CN117721142A - 水稻蛋白激酶OsSAPK5在提高水稻抗盐能力中的应用 - Google Patents
水稻蛋白激酶OsSAPK5在提高水稻抗盐能力中的应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了水稻蛋白激酶基因OsSAPK5在提高水稻抗盐能力中的应用，通过从水稻叶片中克隆到OsSAPK5基因，构建亚细胞定位表达载体进行基因亚细胞定位，利用CRISPR/Cas9技术构建了sapk5突变体S5‑1和S5‑2，进一步探究了OsSAPK5基因的功能，发现盐胁迫下sapk5突变体植株种子萌发的耐性明显低于对照植株，幼苗的盐胁迫耐受性明显低于对照植株；进一步研究发现，OsSAPK5可以通过增加渗透调节物质如脯氨酸和可溶性糖等的积累，并提高水稻盐胁迫下的抗氧化酶的活性或者含量，提高水稻抗盐胁迫能力；本发明为培育耐盐性作物研究提供了潜在候选基因。
Description
技术领域
本发明属于植物生物工程和转基因技术领域，涉及水稻蛋白激酶OsSAPK5在盐胁迫下提高水稻种子萌发能力和幼苗抗盐能力中的应用，专用于水稻抗盐品种选育和盐胁迫下水稻遗传改良。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，盐胁迫是水稻生长过程中最易遭遇的非生物胁迫之一(Lutts等，1995)，因此培育具有抗盐性的水稻品种，对于缓解因耕地的盐渍化造成的粮食危机具有重要的意义。
过高的盐离子会对水稻造成离子胁迫和渗透胁迫，这两种胁迫又都可影响水稻植株体内活性氧代谢系统的平衡，进而产生氧化胁迫，使膜脂和膜蛋白过氧化，导致膜的完整性被破坏、膜渗透性增加等，影响水稻植株的多种生理生化代谢途径，包括光合作用、呼吸作用、水分平衡、氧化平衡、离子平衡等，严重时抑制植株正常生长，甚至导致植物体死亡(Deinlein et al.,2014)。
在盐胁迫下，蛋白质磷酸化级联反应被激活并发挥关键作用在水稻耐盐性中的作用。水稻中的渗透胁迫/ABA活化蛋白激酶(Osmotic stress/ABA–activated proteinkinases，SAPKs)共有10个家族成员(SAPK1-10)(Kobayashi,2004)。现有技术中未报道关于水稻OsSAPK5参与响应盐胁迫调控方面的功能和应用。
发明内容
本发明以水稻OsSAPK5为切入点，克隆基因OsSAPK5，进一步通过荧光定量PCR分析、亚细胞定位、生长表型分析等技术对该基因的表达谱和基因功能进行了分析，旨在进一步解析水稻耐盐机理并为后期耐盐品种培育提供候选基因，为今后水稻作物改良提供技术依据。
本发明提供了水稻蛋白激酶基因OsSAPK5在提高水稻抗盐能力中的应用，所述OsSAPK5基因的编号为LOC_Os04g59450，该基因的全基因序列如SEQ ID NO:1所示，cDNA序列如SEQ ID NO:2所示，启动子区序列如SEQ ID NO:3所示。
所述OsSAPK5基因编码的蛋白为SnRK2家族蛋白激酶，由371个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明通过RNA反转录的方法获得OsSAPK5的cDNA序列，然后将OsSAPK5基因的cDNA连接到p30-GFP，获得OsSAPK5基因的和GFP融合蛋白载体35S-SAPK5-GFP，然后将OsSAPK5的启动子区序列连接到p1300上，获得GUS分析载体ProSAPK5:GUS。
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在水稻粳稻品种日本晴(Oryza.SativaL.spp.japonica,var Nipponbare,AA genome)中敲除OsSAPK5基因，制备得到OsSAPK5基因敲除的植株S5-1和S5-2，比较了野生型种子和S5-1、S5-2突变体种子在添加不同浓度NaCl(0和175mM)的MS板上的种子萌发率，以胚芽鞘长度>5mm作为萌发已完成的标准，将萌发3天的幼苗转移至含有175mM NaCl的MS培养瓶中生长7天，统计突变体和野生型植株生长表型。
本发明OsSAPK5基因在水稻苗期盐胁迫抗性中的探究，通过将野生型和和S5-1、S5-2突变体种子分别置于培养皿中萌发，待水稻种子生长到2～3cm时，将野生型和突变体幼苗转移至全培养液中培养，每盆中野生型水稻与突变型水稻数量各16株，将水培4周龄的不同基因型的植株移至添加了175mM NaCl的MS培养液中处理5天后，再移至新鲜的MS培养液中回复7天，统计突变体和野生型植株的存活率、株高、干重等生长表型，分析渗透调节物质和抗氧化物质等含量变化。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过在水稻原生质体中的亚细胞定位明确，OsSAPK5基因在细胞质和细胞核中均有表达，通过GUS染色分析明确，OsSAPK5基因最强的表达在根，其次是在种子。
(2)本发明萌发期的实验表明，OsSAPK5基因可以有效提高盐胁迫下水稻种子萌发能力，并显著改善盐胁迫下种子萌发后幼苗的生长表型。
(3)本发明苗期耐盐分析表明，OsSAPK5基因可以在盐胁迫调节中起正调节作用，实验中，将水培4周龄的不同基因型的植株移至添加了不同浓度NaCl(0，175mM)的MS培养液中处理5天后，统计S5-1和S5-2突变体和野生型植株的存活率，在0mM NaCl处理5天后的生长表型，S5-1和S5-2突变体株系与野生型无明显差异，但是在175mM NaCl处理5天后，S5-1和S5-2突变体株系分别为57％和61％，野生型则为79％；；在0mMNaCl处理下，S5-1和S5-2突变体株系与野生型在生长表型上无明显差别，但是在175mM NaCl处理后，在S5-1和S5-2突变体株系中盐胁迫引起的可见损伤比野生型更加严重，表现在与野生型相比，S5-1和S5-2突变体株系长度(地上和地下部分)和鲜重(地上和地下部分)均明显低于野生型，地上和地下部分鲜重明显低于野生型。
(4)本发明证明OsSAPK5通过影响渗透调节物质如脯氨酸的积累参与水稻盐胁迫响应，对175mM NaCl处理前后植物体内游离脯氨酸含量进行测量，结果显示，175mM NaCl处理后S5-1和S5-2突变体株系游离脯氨酸含量显著低于野生型植株，脯氨酸的生物合成是依赖于OsP5CS表达产物的催化，qRT-PCR数据显示，OsP5CS的表达水平在S5-1和S5-2突变体株系中远低于野生型。
(5)本发明证明OsSAPK5通过影响抗氧物质的含量提高水稻盐胁迫能力，比较175mM NaCl处理前后野生型和突变体株系叶片中超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性以及抗坏血酸(Ascorbate Oxidase，AsA)含量；在正常条件下，野生型和突变体株系叶片中的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性以及抗坏血酸(Ascorbate Oxidase，AsA)含量没有显着差异，175mMNaCl处理后，S5-1和S5-2突变体株系中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性以及抗坏血酸(AscorbateOxidase，AsA)含量均明显低于野生型。
附图说明
图1为OsSAPK5表达模式和定位分析，其中(A)为qRT-PCR分析NaCl、PEG、干旱和ABA处理下OsSAPK5的表达结果；(B)qRT-PCR分析不同组织中OsSAPK5的表达量；(C)2周龄幼苗中的ProSAPK5:GUS转基因植物的β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)染色分析OsSAPK5在(a)全株(b)根(c)茎(d)叶等部位的表达水平；(D)原生质体中35S-SAPK5-GFP的亚细胞定位分析；
图2为OsSAPK5基因敲除植株S5-1和S5-2的鉴定，其中(A)S5-1和S5-2突变体中OsSAPK5基因的基因序列在靶点处的碱基突变情况；(B)S5-1和S5-2突变体中OsSAPK5基因对应的表达产物情况；(C)S5-1和S5-2突变体中OsSAPK5基因序列突变后的测序图谱；
图3(A)WT和S5-1和S5-2突变体种子在含有175mM NaCl的培养基上生长6天的发芽率；(B)盐胁迫下早期幼苗发育阶段的幼苗生长状况，将WT和S5-1和S5-2突变体种子在MS培养基上发芽3天后，将所有幼苗分别转移至含0或175mM NaCl的培养瓶中培养7天的表型；(C)地上部分长度和(D)根长长度统计分析；
图4(A)四周龄的WT、S5-1和S5-2突变体苗在0或175mM NaCl处理5天后的生长表型；(B)为与(A)对应的存活率；(C)地上部分长度；(D)根长；
图5四周龄的WT、S5-1和S5-2突变体苗在175mM NaCl处理5天前后，植株体内的渗透调节物质和抗氧化物质含量分析(A)脯氨酸含量；(B)可溶性糖含量；(C)MDA含量；(D)相对电解质渗漏率；(E)OsP5CS的转录水平；(F)抗坏血酸(Ascorbate Oxidase，AsA)含量；(G)过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性；(H)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性；(I)过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1
水稻OsSAPK5基因的获取：
提取水稻总DNA，用于克隆OsSAPK5基因启动子的模板，提取水稻的总RNA，反转录获取水稻总cDNA的，用于克隆OsSAPK5基因cDNA的模板。
(1)SDS法提取水稻总DNA
①取一片幼嫩的水稻(日本晴)叶片于1.5mL的离心管中，用液氮冻叶片，研磨；
②加600μL SDS DNA提取液，溶解后摇匀，65℃水浴15mins；
③12000rpm离心10mins，取上清(约500μL)，加等体积异丙醇，混匀，室温放置15mins；
④12000rpm离心10mins，弃上清，加70％酒精500μL，12000rpm离心5mins；
⑤弃上清，室温干燥，加适量ddH2O溶解，获取的DNA-20℃保存。
(2)水饱和酚法提取总RNA
①取适量新鲜的幼嫩植物材料放在1.5mL的离心管中，加入液氮，迅速研磨成粉末；
②加入800μL RNA提取液覆盖粉末，然后加入560μL水饱和酚混匀，加入70μL 2MNaAc溶液(pH4.0)，140μL氯仿/异戊醇，充分混匀；
③4℃，10000rpm，离心20mins，上清转移至另一灭菌离心管中，然后加等体积的异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀1h以上；
④4℃，11000rpm，离心20mins，小心倒去上清；
⑤加70％的乙醇500μL，4℃，11000rpm，离心5mins，弃上清，稍微干10mins后，溶于适量体积的DEPC-SDS-H2O，测获得的RNA浓度，-20℃保存。
(3)RNA反转录获取水稻总cDNA
根据TaKaRa公司生产的反转录试剂盒的操作步骤进行反转录：
①10μL体系消化：RNA样品1ng，RNase Free dH2O add to 7μL，gDNA Eraser 1μL，5×gDNA Eraser Buffer 2μL，置于42℃水浴2mins，放置于冰上待用；
②20μL反转录：消化产物10μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1μL，5×PrimeScript Buffer 24μL，RT Primer Mix 1μL，RNase Free H2O 4μL，37℃水浴15mins，85℃终止反应，-20℃保存获取的cDNA；
(4)qRT-PCR分析使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara)进行，引物见下表1。
表1
结果如图1所示：图1为OsSAPK5表达模式和定位分析，其中(A)为qRT-PCR分析NaCl、PEG、干旱和ABA处理下OsSAPK5的表达，结果显示OsSAPK5受干旱、NaCl和PEG处理强烈诱导，但不受ABA处理诱导表达。(B)qRT-PCR分析不同组织中OsSAPK5的表达量，结果表明OsSAPK5表达水平在根中最高，其次是种子中较高。
实施例2
表达载体构建
目的序列通过DNA聚合酶链式反应(PCR)扩增后，经胶回收纯化后酶切，酶切产物沉淀纯化后与相应载体连接并转化大肠杆菌，阳性克隆用菌落PCR鉴定后扩繁并送测序，经测序确认正确的阳性克隆用于后续实验，具体如下：
(1)通过DNA聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因(包括OsSAPK5的cDNA和启动子区)，以水稻总cDNA为模板，扩增获得OsSAPK5的cDNA(用引物SAPK5-F和SAPK5-R，表2所示，cDNA序列如SEQ ID NO:2所示)，然后用于OsSAPK5基因和GFP融合蛋白载体35S-SAPK5-GFP载体的构建，以水稻总DNA为模板，扩增获得OsSAPK5基因启动子(用引物Promoter-SAPK5-F和Promoter-SAPK5-R，启动子区序列如SEQ ID NO:3所示)，然后用于ProSAPK5:GUS载体的构建。
①PCR反应体系：使用Ex-Taq DNA Polymerase30μL反应体系，具体如下：10×ExTaq Buffer3μL，2.5mM dNTP2.5μL，Primer F2μL，Primer R2μL，Template1μL，H2O19μL，ExTaqnase0.25μL；
②PCR反应程序：95℃1min；32循环：95℃10s，60℃15s，72℃30s；72℃5min。
表2
(2)玻璃珠法DNA胶回收：割胶，并称量胶的重量，按mg计算；加0.5倍的TBEconvertion buffer和4.5倍的bingding solution；55℃水浴10mins；加2.5-3μLsilicapowder suspension，混匀，55℃水浴5mins(其间摇匀一次)；10000rpm，离心15sec，弃上清；加50μL洗液，用枪头吹起沉淀，11000rpm，离心15sec，弃上清；37℃烘干(约20mins)；加25-30μL水，混匀，55℃水浴5mins；10000rpm，离心30sec，上清即为DNA溶液，转移至新管备用；
(3)酶切：配置50μL酶切体系(具体如下：10×Buffer5μL，Vector1μL，H2O addto40μL，内切酶2.5μL)，37℃水浴2-4h；
(4)沉淀：PCR产物或酶切产物，加0.1倍3M NaAc(pH5.2)，2.5倍以上的无水酒精，-20℃沉淀2h以上；室温130000rpm，10mins；加500μL，70％酒精，13000rpm，5min；弃上清，37℃干燥，加水溶解；
(5)连接液：20μL反应体系(10×T4 DNA Ligase Buffer2μL，T4 DNA Ligase 1μL，H2O17μL)在16℃水浴2h；
(6)质粒DNA转化大肠杆菌：取出-80℃冻存的DH5α大肠杆菌感受态细胞，置冰上使其缓慢融化(约5min)，加入步骤(5)中获得的连接液，混匀，立即置冰上30mins；42℃水浴中热激35-50sec，立即放回冰上2-3mins；加入800μLSOC液体培养基，混匀，37℃摇动1h；12000rpm，30sec；弃部分上清，留100μL左右(根据板的湿度来确定)，吹匀沉淀，涂板；Prafilm封口，37℃倒置培养12-16h；
(7)菌落PCR反应：Taq DNA Polymerase20μL反应体系，具体如下：10×Taq Buffer2μL，2.5mM dNTP 1μL，Primer F 0.5μL，Primer R 0.5μL，Template菌落，H2O 16μL，Extaqnase 0.1μL；
(8)质粒DNA小提：收集菌液于3mL于离心管，12000rpm，30s，弃上清；加250μLPR，涡漩振荡悬浮；加250μLLB，上下翻转几次，裂解至澄清(不要超过5min)；加350μLNB，上下翻转5-7次；12000rpm，12mins；将上清于转移至新ep管中，11000rpm，30sec；弃上清，加600μL70％乙醇，静置12000rpm，30sec；重复一次，弃上清，37℃烘干(约20min)；加60μL灭菌的去离子水，65℃水浴5min 12000rpm，2min，-20℃贮存。
利用35S-SAPK5-GFP进行OsSAPK5定位分析，结果如图1(D)所示：原生质体中35S-SAPK5-GFP的亚细胞定位分析发现OsSAPK5在细胞质和细胞核中均有表达。
实施例3
GUS报告基因检测
将新鲜材料(ProSAPK5:GUS载体转化植株)用预冷的90％丙酮于冰上浸泡30mins；配置新鲜100mM铁氰化钾母液和100mM亚铁氰化钾母液，各5mL，并避光保存于4℃；用GUSStaining solution(without X-Gluc 1mg/ml)在冰上漂洗固定后的材料3次；将漂洗后的材料放入GUS Staining solution(with X-Gluc)，并于冰上抽真空3次，每次3mins，操作中注意避光，然后于37℃放置6-12h(染色时间根据基因表达情况而定)；将然GUS色后的材料转移到70％的乙醇溶液中进行脱色，观察并记录实验结果。
利用ProSAPK5:GUS进行OsSAPK5定位分析，结果如图1(C)所示：2周龄幼苗中的ProSAPK5:GUS转基因植物的β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)染色分析OsSAPK5在(a)全株(b)根(c)茎(d)叶等部位的表达水平，分析显示OsSAPK5表达水平在根中最高，其次是种子中较高。
实施例4
水稻转化植株鉴定
CRISPR/Cas9打靶效果检测：打靶成功往往在靶点缺失若干碱基，以靶点切点为中心，在上下游各离开约300-400bp处设计检测引物(Cas9-SAPK5-F,Cas9-SAPK5-R)，克隆T0或T1突变体植株中突变靶点附近的OsSAPK5基因，随后将靶点PCR产物直接测序，从测序出现杂波峰或突变型波峰判断突变状态，具体如下：
(1)SDS法提取T0或T1突变体植株中的总DNA；
(2)克隆T0或T1突变体植株中突变靶点附近的OsSAPK5基因序列小于等于720bp(基因的全基因序列如SEQ ID NO：1所示)：
①PCR反应体系：水稻总DNA为模板，扩增获得OsSAPK5基因启动子(用引物Cas9-SAPK5-F和Cas9-SAPK5-R，如表3所示)，使用Ex-Taq DNA Polymerase30μL反应体系，具体如下：10×Ex Taq Buffer 3μlL，2.5mM dNTP 2.5μL，Primer F 2μL，Primer R 2μL，Template1μL，ddH2O19μL，Ex Taqnase 0.25μL；
表3
②PCR反应程序：95℃1min；95℃10s；32循环：60℃15s，72℃30s；72℃5min；
③PCR反应产物直接送测序公司测序。
(3)突变体靶点情况分析，将OsSAPK5基因全基因组序列(基因的全基因序列如SEQID NO：1所示)中引物Cas9-SAPK5-F和Cas9-SAPK5-R之间的序列(约720bp左右)找出，用前面得到的测序结果与该序列比对，得出突变体突变类型。
如图2OsSAPK5基因敲除植株S5-1和S5-2的鉴定结果所示，其中(A)为S5-1和S5-2突变体中OsSAPK5基因的基因序列在靶点处分别出现37个碱基缺失和1个碱基缺失；(B)为S5-1和S5-2突变体中OsSAPK5基因在靶点处分别出现37个碱基缺失和1个碱基缺失突变时，对应的表达产物分别仅有7个氨基酸的肽链和16个氨基酸的肽链，这2种产物肽链长度均远远小于OsSAPK5基因产生的370个氨基酸的正常肽链(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)；(C)为S5-1和S5-2突变体中OsSAPK5基因序列突变后的测序图谱，图中WT为OsSAPK5基因靶点处的基因序列，红色箭头处表示S5-1突变体中OsSAPK5基因有37个碱基缺失的位置，蓝色箭头处表示S5-2突变体中OsSAPK5基因有1个碱基缺失的位置，结果可以说明，本发明构建的S5-1和S5-2突变体是功能缺失型的有效突变体。
实施例5
种子萌发和早期幼苗发育阶段OsSAPK5耐盐功能分析，实验中所有的水稻材料种子均为同批次收获，并同一条件下保存，具体如下：
(1)种子萌发阶段OsSAPK5耐盐功能分析：
将野生型种子WT、S5-1和S5-2突变体种子经表面消毒后均匀散布在含不同浓度NaCl(0、175mM)的MS培养基平板上，随后每隔24小时观察并记录不同基因型的水稻种子的萌发率，以胚芽鞘长度>5mm为萌发已完成。
结果如图3所示：(A)WT和S5-1和S5-2突变体种子在含有175mM NaCl溶液的培养基上生长6天的发芽率，正常情况下(0mM NaCl)，S5-1、S5-2突变体和野生型的种子之间的萌发率无显著差异；在175mM NaCl处理下，S5-1、S5-2突变体和野生型的种子均在48小时候开始萌发，但萌发率出现显著性差异，在萌发第6天时，S5-1和S5-2突变体种子萌发率分别为41％和44％，而野生型种子则为52％，此结果说明OsSAPK5可以提高盐胁迫下水稻种子的萌发率。
(2)早期幼苗发育阶段OsSAPK5耐盐功能分析，将野生型、S5-1和S5-2突变体种子在MS培养基上发芽3天后，将所有幼苗分别转移至含不同浓度NaCl(0、175mM)的培养瓶中培养7天的表型。
结果如图3所示：(B)为盐胁迫下早期幼苗发育阶段的幼苗生长状况；通过(C)地上部分长度和(D)根长长度统计分析发现：0mM NaCl处理时，突变体和野生型之间的地上部分长度和根长没有显著差异，然而，175mM NaCl处理时，S5-1和S5-2突变体的地上部分长度分别为1.81cm和1.78cm，显著低于野生型4.46cm；S5-1和S5-2突变体的根长分别为1.05cm和1.16cm，明显小于野生型2.36cm，说明OsSAPK5可以提高水稻早期幼苗发育阶段的抗盐胁迫能力。
(3)营养生长阶段OsSAPK5耐盐功能分析，将野生型种子、S5-1和S5-2突变体种子经表面消毒后均匀散布在MS培养基平板上，后转移到28℃人工气候室内萌发5-7天，然后将完成萌发的幼苗移栽到MS培养液中，所有材料均在人工培养室里生长，光照周期为14h光照/10h黑暗，生长温度为白天28℃，晚上20℃，将水培4周龄的不同基因型的植株移至添加了不同浓度NaCl(0、175mM)的MS培养液中处理5天后，统计S5-1和S5-2突变体和野生型植株的存活率、及生长表型。
结果发现，如图4所示：(A)四周龄的WT、S5-1和S5-2突变体苗在0或175mM NaCl处理5天后的生长表型，在0mM NaCl处理5天后的生长表型，S5-1和S5-2突变体株系与野生型无明显差异，但是在175mM NaCl处理5天后，如图4(B)存活率所示，S5-1和S5-2突变体株系分别为57％和61％，野生型则为79％；(C)S5-1和S5-2突变体的地上部分长度分别为24cm和23cm，显著低于野生型26cm；(D)S5-1和S5-2突变体的根长分别为8.5cm和8.3cm，明显小于野生型11.5cm，表明OsSAPK5可以明显提高水稻营养生长阶段的耐盐能力。
实施例6
耐盐生理指标分析，分别测定并分析175mM NaCl处理5天前后，野生型、S5-1和S5-2突变体中渗透调节物质和抗氧化酶体系相关指标的数值，具体如下：
(1)游离脯氨酸含量测定：分离突变体和野生型植株的旗叶约0.5g，液氮研磨成粉末，然后装入含有10mL3％磺基水杨酸的试管中，然后3000×g离心20min并收集上清液，2mL上清液、2mL酸茚三酮和2mL冰醋酸在试管中100℃反应1小时，然后置冰上冷却，然后用分光光度计测定520的吸光度，计算游离脯氨酸浓度，L-脯氨酸作为计算脯氨酸浓度标准样品。
结果发现，如图5(A)所示，175mM NaCl处理下，S5-1和S5-2突变体中的脯氨酸含量分别为81g/g和93g/g，明显低于野生型的脯氨酸含量162μg/g，说明OsSAPK5基因突变，导致盐胁迫下水稻植株中游离脯氨酸含量显著下降，即OsSAPK5在提高水稻盐胁迫下的游离脯氨酸含量方面发挥重要作用。
(2)蒽酮试剂测定叶片中可溶性糖含量：分离突变体和野生型植株的旗叶约0.5g，磨成粉末，用液氮冷冻，然后用50mL的试管加2mL80％乙醇在200rpm震荡1小时，6000xg离心10分钟，然后取尽可能多的上清液转移到新的5mL管中，加入等体积的氯仿，充分混合，然后于12000xg离心10min，液体部分转移到新管中，每50μL加入4.95mL蒽酮试剂，然后煮沸15分钟，用分光光度计测620nm吸光度，计算可溶性糖含量。
结果发现，如图5(B)所示，175mM NaCl处理下，S5-1和S5-2突变体中的可溶性糖含量分别为61μg/g和68μg/g，明显低于野生型的存活率102μg/g，说明OsSAPK5基因突变，导致盐胁迫下水稻植株中可溶性糖含量显著下降，即OsSAPK5在提高水稻盐胁迫下的可溶性糖含量方面发挥重要作用。
(3)脯氨酸的生物合成是依赖于OsP5CS表达产物的催化，分别提取不同浓度NaCl(0、175mM)处理后的野生型、S5-1和S5-2突变体植株中的RNA，进行荧光定量PCR分析，根据TaKaRa公司生产的SYBR Primix X Ex Taq试剂盒配置试剂，并在RocheLightCycler480定量PCR仪上进行反应。
如图5(E)所示，qRT-PCR数据显示，OsP5CS的表达水平在S5-1和S5-2突变体中远低于野生型，此结果与S5-1和S5-2突变体的脯氨酸含量明显低于野生型这一结果相一致。
综合以上结果表明，OsSAPK5可以通过影响渗透调节物质如脯氨酸和可溶性糖等的积累提高水稻抵抗盐胁迫的能力。
(4)丙二醛(MDA)含量进行了测定：分离突变体和野生型植株的旗叶约1g装入含10mL10％(v/v)三氯醋酸的试管中，5000x g离心10分钟，取上清液2mL与2mL硫代巴比妥酸在试管中100℃反应15分钟，置冰上冷却，利用分光光度法测定532nm的吸光度。
结果发现，如图5(C)所示，175mM NaCl处理下，S5-1和S5-2突变体中的丙二醛含量分别为863μg/g和813μg/g，明显高于野生型的丙二醛含量563μg/g，说明OsSAPK5基因突变，导致盐胁迫下水稻植株中的丙二醛含量上升显著高于野生型，而丙二醛含量是植株是否受到氧化伤害的重要指标之一，即OsSAPK5在提高水稻盐胁迫下的抗氧化能力过程中发挥重要作用。
(5)相对离子渗漏率的测定：分离突变体和野生型植株的旗叶约1g，分别切成5毫米长，放在含有10mL去离子水的试管中，试管盖上塑料帽，放在22℃水浴中保持2小时，用电导率仪测定水的电导率。
结果发现，如图5(D)所示，175mM NaCl处理下，S5-1和S5-2突变体中的相对离子渗漏率分别为83％和82％，明显高于野生型的62％，说明OsSAPK5基因突变，导致盐胁迫下水稻植株中的细胞膜相对离子渗漏率显著上升显著高于野生型，而细胞膜相对离子渗漏率是植株是否受到氧化伤害的重要指标之一，即OsSAPK5在提高水稻盐胁迫下的抗氧化能力过程中发挥重要作用。
(6)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性以及抗坏血酸(Ascorbate Oxidase，AsA)含量，使用购自南京建成生物工程研究所(中国南京)的商业测定试剂盒检测。
结果表明，如图5(F-I)所示，在175mM NaCl胁迫下，S5-1和S5-2突变体中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及抗坏血酸(AsA)等抗氧化酶的活性或者含量均明显低于野生型植株中相应抗氧化酶的活性或者含量，说明OsSAPK5基因突变，导致盐胁迫下水稻植株中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等抗氧化酶的活性或者含量上升显著低于野生型，即OsSAPK5可以提高水稻盐胁迫下的抗氧化酶的活性或者含量，进而提高水稻植株的抗氧化能力，从而提高水稻抗盐胁迫能力。
Claims (1)
1.水稻蛋白激酶基因OsSAPK5在提高水稻抗盐能力中的应用，所述基因OsSAPK5的DNA序列如SEQ No：1所示。
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