31ml、32ml、33ml、34ml、35ml、36ml、37ml、38ml、39ml、40ml、41ml、42ml、43ml、44ml、45ml、46ml、47ml、48ml、49ml、50ml、51ml、52ml、53ml、54ml、55ml、56ml、57ml、58ml、59ml、60ml、61ml、62ml、63ml、64ml、65ml、66ml、67ml、68ml、69ml、70ml、71ml、72ml、73ml、74ml、75ml、76ml、77ml、78ml、79ml、80ml、81ml、82ml、83ml、84ml、85ml、86ml、87ml、88ml、89ml、90ml、91ml、92ml、93ml、94ml、95ml、96ml、97ml、98ml、99ml或100ml。
如本文所用，“填充体积”是指容器中包含细胞的样品的体积。在一些实施方案中，填充体积小于容器的最大容量。在一些实施方案中，小瓶中的填充体积可介于小瓶的最大容量的15％到90％之间。举例来说，小瓶中的填充体积可以是最大容量的15％、最大容量的20％、最大容量的25％、最大容量的30％、最大容量的35％、最大容量的40％、最大容量的45％、最大容量的50％、最大容量的55％、最大容量的60％、最大容量的65％、最大容量的70％、最大容量的75％、最大容量的80％、最大容量的85％或最大容量的90％。在一些实施方案中，2ml冷冻瓶的填充体积是1ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是8ml至45ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是8ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是10ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是12ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是14ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是16ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是18ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是20ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是22ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是24ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是26ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是28ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是30ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是32ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是34ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是36ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是38ml。在一些实施方案中，50ml AT小瓶的填充体积是40ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是42ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是44ml。在一些实施方案中，50ml冷冻瓶的填充体积是45ml。在一些实施方案中，冷冻容器可具有约50mL、约75mL、约100mL、约250mL、约500mL、约750mL、约1L或超过约1L的体积。
在一些实施方案中，哺乳动物免疫细胞可以约6M/ml到约120M/ml之间的浓度冷冻保存。举例来说，在一些实施方案中，免疫细胞可以6M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以10M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以15M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以20M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以25M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以30M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以35M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以40M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以45M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以50M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以55M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以60M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以65M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以70M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以75M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以80M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以85M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以90M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以100M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以105M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以110M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以115M/ml的浓度冷冻保存。在一些实施方案中，免疫细胞可以120M/ml的浓度冷冻保存。
在一些实施方案中，CAR NK细胞以约36mL的体积中约1×106到1×107细胞之间的剂量提供于50mL冷冻瓶中。在一些实施方案中，CAR NK细胞以约200×106与800×106个细胞之间的剂量提供于50mL冷冻瓶中。在一些实施方案中，使CAR NK细胞悬浮于如本文所述的冷冻保存介质中，然后如本文所述冷冻保存。这类冷冻保存的NK细胞然后可如本文所述储存。然后如本文所述解冻包含NK冷冻保存的NK细胞的样品。随后向有需要的患者施用解冻的细胞。在一些实施方案中，使用用于无菌施用的药瓶适配器向有需要的患者施用约33mL、34mL、35mL或36mL的体积的解冻的细胞。在一些实施方案中，使用用于无菌施用的药瓶适配器向有需要的患者施用约33mL的体积的解冻的细胞。在一些实施方案中，使用用于无菌施用的药瓶适配器向有需要的患者施用约34mL的体积的解冻的细胞。在一些实施方案中，使用用于无菌施用的药瓶适配器向有需要的患者施用约35mL的体积的解冻的细胞。在一些实施方案中，使用用于无菌施用的药瓶适配器向有需要的患者施用约36mL的体积的解冻的细胞。
在一些方面，适于冷冻保存细胞的介质(即，冷冻保存介质)包含：冷冻保护剂、白蛋白、二糖、和无热原且等渗的晶体溶液。在各种实施方案中，细胞一旦在所述介质中冷冻保存，则可解冻并随后施用到患者，无需在另一种介质或溶液中重新配制或重悬细胞。
在数个实施方案中，哺乳动物免疫细胞在含有一种或多种冷冻保护剂的介质中冷冻保存。在本领域中已知各种冷冻保护剂并包括例如二甲亚砜(DMSO)、甘油和丙二醇等。在一些实施方案中，冷冻保存介质包含DMSO作为冷冻保护剂。
在一些实施方案中，哺乳动物免疫细胞的冷冻保存涉及多达9步的低温冷冻顺序。在一些实施方案中，逐步冷冻减少冷冻的生物样品的熔化潜热。在一些实施方案中，细胞在具有选定温度降低速率的温度缓降阶段中冷却。在一些实施方案中，温度缓降阶段的温度降低速率是约10℃/分钟。在数个实施方案中，使用其它变化速率，例如约1℃/分钟、约2℃/分钟、约5℃/分钟、约7℃/分钟、约12℃/分钟、约15℃/分钟、约17℃/分钟、约20℃/分钟、约25℃/分钟或上述值内的速率。在数个实施方案中，温度缓降阶段可包括急速冷冻(例如，最大温度降低)步骤。例如，急速冷冻步骤可包括具有增加的温度降低速率的温度变化的急速冷冻速率，其中选择所述速率以有利地提高细胞完整性或细胞活力。相反，在数个实施方案中并与传统观念相反，不采用急速冷冻步骤。申请者已发现，在某些实施方案中，最大温度降低速率与某些较慢降低速率具有类似的破坏性，而某些中间速率提供出乎意料地改善的冷冻保存质量和/或细胞活力。在一些实施方案中，温度缓降阶段可包括以大约10℃/10秒、10℃/20秒、10℃/30秒、10℃/40秒、10℃/50秒、10℃/60秒、10℃/70秒、10℃/80秒、10℃/90秒、10℃/100秒、10℃/110秒、10℃/120秒、10℃/130秒、10℃/140秒、10℃/150秒、10℃/160秒、10℃/170秒、10℃/180秒、10℃/190秒或10℃/200秒的速率冷却粘附底物的细胞。在一些实施方案中，温度在预定温度下维持预定时间量。温度缓降阶段的冷却速率被配置用于提高细胞活力。例如，温度缓降阶段的某些冷却速率提高冷冻保存后的细胞功能性。在一些实施方案中，温度缓降阶段中的冷却速率被配置用于提高细胞完整性或稳定性。在一些实施方案中，冷冻保存的细胞在冷冻保存后基本上维持治疗作用。举例来说，这些细胞适合在冷冻保存的细胞解冻后直接植入患者的目标部位，其产生的治疗功效大致相当于(或优于)未冷冻保存的细胞。
在一些实施方案中，冷冻保存方法包括一个或多个持续约1分钟到约10分钟的保持步骤。在一些实施方案中，保持步骤持续约1分钟。在一些实施方案中，保持步骤持续约3分钟。在一些实施方案中，保持步骤持续约5分钟。在一些实施方案中，保持步骤持续约10分钟。保持步骤可在各种温度下进行。举例来说，在一些实施方案中，保持步骤在约-2.0℃的温度下进行。在一些实施方案中，保持步骤在约-25℃的温度下。在一些实施方案中，保持步骤在约-40℃的温度下。在一些实施方案中，保持步骤在约-60℃的温度下。在一些实施方案中，本文公开的冷冻保存方法包括一个、两个、三个、四个、五个或更多个保持步骤。在一些实施方案中，所述方法包括一个保持步骤。在一些实施方案中，所述方法包括两个保持步骤。在一些实施方案中，所述方法包括三个保持步骤。在一些实施方案中，所述方法包括四个保持步骤。在一些实施方案中，所述方法包括五个保持步骤。在一些实施方案中，所述方法包括超过五个保持步骤。
在一些实施方案中，冷冻保护工艺的总时间少于120分钟。在一些实施方案中，冷冻保护工艺的总时间少于100分钟。在一些实施方案中，冷冻保护工艺的总时间少于90分钟。在一些实施方案中，冷冻保护工艺的总时间是约60分钟。
在一些实施方案中，最终温度是约-80℃。在一些实施方案中，最终温度低于-80℃。在一些实施方案中，最终温度是-90℃。在一些实施方案中，最终温度是-96℃。在一些实施方案中，最终温度是-120℃。在一些实施方案中，最终温度是-196℃。
在一些实施方案中，如本文公开的冷冻方法涵盖使温度变化可控的一系列步骤。在一些实施方案中，所述方法可包括一系列包括降低温度的步骤。在一些实施方案中，所述方法可包括一系列包括增加温度的步骤。
在一些实施方案中，一种改变含有细胞的样品的温度的方法，使温度从第一温度变成低于或等于-80℃的最终温度，从而将样品冷冻保存在最终温度下，所述方法包括以下步骤：(a)将样品放置于高于样品的冷冻温度的第一温度下；(b)将第一温度以第一控制速率降低到第二温度，其中第二温度比第一温度低至少2℃；(c)将第二温度以第二控制速率降低到第三温度，其中第三温度比第二温度低至少40℃；(d)将第三温度以第三控制速率升高到第四温度，其中第四温度比第三温度高至少20℃；(e)将第四温度以第四控制速率降低到第五温度，其中第五温度比第四温度低至少10℃；以及(f)将第五温度以第五控制速率降低到最终温度，其中最终温度低于或等于-80℃。
在一些实施方案中，第一温度是约4℃到0℃。
在一些实施方案中，第一控制速率介于约0.75℃与1.25℃/分钟之间。
在一些实施方案中，第二温度是约-2℃。
在一些实施方案中，第二控制速率介于约20℃与30℃/分钟之间。
在一些实施方案中，第三温度是约-60℃。
在一些实施方案中，第三控制速率介于约5℃与15℃/分钟之间。
在一些实施方案中，第四温度是约-25℃。
在一些实施方案中，第四控制速率介于0.5℃与1.25℃/分钟之间。
在一些实施方案中，第五温度是约-40℃。
在一些实施方案中，第五控制速率介于7℃与15℃/分钟之间。
在一些实施方案中，最终温度低于或等于-80℃。
在一些方面，提供了一种方法，所述方法包括冷冻保存适于细胞疗法的工程化的免疫细胞，所述方法包括以最大限度地减少熔化潜热的控制速率逐步冷冻工程化的免疫细胞群，其中逐步冷冻包括将细胞以0.5℃/分钟到30℃/分钟之间的速率冷却到-80℃或更低的最终温度，从而冷冻保存细胞。
在一些方面，一种解冻冷冻保存的工程化的免疫细胞的方法包括将包含冷冻保存的工程化的免疫细胞的容器加热到37℃与70℃之间的温度；以及将细胞以约100RPM与约250RPM之间的速度搅动合适的时间段，直到细胞解冻。
在一些方面，提供了一种方法，所述方法包括使用本文所述的冷冻保存介质冷冻保存适于细胞疗法的工程化的免疫细胞，所述方法包括以最大限度地减少熔化潜热的控制速率逐步冷冻工程化的免疫细胞群，其中逐步冷冻包括将细胞以0.5℃/分钟到30℃/分钟之间的速率冷却到-80或更低的最终温度，从而冷冻保存细胞。
在一些方面，提供了一种解冻冷冻保存的工程化的免疫细胞的方法，所述方法包括将包含冷冻保存的工程化的免疫细胞的容器加热到37℃与70℃之间的温度；以及将细胞以约100RPM与约250RPM之间的速度搅动合适的时间段，直到细胞解冻。
在一些实施方案中，将细胞以约100RPM到约250RPM之间的速度搅动。在一些实施方案中，将细胞以约100RPM到约150RPM之间的速度搅动。在一些实施方案中，将细胞以约100RPM到约125RPM之间的速度搅动。在一些实施方案中，将细胞以约100RPM的速度搅动。在一些实施方案中，将细胞以约125RPM的速度搅动。在一些实施方案中，将细胞以约150RPM的速度搅动。在一些实施方案中，将细胞以约200RPM的速度搅动。在一些实施方案中，将细胞以约250RPM的速度搅动。
在一些实施方案中，解冻总时间约介于5分钟与20分钟之间。因此，在一些实施方案中，解冻总时间是约5分钟。在一些实施方案中，解冻总时间是约10分钟。在一些实施方案中，解冻总时间是约15分钟。在一些实施方案中，解冻总时间是约20分钟。
在一特定实施方案中，冷冻保存的细胞是包含被工程化成表达CD-19CAR、IL-15和iCaspase9的脐带血来源的NK细胞的CAR-NK细胞，所述细胞使用本文所述的方法冷冻保存，然后在定轨振荡器水浴中在60℃和约125rpm下解冻约10分钟。一旦解冻，细胞即可施用到有需要的受试者。
在一些实施方案中，解冻的细胞稳定达约1到6小时之间。因此，在一些实施方案中，解冻的细胞稳定达约2到4小时之间。在一些实施方案中，解冻的细胞稳定达约1到2小时之间。在一些实施方案中，解冻的细胞稳定达约1小时。在一些实施方案中，解冻的细胞稳定达约2小时。在一些实施方案中，解冻的细胞稳定达约3小时。在一些实施方案中，解冻的细胞稳定达约4小时。在一些实施方案中，解冻的细胞稳定达约5小时。在一些实施方案中，解冻的细胞稳定超过5小时。
在一些实施方案中，可在解冻的细胞稳定的时期内向有需要的患者施用解冻的细胞。举例来说，在一些实施方案中，在解冻约30分钟到5小时内向有需要的患者施用解冻的细胞。在一些实施方案中，在解冻约30分钟到2小时内向有需要的患者施用解冻的细胞。在一些实施方案中，在解冻后立即向有需要的患者施用解冻的细胞。
在数个实施方案中，哺乳动物免疫细胞可冷冻约1-5小时、5-12小时、12-24小时、24-48小时、48小时到一周、一周到两周、两周到三周、三周到四周或更长时间，以及其重叠范围。在一些实施方案中，将细胞冷冻保存并储存超过一个月、超过一年、超过5年、超过10年或更长时间。
在一些实施方案中，免疫细胞可以是新鲜分离的。在一些实施方案中，免疫细胞至少曾冷冻和解冻。
在一些实施方案中，通过将含有冷冻保存的细胞的冷冻瓶转移到温度约为体温，例如约37℃或任何其它合适温度的水浴中，将冷冻保存的细胞解冻以供使用(例如，植入)。在其它实施方案中，使用具有逐步加热速率的“逐步”解冻工艺。举例来说，在一些实施方案中，冷冻瓶可放置在温度递增的顺序储存环境中，然后转移到接近体温的温度，例如温度是50℃或更高的水浴，或如本文所述的任何其它合适温度。
在数个实施方案中，细胞在患者床边解冻，这允许立即使用新鲜解冻的细胞。在数个实施方案中，在解冻后，可将免疫细胞转移到培养皿中并在适当条件下培养大约30分钟、1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、86小时、110小时、一周、两周或多于三周，然后运输到所需位置(例如，用于递送到患者的手术室)。或者，在数个实施方案中，将解冻的细胞接种的底物直接注射到患者中。
解冻方法
对哺乳动物免疫细胞的细胞悬浮液进行当前解冻冷冻保存的细胞的方法。在一些实施方案中，解冻工艺是快速的并且可扩展到多达5个小瓶。在一些实施方案中，解冻工艺是快速的并且可扩展到多达10小瓶、15小瓶、20小瓶、25小瓶、30小瓶或更低。如上所述，由于冰晶的形成，缓慢解冻往往对细胞造成物理损伤。当前解冻方法涵盖在定轨振荡器水浴或其类似物中解冻免疫细胞。在一些实施方案中，可通过干式解冻装置实现解冻，这种方式可将热量均匀地分布在整个冷冻保存的样品中以解冻样品。在一些实施方案中，解冻通过将水浴温度调到40℃来实现。在一些实施方案中，解冻通过将水浴温度调到45℃来实现。在一些实施方案中，解冻通过将水浴温度调到50℃来实现。在一些实施方案中，解冻通过将水浴温度调到55℃来实现。在一些实施方案中，解冻通过将水浴温度调到60℃来实现。在一些实施方案中，解冻通过将水浴温度调到65℃来实现。
在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到100rpm与250rpm之间来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到120rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到130rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到135rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到140rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到145rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的旋转速度调到超过150rpm来实现。
在一些实施方案中，搅动速度不会导致正在解冻的细胞发生剪切。
在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到37℃和旋转速度调到100rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到37℃和旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到37℃和旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到37℃和旋转速度调到175rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到37℃和旋转速度调到200rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到45℃和旋转速度调到100rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到45℃和旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到45℃和旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到45℃和旋转速度调到175rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到45℃和旋转速度调到200rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到50℃和旋转速度调到100rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到50℃和旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到50℃和旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到50℃和旋转速度调到175rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到50℃和旋转速度调到200rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到60℃和旋转速度调到100rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到60℃和旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到60℃和旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到60℃和旋转速度调到175rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将定轨振荡器水浴的温度调到60℃和旋转速度调到200rpm来实现。示例性定轨振荡器如图1A-1B所示。
在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到37℃和旋转速度调到100rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到37℃和旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到37℃和旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到37℃和旋转速度调到175rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到37℃和旋转速度调到200rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到45℃和旋转速度调到100rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到45℃和旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到45℃和旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到45℃和旋转速度调到175rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到45℃和旋转速度调到200rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到50℃和旋转速度调到100rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到50℃和旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到50℃和旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到50℃和旋转速度调到175rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到50℃和旋转速度调到200rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到60℃和旋转速度调到100rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到60℃和旋转速度调到125rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到60℃和旋转速度调到150rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到60℃和旋转速度调到175rpm来实现。在一些实施方案中，解冻通过将干式加热装置的温度调到60℃和旋转速度调到200rpm来实现。
在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约5分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约6分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约7分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约8分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约9分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约10分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约11分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约12分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约13分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约14分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在定轨振荡器水浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约15分钟来实现。
在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约5分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约6分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约7分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约8分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约9分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约10分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约11分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约12分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约13分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约14分钟来实现。在一些实施方案中，解冻通过在干式加热装置浴中孵育冷冻保存的细胞悬浮液约15分钟来实现。
以这种方式解冻细胞，例如CAR-NK细胞，允许解冻的细胞保持高活力(例如，大于70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％)和与CAR转导后未冷冻保存的细胞类似的功能性。
细胞冷冻-解冻功效的测量
在一些实施方案中，通过测量细胞活力，例如通过染色死细胞以区别于活细胞来测量冷冻-解冻功效。在一些实施方案中，冷冻-解冻功效通过测量代谢活性、ATP含量或细胞增殖来测量。任何合适的测量细胞活力的测定法均可用于评估细胞活力。在一些实施方案中，如果细胞活力大于50％，则冷冻-解冻是有效的。在一些实施方案中，如果细胞活力大于60％，则冷冻-解冻是有效的。在一些实施方案中，如果细胞活力大于70％，则冷冻-解冻是有效的。在一些实施方案中，如果细胞活力大于80％，则冷冻-解冻是有效的。在一些实施方案中，如果细胞活力大于90％，则冷冻-解冻是有效的。
在一些实施方案中，冷冻-解冻功效通过测量在给定效应物与靶(E:T)比率下的靶杀死百分比来测量。E:T比率是所取的T细胞(效应细胞)的给定量:靶细胞的量。在一些实施方案中，如果与新鲜分离的细胞样品的E:T比率相比，靶杀死百分比处于特定E:T比率下，则冷冻-解冻是有效的。
冷冻保存的使用方法
在一些实施方案中，冷冻保存程序与将治疗性细胞运输到使用目的地结合使用。在一些实施方案中，为了避免脱玻璃化，冷冻保存的细胞在液氮干燥运输机中运输，例如在-140℃到-196℃的温度范围内。因此，在一些实施方案中，冷冻保存的细胞在冷冻运输容器中运输。在一些实施方案中，玻璃化细胞在无菌容器和/或无菌环境中运输。在一些实施方案中，玻璃化细胞大规模运输到例如医院或细胞库的地点。在一些实施方案中，本文所述的冷冻保存技术与“运输条件”下96小时气相储存相容，不会在升温后不利地影响活力。在一些实施方案中，冷冻保存的细胞在患者床边解冻。
冷冻保存介质
本文提供了适用于冷冻保存细胞的各种冷冻保存介质。在一些实施方案中，本文提供的冷冻保存介质适用于冷冻保存免疫细胞。已知多种免疫细胞，包括例如NK细胞；T细胞，包括αβT细胞、γδT细胞和调节性T细胞；B细胞；HSC；和MSC。在一个实施方案中，免疫细胞是脐带血来源的NK细胞、iPS细胞来源的NK细胞和iPS细胞来源的T细胞。在一个实施方案中，细胞是NK细胞，尤其是表达CAR的同种异体NK细胞(即，CAR-NK细胞)。
在一些方面，适于冷冻保活细胞和随后解冻的冷冻保存介质包含：冷冻保护剂、白蛋白、和无热原且等渗的晶体溶液。在一些方面，适于冷冻保活细胞和随后解冻的冷冻保存介质包含：冷冻保护剂、二糖、白蛋白、和无热原且等渗的晶体溶液。
在本领域中已知各种冷冻保护剂并且包括例如二甲亚砜(DMSO)、甘油和丙二醇等。在一些实施方案中，冷冻保存介质包含DMSO作为冷冻保护剂。在一些实施方案中，人血清白蛋白(HSA)是冷冻保存介质中的白蛋白。
在一些实施方案中，合适的冷冻保存介质还包含糖类或糖。在另一方面中，合适的冷冻保存介质包含：HSA、钠、氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾、氯化镁、二甲亚砜(DMSO)和二糖。
在一些实施方案中，糖类包括单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方案中，糖类是二糖。在一些实施方案中，二糖是蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖或壳二糖。在一些实施方案中，二糖是海藻糖。
在一些实施方案中，合适的冷冻保存介质包括以下中的一者或多者：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、肌醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖醇、麦芽糖醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、右旋糖酐、肝糖、直链淀粉、支链淀粉、菊糖、海藻酸钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、棉子糖、水苏糖、黄原胶、葡萄糖胺和半乳糖胺。在一些实施方案中，合适的冷冻保存介质包括海藻糖、蔗糖、甘露醇和/或右旋糖酐。在一些实施方案中，合适的冷冻保存介质包括一种或多种选自海藻糖、蔗糖和/或甘露醇的糖。
各种浓度的糖类或糖可用于一种冷冻保存介质中。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0mM-500mM之间的海藻糖、蔗糖或甘露醇。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0mM-200mM之间的海藻糖、蔗糖或甘露醇。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0mM-100mM之间的海藻糖、蔗糖或甘露醇。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包括浓度介于约0-100mM之间的一种或多种选自海藻糖、蔗糖和/或甘露醇的糖。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0-100mM之间的甘露醇。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约10mM-100mM之间的海藻糖。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括30mM海藻糖。
因此，在一些实施方案中，海藻糖、蔗糖或甘露醇以约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM的最终浓度存在于冷冻保存介质中。
因此，在一些实施方案中，海藻糖、蔗糖或甘露醇以低于1mM、低于10mM、低于20mM、低于30mM、低于40mM、低于50mM、低于60mM、低于70mM、低于80mM、低于90mM、低于100mM、低于110mM、低于120mM、低于130mM、低于140mM、低于150mM、低于160mM、低于170mM、低于180mM、低于190mM或低于200mM的最终浓度存在于冷冻保存介质中。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包括右旋糖酐。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0-20w/v％之间的右旋糖酐。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0-6w/v％之间的右旋糖酐。因此，在一些实施方案中，右旋糖酐以约0.2w/v％、0.4w/v％、0.6w/v％、0.8w/v％、1.0w/v％、1.5w/v％、2.0w/v％、2.5w/v％、3.0w/v％、3.5w/v％、4.0w/v％、4.5w/v％、5.0w/v％、5.5w/v％、6.0w/v％、6.5w/v％、7.0w/v％、7.5w/v％、8.0w/v％、8.5w/v％、9.0w/v％、9.5w/v％、10.0w/v％、10.5w/v％、11.0w/v％、11.5w/v％、12.0w/v％、12.5w/v％、13.0w/v％、13.5w/v％、14.0w/v％、14.5w/v％、15.0w/v％、15.5w/v％、16.0w/v％、16.5w/v％、17.0w/v％、17.5w/v％、18.0w/v％、18.5w/v％、19.0w/v％、19.5w/v％或20.0w/v％的最终浓度存在于冷冻保存介质中。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包含无热原且等渗的晶体溶液。各种无热原且等渗的晶体溶液可用于本文所述的冷冻保存介质中。举例来说，可用于冷冻保存介质中的示例性等渗晶体溶液包括PLASMA-LYTE A、生理盐水、乳酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、乙酸盐和乳酸盐缓冲溶液和右旋糖水溶液。一般来说，无热原且等渗的晶体溶液包含以下中的一者或多者：氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾和氯化镁。因此，在一些实施方案中，冷冻保存介质包含以下中的一者或多者：氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾和氯化镁。在一些实施方案中，以下：氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾和氯化镁。市售的无热原且等渗的晶体溶液的一实例是PLASMA-LYTE A。在一些实施方案中，无热原且等渗的晶体溶液是PLASMA-LYTE A。在一些实施方案中，无热原且等渗的晶体溶液是0.9％生理盐水溶液。在一些实施方案中，无热原且等渗的晶体溶液是乳酸盐缓冲溶液。在一些实施方案中，无热原且等渗的晶体溶液是右旋糖水溶液。
PLASMA-LYTE A包括氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾和氯化镁。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约10％v/v-75％v/v之间的Plasma-LYTE A。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约25％v/v-50％v/v之间的PLASMA-LYTE A。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约40％v/v之间的PLASMA-LYTE A。因此，在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约10％v/v、15％v/v、20％v/v、25％v/v、30％v/v、35％v/v、40％v/v、45％v/v、50％v/v、55％v/v、60％v/v、65％v/v、70％v/v或75％v/v PLASMA-LYTE A。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0.1mg/mL到约1mg/mL之间的氯化钠。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0.4mg/mL到约0.6mg/mL之间的氯化钠。因此，在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL、0.7mg/mL、0.75mg/mL、0.8mg/mL、0.85mg/mL、0.9mg/mL、0.95mg/mL、1mg/mL氯化钠。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0.1mg/mL到约1mg/mL之间的葡萄糖酸钠。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0.3mg/mL到约0.6mg/mL之间的葡萄糖酸钠。因此，在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL、0.7mg/mL、0.75mg/mL、0.8mg/mL、0.85mg/mL、0.9mg/mL、0.95mg/mL、1mg/mL葡萄糖酸钠。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约25％v/v-75％v/v之间的CS10。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约40％v/v-60％v/v之间的CS10。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约50％v/vCS10。因此，在一些实施方案中，CS10以约25％v/v、30％v/v、35％v/v、40％v/v、45％v/v、50％v/v、55％v/v、60％v/v、65％v/v、70％v/v或75％v/v存在于冷冻保存介质中。在一些实施方案中，CS10包含二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包含人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0.5v/v％-25v/v％之间的HSA。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约5v/v％-20v/v％之间的HSA。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约10v/v％HSA。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约1.25％v/v至5％v/v HSA。在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约2.5％v/v HSA。
因此，在一些实施方案中，冷冻保存介质包括约0.5v/v％、1.0v/v％、1.5v/v％、2.0v/v％、2.5v/v％、3.0v/v％、3.5v/v％、4.0v/v％、4.5v/v％、5.0v/v％、6.0v/v％、6.5v/v％、7.0v/v％、7.5v/v％、8.0v/v％、8.5v/v％、9.0v/v％、10.0v/v％、10.5v/v％、11.0v/v％、11.5v/v％、12.0v/v％、12.5v/v％、13.0v/v％、13.5v/v％、14.0v/v％、14.5v/v％、15.0v/v％、15.5v/v％、16.0v/v％、16.5v/v％、17.0v/v％、17.5v/v％、18.0v/v％、18.5v/v％、19.0v/v％、19.5v/v％、20.0v/v％、20.5v/v％、21.0v/v％、21.5v/v％、22.0v/v％、22.5v/v％、23.0v/v％、23.5v/v％、24.0v/v％、24.5v/v％或25.0v/v％HSA。
在一些方面，冷冻保存介质包含HSA、Ca2+、Na+、K+、Mg2+、HEPES、一种或多种二糖、糖醇、右旋糖酐、代谢物和抗氧化剂中的一者或多者。在另一方面中，冷冻保存介质包含：浓度为约0-55mM的HSA、Na+、K+、Mg2+、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；浓度约0-100mM之间的一种或多种选自海藻糖、蔗糖和/或甘露醇的糖；约0-6％之间的右旋糖酐；腺苷和谷胱甘肽。在一些实施方案中，代谢物是腺苷。在一些实施方案中，抗氧化剂是谷胱甘肽。
因此，在一些实施方案中，HEPES以约0mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或55mM存在于冷冻保存介质中。
在一些实施方案中，冷冻保存介质包含人血清白蛋白(HSA)、PLASMA-LYTE A和CS10。
在一些方面，冷冻保存介质适于冷冻保存自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，NK细胞来自原代细胞分离物。在一些实施方案中，NK细胞是脐带血来源的NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞来自细胞系。在一些实施方案中，NK细胞是新鲜细胞。在一些实施方案中，NK细胞预先冷冻和解冻，例如NK细胞是预先冷冻和解冻的脐带血来源的NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，如例如CD19 CAR。在一些实施方案中，冷冻保存介质包含浓度介于6M/mL到120M/mL之间的NK细胞。
在一些实施方案中，CAR-NK细胞治疗产品使用本文所述的制剂冷冻保存。在一些实施方案中，CAR-NK细胞治疗产品是由经表达iCaspase9、CD-19CAR和IL-15的逆转录病毒载体转导的人脐带血来源的NK细胞构成的同种异体细胞治疗产品。
在一些实施方案中，CAR-NK细胞治疗产品包含抗CD19结合结构域，所述抗CD19结合结构域包括包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链可变区和/或SEQ ID NO:2中所列的重链可变区。在另一实施方案中，CD-19CAR可包括抗CD19结合结构域、CD28跨膜结构域(示例性CD28跨膜序列在SEQ ID NO:3中示出、CD3z信号传导结构域(示例性CD3z序列在SEQID NO:4中示出，还可包括自杀开关，例如iCaspase9和/或IL-15。
在一个实施方案中，CAR-NK细胞治疗产品包括编码抗CD19结合结构域的重链可变区的核酸分子和/或编码抗CD19结合结构域的轻链可变区的核酸分子。
因此，在一些实施方案中，冷冻保存介质包含浓度为约1M/mL、5M/mL、10M/mL、15M/mL、20M/mL、25M/mL、30M/mL、35M/mL、40M/mL、45M/mL、50M/mL、55M/mL、60M/mL、65M/mL、70M/mL、75M/mL、80M/mL、85M/mL、90M/mL、95M/mL、100M/mL、105M/mL、110M/mL、115M/mL、120M/mL、130M/mL、140M/mL、150M/mL、160M/mL、170M/mL、180M/mL、190M/mL、200M/mL的NK细胞。
在一些实施方案中，基因工程化的脐带血NK细胞以6M/mL到120M/mL之间的浓度存在。在一些实施方案中，基因工程化的脐带血NK细胞以6M/mL到200M/mL之间的浓度存在。在一些实施方案中，基因工程化的脐带血NK细胞以6M/mL到25M/mL之间的浓度存在。在一些实施方案中，基因工程化的脐带血NK细胞以在30-45ml范围内的介质体积中6M/mL到120M/mL之间的浓度存在。在一些实施方案中，基因工程化的脐带血NK细胞以在30-45ml范围内的介质体积中6M/mL到200M/mL之间的浓度存在。在一些实施方案中，基因工程化的脐带血NK细胞以在30-45ml范围内的介质体积中6M/mL到25M/mL之间的浓度存在。
在一些实施方案中，CAR-NK细胞在本文提供的冷冻保存介质中配制，浓度范围是在30-45mL范围内的介质体积中存在100×106个细胞到900×106个细胞。在一特定实施方案中，CAR-NK细胞以约36mL介质体积中约200×106个细胞的浓度存在。在另一实施方案中，CAR-NK细胞以约36mL介质体积中约800×106个细胞的浓度存在。在一些实施方案中，36mL介质中的细胞含于无菌容器(例如，AT小瓶)中。
在一些实施方案中，NK细胞包含CAR-NK细胞治疗产品，所述产品包含配制在本文所述的冷冻保存介质中的约100×106个细胞与900×106个细胞之间的细胞群。在一些实施方案中，NK细胞包含CAR-NK细胞治疗产品，所述产品包含配制在本文所述的冷冻保存介质中的在200×106个细胞到约800×106个细胞范围内的细胞群。在一些实施方案中，CAR-NK细胞治疗产品是由经表达iCaspase9、CD19CAR和IL-15的逆转录病毒载体转导的人脐带血来源的NK细胞构成的同种异体细胞治疗产品。在一特定实施方案中，CAR-NK细胞治疗产品是由经表达iCaspase9、CD19 CAR和IL-15的逆转录病毒载体转导的人脐带血来源的NK细胞构成的同种异体细胞治疗产品，其中经转导的细胞在36ml包含DMSO、海藻糖、HSA和PLASMA-LYTE A的冷冻保存的介质中以6M到120M个细胞/毫升的浓度配制。在另一实施方案中，CAR-NK细胞治疗产品是由经表达iCaspase9、CD19CAR和IL-15的逆转录病毒载体转导的人脐带血来源的NK细胞构成的同种异体细胞治疗产品，其中经转导的细胞在36ml包含DMSO、海藻糖、HSA和PLASMA-LYTE A的冷冻保存的介质中以800×106个细胞的浓度配制。在一些实施方案中，经转导的细胞在悬浮于冷冻保存介质中之后使用本文所述的方法冷冻。然后冷冻的细胞可在冷冻运送机(例如，在-140℃到-196℃范围内的温度下)中运送或运输到护理点位置并在使用本文所述的方法解冻细胞之后施用到有需要的受试者(例如，癌症患者)。
冷冻保存的细胞的用途
本文所述的方法和组合物，包括CAR-NK细胞组合物，适于过继细胞疗法。过继细胞疗法可用于治疗各种疾病，包括例如癌症。在某些实施方案中，本文所述的冷冻保存介质中所含的冷冻和随后解冻的CAR-NK细胞组合物可用于治疗癌症或肿瘤。在某些实施方案中，癌症包含乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头、颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸和肝的肿瘤。在一些实施方案中，癌症是血液癌。在一些实施方案中，血液癌是B细胞恶性肿瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)。
在一些实施方案中，本文所述的方法可用于过继细胞疗法。因此，在一些实施方案中，本文所述的细胞根据本文提供的描述进行冷冻保存和解冻。在一些实施方案中，细胞是如本文所述的NK。在一些实施方案中，NK细胞悬浮于如本文所述的冷冻保存介质中。
在一些实施方案中，悬浮于本文所述的冷冻保存介质中的CAR-NK细胞组合物用于治疗患有癌症的受试者。在一些实施方案中，向受试者施用包含本文所述的冷冻保存介质内的CAR-NK细胞的组合物。在一些实施方案中，CAR-NK细胞包含抗CD19 CAR基因和IL-15基因。在一些实施方案中，CAR-NK细胞包含抗CD19 CAR基因、IL-15基因和iCaspase9。在一些实施方案中，CAR-NK细胞在施用到有需要的受试者之前未进行洗涤。在一些实施方案中，CAR-NK细胞在施用到有需要的受试者之前洗去冷冻保存介质。
在一些实施方案中，过继细胞疗法与一种或多种额外癌症治疗，例如清除淋巴细胞的化学疗法组合使用。因此，在一些实施方案中，患有癌症的受试者在施用在本文所述的冷冻保存介质中配制的CAR-NK细胞治疗产品之前接受清除淋巴细胞的化学疗法。
在一些实施方案中，CAR-NK细胞治疗产品如本文所述进行冷冻保存，并随后在施用到有需要的患者之前解冻。例如，如本文所述的CAR-NK细胞治疗产品如本文所述进行冷冻保存、运输、解冻并施用到有需要的患者。因此，在一些实施方案中，将CAR-NK细胞治疗产品冷冻保存在如本文所述的制剂中并随后解冻，然后施用到患者以治疗B细胞恶性肿瘤。
在一些实施方案中，冷冻的CAR-NK细胞治疗产品如本文所述进行冷冻并运输到有需要的患者。例如，在一些实施方案中，运输细胞治疗产品的方法包括：(a)使CAR-NK细胞与如本文所述的冷冻保存介质接触；(b)将CAR-NK细胞冷却到-80℃的温度，从而冷冻保存哺乳动物细胞；以及(c)将冷冻保存的哺乳动物细胞运输到温度在约-20℃到约-190℃或更低之间的不同位置。在一些实施方案中，细胞储存在-190℃或低于约-190℃下，并且在特定实施方案中，在-140℃或低于-140℃下并运输。在一些实施方案中，运输的细胞可储存于冷冻运送机中，直到施用到患者。
在一特定实施方案中，用于过继细胞疗法的细胞在体积是36ml的冷冻保存介质中以200-800×106个细胞的浓度冷冻保存于小瓶(例如，50ml AT小瓶)中。在各种实施方案中，小瓶可在细胞冷冻后用标签进行标记并在冷冻运送机中运送到护理点位置。在一些实施方案中，小瓶可在冷冻细胞前进行标记。
在一些实施方案中，细胞治疗产品是还包含IL-15和iCaspase9的CD19 CAR NK细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品以约6×106与120×106个细胞/毫升之间的浓度冷冻保存于容器中。在一些实施方案中，细胞治疗产品以约6×106与120×106个细胞/毫升之间的浓度冷冻保存于50mL容器中。在一些实施方案中，细胞治疗产品以约3×106与150×106个细胞/毫升之间的浓度冷冻保存于50mL容器中。在一些实施方案中，细胞治疗产品以约1×106与250×106个细胞/毫升之间的浓度冷冻保存于50mL容器中。在一些实施方案中，细胞治疗产品以约1×106与350×106个细胞/毫升之间的浓度冷冻保存于50mL容器中。在一些实施方案中，细胞治疗产品以约1×106与500×106个细胞/毫升之间的浓度冷冻保存于50mL容器中。
在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约20×106与100×107个之间的细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约100×106与900×106个之间的细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约50×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约100×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约200×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约100×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约200×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约300×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约400×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约500×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约600×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约700×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约800×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约900×106个细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50mL容器中包含约100×107个细胞。
在一些实施方案中，细胞治疗产品以约20-45mL之间的填充体积包含于50mL容器中。在一些实施方案中，细胞治疗产品以约36mL的填充体积包含于50mL容器中。在一些实施方案中，细胞治疗产品是免疫细胞，例如NK细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，免疫细胞被工程化成包含一种或多种转基因，例如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，细胞是CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，细胞治疗产品包含CD19 CAR、IL-15转基因和iCaspas9。在一些实施方案中，细胞治疗产品在50ml容器中包含约100×106与900×106个之间的CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品的量是50ml容器中的100×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品的量是50ml容器中的200×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品的量是50ml容器中的300×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品的量是50ml容器中的400×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品的量是50ml容器中的500×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品的量是50ml容器中的600×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品的量是50ml容器中的700×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品是50ml容器中的800×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品是50ml容器中的900×106个CAR-NK+细胞。在一些实施方案中，存在的细胞治疗产品的量是50ml容器中的100×107个CAR-NK+细胞。
运输的细胞治疗产品可如本文所述解冻，然后施用到有需要的患者。在一些实施方案中，细胞治疗产品在患者床边解冻。在一些实施方案中，细胞治疗产品在施用到有需要的患者之前未进行洗涤。在一些实施方案中，在细胞解冻后约30分钟和2小时内向有需要的患者施用解冻的细胞。在一些实施方案中，向受试者以一定速率输注约2-3分钟之间。
在一些实施方案中，运输的细胞治疗产品保持冷冻以在不同位置进一步储存。在一些实施方案中，将解冻的细胞引入有需要的受试者中，不分离细胞和冷冻保存溶液。因此，在一些实施方案中，解冻的细胞在使用之前未进行洗涤。在引入受试者中之前，解冻的细胞和附随的冷冻保存溶液优选温热到体温(即，约37℃)。在这类情况下，细胞剂量是基于冷冻前细胞计数。
在一些实施方案中，进一步培养解冻的细胞。在一些实施方案中，培养包括将细胞放置于孵育箱中；去除缓冲溶液；并且用针对细胞生长和/或分化而设计的培养基置换缓冲溶液。在一些实施方案中，将细胞在孵育箱中孵育约6到7小时之间。在一些实施方案中，针对细胞生长和/或分化而设计的培养基包含久保田培养基(Kubota's medium)和/或用于细胞分化的激素界定的培养基(HDM)。
可使用本领域中已知的各种方法在体外以及体内评估解冻的细胞的活力。在一些实施方案中，体外细胞活力测试包括台盼蓝(Trypan Blue)排除测定法。在一些实施方案中，可使用其它分析方法来评估已用不同冷冻保存介质冷冻的解冻的细胞的细胞活力，例如基因表达、经由使用RT-qPCR等。本领域的一般技术人员可选择可用于评估另外新鲜细胞的细胞活力的任何分析方法来评估解冻的细胞的活力。
通常，可通过评估体内所施用细胞的功能特征来评估细胞在体内的活力。在一些实施方案中，细胞在体内的活力可通过评估已引入有需要的受试者中的细胞的细胞数目来评估。本领域中已知用于追踪细胞和确定所施用细胞的活力的各种方法。
使用本文所述的冷冻保存介质冷冻保存并解冻的细胞允许使用细胞来达成原代细胞或新鲜细胞分离物可达成的任何目的。冷冻保存并解冻的细胞保持高活力(例如，大于70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％)并保持其天然状态的生理特征，这允许细胞用于各种应用，例如细胞的基因操纵，和用于达成细胞治疗目的，例如用于过继细胞疗法应用中。
本文公开的序列：
抗CD19轻链可变片段，VL：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLELKR(SEQ ID NO:1)
抗CD19重链可变片段，VH：
EVQLQQSGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTTVTVSSYVTVSSQDPA(SEQ ID NO:2)
CD28：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:3)
CD3ζ：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGP(SEQ ID NO:4)
实施例
在以下实施例中将显而易见本发明的其它特征、目标和优势。然而，应了解，实施例虽然指示本发明的实施方案，但仅以说明的方式给出，而非限制。本领域的技术人员从实施例将显而易见在本发明的范围内的各种改变和修改。
这些实施例中使用的NK细胞包含抗CD19 CAR、IL-15和iCaspase9。然而，应注意，包含其它转基因的NK细胞也可以用于这些方法。
这些实施例中使用的CAR-NK细胞是经编码靶向肿瘤的CD19-CAR的基因转导的脐带血单位来源的NK细胞(iC9/CAR.19/IL15，Leukemia 32(2018)520-531，以引用的方式整体并入本文中)，例如经编码包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的抗CD19结合结构域轻链可变区和/或包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的抗CD19结合结构域重链可变区的核酸分子转导的NK-CAR细胞。
实施例1：50ml容器中哺乳动物细胞冷冻保存的扩大
本实施例显示使用120分钟冷冻顺序的哺乳动物细胞的冷冻概况。
首先，将45ml不含细胞的冷冻保存介质(对照)填充到50ml AT小瓶中，所述小瓶包含NaCl中的50％ RPMI、5％ DMSO、20％的25％人血清白蛋白、10％右旋糖酐。在CryoMed5474控制冷冻设备中，小瓶的温度降到4℃。通过测量溶液温度来测量由AT小瓶的内容物发出的热量。为了开始冷冻保存过程，温度以1℃/分钟的速率降低到-4℃。然后，将温度以20℃/分钟的速率快速降到-45℃。然后，将温度以10℃/分钟的速率快速升到-10℃。然后，将温度以0.5℃/分钟的速率快速降到-20℃。最后，通过以1℃/分钟的速率降低温度，将温度缓慢降到-80℃。
据观察，在所述冷冻顺序下，由溶液内容物释放的热量保持在-1℃下超过35分钟，这表明冰融化和缓慢结冰的可能性很高。此外，小瓶内容物的温度与周围温度不同，这也增加了不均匀结冰的概率。图2展示了使用上述冷冻顺序冷冻的冷冻保存介质的冷冻概况。
实施例2：50ml容器中哺乳动物细胞的最佳冷冻保存
本实施例显示将哺乳动物细胞冷冻保存在50ml容器(例如50ml AT小瓶)中的方法，以最大限度地减少熔化潜热的影响。
首先，将36ml CAR-NK细胞在包含40％ PLASMA-LYTE A+10％ HSA+50％ CS10的介质中以110×106个细胞/毫升的浓度配制，然后填充到50ml AT小瓶中。在控制速率冷冻装置中将小瓶温度降低到4℃。对于这些实验，使用CryoMed 5474控制速率冷冻装置。为了开始冷冻保存过程，温度以1℃/分钟的速率降低到-2℃。使小瓶的内部温度和内容物在-2℃下平衡3分钟。通过以25℃/分钟的速率将温度快速降低到-60℃来诱导冰成核过程。使小瓶内部和小瓶内容物在-60℃下平衡1分钟以吸收由于开始结冰而产生的熔化潜热，从而将细胞悬浮液的温度维持在冰点以下以避免冰再融化。为了避免加速胞外结冰，导致不希望的细胞内结冰，将温度以10℃/分钟的速率升高到-30℃，以使得温度连续平稳地下降，从而在细胞内水继续渗透移出的同时胞外逐渐结冰。温度保持在-30℃下，以使细胞均匀冷冻。最后，将温度以1℃/分钟的速率降到-40℃。将细胞内容物在-40℃下平衡5分钟以最大限度地进行胞外结冰。将温度以10℃/分钟的速率降到-80℃的最终温度，以进行任何残留的胞外结冰。将样品释放的热量以及腔室温度和系统温度绘制成时间的函数。图3展示了CAR-NK细胞的冷冻概况。
据观察，细胞内容物释放的热量在整个冷冻方案中几乎保持不变，这表明了熔化潜热显著降低。此外，解冻顺序所用的时间少于1小时。
实施例3：多个50ml容器中哺乳动物细胞的冷冻保存
本实施例显示一种将哺乳动物细胞(例如，适合细胞疗法的细胞)冷冻保存在五个50ml容器，例如50ml AT小瓶中的方法，所述容器布置在四个角落和中心，以最大限度地减少熔化潜热的影响。
首先，提供五个容器，所述容器包含在适当冷冻保存悬浮介质中的45ml iCAR-T细胞，其在50ml AT小瓶中含有浓度为80×106个细胞/毫升的细胞。在CryoMed 5474控制冷冻设备中，将小瓶温度降到4℃。为了开始冷冻保存过程，温度以1℃/分钟的速率降低到-2℃。使小瓶内部温度和内容物在-2℃下平衡3分钟。通过以25℃/分钟的速率将温度快速降低到-60℃来开始冰成核过程。使小瓶内部和小瓶内容物在-60℃下平衡1分钟以吸收由于开始结冰而产生的熔化潜热，从而将细胞悬浮液温度维持在冰点以下以避免冰再融化。为了避免加速胞外结冰，导致不希望的细胞内结冰，将温度以10℃/分钟的速率升高到-30℃，以使得温度连续平稳地下降，从而在细胞内水继续渗透移出的同时胞外逐渐结冰。温度保持在-30℃下，以使细胞均匀冷冻。最后，将温度以1℃/分钟的速率降到-40℃。将细胞内容物在-40℃下平衡5分钟以最大限度地进行胞外结冰。将温度以10℃/分钟的速率降到-80℃的最终温度，以进行任何残留的胞外结冰。将样品释放的热量以及腔室温度和系统温度绘制成时间的函数。图4展示了五个45ml CAR-NK细胞悬浮液的冷冻概况。
据观察，所有五个45ml细胞悬浮液的内容物释放的热量在整个冷冻方案中几乎保持不变，这表明胞外结冰所产生的熔化潜热的影响显著降低。此外，多个腔室的使用表明所述冷冻方案可针对大量哺乳动物细胞悬浮液进行扩大。
实施例4：解冻冷冻保存的哺乳动物细胞
本实施例显示一种解冻储存在液氮温度(-196℃)下的哺乳动物细胞以减少致命冰再结晶的方法。测量解冻的细胞的活力。
以80×106个细胞/毫升和120个细胞/毫升的细胞密度取以三种不同体积16、30和45mL iCART细胞于50ml AT小瓶中，最初使用一种降低熔化潜热的方法进行冷冻保存并冷冻于50mL中，填充到AT小瓶中，并且储存在-196℃下。通过将AT小瓶放置于设置为60℃和120rpm的转速下的定轨振荡器水浴(Benchmark SBL-12)中长达600秒，将储存在-196℃下的细胞解冻。测量细胞样品的温度。图5A和图5B显示在包含16、30和45ml细胞的50ml AT小瓶解冻期间细胞样品的温度随时间升高。
评估解冻的细胞的活力。图6显示如所述解冻的80×106个细胞/毫升和120×106个细胞/毫升的活力。观察到所有细胞均具有大于95％的活力，这表明该方法成功地防止致命性冰再结晶的诱发。
实施例5：冷冻和解冻CAR-NK细胞的体外功效
本实施例显示当哺乳动物细胞以最大限度地减少熔化潜热的方法冷冻时，与2mLAT小瓶或2ml冷冻瓶相比，在50mL AT小瓶中冷冻和解冻哺乳动物CAR-NK细胞的功效。
首先，以80×106和120×106个细胞/毫升的浓度取45mL、30mL和10mL CAR-NK细胞于50mL AT小瓶中。然后，将1mL CAR-NK细胞以80×106和120×106个细胞/毫升提供于2mLAT小瓶中，或以10×106个细胞/毫升的浓度提供于2mL冷冻瓶中作为对照。将所有细胞悬浮在冷冻保存悬浮介质中，所述介质包含40％ PLASMA-LYTE A、50％ CS10、10％人血清白蛋白。
将填充到50mL和2mL AT小瓶中的CAR-NK细胞按如下方式冷冻：将小瓶温度降低到4℃，并且在CryoMed 5474控制冷冻设备中进行。为了开始冷冻保存过程，温度以1℃/分钟的速率降低到-2℃。使小瓶内部温度和内容物在-2℃下平衡3分钟。通过以25℃/分钟的速率将温度快速降低到-60℃来开始冰成核过程。使小瓶内部和小瓶内容物在-60℃下平衡1分钟以吸收由于开始结冰而产生的熔化潜热，从而将细胞悬浮液温度维持在冰点以下以避免冰再融化。为了避免加速胞外结冰，导致不希望的细胞内结冰，将温度以10℃/分钟的速率升高到-30℃，以使得温度连续平稳地下降，从而在细胞内水继续渗透移出的同时胞外逐渐结冰。温度保持在-30℃下，以使细胞均匀冷冻。最后，将温度以1℃/分钟的速率降到-40℃。将细胞内容物在-40℃下平衡5分钟以最大限度地进行胞外结冰。将温度以10℃/分钟的速率降到-80℃的最终温度，以进行任何残留的胞外结冰。将2mL冷冻瓶中的CAR-NK细胞分为两组，一组使用基准程序冷冻，作为冷冻对照，并且一组在培养基中培养，作为新鲜对照。
解冻前将冷冻的细胞储存在液氮罐(≤-140℃)的气相中。通过将AT小瓶放置于设置为60℃和150rpm的转速下的定轨振荡器水浴(Benchmark SBL-12)中长达600秒，将50mL和2mL AT小瓶解冻。将细胞冷冻在2ml冷冻瓶中，在设置在37℃和150rpm的转速下的定轨振荡器水浴(Benchmark SBL-12)中在37℃下解冻长达600秒。
测量细胞活力。通过测量不同E:T比率下CAR-NK细胞的杀死百分比来测试细胞功能性。E:T 10:1的比率视为杀死功能比较的最佳比率。表1展示了CAR-NK细胞的活力和功能测定。据观察，如通过测量染色的死细胞和活细胞的数目所测量，超过93％细胞有活力。此外，观察到，使用本文所述的冷冻和解冻顺序的50mL小瓶中的细胞显示出在杀死功能方面与新鲜细胞和利用基准冷冻和解冻方法的细胞可比较的活力(图7A)。此外，使用本文所述的冷冻和解冻顺序的50mL小瓶中的CAR-NK细胞显示出与新鲜细胞可比较的免疫表型(表2)。图7A显示CAR-NK细胞的杀死百分比作为E:T比率的函数的关系。表2显示冷冻和解冻的CAR-NK细胞中免疫表型的保存情况。
表1：50ml容器对比2ml小瓶中冷冻和解冻的CAR-NK细胞的体外功能数据、杀死和活力
*请注意，冷冻/新鲜列的值是通过将从同一患者获得的冷冻对比新鲜NK细胞的杀死百分比归一化获得的
实施例6：冷冻和解冻CAR-NK细胞的体内功效
本实施例显示当哺乳动物细胞以最大限度地减少熔化潜热的方法冷冻时，与2mLAT小瓶或2ml通用冷冻瓶相比，在50mL AT小瓶中冷冻和解冻哺乳动物CAR-NK细胞的体内功效。AT冷冻瓶是专有冷冻瓶，具有专门容器封闭技术。
首先，将35ml CAR-NK细胞以80×106个细胞/毫升的浓度冷冻在50ml AT小瓶中。在CryoMed 5474控制冷冻设备中，小瓶的温度降到4℃。为了开始冷冻保存过程，温度以1℃/分钟的速率降低到-2℃。使小瓶内部温度和内容物在-2℃下平衡3分钟。通过以25℃/分钟的速率将温度快速降低到-60℃来开始冰成核过程。使小瓶内部和小瓶内容物在-60℃下平衡1分钟以吸收由于开始结冰而产生的熔化潜热，从而将细胞悬浮液温度维持在冰点以下以避免冰再融化。为了避免加速胞外结冰，导致不希望的细胞内结冰，将温度以10℃/分钟的速率升高到-30℃，以使得温度连续平稳地下降，从而在细胞内水继续渗透移出的同时胞外逐渐结冰。温度保持在-30℃下，以使细胞均匀冷冻。最后，将温度以1℃/分钟的速率降到-40℃。将细胞内容物在-40℃下平衡5分钟以最大限度地进行胞外结冰。将温度以10℃/分钟的速率降到-80℃的最终温度，以进行任何残留的胞外结冰。冷冻完成后，将冷冻小瓶储存在液氮罐的气相中。表3展示了冷冻保存介质的组分。
表3：冷冻保存介质的示例性组分
通过将AT小瓶放置于设置为60℃和150rpm的转速下的定轨振荡器水浴(Benchmark SBL-12)中长达600秒，将冷冻保存的细胞解冻。
对冷冻和解冻的CAR-NK进行体外活力、杀死和免疫表型测试。此外，将CAR-NK细胞注射到雌性NOD SCIDγ(NSG)小鼠中，所述小鼠载有表达荧光素酶的Raji人伯基特淋巴瘤(burkitt’s lymphoma)(Raji B.luc)异种移植物。12周龄的雌性NSG小鼠源自The JacksonLaboratory。通过评估在NOD/Shi-scid IL-2Rγ无效免疫缺陷小鼠(“NSG小鼠”)中的体内杀死功效来测量CAR-NK细胞中冷冻和解冻方案的体内功效。自然杀伤(NK)细胞激活是一个抗原依赖性过程，导致NK细胞增殖并持续形成效应细胞。PBS用作阴性对照物。
在雌性NOD SCIDγ(NSG)小鼠中测试CAR-NK细胞的体内功效，所述小鼠载有表达荧光素酶的Raji人伯基特淋巴瘤(Raji B.luc)异种移植物。治疗前一天(D-1)，将雌性NSG小鼠根据体重随机分组，每组5只小鼠，然后接受1.5戈瑞(Gray)(1.5Gy)的全身照射。第0天，向小鼠共同施用2×104个生物发光Raji B luc肿瘤细胞和经由尾静脉的静脉注射进行的治疗。在体内，向小鼠施用荧光素并在底物注射后九分钟捕获全身腹侧图像。在活小鼠中在处理后使用Spectrum CT成像系统(PerkinElmer)测量荧光素酶活性。在成像当天，小鼠接受荧光素底物(总共150mg/kg；IP)注射并放置于麻醉诱导室(氧气中的2.5-3.5％异氟醚)中。镇静后，在荧光素底物注射后九分钟，将小鼠放置于成像室中进行图像采集。
图8展示了在50mL AT小瓶和2mL AT小瓶中在两种冷冻保存介质(有或无30mM海藻糖的40％ PLASMA-LYTE A、10％ HSA、50％ CS10)中6×106和80×106个细胞的解冻后细胞在不同E:T比率下的体外杀死百分比图。观察到50mL AT小瓶中的冷冻细胞显示出可比较的杀死功能(图8)。表4总结了在10:1E:T比率下的杀死百分比以及使用本文所述的顺序冷冻和解冻的CAR-NK细胞的生存百分比和回收百分比。观察到50ml AT小瓶中的CAR-NK细胞显示出高活力(≥97.0％)并且与2ml AT小瓶中冷冻的CAR-NK细胞可比较。表5总结了在50ml小瓶中对比2ml小瓶中冷冻的CAR-NK细胞的表型的保存。据观察，与在2ml AT小瓶中冷冻的CAR-NK细胞相比，在50ml AT小瓶中冷冻的CAR-NK中的免疫表型保存程度相同。
图9进一步说明CAR-NK细胞在施用CAR-NK细胞后36天的体内功效。测试三种不同CAR-NK细胞(例如，从不同供体获得)的体内功效。这些研究中使用两种不同制剂：1)40％PLASMA-LYTE A、10％HSA、50％ CS10(T6)；和2)40％ PLASMA-LYTE A、10％ HSA、50％CS10、30mM海藻糖(T6T)。向阴性对照小鼠注射含有细胞的介质(媒介物)。观察到注射NK-CAR细胞的小鼠在第13/14天和第20/21天显示出较低强度的荧光素酶表达(图9G-图9I)。作为时间函数的荧光素酶荧光的总通量示于图9D-图9F中。图9A-9B展示作为处理后天数的函数的小鼠生存百分比。观察到注射新鲜CAR-NK细胞和根据本文所述的顺序冷冻和解冻的CAR-NK细胞的小鼠显示出可比较的生存率。
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实施例7：用CAR-NK细胞治疗有需要的受试者-以小瓶冷冻、运送、解冻、施用
本实施例描述了如本文所述的工程化的CAR-NK细胞的冷冻、解冻和示例性使用。本实施例中描述的示例性用途是将CAR NK细胞冷冻、解冻和施用到癌症患者，例如患有弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者。
将包含CD19、IL-15和iCaspase9的CAR-NK细胞悬浮于包含人血清白蛋白(HSA)、PLASMA-LYTE A、海藻糖和CS10的冷冻保存介质中。CAR-NK细胞在50mL冷冻瓶中以6M/mL到25M/mL的浓度冷冻，填充样品的填充体积是约36mL。对于有需要的患者，一个这样的冷冻瓶可含有2到4剂。使用以下冷冻程序冷冻CAR-NK细胞，所述程序包括：(a)将样品放置于高于样品的冷冻温度的第一温度下；(b)将第一温度以第一控制速率降低到第二温度，其中第二温度比第一温度低至少2℃；(c)将第二温度以第二控制速率降低到第三温度，其中第三温度比第二温度低至少40℃；(d)将第三温度以第三控制速率升高到第四温度，其中第四温度比第三温度高至少20℃；(e)将第四温度以第四控制速率降低到第五温度，其中第五温度比第四温度低至少10℃；以及(f)将第五温度以第五控制速率降低到最终温度，其中最终温度低于或等于-80℃。通常，整个冷冻工艺不到1小时。
一旦细胞冷冻，则将样品储存于-140℃或更低的温度下。这类温度可通过多种方式实现，例如将样品放置于液氮气相中。冷冻的细胞可保持储存于-140℃或更低的温度下，直到需要使用。细胞可保持储存1周、2周、1个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间。
一旦需要使用细胞，例如用于同种异体细胞疗法，则将细胞在冷冻运送机中从冷冻储存处运输到医院或患者等待移植细胞的其它地点。在运送过程中，细胞维持在-140℃或更低的温度，直到到达医院或其它地点(例如，护理点)。一旦到达所述地点，则可解冻细胞。细胞可如下解冻：将包含冷冻保存的工程化的免疫细胞的容器加热到37℃与70℃之间的温度；并且将细胞以约100RPM与约250RPM之间的速度搅动合适的时间段，直到细胞解冻。例如，可在60℃与65℃之间的温度下进行加热，同时以100RPM与125RPM之间的速度搅动细胞样品。可使用水浴或使用干式加热装置进行加热。通常，解冻细胞的整个时间是约10分钟。
可在患者床边或其它附近位置解冻50mL冷冻瓶，以便于接近将接收细胞的患者。一旦样品解冻，样品的总体积将在约34到36mL之间。使用用于无菌施用的药瓶适配器将多达约34mL的解冻样品施用到患者。一份解冻的样本可含有多剂。
等效物和范围
本领域的技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验即可确定本文所述的本发明特定实施方案的许多等效物。本发明的范围不意图限于以上描述，而是如以上权利要求书中所阐述。
Claims (45)
1.一种大规模冷冻保存免疫细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供包含样品的容器，所述样品包含悬浮于冷冻保存介质中的免疫细胞，其中样品体积比所述容器的全容量体积小至少5％，并且其中所述样品体积是至少10ml；
(b)在多步工艺中以最大限度地减少熔化潜热的控制速率将所述容器从高于所述样品的冷冻温度的温度冷却到约或低于-80℃的温度；
(c)将所述细胞储存于液氮气相中，从而冷冻保存所述免疫细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述最大限度地减少熔化潜热的控制速率包括将温度以0.75℃/分钟到30℃/分钟之间的速率降低到-80℃或更低的最终温度的两个或更多个步骤。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中实现所述免疫细胞的冷冻保存的总时间少于120分钟、少于110分钟、少于100分钟、少于90分钟、少于80分钟、少于70分钟或少于60分钟。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是新鲜分离的或至少曾冷冻和解冻。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞是天然存在或工程化的自然杀伤(NK)细胞、αβT细胞、γδT细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、iPSC来源的T或NK细胞、调节性T细胞(Treg)、造血干细胞(HSC)、间充质基质细胞(MSC)、树突状细胞、巨噬细胞或B细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞是经嵌合抗原受体(CAR)工程改造的脐带血来源的NK细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其中容器的所述全容量体积是约50ml。
8.如权利要求1所述的方法，其中容器的所述全容量体积是约50ml并且所述样品体积小于40ml。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述样品体积是约10ml、约15ml、约20ml、约25ml、约30ml、约31ml、约32ml、约33ml、约34ml、约35ml、约36ml、约37ml、约38ml、约39ml、约40ml、约41ml、约42ml、约43ml、约44ml或约45ml。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述容器是冷冻瓶或冷冻袋。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述容器是冷冻瓶。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述冷冻瓶的内部尺寸介于10mm与18mm之间。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述冷冻瓶的外部尺寸是约13.5mm。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述冷冻瓶的高度介于约40mm与50mm之间。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述冷冻瓶的高度是约48.3mm。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述容器对DMSO有抗性。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞以约6与120×106个细胞/毫升之间的浓度存在。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存介质包含冷冻保护剂、白蛋白、二糖、和无热原且等渗的晶体溶液。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存介质包含：人血清白蛋白(HSA)、氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾、氯化镁、二甲亚砜(DMSO)和海藻糖。
20.一种大规模解冻冷冻保存的免疫细胞的方法，所述方法包括：
(a)将水浴加热到在37℃和70℃范围内的温度；
(b)将包含根据权利要求1的冷冻保存的免疫细胞的容器转移到所述预热的水浴；以及
(c)将所述容器以约100RPM与约250RPM之间的速度搅动合适的时间段，从而获得解冻的免疫细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述合适的时间段介于5-15分钟之间。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述合适的时间段是约10分钟。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述搅动发生在定轨振荡器水浴中。
24.如权利要求23所述的方法，其中在所述定轨振荡器水浴中搅动所述细胞是在约120-150RPM的速度下。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述定轨振荡器水浴的温度是约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述定轨振荡器水浴的温度是约60℃。
27.如权利要求20所述的方法，其中所述容器具有约50mL的全容量体积和介于约8mL与45mL之间的样品体积。
28.如权利要求20所述的方法，其中所述免疫细胞是天然存在或工程化的自然杀伤(NK)细胞、αβT细胞、γδT细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)来源的NK或T细胞、调节性T细胞(Treg)、巨噬细胞、树突状细胞、造血干细胞(HSC)、间充质基质细胞(MSC)或B细胞。
29.如权利要求20所述的方法，其中所述冷冻保存的免疫细胞是被工程化成包含嵌合抗原受体(CAR)的NK细胞或T细胞。
30.如权利要求20所述的方法，其中所述解冻的免疫细胞具有90％、95％、97％或更高的解冻后活力。
31.如权利要求20所述的方法，其中所述解冻的免疫细胞保留与新鲜分离的免疫细胞类似的体外和/或体内功能。
32.如权利要求20所述的方法，所述方法还包括向有需要的受试者施用所述解冻的免疫细胞的步骤。
33.一种改变含有免疫细胞的样品的温度的方法，使温度从高于所述样品的冷冻温度的第一温度变成低于或等于-80℃的最终温度，从而将所述样品冷冻保存在所述最终温度下，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述样品放置于高于所述样品的冷冻温度的第一温度下；
(b)将所述第一温度以第一控制速率降低到第二温度，其中所述第二温度比所述第一温度低至少2℃；
(c)将所述第二温度以第二控制速率降低到第三温度，其中所述第三温度比所述第二温度低至少40℃；
(d)将所述第三温度以第三控制速率升高到第四温度，其中所述第四温度比所述第三温度高至少20℃；
(e)将所述第四温度以第四控制速率降低到第五温度，其中所述第五温度比所述第四温度低至少10℃；以及
(f)将所述第五温度以第五控制速率降低到所述最终温度，其中所述最终温度低于或等于-80℃。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述第一温度是约4℃到1℃。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述第一控制速率介于约0.75℃与1.25℃/分钟之间。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述第二温度是约-2℃。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述第二控制速率介于约20℃与30℃/分钟之间。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述第三温度是约-60℃。
39.如权利要求33所述的方法，其中所述第三控制速率介于约5℃与15℃/分钟之间。
40.如权利要求33所述的方法，其中所述第四温度是约-25℃。
41.如权利要求33所述的方法，其中所述第四控制速率介于0.75℃与1.25℃/分钟之间。
42.如权利要求33所述的方法，其中所述第五温度是约-40℃。
43.如权利要求33所述的方法，其中所述第五控制速率介于7℃与15℃/分钟之间。
44.如权利要求33所述的方法，其中最终温度小于或等于-80℃。
45.一种方法，所述方法包括冷冻保存适于细胞疗法的工程化的免疫细胞，所述方法包括：(1)提供包含样品的容器，所述样品包含悬浮于冷冻保存介质中的免疫细胞，其中样品体积比所述容器的全容量体积小至少5％，其中所述样品体积是至少10mL；以及(2)以最大限度地减少熔化潜热的影响的控制速率逐步冷冻工程化的免疫细胞群，其中所述逐步冷冻包括将所述细胞以0.75℃/分钟到30℃/分钟之间的速率冷却到-80℃或更低的最终温度，从而冷冻保存所述细胞。
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