CN117715629A - 保护生物制品免受降解 - Google Patents

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Abstract

一种制备储存稳定的注射用或口服制剂的方法，其包括：使生物制品与包括生物相容性固体颗粒的递送系统接触以形成复合物；然后任选地，将复合物冻干以形成粉末；并且然后将复合物分散在可生物降解的凝胶材料中以形成制剂，其包括包埋在可生物降解的凝胶材料中的复合物。还有相关的产品、方法和医疗用途。

Description

保护生物制品免受降解
技术领域
本发明涉及用于保护生物制品(biological species)(如核酸、抗原和疫苗)免受降解的方法和组合物(特别是注射用或口服组合物)。这种方法和组合物在药物领域特别有用，但不限于此。
背景技术
需要改善用于生物活性剂的赋形剂，特别是在注射用或口服制剂领域。生物医学研究的进展需要提供合适的赋形剂，才能充分转化为有效、安全和成本效益高的治疗。特别需要稳定生物制品，以减少储存期间的降解。还需要用于口服或注射用组合物的生物相容性赋形剂，其使得能够口服给药或通过注射给药，而无需干预步骤(i)从组合物中提取活性生物制品和(ii)重新配制。
生物制品，如核酸、抗原和疫苗，可以是用于治疗或预防各种疾病的有效试剂。然而，与小型化学实体不同，生物制品可能很难储存，通常需要在低温(如-20℃)或超低温(如-70℃)下储存。这使得许多含有生物制品的药物产品难以储存和运输给患者，尤其是在欠发达国家。
包括生物制品的药物产品不稳定的一个原因是，生物制品的制造过程，特别是那些含有核酸如mRNA、pDNA、saRNA、shRNA和siRNA的生物制品的制造过程，导致产品中存在酶的残留。例如，使用微生物发酵表达系统来生产生物制品产生含有难以完全去除的酶残留的粗产物。即使进行了大量的下游加工，仍会残留一些有可能降解生物制品的低水平污染物。特别是mRNA易受酶促和化学降解的影响。低温和/或生物制品的冻干可能减缓酶活性，但这些溶液中的每一种都有缺点。此外，即使生物制品可以通过低温或从储存介质中去除水而变得储存稳定，在将储存的制剂转化为适合给药的剂型时获得的产物的不稳定性仍然是一个问题。在冻干制剂的重构或冷冻剂型的解冻过程中，储存时休眠的酶残留污染物被重新激活，导致最终剂型的保质期缩短。此外，生物系统(如mRNA-脂质纳米颗粒疫苗)中存在水和自由基，可导致磷酸酯骨架的水解或磷酸酯剪切，使得核酸不可读。
许多针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗，包括辉瑞生物技术公司(Pfizer BioNTech)疫苗BNT162b2(“复必泰(Comirnaty)”)和莫德纳(Moderna)CX-024414疫苗，都需要冷链储存和运输。这限制了低收入国家获得疫苗的机会，并增加了所有市场的成本和物流复杂性。冷链要求还限制了可以制造、储存和运输的疫苗体积，从而限制了疫苗的供应，阻碍了疫苗在短时间内的有效推广，这种推广通常对遏制感染的传播至关重要。如果疫苗可以在标准冰箱温度(约-5℃)或室温(约20℃)下储存和运输，这将是有利的。如果疫苗能够耐受更高的温度(例如30、40或50℃)进行储存，或者至少在短期内用于运输和配送目的，这也将是有益的。
通过低温维持注射用组合物(例如疫苗组合物)中RNA的稳定性，以及带来物流挑战，也具有技术限制，即RNA必须在注射前解冻，并且在注射后必须在体内保持足够长的时间稳定，以显示出足够的生物活性。这可能需要在身体周围移位和/或从内体室(endosomalcompartment)逃逸期间保持稳定性。体内的稳定性也必须保持足够长的时间，以便充分翻译成蛋白质和/或运输到体内发生翻译成蛋白质的位置。
需要能够稳定生物制品(如mRNA疫苗)的制剂，允许在标准冰箱温度、室温或更高温度下长期储存。同样，需要稳定用于将生物材料递送至体内细胞的制剂，使得生物制品的有效载荷仅在内化到所需细胞中时释放。稳定生物制品的制剂理想地仅包括药学上可接受的赋形剂，以允许制剂给药(特别是口服或通过注射给药)，而无需从制剂中提取活性生物制品，然后重新配制。例如，用于稳定生物制品的制剂有利地能够直接给药(特别是口服或通过注射给药)；或在添加其它药剂或赋形剂后给药(特别是口服或通过注射给药)，例如用溶剂稀释，或在简单的重构步骤后。
凝胶材料，尤其是水凝胶，以前曾被用作各种生物医学应用中的粘合剂。例如，水凝胶用于密封组织和器官中的伤口，将生物电子粘附到身体上，或将药物递送装置(如贴片)结合到皮肤上。已开发了许多生物相容性和可生物降解的水凝胶用于这种目的，如Bovone等人在ACS Biomater.Sci.Eng.2021年4月,“Engineering Hydrogel Adhesion forBiomedical Applications via Chemical Design of the Junction”中所描述。然而，以前没有建议过使用生物相容性凝胶，特别是在注射用或口服制剂中，来稳定与生物相容性固体颗粒复合的生物制品。
发明内容
本发明基于以下认识，即如果将生物制品与包括生物相容性固体颗粒的递送系统接触以形成复合物，然后将该复合物包埋在可生物降解的凝胶材料中，则可以阻止或至少减缓递送系统和因此的生物制品的降解；特别是在颗粒包括可水解的硅的情况下。因此，将所述复合物包埋在所述可生物降解的凝胶材料中可用于稳定复合物。稳定的复合物能够更好地保护其中所含的生物制品在储存或体内免受降解。
此外，该递送系统可以用作生物制品的口服或注射用给药的生物相容性赋形剂，这使得能够进行所述口服给药或通过注射给药，而无需干预步骤(i)从组合物中提取活性生物制品和(ii)重新配制。
因此，根据本发明的第一方面，提供一种制备制剂的方法，该制剂有利地为口服或注射用制剂，且有利地为储存稳定制剂，该方法包括(i)使生物制品与包括生物相容性固体颗粒的递送系统接触以形成复合物；然后(ii)任选地，将复合物冻干以形成粉末；以及然后(iii)将复合物分散在可生物降解的凝胶材料中，以形成制剂，其包括包埋在可生物降解的凝胶材料中的复合物。
根据本发明的第二方面，提供一种保护生物制品免受降解的方法，其包括(i)使生物制品与包括生物相容性固体颗粒的递送系统接触以形成复合物；然后(ii)任选地，将复合物冻干以形成粉末；以及然后(iii)将复合物分散在可生物降解的凝胶材料中以形成制剂，有利地为口服或注射用制剂，该制剂包括包埋在可生物降解的凝胶材料中的复合物。
本发明第二方面的方法还可以包括步骤(iv)任选地，储存制剂；以及然后(v)从制剂中制备用于给药(优选口服给药或通过注射给药)的药物；优选无需从组合物中提取活性生物制品和重新配制的任何干预步骤。因此，在优选实施方式中，制备药物的步骤(v)不包括任何提取步骤，使得药物包括制剂的所有成分。因此，制备步骤可以例如简单地是或包括稀释步骤和/或重构步骤。
根据本发明的第三方面，提供一种制剂，优选为口服或注射用制剂，其包括可生物降解的凝胶基质，其中包埋有与包括固体生物相容性颗粒的递送系统复合的生物制品。本发明第三方面的制剂有利地是储存稳定的制剂。本发明第三方面的制剂有利地包括脂质组分，该脂质组分包括阳离子脂质和/或可电离脂质；和任选的非还原性二糖。
本发明第三方面的制剂(优选口服或注射用制剂)可以根据本发明第一方面制备。本发明第三方面的制剂通常是凝胶或固体。本发明第三方面的制剂可以是适用于直接给药的药物组合物。例如，该制剂可以局部给药，例如用于给药到皮肤或身体的膜或表面的凝胶，或者该制剂可以是固体口服剂型，或注射用剂型(例如注射用溶液)。或者，本发明第三方面的制剂可适用于在制备步骤中转化为用于给药(特别是口服给药或通过注射给药)的药物组合物。例如，该制剂可以被重构和/或稀释以提供注射用溶液，重新配制为乳液或软膏，重新配制成口服剂型，或被包括为透皮递送贴片的活性组分，该透皮递送贴片具有多个用于通过一个或多个皮肤层注射组合物的微针。有利地，本发明第三方面的整个制剂可以适用于转化为用于给药的药物组合物，而无需提取制剂的任何成分，除了任选地例如在蒸发步骤或冻干步骤中去除溶剂如水。在转化为药物组合物时，可以将额外的成分添加到制剂中，例如药学上可接受的赋形剂、稀释剂和佐剂。因此，本发明第三方面的制剂和由其制备的药物满足了对生物相容性赋形剂的需要，特别是对口服或注射用组合物的需要，其能够给药，特别是口服给药或通过注射给药，而无需从组合物中提取活性生物制品的干预步骤，也无需重新配制的干预步骤。这可能特别是在生物相容性固体颗粒包括可水解的硅的情况下。
根据本发明的第四方面，提供一种制备用于给药(有利地口服给药或通过注射给药)的包括生物制品的药物的方法，该方法包括：根据本发明第一方面的方法制备制剂，或提供根据本发明的第三方面的制剂；然后(ii)任选地储存该制剂；以及然后(iii)制备用于给药优选口服给药或通过注射给药的包括生物制品的药物，例如稀释和/或重构步骤。
因此，当包括根据本发明第一方面的方法制备制剂时，本发明第四方面的方法可以包括：使生物制品与包括固体生物相容性颗粒的递送系统接触以形成复合物；然后，任选地，将所述复合物冻干以形成粉末；然后将复合物分散在可生物降解的凝胶材料中以形成制剂；然后任选地储存制剂；以及然后制备用于给药(优选口服给药或通过注射给药)的包括生物制品和递送系统的药物。
或者，当包括提供根据本发明第三方面的制剂时，本发明第四方面的方法可以包括提供一种制剂，优选口服或注射用制剂，制剂包括与递送系统复合的生物制品，递送系统包括包埋在可生物降解的凝胶基质中的生物相容性固体颗粒；以及然后制备用于给药(优选口服给药或通过注射给药)的包括生物制品和递送系统的药物。
制备用于给药的药物的步骤例如可以是制备通过注射给药的药物的步骤，例如稀释和/或重构含有分散的生物制品和递送系统的可生物降解的凝胶材料的步骤；或者在另一个实例中，它可以是制备用于口服给药的药物的步骤，例如，通过用药学上可接受的赋形剂如填充剂、崩解剂等压片。
根据本发明的第五方面，提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括将本发明第四方面的药物施用(优选口服或通过注射)于有需要的受试者，例如通过皮下或肌内注射。
因此，本发明第五方面的方法可以包括：使生物制品与包括生物相容性固体颗粒的递送系统接触以形成复合物；然后，任选地，将复合物冻干以形成粉末；然后将复合物分散在可生物降解的凝胶材料中以形成制剂，优选口服或注射用制剂；然后，任选地，储存制剂；然后制备用于给药(优选口服给药或通过注射给药)的包括生物制品和递送系统的药物；以及然后将药物施用(优选口服或通过注射)于有需要的受试者。
或者，本发明第五方面的方法可以包括提供一种制剂，优选口服或注射用制剂，该制剂包括可生物降解的凝胶材料，其中包埋有与包括生物相容性固体颗粒的递送系统复合的生物制品；然后制备用于给药(优选口服或通过注射)的包括生物制品和递送系统的药物，例如稀释和/或重构含有包埋的生物制品和递送系统的可生物降解的凝胶材料的步骤；以及然后将药物施用(优选口服或通过注射)于有需要的受试者。制备用于给药(优选口服或通过注射)的药物的步骤可以例如是或包括稀释和/或重构含有包埋的生物制品和递送系统的可生物降解的凝胶材料的步骤；或者，在另一个实例中，可以是或包括制备用于口服给药的药物的步骤，例如通过用药学上可接受的赋形剂如填充剂、崩解剂等压片。施用药物的步骤可以例如是通过注射皮下或肌内给药、或固体剂型的口服给药的步骤。
优选地，本发明第四方面的制备药物的方法和/或本发明第五方面的治疗或预防疾病或病症的方法不包括任何提取步骤；使得用于给药(优选口服给药或通过注射给药)的药物包括本发明第一方面的方法中产生的(优选口服或注射用)制剂或本发明第三方面的(优选口服或注射用)制剂的所有成分。不包括提取步骤的(本发明第四或第五方面的)方法可以包括从本发明第一方面的方法中产生的(优选口服或注射用)制剂或本发明第三方面的(优选口服或注射用)制剂中去除溶剂如水的步骤，例如蒸发步骤、冻干或过滤步骤。
在第六方面，本发明提供一种(优选口服或注射用)药物。药物可以包括与包埋在可生物降解的凝胶材料中的递送系统复合的生物制品。或者，药物可以包括与递送系统复合的生物制品，以及能够形成分散在载体系统中的可生物降解的凝胶基质的化合物，载体系统可以是液体载体系统，例如水溶液，或固体载体系统。例如，药物可以是注射用剂型，其包括与递送系统复合的生物制品以及能够形成分散在液体载体系统中的可生物降解的凝胶基质的化合物。或者，药物可以例如是固体或凝胶剂型，其包括与递送系统复合的生物制品，一起包埋在可生物降解的凝胶中，例如用于口服给药。
在本发明的第一、第二、第四和第五方面的方法中，在使生物制品与递送系统接触的步骤之后，任选地在冻干步骤中将与递送系统相接触的生物制品冻干以形成粉末。已经发现，例如在制剂的任选储存期间，冻干可以有利于提高制剂的稳定性。
生物制品任选地是或任选地包括核酸、抗原和疫苗中的一种或多种。生物制品通常包括核酸，特别是siRNA或mRNA或质粒DNA。当生物制品是疫苗时，本发明第五方面的预防疾病或病症的方法可以是疫苗接种的方法。
本发明的第一至第六方面的递送系统是一种颗粒递送系统，其包括生物相容性(以及任选地可生物降解的)固体颗粒。包括生物相容性颗粒的递送系统有利地包括可水解的硅的颗粒。例如，在脂质组分的存在下，递送系统可以包括可水解的硅的生物相容性颗粒，脂质组分包括至少一种脂质(例如阳离子或可电离脂质)和任选的非还原性二糖(例如海藻糖)。
因此，本发明的第一方面的方法或本发明的第二方面的方法(以及因此本发明第四方面的方法或者本发明第五方面的方法)可以包括在至少一种脂质(例如阳离子或可电离脂质)和任选的非还原性二糖(例如海藻糖)的存在下，使包括核酸的生物制品与包括可水解的硅的生物相容性颗粒的递送系统接触；然后，任选地，将与递送系统接触的生物制品冻干以形成粉末；以及然后将复合的生物制品和递送系统包埋在可生物降解的凝胶材料中。本发明第三方面的制剂和/或本发明第六方面的药物可包括包埋在可生物降解的凝胶材料中的包括核酸的生物制品，该生物制品与包括可水解的硅的颗粒、至少一种脂质(例如阳离子或电离脂质)、以及任选的非还原性二糖(例如海藻糖)复合。
与递送系统接触的生物制品或其一种或多种成分可以用作将生物制品或其一种或多种其它成分递送至细胞的载体，例如用作转染载体或其它载体，其可以被内化并允许内体逃逸以将生物制品递送至细胞质。转染载体可以用于将生物制品靶向至细胞。因此，生物制品可以包括用于在细胞内转录的核酸，以及提供转染载体(特别是非病毒转染载体)或允许免疫细胞摄取的载体(导致核酸的内体逃逸以释放到细胞质中)的其它成分。
根据本发明第一或第二方面的方法生产的或由本发明第三方面提供的(优选口服或注射用)制剂，可以有利地在相对较高的温度(例如-10℃或更高，特别是4℃或更高)下储存相当长的时间(例如6周或更长)，而不发生实质性降解，例如没有10％或更多(例如没有8、7、6、5、4、3、2或1％或更多)的生物制品被降解。此外，当例如根据本发明第四方面的方法，将本发明第三方面的(优选口服或注射用)制剂制备为用于给药的药物时，药物(例如，与包括生物制品的常规重组或解冻的药物产品相比)中存在的生物制品有利地保持免受降解的保护。
当在固体结构中时，分子的运动受到限制，其正常共振振幅减小。据推测，当包括生物制品和痕量污染物例如酶(例如来自用于生物制品的制造过程的残留酶)的组合物结合到基质结构中时，系统中的污染物(例如酶)没有足够的运动来作用于生物制品并引起降解。例如，酶(例如残留的酶)不具有足够的运动自由度来结合核酸或其它生物制品的正确部分，并且将不具有影响酶切割的能力。类似地，在不希望受理论约束的情况下，认为可用于与生物制品的酶催化反应的水分子的数量可能减少，例如，水分子可以通过水与可水解的硅的反应来去除。
因此，已经发现用包括生物相容性固体材料颗粒的递送系统将生物制品的复合物包埋在生物相容性凝胶内可以稳定复合物，在储存时和给药至人体后在体内都保留复合物的成分。
已经发现生物制品与包括生物相容性固体材料(特别是可水解的硅)颗粒的递送系统的接触在防止生物制品降解方面特别有效。据推测，生物制品，如一种或多种核酸，结合在多孔硅的表面上，保护核酸的切割位点，如磷酸酯骨架上的位点，免受酶降解。
据信，产品在储存时的总体稳定性有三种主要因素：防止生物制品(如RNA)降解；减缓脂质的氧化，例如那些参与转染的脂质；以及防止颗粒聚集的颗粒悬浮液的胶体稳定性。本发明的制剂和药物有利地提供了这三种因素中的一些或全部。此外，在给药后，优选口服给药或通过注射给药，据信生物制品与递送系统的复合物可以通过凝胶的存在而在体内继续稳定，直到其完全降解。这种增强的生物稳定性可以有助于增加生物制品被递送至期望位置(例如，被靶细胞内化)的可能性。
附图说明
图1为制备时和在室温(RT)或40℃下储存6小时后，包埋在透明质酸钠可生物降解的凝胶中的液体mRNA-Biocourier制剂的凝胶电泳图像。
图2为在室温(RT)或40℃下储存24和48小时后，包埋在透明质酸钠可生物降解的凝胶中的液体mRNA-Biocourier制剂的凝胶电泳图像。
图3为制备时和在室温(RT)或40℃下储存6小时后，包埋在透明质酸钠可生物降解的凝胶中的冻干和重建的mRNA-Biocourier制剂的凝胶电泳图像。
图4为在室温(RT)或40℃下储存24和48小时后，包埋在透明质酸钠可生物降解的凝胶中的冻干和重建的mRNA-Biocourier制剂的凝胶电泳图像。
图5为在制备后立即以及在室温(RT)或40℃下储存2小时后，siRNA-Biocourier-可生物降解的凝胶制剂的凝胶阻滞图像。
图6为在室温(RT)或40℃下储存24-48小时后，siRNA-Biocourier-可生物降解的凝胶制剂的凝胶阻滞图像。
图7为在制备后立即(0小时)和在室温储存2小时后，siRNA-SIS0012-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图8为在室温储存4-6小时后，siRNA-SIS0012-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图9为在室温储存24-48小时后，siRNA-SIS0012-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图10为在制备后立即(0小时)和在40℃下储存2小时后，siRNA-SIS0012-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图11为在40℃下储存4-6小时后，siRNA-SIS0012-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图12为在40℃下储存24-48小时后，siRNA-SIS0012-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图13为在制备后立即(0小时)和在室温储存2小时后，siRNA-SIS0013-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图14为在室温储存4-6小时后，siRNA-SIS0013-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图15为在室温储存24-48小时后，siRNA-SIS0013-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图16为在制备后立即(0小时)和在40℃下储存2小时后，siRNA-SIS0013-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图17为在40℃下储存4-6小时后，siRNA-SIS0013-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图18为在40℃下储存24-48小时后，siRNA-SIS0013-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像。
图19为制备后不久，液体形式(Liq)或重悬的冻干粉(FD)的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像。
图20为在室温(RT)或4℃下储存24-48小时后，液体形式(Liq)或重悬的冻干粉(FD)的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像。
图21为在室温(RT)或4℃下储存5天和7天后，液体形式(Liq)或重悬的冻干粉(FD)的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像。
图22为在室温(RT)或4℃下储存14和28天后，液体形式(Liq)或重悬的冻干粉(FD)的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像。
图23为制备后不久，作为重悬的冻干粉(FD)或负载在透明质酸钠(SH)水凝胶上的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像。
图24为在40℃下储存24-48小时后，作为重悬的冻干粉(FD)或负载在透明质酸钠(SH)水凝胶上的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像。
图25为在40℃下储存5天和7天后，作为重悬的冻干粉(FD)或负载在透明质酸钠(SH)水凝胶上的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像。
图26为在40℃下储存14和28天后，作为重悬的冻干粉(FD)或负载在透明质酸钠(SH)水凝胶上的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像。
图27为显示用常规底盘(chassis)中、负载在本发明的制剂中的肽API或对照(无肽)接种和治疗后人类志愿者皮肤上的MRSA细菌群的图表。
图28为显示MRSA-生物膜小鼠鼻腔支架模型测试含硅制剂的结果的图表。
图29显示在负载siRNA时，具有NAD、TYR和QUE的SIS0012和SIS0013的凝胶电泳图像。
图30显示在负载siRNA时，实施例6的DPPC/PAL-KTTKS-DOPE制剂的凝胶电泳图像。
图31显示在负载siRNA时，实施例6的DPPC/PAL-KTTKS-DOPE制剂的进一步凝胶电泳图像。
图32显示在负载mRNA时，实施例6的DPPC/PAL-KTTKS-DOPE制剂的进一步凝胶电泳图像。
具体实施方式
在不希望受任何理论约束的情况下，本发明人已经认识到，核酸或其它生物制品与固体生物相容性颗粒(如可水解的硅)的复合不仅限制了生物制品的迁移率(分子运动)，而且限制了可能存在于组合物中的带正电荷组分(如用于形成脂质膜的脂质、聚合物和肽)的迁移率。这稳定了它们的正电荷，从而使它们能够保持稳定生物制品的功能。据信，修饰和衍生的硅颗粒通过保留其正电荷并防止生物制品和正电荷组分的解离，不仅稳定了生物制品，而且稳定了带正电荷组分的完整性。与作为油/水/表面活性剂相互作用的结果的脂质体、或脂质纳米颗粒(据信其在脂质纳米颗粒内仍含有一些水袋，并因此将生物制品暴露于水性环境中)不同，在本发明的复合物中有利地不存在或很少存在水分。因此，酶或自由基没有溶剂/水性环境可供操作。硅结合和局部水可利用性降低的双重作用也可能是其在室温储存时提高生物制品稳定性的原因。
基于这一认识，本发明人已经研究了将整个复合物包埋在(可生物降解的凝胶材料的)基质系统中以进一步保护和固定复合物的成分的效果。通过本发明复合物中的脂质层的包封和吸附到固体载体(例如，包括可水解的硅的颗粒)上的组合，以及通过将整个复合物包埋在(可生物降解的凝胶材料的)基质系统中，来提供对生物制品如核酸(针对环境)的物理保护。这通过避免与外部生物制品的相互作用，提供了高水平的保护，防止降解。虽然单独的吸附或包封可以限制这些相互作用中的一些，例如酶和微生物的进入、与环境水分的接触以及生物制品的流动性，但已发现将其包括在基质系统(可生物降解的凝胶材料)中对于在温和条件下长期储存期间防止相互作用是非常有利的。凝胶是一种必然包括大量液体(通常是水)的材料，其膨胀聚合物基质以稳定复合物的有效性令人惊讶，以前据认为液体的存在将破坏复合物的稳定和/或导致生物制品或其它成分的降解。因此，以前没有将凝胶广泛用于保护活性药物成分，特别是在口服或注射用制剂中，也没有促进储存稳定性，而是更多地用于例如组织结合的应用或局部应用中。
本发明的(优选口服或注射用)制剂(例如，本发明的第三方面的制剂)的另一个优点是，它们准备好转化为用于给药(特别是口服给药或通过注射给药)的药物(例如，本发明的第六方面的药物)，而无需任何提取步骤。因此，例如，制剂可以准备好稀释和注射，而无需提取步骤；或者在没有提取步骤的情况下制成固体口服剂型。因此，该制剂满足对生物相容性赋形剂的需要，特别是对口服或注射用组合物的需要，其能够给药，特别是口服给药或通过注射给药，而无需从组合物中提取活性生物制品和重新配制的干预步骤。在不希望受任何理论约束的情况下，认为可能是这种情况，因为本发明的递送系统的固体颗粒是生物相容的。因此，可能特别是颗粒包括可水解的硅的情况。相比之下，例如，口服或通过注射给药的二氧化硅颗粒不具有生物相容性，因此可能引起炎症。
口服或注射用制剂和药物
本发明第一至第六方面的方法、制剂和药物优选为口服或注射用产品，或优选产生口服或注射用产品。凝胶，例如存在于本发明的第三或第六方面的制剂和药物中的凝胶，以前没有广泛用于保护口服或注射用制剂中的生物制品(也没有促进储存稳定性)，而是更多地用于例如组织结合的应用、或局部应用例如化妆品或烧伤治疗中。
例如，有利地，本发明第三方面的整个制剂可以适合于转化为用于给药的药物组合物，而无需提取制剂的任何成分；除了例如在蒸发步骤或冻干步骤中任选地去除溶剂比如水。还应理解的是，在转化为药物组合物时可将额外的成分添加到制剂中，例如额外的药学上可接受的赋形剂、稀释剂和佐剂；仍然无需提取和/或重新配制步骤。
因此，本发明第三方面的制剂和由其制备的药物满足了对口服或注射用组合物的生物相容性赋形剂的需求，其使得能够口服给药或通过注射给药，而无需从组合物中提取活性生物制品的干预步骤，并且也无需重新配制的干预步骤。这可能特别是生物相容性固体颗粒包括可水解的硅的情况。
因此，在优选实施方式中，制剂是注射用制剂，而药物是注射用药物。注射模式可以是皮下或皮内(例如通过包括微针的透皮贴片)；肌内；或静脉。因此，本文提供一种注射装置，其包括本发明第三方面的制剂，或由本发明第三方面的制剂制备的药物。注射装置可以是或包括注射器，该注射器包括柱塞、药筒(也称为筒)和针。注射器的药筒可以含有本发明第三方面的制剂或由其制备的药物。药筒可以包括单剂量或多剂量，例如1、2、3、4或5剂量的所述制剂或药物。注射器可以是或包括安全注射器。注射器可以是或包括一次性注射器。注射器可以是或包括皮下注射器。注射装置可以是或包括自动注射器系统，例如是或包括注射笔的系统。注射装置可以是或包括无针注射器。注射装置可以是或包括透皮递送装置，例如配备有多个用于注射的微针的递送贴片。注射装置可以是或包括自动注射器。注射装置可以是或包括输注泵装置。在其所有实施方式中，注射装置包括本发明第三方面的制剂，或由本发明第三方面的制剂制备的药物。
本文还提供了一种口服剂型，其包括本发明第三方面的制剂，或由本发明第三方面的制剂制备的药物。口服剂型可包括一种或多种生理学上相容的载体和/或赋形剂，并且可以是固体(如片剂、胶囊或粉末)或液体(如溶液)形式。片剂和胶囊可与结合剂一起制备，例如糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填料，如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；润滑剂，如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；和表面活性剂，如十二烷基硫酸钠。液体组合物可包括常规添加剂，例如悬浮剂，例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基纤维素或可食用脂肪；乳化剂，如卵磷脂或阿拉伯胶；植物油，如杏仁油、椰子油、鱼肝油或花生油；防腐剂如丁基化羟基苯甲醚(BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT)。口服剂型可以是或包括液体组合物，该液体组合物可以封装在例如明胶中，以提供单位剂型。固体口服剂型可以包括片剂、两片式硬壳胶囊和软弹性明胶(SEG)胶囊。固体口服剂型可以是或包括干壳制剂，其通常包括约40％至60％浓度的明胶、约20％至30％浓度的增塑剂(如甘油、山梨醇或丙二醇)和约30％至40％浓度的水。也可能存在其它材料，如防腐剂、染料、遮光剂和香料。液体填充材料可包括已溶化、溶解或分散(用悬浮剂如蜂蜡、氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)的固体形式的制剂或药物，或在如矿物油、植物油、甘油三酯、二醇、多元醇和表面活性剂的载体或载体组合中的液体形式的制剂或药物。
提取步骤
有利地，在本发明的第四方面的方法中，制备用于给药的药物不包括任何提取步骤，使得药物包括制剂的所有成分。如本文所用，术语“提取步骤”可指从包括所述生物制品的组合物中去除生物制品。去除步骤可包括物理分离(例如离心和/或过滤)和化学分离中的一个或多个(例如将生物制品溶解在组合物的其它组分难溶于其中的溶剂中和/或将所述其它组分溶解在一种或多种生物制品难溶于其中的溶剂中；这之后可以进行物理分离，例如上述过滤，和/或蒸发，例如旋转蒸发)。当生物制品在提取条件下不稳定时，特别是在生物制品是核酸或包括核酸(如mRNA)的情况下，提取可能有生物制品分解的风险。此外，本文所用的术语“重新配制(reformulation)”或“再配制(reformulate)”可指在生物制品从先前的组合物中提取后向其添加一种或多种赋形剂。
有利地，如本文所述，在本发明的所有方面中提供了制剂和药物，其省去了提取和重新配制步骤，或者可替换地仅省去了提取步骤。
递送系统
本发明第一至第六方面的递送系统通常包括生物相容性材料的颗粒，例如可水解的硅的颗粒，以及脂质组分，通常包括至少一种阳离子脂质或可电离脂质，以及任选的非还原性二糖，例如海藻糖。
生物相容性颗粒
递送系统包括具有生物相容性的固体材料颗粒。因此，这些颗粒对活体组织无害。有利地，颗粒也是可生物降解的，并且能够在体内分解成对活组织无害的降解产物。颗粒为固体颗粒，在低于60℃的温度下，优选在低于80℃的条件下不熔化或热降解。
可用于本发明的已知合适的生物相容性固体材料是金属颗粒、类金属颗粒，尤其是硅颗粒和石墨烯颗粒。金属纳米颗粒，特别是含有金和氧化铁的金属纳米颗粒，广泛用于医学诊断和治疗，并已被用作药物和疫苗的递送系统。
生物相容性固体颗粒可以包括硅，例如介孔硅颗粒。有利地，生物相容性颗粒可以是纯硅或另一种含有可水解的硅的材料。如果它们不是纯硅，则它们含有至少50重量％的硅，即基于颗粒中原子的总质量包括至少50重量％的硅原子。例如，硅颗粒可以包括至少60％、70％、80％、90％或95％的硅。硅颗粒优选显示水解速率，例如在室温的PBS缓冲液中，为相同尺寸的纯硅颗粒的水解速率的至少10％。含硅材料的水解测定在本领域中是众所周知的，参见例如WO2011/001456。应当理解，不包括50重量％的元素硅的二氧化硅(SiO2)纳米颗粒不属于硅纳米颗粒的定义范围。二氧化硅纳米颗粒也不可水解，因为在体内存在的条件下水解二氧化硅在热力学上是不利的。可水解的硅颗粒具有的优点是它们可以在体内降解为有益的原硅酸，例如当如WO 2011/012867中所述配制时。递送系统中的脂质组分和/或额外组分如氨基酸有利地充当一种或多种稳定剂，其在体内改变递送系统中硅的水解速率和/或抑制体内递送系统降解时原硅酸聚合的速率，如WO 2011/012867中所述。
根据本发明的所有方面，颗粒，包括那些包括可水解的硅的颗粒，可以是纳米颗粒。纳米颗粒的标称直径为5至300nm，例如8至200nm，例如10至150nm，例如15至100nm，例如18至80nm。上述标称直径可指平均直径，且颗粒样品中颗粒总质量的至少90％可在规定的尺寸范围内。颗粒尺寸可通过透射电子显微镜(TEM)确定或确认，例如使用NIST–NCL联合测定方案，PCC-X，版本1.1，“使用TEM测量纳米颗粒的尺寸(Measuring the size ofnanoparticles using TEM)”，修订于2010年2月：https://tsapps.nist.gov/ publication/get_pdf.cfm？pub_id＝854083。
优选对生物相容性颗粒进行蚀刻。如果颗粒被蚀刻，它们的总表面积将由于它们增加的孔隙率而增加。例如，表面积可以比相应的无孔颗粒的表面积增加至少50％或至少100％。在许多情况下，根据本发明所有方面的多孔颗粒实际上由于其孔隙率而具有更大的总表面积增加。包括可水解的硅的颗粒可以通过标准技术制成多孔的，例如使颗粒与氢氟酸(HF)/乙醇混合物接触并施加电流。通过改变HF浓度、电流密度和暴露时间，可以控制孔的密度及其尺寸，并且可以通过扫描电子显微摄影术和/或氮吸附-解吸体积等温线测量来监测。根据某些实施方式，孔隙率为至少30％、40％、50％或60％。这意味着，颗粒体积的30％、40％、50％或60％分别是孔隙空间。优选的孔径范围为1nm至50nm，例如5nm至25nm。优选颗粒是多孔的，更优选它们是介孔的。
本发明所有方面的颗粒可以方便地通过本领域的常规技术来制备，例如通过研磨工艺或通过其它已知的减小颗粒尺寸的技术。含硅颗粒可以由硅酸钠颗粒、胶体二氧化硅或硅晶片材料制成。宏观或微观尺度的颗粒在球磨机、行星式球磨机或其它尺寸减小机械装置中研磨。所得颗粒可以被空气分类或过筛以回收颗粒。也可以使用等离子体方法和激光烧蚀来产生颗粒。
脂质
本发明第一至第五方面的递送系统通常包括脂质组分。
在本技术领域中，脂质通常应理解为包括脂肪酸和脂肪酸衍生物、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂和聚酮。
如在本申请中所使用的，术语“脂质”也可涵盖脂化寡肽(其为在本文中与术语脂肽可互换使用的术语)，其中短肽序列(例如具有3至20个氨基酸残基，例如5至15个氨基酸残基，特别是3、4或5个氨基酸残基，最特别是5个氨基酸残基的肽序列)与一个或多个脂肪酸链(特别是具有10至24个碳链长度，优选12至18个碳链长度，例如14、15或16个碳链长度的脂肪酸链；例如，肽部分可任选地用棕榈酰基、鲸蜡基或肉豆蔻酰基部分脂化)缀合。
脂化寡肽可以任选地是脂化四肽、脂化五肽或脂化六肽。优选地，氨基酸残基包括至少一个(例如，2或3个氨基酸残基)在pH 7.4(生理pH)下为阳离子的氨基酸残基，例如赖氨酸或精氨酸。例如，脂化寡肽可以包括一个或多个(例如2个)赖氨酸残基。因此，一个特定的实例是棕榈酰-五肽-4(CAS编号214047-00-4；缩写为PAL-KTTKS)：
因此，在根据本发明所有方面的某些优选实施方式中，一种或多种脂质是或包括一种或多种脂化寡肽，特别是具有一个或多个在pH 7.4(生理pH；实例包括赖氨酸和精氨酸)时是阳离子的氨基酸残基的那些。
脂化寡肽可以与一种或多种磷脂如DOPE或DPPC组合使用。据认为，脂肽的烷基链可以有利地在磷脂双层中被同化，而双层的表面用肽部分修饰。据认为，通过这种方式，肽可以提供组织和/或细胞靶向性；并且，例如在肽在生理pH下带有阳离子电荷的情况下，可以稳定带负电荷的API，例如核酸，例如mRNA。
根据本发明的所有方面，脂质组分有利地包括阳离子脂质和/或可电离脂质。脂质组分可以额外包括辅助脂质，例如磷脂；结构脂质，例如基于胆固醇的脂质；和/或PEG-脂质。优选的脂质组分包括至少阳离子或可电离脂质和磷脂，以及任选的PEG-脂质和/或结构脂质，优选PEG脂质和结构脂质中的至少一种。
用于处理递送系统的可生物降解的生物相容性固体颗粒的表面的脂质类型可能影响其在体内的降解速率。例如，已经发现在包括硅颗粒的递送系统中存在至少一种脂质，以允许控制硅的水解速率，使得硅水解成生物可利用的原硅酸降解产物，而不是不溶性聚合物水解产物。还发现，用脂质对颗粒进行表面处理可以帮助递送系统摄取生物制品，例如核酸，和/或可以帮助控制生物制品从递送系统的释放速率。特别地，已经发现用脂质表面处理硅颗粒对硅颗粒的表面电荷具有有益的影响，为它们提供必要的ζ电位以允许提高siRNA(短干扰RNA)或mRNA(信使RNA)的负载，并控制负载分子在靶位点的释放速率。
根据本发明的所有方面，脂质组分的一种或多种脂质的平均分子量可以在300-1200道尔顿的范围内，例如500-1000道尔顿。
脂质组分可以是或包括阳离子脂质。术语“阳离子脂质”是指带正电荷的分子，其具有通过一些间隔物连接到疏水尾部的阳离子头基团。实例包括DTDTMA(二烷基三甲基铵)、DOTMA(2,3-二油氧基丙基-1-三甲基铵)、DHDTMA(十六烷基三甲基胺)、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)和SA(硬脂胺)。正电荷通常通过负反离子(例如氯离子)来稳定。脂质的负电荷也可以或进一步通过与固体生物相容性颗粒的材料结合，例如通过与可水解的硅结合来稳定。已发现阳离子脂质的存在可促进目的组织或器官中细胞的细胞内化。带正电荷的阳离子脂质促进了递送系统和生物制品的吸收，使得生物制品的核酸成分能够在目的组织或器官的细胞中转录，从而产生治疗效果。
脂质组分可以是或包括可电离脂质。术语“可电离脂质”是指具有能够带正电荷的基团的脂质，通常具有例如通过一些间隔物连接到疏水尾部的路易斯碱(氢受体)头基团。可电离脂质通常包括含有叔胺部分的头部。可电离脂质在生理pH下可以是中性的，但在较低的pH下，例如低于pH 6.5，例如作为内体逃逸的一部分在液泡内发现的pH，变成阳离子。例如，在Nano Lett.2020Mar 11；20(3):1578-1589中描述了可电离脂质。许多疫苗平台使用的脂质系统在生理pH下是中性的，然后只有当内吞到内体中并且pH降低到pH 6.2左右时才变成阳离子，然后变成阳离子的脂质允许内体逃逸。包括中性脂质的递送系统允许更多的颗粒从肌肉迁移到淋巴结，并被树突细胞吞噬。可电离脂质可通过与固体生物相容性颗粒的材料结合来稳定，例如通过与可水解的硅结合。
脂质组分可以包括作为辅助脂质的磷脂。术语“磷脂”是指包括脂肪酸链和磷酸基团的脂质。磷脂通常是中性分子，因为它们不带总电荷或可能带负电荷，而不像带正电荷的阳离子脂质。磷脂通常是两性离子化合物，包括带正电荷和带负电荷的组分，但没有总电荷。因此，磷脂通常被归类为中性脂质。特别合适的磷脂是甘油磷脂。特别合适的磷脂是其中极性头基团与季铵部分连接的那些，例如磷脂酰胆碱(PC)或氢化磷脂酰胆碱。磷脂的其它实例是融合性脂质，如DOPE(磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)。脂质的类型可以根据制剂的性质进行选择，中性或带负电荷的磷脂优选用于非质子制剂，而带正电荷的阳离子脂质和小CH3链脂质优选用于质子制剂。磷脂可以是卵磷脂，或者来源于卵磷脂。优选地，磷脂的侧链是具有15个或更多个碳原子的脂族侧链，或具有6个或更多重复醚单元的醚侧链，例如聚乙二醇或聚丙二醇链。
脂质组分可以附加地或替代地包括PEG脂质。具有聚醚侧链的脂质，可称为“PEG脂质”或“PEG酰化”脂质。PEG脂质可以是具有PEG侧链的磷脂，例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，例如DSPE-mPEG2000。
脂质组分可包括磷脂酰胆碱(PC)、氢化PC、硬脂胺(SA)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇基3β-N-(二甲基氨基乙基)氨基甲酸酯盐酸盐(DC)-胆固醇及其衍生物中的一种或多种。在某些实施方式中，脂质组分可基本上由磷脂酰胆碱、氢化磷脂酰胆碱、硬脂胺或其组合组成。
优选地，根据本发明的所有方面，在材料的任何进一步处理(即通过过滤或灭菌过程)之前，脂质(即总脂质成分)与硅的比率为0.5:1至45:1，例如0.8:1至20:1、1:1至16:1、1:1至12:1、1:1至11:1、1:1至10:1、1:1至9:1、1:1至8:1、1:1至13:1、2:1至12:1、2:1至11:1、2:1至10:1、2:1至9:1、2:1至8:1，例如1:1至7:1、2:1至7:1、3:1至6:1、4:1至5:1。已经发现，脂质组分与硅的摩尔比为0.8:1至20:1是特别有利的，例如16:1、12:1、8:1或2.5:1。有利地，这种脂质与硅的比率提供了一种多层囊泡系统，该系统能够控制与可水解的硅颗粒接触的核酸的释放并稳定核酸，并促进硅的生物可利用降解产物，即原硅酸的受控释放。
有利地，脂质组分可以对硅颗粒的表面电荷施加显著影响。当进行ζ电位分析时，包括用磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和卵磷脂处理的可水解的硅的颗粒显示出负表面电荷(范围从-60到-20mV，硅与脂质的比率为1:1至1:3)。用硬脂胺处理的颗粒表面显示出正ζ电位(范围从0到40mV，硅与脂质的比率为1:1至1:3)。脂质组分可以通过与固体生物相容性颗粒的材料结合来稳定，例如通过与可水解的硅结合。相反，固体生物相容性颗粒，可水解的硅颗粒，可以通过与脂质组分结合来稳定。
非还原性二糖
根据本发明的所有方面，在递送系统中任选地包括至少一种非还原性二糖。非还原性二糖可任选选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖或其任何混合物，最优选非还原性二糖为海藻糖或包括海藻糖的混合物。
当递送系统包括硅颗粒时，非还原性二糖(例如海藻糖或包括海藻糖的混合物)任选地以与硅的重量比为至少1000:1、至少100:1、至少50:1、至少10:1、至少1:1或至少0.5:1存在。优选地，非还原性二糖是海藻糖，其任选地以与硅的重量比为至少1000:1、至少100:1、至少50:1、至少10:1、至少1:1或至少0.5:1存在。
据推测，非还原性二糖，特别是海藻糖，可以作为脱水保护剂。非还原性二糖可以充当茧，将生物分子捕获在玻璃糖基质中，从而使蛋白质的运动受到糖基质的限制。海藻糖可能是特别有效的，这是由于其从一种结晶形态至另一种结晶形态之间传递，而不放松其结构完整性的能力和/或由于其与其它二糖如蔗糖相比特别高的玻璃化转变温度。此外，在无定形海藻糖中，存在晶体二水合物的局部口袋，这些口袋捕获残留的水分子，在缺水时将其固定。包括非还原性二糖如海藻糖的另一个优点是，非还原性二糖的存在有助于粉末材料的再悬浮。
氨基酸
根据本发明所有方面的递送系统可以包括一种或多种氨基酸的额外任选存在。
在最广泛的意义上，术语“氨基酸”包括任何含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)官能团的人工或天然存在的有机化合物。它包括α、β、γ和δ氨基酸。它包括任何手性构型的氨基酸。根据一些实施方式(例如，当本发明的纳米颗粒与PC、氢化PC、SA、DOPE、DC胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制时)，氨基酸优选为天然存在的α氨基酸。它可能是一种蛋白质氨基酸或非蛋白氨基酸(如肉碱、左甲状腺素、羟脯氨酸、鸟氨酸或瓜氨酸)。
在优选实施方式中，氨基酸包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸或甘氨酸或其混合物，特别是精氨酸和甘氨酸的混合物或甘氨酸和赖氨酸的混合物。优选地，氨基酸是精氨酸或甘氨酸或甘氨酸和精氨酸的组合或甘氨酸和赖氨酸的组合。在特别优选的实施方式中，氨基酸包括甘氨酸，或甘氨酸和赖氨酸的组合。这样的氨基酸可以起到稳定固体生物相容性颗粒的作用，特别是稳定诸如硅颗粒的可生物降解的生物相容性颗粒。氨基酸在储存和体内都有利地控制例如降低硅的水解速率。
当递送系统包括硅颗粒时，氨基酸(例如甘氨酸，或甘氨酸和赖氨酸的混合物)任选地以与硅的重量比为至少500:1、至少50:1、至少5:1、至少2.5:1、至少1:1、或至少0.5:1或0.05:1存在。优选地，氨基酸是甘氨酸，其任选地以与硅的重量比为至少500:1、至少50:1、至少5:1、至少2.5:1、至少1:1、或至少0.5:1或0.05:1存在。有利地，这种氨基酸与硅的比率进一步影响与颗粒相关的生物制品(例如RNA分子)的释放速率并使其稳定。
根据本发明的所有方面，递送系统有利地包括用脂质组分(例如，包括阳离子脂质)和氨基酸处理的生物相容性颗粒。递送系统可以另外包括非还原性二糖，例如海藻糖。
生物制品
根据本发明的所有方面，生物制品可以包括核酸、抗原或疫苗。核酸可以是DNA或RNA，特别是RNA或质粒DNA。RNA可以是例如mRNA或saRNA、shRNA或siRNA，尤其是mRNA疫苗。所述mRNA可以是能够在体内扩增的自扩增mRNA。已经发现本发明的方法和制剂在稳定特别容易降解的RNA方面特别有效，无论是在体外储存期间还是在向患者给药后的体内。核酸可以来源于生物源，例如体外转录核酸或质粒核酸。有利地，本发明的制剂保护来源于生物源的核酸(例如RNA)不被来自所述生物源的酶降解。因此，本发明第三方面的制剂可以保护生物来源的核酸在储存期间不被来自所述生物源的酶降解。同样，本发明第二方面的方法可以是保护来源于生物源的核酸不被来自所述生物源的酶降解的方法。根据本发明的生物制品的某些实施方式包括来自生物源的核酸(如mRNA)和源自该生物源的低但可测量水平的降解酶。
从最广义上讲，术语“siRNA”包括小干扰RNA(siRNA)，有时被称为短干扰RNA或沉默RNA，且包括长度为5至50个碱基对的双链RNA分子，并在RNA干扰(RNAi)途径中发挥作用。例如长度为10至45个碱基对、15至40个碱基对、20-30个碱基对，特别是20至25个碱基对。
术语“mRNA”包括信使RNA，并且可以任选地包括包括5-引物帽和/或聚腺苷酸末端的mRNA。或者，这两个特征中的一个可能不存在。在某些实施方式中，mRNA的长度可以是至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000个碱基对。
根据本发明所有方面的实施方式的RNA可以是天然存在的或化学修饰的，以增强其治疗特性，例如增强的活性、增加的血清稳定性、更少的脱靶点和更低的免疫激活。对RNA的化学修饰可以包括本领域公知的任何修饰。本发明的mRNA可以编码多种蛋白质。例如病毒抗原和佐剂蛋白或多种病毒抗原。
生物制品可以是抗原或编码抗原的mRNA，从而提供作为疫苗的制剂。抗原可以是病原体的抗原或病毒抗原，例如SARS-CoV-2的抗原，例如源自SARS-CoV-2的刺突蛋白的抗原。
根据本发明使用的核酸例如RNA包括双链和单链DNA、RNA、DNA:RNA杂交体以及PNA(肽核酸)或RNA或DNA之间的杂交体。这些术语还包括已知类型的修饰，例如本领域已知的标记，甲基化，“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、氨基甲酸酯等)，具有带负电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)和带正电荷的键(例如，氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷三酯)的那些，含有侧链(pendant)部分，例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的那些，具有包埋入物(例如吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些，含有烷基化剂的那些，具有修饰键(如α-异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。
应理解，如本文所用，术语“核苷”和“核苷酸”将包括那些不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基，而且含有已修饰的其它杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶或其它杂环。修饰的核苷或核苷酸也将包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素、脂族基团取代，或被官能化为醚、胺等。对核苷酸或多核苷酸的其它修饰包括重新排列、附加、取代或以其它方式改变嘌呤或嘧啶碱基上的官能团，这些嘌呤或嘧啶碱基与相应的互补嘧啶或嘌呤形成氢键，例如异鸟嘌呤、异半胱氨酸等。在一些实施方式中，寡核苷酸和/或探针包括至少一个、两个、三个或四个修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，核酸如本文公开的RNA包括一个或多个通用碱基。如本文所用，术语“通用碱基”是指可与选自A、U/T、C和G的一种以上核苷酸杂交的核苷酸类似物。在一些实施方式中，通用碱基可选自脱氧肌苷、3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、6-硝基吲哚、5-硝基吲哚。
含有siRNA的生物制品可以任选地包括通过生物系统外的化学合成合成制造的siRNA。这样的siRNA可以在不含核酸降解酶的情况下制造。然而，制造较长核酸如mRNA(例如用于疫苗制剂)的优选方式涉及使用生物系统。mRNA通常从该生物系统中纯化，以降低降解酶(例如RNA酶)的水平。可能很难完全消除所有的降解酶。这通常需要在低温下储存以将酶活性降至最低。然而，已经发现，根据本发明，用根据本发明的递送系统，特别是包括含有可水解的硅、脂质组分和非还原性二糖的颗粒的递送系统配制核酸(如mRNA)以形成复合物，然后将该复合物分散在可生物降解的凝胶基质中，可以增加mRNA在制剂中的储存寿命，可能取消、减轻或减少对低温储存的需要。
因此，本发明第二方面的方法包括保护生物制品(例如mRNA、saRNA、shRNA或siRNA)不因核酸制剂中存在的酶而降解的方法。优选地，与没有可水解含硅材料颗粒的等效组合物相比，室温(20℃)下的酶促降解减少至少一半，更优选减少至少5、10、35、50、100、500或1000倍。优选地，本发明制剂中的生物制品在4℃下具有至少3个月、至少6个月或至少12个月的半衰期。已经发现，通过本发明的方法制备的制剂在40℃下储存至少48小时时以及在室温(20℃)下储存至少8天时都不会降解。
生物制品-颗粒结合
生物制品和与其接触的递送系统有利地结合在一起形成复合体。通常，将生物制品负载到包括生物相容性固体颗粒(例如硅颗粒)的递送系统上，脂质组分(例如包括阳离子脂质和/或可电离脂质，优选与磷脂以及PEG脂质和/或者结构脂质一起)先前已任选地与非还原性二糖，特别是海藻糖和其它任选的组分如氨基酸一起负载到所述递送系统上。因此，生物制品与递送系统的接触通常形成包括生物相容性固体颗粒，特别是硅颗粒的复合物，该复合物负载有脂质组分、非还原性二糖和生物制品，以及任何额外的组分，例如氨基酸。
有利地，本发明所有方面的制剂中存在的至少80％，例如至少90％重量的核酸(例如siRNA或mRNA)或其它生物制品与递送系统的颗粒相结合。这意味着生物制品与生物相容性和可生物降解的颗粒非共价结合，例如核酸与硅颗粒非共价结合。据推测，当这种情况发生时，生物制品的随机运动减少，其被降解，例如通过制剂中存在的降解酶降解的机会减少。
硅颗粒的降解速率及其与生物制品结合的结束取决于颗粒中硅的水解。由于该速率可以被控制，核酸或其它生物制品(如siRNA、saRNA、shRNA或mRNA)变得可生物利用的速率也可以被控制以避免剂量倾倒和/或确保在适当长的时间内逐渐释放。
已经发现用氨基酸(例如，甘氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸中的一种或多种，优选甘氨酸或甘氨酸和赖氨酸的组合)处理脂质处理的可生物降解的生物相容性颗粒对生物制品如核酸(例如，mRNA、saRNA、shRNA或siRNA)提供有益的稳定作用。特别地，用氨基酸处理脂质处理的颗粒已被证明可以稳定生物流体中的生物制品，如RNA，例如眼组织中的RNA。以这种方式用氨基酸配制的脂质处理的颗粒特别适合递送至身体，例如通过经皮注射、玻璃体内注射和眼内植入进行递送。
为了帮助生物制品与递送系统的颗粒复合，递送系统可任选地进一步包括聚阳离子核酸结合组分。术语“聚阳离子核酸结合组分”在本领域中是众所周知的，并且是指具有至少3个重复的阳离子氨基酸残基或其它带有正电荷基团的阳离子单元的聚合物，这种聚合物能够在生理条件下与核酸复合。核酸结合聚阳离子分子的实例是包括一个或多个阳离子氨基酸的寡肽。这样的寡肽可以是，例如，寡赖氨酸分子、寡组氨酸分子、寡精氨酸分子，寡鸟氨酸分子、寡二氨基丙酸分子、或寡二氨基丁酸分子、或包括组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸二氨基丙酸和二氨基丁酸残基的任何组合或由其组成。聚阳离子组分的进一步实例包括树枝状聚合物和聚乙烯亚胺。
优选组合
根据本发明的所有方面，特别优选的实施方式涉及活性成分，该活性成分是核酸(特别是mRNA，特别是编码mRNA疫苗的抗原的mRNA)。在一些实施方式中，存在阳离子脂质，例如是或包括DOTAP的脂质。然而，已经发现DOTAP对于本制剂并不总是必需的，如下文实施例所示。因此，根据实施例，在特别优选的实施方式中，所述一种或多种脂质是或包括磷脂(如DPPC和/或DOPE)和具有一个或多个在pH 7.4(生理pH；实例包括赖氨酸和精氨酸)下是阳离子的氨基酸残基的脂化寡肽中的一种或多种。任选地还存在一种或多种糖(特别是海藻糖)和/或一种或多种氨基酸(特别是甘氨酸)。
或者，在其它优选实施方式中，一种或多种脂质是或包括一种或几种磷脂(如DPPC和/或DOPE)，并与一种或多种辅酶(如NAD)配制；一种或多种黄烷醇(例如槲皮素)和/或一种或多种氨基酸(例如酪氨酸)。任选地还存在一种或多种糖(特别是海藻糖)和/或一种或多种氨基酸(特别是甘氨酸)。
可生物降解的凝胶材料
IUPAC将“凝胶”定义为非流体胶体网络或聚合物网络，其通过液体膨胀到整个体积。凝胶通常是稀释的交联体系，其在由两种或多种组分(其中一种是大量存在的液体，另一种是被液体溶胀的交联聚合物基质)组成的稳态下不显示流动。网络连接点处的交联可以通过聚合物链之间的化学键提供，或者通过网络连接点上聚合物链的物理聚集提供。本发明的可生物降解的凝胶材料是对人体没有有害影响并且在体内降解为无害降解产物的凝胶。
在本发明的方法(即本发明的第一、第二、第四和第五方面的方法)的步骤(iii)中，将生物制品和递送系统分散在可生物降解的凝胶材料中。同样，本发明第三方面的制剂包括可生物降解的凝胶材料。本发明的第六方面的药物可以包括可生物降解的凝胶材料，或者可以包括可生物降解的凝胶材料的残留物。形成本发明第三方面制剂的可生物降解的凝胶基质的材料有利地存在于本发明第六方面的药物中，但不一定以凝胶形式存在。例如，形成可生物降解的凝胶的材料可以溶解在本发明第六方面的药物的液体介质中。有利地，在制备药物时不去除形成可生物降解的凝胶基质的材料。
凝胶材料通常是通过聚合物链的物理聚集形成的聚合物网络。聚集例如可以是氢键和/或结晶的结果，其导致局部有序区域充当网络连接点。膨胀的网络可以是热可逆凝胶，其中局部有序的区域是热可逆的。或者，凝胶材料可以是共价聚合物网络，例如通过交联聚合物链形成的网络。
凝胶可以是干凝胶的形式，其中液体溶胀剂，例如水，已经被去除以留下并打开交联聚合物的网络。由于这种干凝胶缺乏水，包埋入的递送系统和生物制品受到保护，不受涉及水的降解机制的影响。
凝胶可以是水凝胶，其中溶胀剂是水。水凝胶是固有的水合材料，聚合物网络通常只占总体积的一小部分。因此，与干材料相比，水凝胶的粘附主要依赖于水包围的稀疏和松散堆积的粘附结。水凝胶材料通常由亲水性聚合物形成，该亲水性聚合物能够吸收水而不溶解在水中。水凝胶材料能够吸收5％重量的水，典型地至少10％重量的水。水凝胶可以由物理或共价交联的天然、合成或半合成聚合物形成。天然来源的水凝胶包括：壳聚糖、海藻酸盐、纤维蛋白、明胶、纤维素和透明质酸基水凝胶。实例包括一些天然存在的淀粉，例如马铃薯淀粉。合成水凝胶包括聚乙二醇或聚乙烯醇聚合物基质。半合成水凝胶通常是官能化的天然水凝胶，如明胶甲基丙烯酰基水凝胶，其是由合成甲基丙烯酰基和羟丙基甲基纤维素(HPMC)“羟丙甲纤维素”官能化的明胶基聚合物。本发明中使用的水凝胶具有生物相容性和可生物降解性。优选的水凝胶包括基于透明质酸的水凝胶，例如透明质酸钠和纤维素(如羟丙甲纤维素)基水凝胶。
凝胶被认为可以保护包埋入的物质免受降解，至少部分原因是包埋入凝胶中的物质的两个官能团发现彼此并反应的能力降低。因此，已经发现甚至含有水的凝胶，即水凝胶，在稳定本发明的复合物方面是有效的，因为它们能够用凝胶基质固定物种，防止发生降解反应。
递送系统的固体颗粒(例如硅颗粒)之间的非共价相互作用被认为稳定了凝胶结构。特别地，已经发现通过包埋递送系统的固体颗粒来稳定非共价交联的凝胶结构。结果，凝胶结构保护包埋入的递送系统和生物制品免受降解，同时又被稳定。因此，已经发现本发明的可生物降解的基于凝胶的制剂有利于储存和保护生物免受降解，而无需渗透剂结合在凝胶基质内。此外，包括可生物降解的凝胶的储存稳定制剂可以用作药物，或用于制备药物，而无需提取生物制品。
制剂的制备
生物相容性和可生物降解材料的颗粒的制备
递送系统包括生物相容性固体材料的颗粒。生物相容性材料可以是金属、类金属材料，通常是金、碳管、石墨烯、二氧化硅、包括多孔金刚石、金、银和可水解的硅的多孔元素材料。
在优选实施方式中，固体生物相容性颗粒是可水解的硅颗粒。可水解的硅可以方便地通过本领域的常规技术制备，例如通过研磨工艺或通过其它已知的减小颗粒尺寸的技术。在某些实施方式中，含硅颗粒可以由硅酸钠颗粒、胶体二氧化硅或硅晶片材料制成。宏观或微观尺度的颗粒在球磨机、行星式球磨机、等离子体或激光烧蚀方法或其它尺寸减小机械装置中研磨。所得颗粒可以被空气分类以回收纳米颗粒。也可以使用等离子体方法和激光烧蚀来生产纳米颗粒。
多孔硅颗粒可以例如通过使用含水HF酸对硅晶片进行阳极蚀刻，然后将蚀刻的晶片破碎并筛分或空气分级以获得均匀的颗粒尺寸选择来制备。或者，可以制备或购买硅粉末，然后蚀刻以增加粉末的孔隙率。蚀刻可以使硅材料的表面积比同等尺寸的无孔材料的表面积增加至少1.5、2、2.5、3、3.5或4倍。通过改变HF浓度、电流密度和暴露时间，可以控制孔的密度及其尺寸，并且可以通过扫描电子显微摄影术和/或氮吸附-解吸体积等温线测量来监测。
根据某些实施方式，孔隙率为至少30％、40％、50％或60％。这意味着，孔隙空间中的颗粒体积分别为30％、40％、50％或60％。优选的孔径范围为1nm至50nm，例如5nm至25nm。
递送系统的形成
递送系统的另外的组分可以在与生物制品接触之前、颗粒与生物制品的接触同时或在颗粒与生物制品的接触之后负载到生物相容性和可生物降解材料的颗粒上。通常，非还原性二糖和氨基酸组分在与生物制品接触之前与颗粒结合。递送系统的脂质组分可以在颗粒与生物制品接触之前、同时或之后与颗粒结合。
可以通过将颗粒(例如多孔硅纳米颗粒)分散在挥发性醇溶剂(例如甲醇、乙醇或丙醇，例如甲醇)中以活化颗粒，然后与含有非还原性二糖(例如海藻糖)和氨基酸(例如甘氨酸)的水溶液混合来制备递送系统。或者，将溶剂从活化颗粒中去除，并将活化颗粒与非还原性二糖(例如海藻糖)和氨基酸(例如甘氨酸)一起分散在无核酸酶的水中。随后，将脂质作为溶液或分散体(例如在甲醇中)加入。可以任选地采用超声处理来增强分散性。所得分散体在高温(例如60℃)下在挤出膜上流动挤出。可以采用多个通道。挤出后，例如使用切向流过滤去除甲醇和潜在的其它杂质。
生物制品与递送系统的接触
在本发明的第一和第二方面的方法的步骤(i)以及本发明的第四和第五方面的某些实施方式中，使生物制品与递送系统接触。接触步骤可以仅涉及将生物制品的溶液与递送系统混合，例如在导致生物制品与递送系统复合的条件下。接触步骤可以包括在添加脂质组分之前使生物制品与生物相容性和可生物降解材料的颗粒接触。在生物制品与生物相容性和可生物降解材料的颗粒接触之后添加脂质组分可以促进在包封生物相容性和可生物降解的材料和生物制品的颗粒的表面上形成脂质包封层。通常将生物相容性和可生物降解材料的颗粒，例如多孔可水解的硅，与非还原性二糖、生物制品和任选的氨基酸混合，然后与脂质组分接触以形成脂质包封的颗粒，其中所述生物制品与脂质包封内的硅或其它生物相容性和可生物降解的材料相结合。
据推测，包括颗粒，特别是可水解的硅颗粒的递送系统通过限制生物制品的迁移率(分子运动)来增加生物制品，特别是核酸的稳定性。此外，当递送系统的附加组分例如脂质和肽与硅颗粒结合时，可以形成稳定的复合物，其中可水解的硅和递送系统的额外组分例如脂质和肽都被稳定。例如脂质，组分可以在硅颗粒周围形成脂质膜，该脂质膜既保护硅不被水解，又稳定脂质分子免受降解，还稳定生物制品，如与硅复合的RNA。带正电荷的物质，如阳离子脂质和其它带有正电荷的脂质组分，包括磷脂，被认为与硅结合，从而稳定正电荷组分的完整性。与包括油/水/表面活性剂相互作用的脂质体不同，在本发明的系统内不存在水分，该系统包括非囊泡结构中的脂质硅和其它有机分子，从而去除酶或自由基操作的水性环境。据信，用具有由硅颗粒和脂质组分形成的非囊泡结构包括生物制品从而保护生物制品免受降解。
固体材料可任选地方便地通过过滤器(该过程可称为“挤出”)或进行切向流过滤/灭菌过程，这取决于预期产品轮廓的性质。
冻干
在本发明的第一和第二方面的方法的步骤(ii)以及本发明的第四和第五方面的某些实施方式中，生物制品和递送系统被最佳地冻干，例如形成粉末。在随后的分散步骤(iii)中，冻干从生物制品和递送系统中去除水，并使干粉能够分散在高浓度的可生物降解的凝胶中，从而使水的存在最小化。还据推测，冻干步骤促进生物制品和递送系统的复合，例如，促进核酸和脂质组分与硅颗粒的结合。
生物制品和递送系统在可生物降解的凝胶中的分散
在本发明的第一和第二方面的方法的步骤(iii)以及本发明的第四和第五方面的某些实施方式中，将生物制品和递送系统分散在可生物降解的凝胶中。在可生物降解的凝胶中的分散通常包括制备可生物降解的凝胶材料的水性分散体，以及将生物制品和递送系统以水性分散液或固体粉末的形式引入到水性分散体内。优选地，生物制品和递送系统在接触后已经被冻干，并且作为粉末被引入到可生物降解的凝胶中。在生物制品和递送系统已经分散在可生物降解的凝胶的水性分散体中之后，所得分散体可以作为液体分散体存储或转化为固体或半固体凝胶，例如在任选地包括去除水的凝胶化步骤中。生物制品和递送系统有利地包埋入可生物降解的凝胶的基质中。包埋入可生物降解的凝胶中可以促进生物制品、脂质成分和任何可能促进降解的污染物(如酶)的固定，从而阻止降解。
药物
本发明的(任选地，口服或注射用)药物，例如本发明第六方面的药物，可以是液体或固体剂型。药物可以是注射用剂型的形式，包括与递送系统复合的生物制品以及能够形成分散在液体载体系统中的水凝胶基质的化合物。固体剂型包括那些用于口服给药的剂型，例如胶囊和片剂、栓剂、可溶性膜(例如用于舌下给药)和透皮给药贴片，例如使用多个微针进行注射的给药贴片。
本发明的制剂或药物可以在递送装置中提供，例如在注射装置例如注射器或多个微针中提供。
实施例
现在参照以下非限制性实施例来描述本发明的各个方面和实施方式。在实施例落在本发明的某些方面的范围之外的情况下，它们被包括作为比较例。
实验结果概述
将递送系统分散在类似胶水的可生物降解的凝胶基质中，并在40℃下连续暴露至少48小时，进行结合效率研究。特别是，在室温或40℃下储存后，对包埋入透明质酸钠(1％w/w)或羟丙甲纤维素(2％w/w)可生物降解的凝胶中的递送系统制剂SIS0012&MVI0010(硅)和SIS0013(掺硼硅)上负载的siRNA进行凝胶阻滞测定，并在指定时间点(0、2、4、6、24和48小时)通过凝胶电泳进行分析。用于这些实验的凝胶电泳系统由凝胶电泳装置、预制琼脂糖凝胶(1％，在凝胶内提供流动缓冲液和电极)和相机组成。将样品、对照(裸siRNA)和DNA梯状条带与所需量的负载缓冲液混合，使总体积为20μL。每个孔单元使用的RNA量为200ng/孔，这遵循琼脂糖凝胶测定的标准方案并且低于饱和量。
结果显示，即使样品连续暴露在40℃下48小时，递送系统SIS0012&MVI0010(含硅)和递送系统SIS0013(含掺硼硅)的核酸结合效力仍保持不变。观察到所有测试的递送系统制剂都能够与siRNA形成复合物，并完全停止其通过凝胶的迁移。此外，发现SIS0012-制剂和SIS0013-制剂在室温和40℃下均稳定长达48小时。
脂质官能化硅纳米颗粒(SiNP)递送系统的制备
将脂质组分溶于甲醇中。同时，将来自American Elements(CAS#7440-21-3，供应商代码SI-E-0181M-NP100N)的未掺杂硅或掺硼硅的直径为30nm的多孔二氧化硅纳米颗粒(SiNP)分散在甲醇中，随后在缓慢蒸发过程中蒸发溶剂以产生活化的SiNP。该活化步骤旨在使SiNP易于分散在水中。将活化的SiNP与甘氨酸和任选的海藻糖一起分散在无核酸酶水中。
在复合物SIS0012和SIS0013的制备中，使用活化的SiNP与甘氨酸和海藻糖一起在无核酸酶水中的分散体对脂质进行水合。分散体在挤出过滤器上挤出。在溶剂蒸发之后，收集脂质官能化的SiNP递送系统。
在MVI0010的制备中，将脂质溶解在甲醇中，然后将其缓慢注入SiNP与甘氨酸和海藻糖一起在无核酸酶水中的分散体中，然后使用3个循环的0.8μm、3个循环的0.4μm和3个循环的0.1μm进行切向流过滤。
表1中提供了递送系统SIS0012/MVI0010和SIS0013的组成。
表1–应用挤出前的递送系统组成
SIS0013中存在的掺硼硅的表征
单面抛光晶片，CZ
直径：150±0.2mm
晶向：(100)±1°
类型：p/硼
电阻率：0.014±25％ Ohmcm。接近5x10^18个原子/cm3。
主定位边：57.50±2.5mm
主定位边1位置：D<100>至{110}
厚度：675±15μm
TTV：<＝18μm
TIR：<＝5μm
在被粉碎成颗粒之前，膜的孔隙率约为40％，厚度可达50μm。
储备溶液的制备
a)Si-NP+GLY+THR：将50mg SiNP、50mg海藻糖和25mg甘氨酸悬浮在50ml无核酸酶水中并超声处理60分钟。
b)DOTAP-Cl：将50mg DOTAP溶解在10ml甲醇中并超声处理直至完全溶解。
c)DOPE：将60mg DOPE溶解在12ml甲醇中并超声处理直至完全溶解。
d)mPEG2000-DSPE：将40mg mPEG2000-DSPE溶解在8ml甲醇中并超声处理直至完全溶解。
膜制备
a)将表1中给出的量的脂质从储备溶液中转移至干净的玻璃圆底烧瓶中并混合。
b)在23℃和真空下使用旋转蒸发器使用水浴蒸发溶剂。
膜的再水合
a)向脂质膜中加入Si-NP+GLY(+THR)溶液，使脂质与SiNP的比率为16:1，并使用无核酸酶水将最终体积调节至10mL。
b)用封口膜覆盖烧瓶，并使膜再水合，在水浴(60℃)中搅拌烧瓶5分钟。
c)将1mL样品分在不含RNA的Eppendorf中，总共10个Eppendorf。将悬浮液储存在冰箱中。
挤出方法
a)在60℃下将脂质悬浮液通过孔径为0.4μm和0.1μm的膜过滤器20次。
实施例1
使用琼脂糖凝胶电泳评估不同温度下负载商业mRNA并包埋在透明质酸钠可生物 降解的凝胶中的制剂的稳定性
mRNA-递送系统复合物的制备
Dasher GFP mRNA储备溶液在无核酸酶水中的浓度为1mg/mL。使用等体积的无核酸酶水稀释该储备溶液以获得浓度为0.5mg/mL的工作溶液。
通过将50μL(25μg)的mRNA溶液与200μL的递送系统分散体混合(递送系统/RNA重量比：12:1)来制备mRNA-递送系统复合物。在室温将混合物孵育40分钟以允许完全复合，然后以液体形式使用或冻干并重新分散在250μL无核酸酶水中。然后将mRNA-递送系统复合物与等体积(250μL)的透明质酸钠水凝胶混合来包埋。为了制备对照，将液体形式或冻干和重构溶液的裸mRNA与等体积的透明质酸钠水凝胶(1％w/w)混合。同样使用具有相同浓度的裸mRNA溶液作为额外的对照。所有样品中mRNA的最终浓度为0.05μg/μL。将最终制剂分为30μL等分试样(用于每个分析时间点)，以最大限度地降低储存和分析过程中的交叉污染风险。所有样品和对照均储存在两种不同的温度下，即室温和设定为40℃的水浴中。每个孔单元使用的RNA量为200ng/孔，这遵循低于饱和量的琼脂糖凝胶测定的标准方案。与任何其它生物测定一样，凝胶电泳测定的性能可以在某种程度上取决于所使用的正确参数。核酸的分子量、正确缓冲液的选择和凝胶负载体积都是重要的。选择200ng/孔以确保凝胶既不负载不足也不过载。
琼脂糖凝胶电泳
在指定的时间点(0小时、6小时、24小时和48小时)，对mRNA-递送系统-可生物降解的凝胶制剂和对照进行凝胶电泳。DNA梯状条带(E-GelTM1Kb加上表达DNA梯状条带)也用作尺寸指导。将样品负载到E-GelTMPower Snap电泳装置中的E-GelTM琼脂糖凝胶(1％)上。对凝胶进行透照，并使用E-gelTMPower Snap电泳相机在3分钟和7分钟时成像。对于所有样品和对照，负载到凝胶上的mRNA总量为0.2μg/孔。
测试1：液体mRNA-递送系统复合物的稳定性
制备后不久以及在室温或40℃下储存长达48小时后，包埋在透明质酸钠水凝胶中的液体mRNA-递送系统制剂的琼脂糖凝胶电泳图像如图1和图2所示。图1提供了制备时和在室温(RT)或40℃下储存6小时后包埋在透明质酸钠(SH)水凝胶中的液体mRNA-递送系统制剂(3，4，6，7)的凝胶电泳图像。图2提供了在室温(RT)或40℃下储存24和48小时后包埋在透明质酸钠水凝胶中的液体mRNA-递送系统制剂(3，4，6，7)的凝胶电泳图像。使用裸mRNA(1，8)和包埋在水凝胶中的裸mRNA(2，5)作为对照。
如所观察到的，裸mRNA(1，8)和包埋在水凝胶中的mRNA(2，5)都迁移通过琼脂糖凝胶。此外，一些透明质酸与mRNA(2，5)共迁移，产生涂抹条带，而不是裸mRNA(1，8)观察到的尖锐条带。在40℃下保存的裸mRNA(8)在48小时后开始降解，如模糊和不清楚的条带所示。类似地，包埋在水凝胶中并在40℃下储存的mRNA(5)在48小时后显示出较弱的信号，表明mRNA有一定程度的降解。对于mRNA-递送系统-可生物降解的凝胶制剂(3，4，6，7)，透明质酸从孔泄漏到孔附近区域的琼脂糖凝胶中。然而，凝胶中的短行程表明可生物降解的凝胶中没有任何mRNA释放。
测试2：冻干和重构的mRNA-递送系统复合物的稳定性
在制备后不久以及在室温或40℃下储存长达48小时后，冻干和重构的包埋在透明质酸钠水凝胶中的mRNA-递送系统制剂的琼脂糖凝胶电泳图像如图3和图4所示。图3提供了制备时和在室温(RT)或40℃下储存6小时后冻干和重构的包埋在透明质酸钠(SH)水凝胶中的mRNA-递送系统制剂(3，4，6，7)的凝胶电泳图像。图4提供了在室温(RT)或40℃下储存24和48小时后，冻干和重构的包埋在透明质酸钠(SH)水凝胶中的mRNA-递送系统制剂(3，4，6，7)的凝胶电泳图像。裸mRNA(1，8)和冻干、重构的包埋在水凝胶中的mRNA(2，5)作为对照。
类似于对图1和图2的液体mRNA-递送系统制剂所观察到的，冻干和重构的包埋在水凝胶中的mRNA-递送系统制剂(3，4，6，7)阻止了mRNA通过琼脂糖凝胶的迁移，并在室温和40℃下稳定长达48小时，而冻干和重构的仅负载在水凝胶上的mRNA(2，5)通过凝胶，表明水凝胶和mRNA之间没有任何复合。从这些数据可以推断，mRNA-递送系统制剂(3，4，6，7)在冻干过程期间和之后是稳定的，并且不损害它们的结合或稳定性。
实施例2
使用琼脂糖凝胶电泳评估在室温或40℃下储存后负载在递送系统上并包埋在透 明质酸钠(2％w/w)水凝胶中的siRNA的稳定性
siRNA-递送系统复合物的制备
siGLOTMGreen储备溶液通过将50nMol(0.66mg)siRNA粉末溶解在1mL无核酸酶水中来制备。
透明质酸钠可生物降解的凝胶通过将粉末溶解在无核酸酶水中以产生2％w/w的浓度来制备。
siRNA-递送系统复合物通过混合4.5μL的siGLOTMGreen储备溶液(相当于3μgsiRNA)和23μL SIS0012、SIS0013和MVI0010递送系统溶液(即脂质与siRNA的重量比为12)，并在室温孵育以确保完全复合来制备。随后，将siGLO-递送系统复合物冻干过夜。然后将冻干粉溶解在3μL无核酸酶水中，并包埋在23μL透明质酸钠(SH)可生物降解的凝胶中。siGLO-MVI0010的制剂也在没有冻干和没有负载在可生物降解的凝胶上的情况下使用。
所有制剂均制备为25μL等分试样(用于每个分析时间点)，并在室温或设置为40℃的水浴中储存长达48小时，以通过凝胶电泳进行分析。用于凝胶阻滞测定的siGLO-递送系统可生物降解的凝胶制剂、裸siGLO和DNA梯状条带的量以及每孔siRNA/DNA的总量如表2所示：
表2
样品类型 样品的量(μL) NFW的量(μL) siRNA/DNA的量(μg/孔)
siGLO-SIS0012-SH 20 - 2.3
siGLO-SIS0013-SH 20 - 2.3
siGLO-MVI0010-SH 20 - 2.3
siGLO-MVI0010 20 - 2.2
裸siGLO 4 16 0.4
DNA梯状条带 2 18 0.2
琼脂糖凝胶电泳
在指定的时间点(0、6、24和48小时)，使用E-gelTMPower Snap电泳装置和E-GelTM琼脂糖(1％)凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分析样品。将样品、裸siGLO和DNA梯状条带以20μL/孔的体积负载在凝胶上。根据表1，在离子负载琼脂糖凝胶之前，用无核酸酶水(NFW)稀释裸siRNA和DNA梯状条带，但使用的制剂没有任何稀释。使用E-gelTMPower Snap电泳相机在3分钟和7分钟后对凝胶进行成像。
测试3：冻干和重构的siRNA-递送系统复合物的稳定性
在室温或40℃下储存的siRNA-递送系统可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像如图5和图6所示。
可以观察到，所有制剂都有效地使siRNA复合，并阻止其通过凝胶迁移。复合物在室温和40℃下稳定6小时，如没有任何siRNA通过凝胶所表明。然而，24小时后，在40℃下储存的液体形式的MVI0010制剂(9)向凝胶中释放了大量的siRNA，这表明该制剂在高温下缺乏稳定性。另一方面，对于包埋在可生物降解的凝胶中的siRNA-SIS0012和SIS0013制剂(6，7)，在40℃下储存48小时后，仅观察到少量的siRNA通过凝胶，与SIS0012-可生物降解的凝胶(6)和MVI0010-可生物降解的凝胶(8)制剂相比，SIS0013-可生物降解的凝胶制剂(7)的siRNA含量略高。从这些数据可以推断，包埋在透明质酸钠可生物降解的凝胶中的siRNA-递送系统制剂在室温(2，3，4)和40℃(6，7，8)下均稳定48小时，而液体形式的siRNA-MVI0010制剂(5，9)仅在室温(5)稳定，并且在40℃(9)下从24小时开始释放siRNA。这些发现表明可生物降解的凝胶基质在稳定siRNA-递送系统复合物中的作用，特别是在更高的温度下。
结论
将siRNA-递送系统复合物与高浓度透明质酸钠水凝胶混合，在室温和40℃下稳定48小时。未与水凝胶混合的siRNA-MVI0010复合物(5，9)在室温(5)稳定48小时，但在40℃(9)下稳定不到24小时，这表明透明质酸钠水凝胶在稳定siRNA-MVI0010复合物中的作用。
实施例3
使用琼脂糖凝胶电泳评估在室温或40℃下储存后包埋在透明质酸钠(2％w/w)或 羟丙甲纤维素(4％w/w)水凝胶中的递送系统制剂SIS0012和SIS0013上负载的siRNA的稳定 性。
siRNA-递送系统-可生物降解的凝胶制剂的制备
根据表1通过将siRNA粉末溶解在无核酸酶的DI水中来制备ADO2-siRNA(具有dTdT外伸)和siGLOTMGreen储备溶液。将250nMol(33.33mg)ADO2 siRNA溶于0.5mL水中，得到6.66mg/mL溶液，并用水进一步稀释至1μg/μL或66.5ng/μL溶液。将50nMol(0.66mg)siGLOTMGreen siRNA溶于1mL水中，得到0.66mg/mL溶液，然后用水进一步稀释至66.5ng/μL溶液。
透明质酸钠和羟丙甲纤维素水凝胶通过将粉末溶解在无核酸酶水中以分别得到2％和4％w/w的浓度来制备。
制备siRNA-递送系统-水凝胶制剂，使脂质/siRNA重量比恒定为12。表3中提供了用于制备不同制剂的siRNA、递送系统和水凝胶的量。制剂以小的等分试样制备(对于含有ADO2 siRNA和siGLOTMGreen的制剂分别为32-33μL)，并在室温或40℃的水浴中储存48小时。
表3
琼脂糖凝胶电泳
在指定的时间点(0、2、4、6、24和48小时)，通过琼脂糖凝胶电泳分析制剂。用于这些实验的凝胶电泳系统由凝胶电泳装置、预制琼脂糖凝胶(1％，在凝胶内提供流动缓冲液和电极)和相机组成。在负载到凝胶上之前，根据表8，将样品、对照(裸siRNA)和DNA梯状条带与所需量的凝胶负载缓冲液混合，使总体积为20μL。随后，将凝胶插入装置室，负载样品、对照和DNA梯状条带，并运行7分钟。将凝胶透照并使用相机在3分钟和7分钟时成像。
表4
样品类型 样品的量(μL) 负载缓冲液的量(μL) siRNA的量(μg/孔)
ADO2-SIS0012-SH 10 10 0.62
ADO2-SIS0012-HY 10 10 0.62
ADO2-SIS0013-SH 10 10 0.62
ADO2-SIS0013-HY 10 10 0.62
siGLO-SIS0012-SH 10 10 0.61
siGLO-SIS0012-HY 10 10 0.61
siGLO-SIS0013-SH 10 10 0.61
siGLO-SIS0013-HY 10 10 0.61
ADO2-SIS0012 10 10 1.2
ADO2-SIS0013 10 10 1.2
siGLO-SIS0012 10 10 1.1
siGLO-SIS0013 10 10 1.1
ADO2-SH 10 10 0.62
ADO2-HY 10 10 0.62
siGLO-SH 10 10 0.61
siGLO-HY 10 10 0.61
裸ADO2 3 17 0.2
裸siGLO 3 17 0.2
DNA梯状条带 2 18 0.2
测试4：负载siRNA的SIS0012制剂的稳定性
负载ADO2-siRNA或siGLOTMgreen并在室温下储存的SIS0012-可生物降解的凝胶制剂的凝胶电泳图像如图7至图9所示。可以观察到，所有制剂都使负载的siRNA复合，并停止其通过凝胶的迁移，而不管组分(即递送系统、可生物降解的凝胶和siRNA)的组合顺序如何。相反，在没有任何递送系统的情况下负载到可生物降解的凝胶上的siRNA(用作阴性对照)通过凝胶，表明siRNA和可生物降解的凝胶之间没有任何结合。
然而，仔细观察图像会发现，在siRNA首先与透明质酸钠混合，然后与SIS0012结合的制剂中，复合并不完全，一小部分siRNA通过凝胶。这被认为是由于透明质酸钠可生物降解的凝胶的高粘度导致siRNA在可生物降解的凝胶中的不均匀分散引起的。结果，在加入递送系统时，siRNA不能与递送系统完全混合，并且未复合的剩余siRNA将通过凝胶。这一观察结果表明，为了有效地复合siRNA，在加入siRNA之前，递送系统应与可生物降解的凝胶混合，或者递送系统应和siRNA混合，然后包埋在可生物降解的凝胶中。在室温下储存48小时后，该特定制剂的siRNA条带的强度显著降低，这表明游离/未结合的siRNA降解。
从图像中可以推断，ADO-2 siRNA和siGLOTMgreen之间在复合和稳定性方面没有差异。还值得注意的是，这两种类型的可生物降解的凝胶在将未结合的siRNA释放到琼脂糖凝胶方面表现不同。从羟丙甲纤维素释放的siRNA似乎具有较小数量的片段，而从透明质酸钠释放的siRNA则表现为具有不同大小的片段的混合物。此外，据推测，由于其负电荷，一定比率的透明质酸也可能与siRNA一起迁移通过凝胶。
在40℃下储存的SIS0012-可生物降解的凝胶-siRNA制剂的凝胶阻滞图像如图10至图12所示。可以观察到，在40℃下储存的SIS0012-可生物降解的凝胶-siRNA制剂的表现与在室温下储存的制剂相似。类似地，在siRNA首先与透明质酸钠混合，然后与SIS0012结合的制剂中，一部分siRNA通过凝胶，表明由于siRNA在可生物降解的凝胶内没有均匀分散，导致缺乏有效的复合作用。然而，4小时后该制剂缺乏siRNA条带表明在40℃下未结合的siRNA降解更快。
测试5：负载siRNA的SIS0013制剂的稳定性
负载ADO-2siRNA或siGLOTMGreen并在室温下储存的SIS0013可生物降解的凝胶制剂的凝胶阻滞图像如图13至图15所示。从这些图中可以明显看出，类似于对siRNA-SIS0012-透明质酸盐制剂所观察到的，对于siRNA-SIS0013-透明质酸盐制剂，在与递送系统混合之前将siRNA包埋在可生物降解的凝胶内也导致低效的复合。与对SIS0012观察到的相比，siRNA条带的更高强度表明由于siRNA在可生物降解的凝胶内的分散性差，未结合的siRNA的比率更大。这一观察结果进一步证实了前面提到的推论，即为了有效地复合siRNA，应首先将siRNA与递送系统混合，然后包埋在可生物降解的凝胶中，或者应将siRNA添加到递送系统和可生物降解的凝胶的均匀混合物中。再次，对于该制剂，4-6小时后观察到的siRNA条带的强度降低，24小时后条带的清除表明未结合的siRNA随着时间的推移而降解。
负载ADO2 siRNA或siGLOTMGreen并在40℃下储存的SIS0013-可生物降解的凝胶制剂的凝胶阻滞图像如图16至图18所示。以与在室温下储存的样品类似的方式，除了siRNA首先包埋入透明质酸可生物降解的凝胶中，然后与递送系统结合的制剂外，所有制剂都表现出稳定48小时，表现为缺乏siRNA迁移。4小时后与该制剂相关的siRNA信号减弱表明未结合的siRNA在40℃下快速降解。
观察
以脂质/siRNA重量比为12将siRNA负载到与1-2％的透明质酸钠或2-4％的羟丙甲纤维素可生物降解的凝胶混合的SIS0012和SIS0013递送系统制剂上导致siRNA的完全复合，这表明该比率是复合的最佳比率。制剂在室温和40℃下均稳定48小时。为了使siRNA与递送系统有效混合和复合，建议在将siRNA包埋入可生物降解的凝胶之前将其与递送系统混合，或者在添加siRNA之前将递送系统与可生物降解的凝胶混合。这种方法将确保siRNA在混合物中的均匀分散，这将允许siRNA与递送系统完全复合。就与递送系统的复合作用而言，ADO-2 siRNA和siGLOTMgreen之间没有差异，表明siGLOTMgreen可作为ADO-2 siRNA的替代品，用于复合和通过凝胶电泳进行稳定性测定。
实施例4
进行该实验是为了在不同温度(4℃、RT和40℃)下，使用故意过载条件的琼脂糖凝胶电泳，提供siRNA本身或与包埋在凝胶中的Bio-Courier递送系统复合的稳定性数据的验证。
为了再次确认在先前的研究(实施例1、2和3)中缺乏可检测的siRNA条带不是由于RNA对琼脂糖凝胶孔的负载不足或孔边缘上的RNA降解引起的，琼脂糖凝胶孔单元故意过载为2.6μg/孔的siRNA量。
将siGLO以液体和冻干的形式负载到不同的Biocourier制剂上。使用琼脂糖凝胶电泳在不同的储存温度下检测包埋在水凝胶中的siGLO-Biocourier复合物。
每个孔单元都用siRNA本身或与Bio-Courier递送系统复合的siRNA过载。
该实验的目的是确定与生物制品本身复合和/或包埋在凝胶中的Bio-Courier递送系统的siRNA剪切条带或涂抹条带的缺失(与实施例1、2和3相关的实验)是否不是由于siRNA的低水平检测或生物制品在孔内的最终降解，而是归因于与生物制品复合并包埋在可生物降解的凝胶中的固体颗粒系统的存在所提供的结合的有效性。
siRNA-递送系统复合物的制备
通过将递送系统溶液与siRNA溶液(0.66mg/mL)以12:1的重量比混合来制备siRNA-递送系统制剂。将混合物在室温下孵育40分钟以允许完全复合，然后以液体形式使用或冻干过夜然后再悬浮在无核酸酶水中。对于负载在水凝胶上的样品，将冻干的粉末直接添加到水凝胶中。将样品分成30μL等分试样，并在不同温度(室温、4℃和40℃)下储存。在表5中提供的指定时间点，通过凝胶电泳对样品进行分析。
表5
琼脂糖凝胶电泳
使用E-GelTMPower Snap电泳装置中的E-GelTM琼脂糖凝胶(1％)通过琼脂糖凝胶电泳分析siGLO-递送系统复合物。在所有情况下使用在类似条件下储存的裸siGLO作为对照。将20μL的每个样品(总共含有2.6μg的siGLO)负载到琼脂糖凝胶上。对于对照(裸siGLO)和DNA梯状条带，在负载到琼脂糖凝胶上之前，将2μL浓缩溶液用18μL无核酸酶水稀释。对凝胶进行透照，并使用E-GelTMPower Snap电泳相机在3分钟和7分钟时成像。
测试5.当琼脂糖凝胶充分过载siRNA时，在不同温度下验证siRNA-递送系统复合物。
制备后不久的siGLO-递送系统复合物的凝胶电泳图像如图19-26所示。对于冻干制剂，观察到完全复合，并且没有游离的siGLO通过凝胶，而对于液体制剂，一些微量的siGLO通过凝胶，表明存在一些未结合的siGLO。然而，与制剂上负载的大量siGLO相比，未结合的siGLO的量是微不足道的。
在所有孔的边缘上存在强信号表明在任何siGLO-递送系统复合物中都缺乏siGLO降解，并且在冷藏和室温条件下制剂的稳定性直到28天。唯一没有停留在琼脂糖凝胶梯状条带边缘的条带是我们的对照组，siRNA游离形式/siGLO，如先前观察到的那样，它在琼脂糖凝胶中行进。用作对照的裸siGLO的条带的强度是非常密集和尖锐的条带，并且可以很好地检测到，这证实了该系统正在工作，并且能够显示siRNA-复合物药物递送是否存在任何解结合(unbinding)。重要的是要记住，由于琼脂糖凝胶上负载了非常大量的siGLO，这产生非常强的信号，因此不可能检测到由裸siGLO的部分降解引起的信号的微小减少，如在实施例1、2和3中观察到的，其中凝胶测定是在非饱和条件下进行的。
当制剂暴露于40℃，它们也被证明在长达7天内是稳定的，并且在孔的边缘中存在强信号表明缺乏siGLO降解。然而，28天后，在孔的边缘不再观察到来自siGLO-GEN AVE1001的信号，这表明siGLO降解，而siGLO-MVI0015直到28天后仍显示出相当强的信号。
观察和一般性评论
已经使用琼脂糖凝胶电泳测定证明了通过掺入包括生物相容性硅颗粒的递送系统(“Biocourier”)来稳定核酸、mRNA和siRNA。RNA与复合物的结合在不同温度下保持稳定，表明复合物是稳定的，不随着时间的推移而失去结合。将RNA-Biocourier复合物包埋在水凝胶中进一步提高了RNA的稳定性，这提供了在无需冷藏的情况下使用RNA的潜力。用siRNA自身或与Biocourier复合的siRNA充分过载琼脂糖凝胶证实了在水凝胶中获得的RNA-Biocourier复合物的稳定数据的有效性。当在饱和条件下使用琼脂糖凝胶阻滞测定法，即超负载凝胶孔时，如先前在实验1、2和3中报道的，同样没有观察到明显的剪切条带或涂抹条带。在饱和条件下没有明显的剪切或条带既不是由于siRNA的降解，也不是由于凝胶孔中复合的生物制品的量不足而导致siRNA缺乏可检测性，而是由于Biocourier递送系统提供的结合的有效性以及该系统在可生物降解的凝胶中的包埋。结合的有效性通过孔边缘的条带的强度来说明，其类似于迁移到琼脂糖凝胶孔的饱和裸siRNA对照的强度。
实施例5-与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphilococcus aureus)(MRSA)相关的研究
制备下表中列出的制剂，其具有作为API的肽：
为了制备该制剂，将脂质组分溶解在甲醇中。同时，将直径为30nm的多孔硅纳米颗粒(SiNP)(获得自American Elements，CAS#7440-21-3，供应商代码SI-E-0181M-NP100N)分散在甲醇中，随后在缓慢蒸发过程中蒸发溶剂以产生活化的SiNP。该活化步骤旨在使SiNP易于分散在水中。活化的SiNP与甘氨酸和精氨酸以及肽API一起分散在无核酸酶的水中。
在溶剂蒸发后，用官能化SiNP的水性分散体将脂质薄膜水合。然后将递送系统分散在水凝胶中，其细节如下所述。将制备好的样品冷藏直至进一步分析。
·制剂负载有0.11％；0.33％或1％w/w的肽
·包埋在1％羟丙甲纤维素水凝胶凝胶C中：羟丙甲纤维素0.5％+聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(pluronic)0.5％
体内分析—应用于人体皮肤
用10μl 1x107 MRSA/ml悬浮液接种人类志愿者的皮肤。在37℃和5％CO2下，与50μl体积中的以下之一孵育1小时后，施用到接种皮肤上：
·仅在羟丙甲纤维素凝胶中的肽(以不同浓度，见图27)；
·与本发明含硅制剂结合的肽(以不同浓度，见图27)，和羟丙甲纤维素凝胶；
·无肽(对照)
再孵育额外的1小时后，可存活细菌的数量在微生物学上测定。结果以菌落形成单位(CFU)表示。这些结果如图27所示。
进一步的体内分析—应用于小鼠鼻腔支架(carriage)
体内MRSA-生物膜小鼠鼻腔支架模型用于测试选定的制剂，即B1PS-肽和C1-PS肽，旨在减少鼻腔中的MRSA细菌负荷。所提出的制剂旨在将肽稳定在鼻腔pH值和温度下，所述稳定作用改善了其对抗MRSA的活性。如图28所示，该制剂在降低MRSA细菌计数>90％方面表现出增强的性能。以下提供了所用制剂的详细信息。
·凝胶B1-肽：负载有1％与上述含硅制剂结合的肽的制剂，包埋在1％羟丙甲纤维素水凝胶中
·凝胶C1-肽：负载有1％与上述含硅制剂结合的肽的制剂，包埋在羟丙甲纤维素0.5％+聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物0.5％中
·凝胶-肽：1％浓度的肽，包埋在1％羟丙甲纤维素水凝胶中
·肽-PBS：1％浓度的肽，包埋在1％羟丙甲纤维素水凝胶中
实施例6–其它含硅制剂与mRNA或siRNA的复合
研究了替代阳离子脂质的替代品，如SIS0012和SIS0013中使用的DOTAP。
一种这样的替代品是脂肽。这些是由与肽序列(通常为3-20个氨基酸残基)缀合的脂链(通常为12-18个碳原子长)组成的两亲物。这种脂肽的一个具体实例是棕榈酰五肽-4(缩写为PAL-KTTKS)：
认为PAL-KTTKS是阳离子脂质替代品的良好候选物，因为它的阳离子赖氨酸残基有助于与带负电荷的RNA结合。
用SIS0012和SIS0013研究的其它候选物包括NAD、酪氨酸(TYR)和槲皮素(QUE)。借助这些配体，据认为可以增强器官特异性的RNA摄取，并且可以改善细胞内化和靶向。此外，它们可以帮助提供带正电荷的环境以结合带负电荷的RNA。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种辅酶。在其氧化形式NAD+下，它具有以下结构：
酪氨酸是一种天然存在的氨基酸，在生理pH(pH 7.4)下具有以下结构：
槲皮素是一种黄烷醇，具有以下结构：
NAD、TYR和QUE–对添加到或替换SIS0012和SIS0013中DOTAP的研究
通过将如上所述(即，除了DOTAP之外)0.2mg NAD、TYR和QUE添加到常用组合物中来制备修饰的SIS0012和SIS0013组合物。然后评估与siRNA的复合作用。图29显示凝胶电泳结果，表明siRNA在这些制剂中成功且完全结合。
还使用Zetasizer(可从Malvern Instruments获得)进行动态光散射测量，以在siRNA复合物形成之前和之后评估尺寸和电荷，如下表所示。如表所示，siRNA复合后观察到尺寸增加，同时表面电荷下降10-15mV。
然后研究用NAD、TYR或QUE替代DOTAP(而不是简单地将NAD、TYR或QUE添加到含有DOTAP的组合物中)。
在这项研究中，DPPC和DOPE被选择与NAD、TYR或QUE一起使用，因为DPPC和DOPE是两性离子脂质，在中性pH下对表面电荷没有显著作用。
因此，DPPC/DOPE制剂是用(i)0.2mg和(ii)1mg NAD、TYR和QUE制备的。制剂如下表所示。
表-用β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)功能化的DPPC/DOPE LNP Biocourier的组成。
表-用槲皮素(QUE)功能化的DPPC/DOPE LNP Biocourier的组成。
表-用酪氨酸(TYR)功能化的DPPC/DOPE LNP Biocourier SIS0012的组成
获得Zetasizer测量结果，显示所有制剂的负ζ电位，与NAD、TYR或QUE的量无关；如下表所示。
表-用0.2mg和1mg NAD、TYR和QUE功能化的DPPC/DOPE LNP。
样品 尺寸 PDI ζ-空
DPPC/DOPE-NAD-0.2mg 78.46±2.65 0.18±0.04 -20.76±0.68
DPPC/DOPE-NAD-1mg 88.46±1.22 0.16±0.05 -25.75±0.57
DPPC/DOPE-QUE-0.2mg 86.0±0.63 0.17±0.02 -25.81±0.82
DPPC/DOPE-QUE-1mg 78.35±2.19 0.18±0.02 -20.2±1.43
DPPC/DOPE-TYR-0.2mg 84.16±2.33 0.19±0.03 -24.99±0.44
DPPC/DOPE-TYR-1mg 83.21±2.57 0.16±0.03 -18.81±0.46
脂肽-替代SIS0012和SIS0013中DOTAP的研究
脂肽也被称为肽两亲物(PA)，探讨其作为DOTAP的另一种替代品。
据认为，脂肽可以为转染组合物中替代阳离子脂质如DOTAP或减少其量的问题提供解决方案。脂肽由与肽序列缀合的烷基链组成。据认为它们的烷基链可能在脂质双层中被同化，而双层的表面被肽部分修饰。
示例性PA是分子棕榈酰五肽-4(缩写为PAL-KTTKS，见上文)。这两个阳离子赖氨酸残基可以执行与如DOTAP的阳离子脂质类似的功能，表现出与带负电荷的RNA的静电相互作用。
选择DPPC和DOPE作为中性脂质与PAL-KTTKS配制。用不同的硅纳米颗粒或完全不含硅；并用pH 4缓冲液(以研究pH的影响)来制备各种制剂。
下表提供了含有DPPC、DOPE和PAL-KTTKS的制剂的全部细节。
表-DPPC、DOPE和Pal-KTTKS与硅纳米颗粒、掺硼硅和硼酸/硅纳米颗粒的各种制剂组成。没有硅纳米颗粒的制剂对应物也被配制为对照。所有制剂的最终体积均为10ml。
所有8种制剂都具有带正电荷的表面，下表提供了ζ电位(用可从MalvernInstruments获得的Zetasizer测量)。
基于这些结果，认为在脂质膜的组装期间，PAL-KTKS自身排列在脂质双层中，肽部分暴露在纳米颗粒表面上。此外，该表面上的赖氨酸残基有助于形成带正电荷的制剂。
表-所有8种DPPC/DOPE/PAL-KTTKS制剂的ζ电位测量值。
样品 ζ-空
1-KTTKS-BC 60.09±0.84
2-KTTKS-BC 48.48±2.54
3-KTTKS-BC 37.24±0.63
4-KTTKS-BC 54.38±2.11
5-KTTKS-BC 55.43±1.11
6-KTTKS-BC pH 4缓冲液 59.44±0.81
7-KTTKS-BC pH 4缓冲液 55.51±0.39
8-KTTKS-BC(无核酸酶水) 53.11±0.39
评估所有制剂与siRNA和mRNA静电结合的能力。
进行凝胶电泳分析。没有观察到siRNA的完全复合。然而，观察到mRNA完全复合。图30显示siRNA的凝胶电泳结果；图31显示mRNA的凝胶电泳结果。
为了解决siRNA与DPPC/DOPE/PAL-KTTKS的部分复合问题，采用了另一种负载方法。图32显示使用替代负载方法后复合物的凝胶电泳，表明siRNA的成功完全复合。(图32泳道3中的亮点是成像装置的伪影。)
在替代负载方法中，与上述方案相比，采用了以下步骤：
1.通过将DPPC、DOPE和Pal-KTTKS溶解在甲醇中并使用旋转蒸发器蒸发来制备薄脂质膜。
2.用含有活化的硅(SIS0012)或活化的掺硼硅(SIS0013)与海藻糖和甘氨酸以及siRNA或mRNA的悬浮液再水合脂质膜。在40℃下再水合10分钟，以确保圆底旋转蒸发烧瓶的壁上没有脂质硅膜残留。
脂肽是高度通用的分子；可以通过改变它们的烷基链和/或它们的肽序列对它们进行微调。据认为肽的定制可以增强细胞和/或组织的靶向性。在基因疗法领域，肽的定制可以增强与核酸(如RNA，特别是mRNA)的静电相互作用。例如，当与DPPC和DOPE配制时，PAL-KTKS产生带正电荷的表面，如ζ电位所证实。
脂肽是两亲性分子，具有与表面活性剂非常相似的性质，可以自组装形成胶束；据认为，这至少部分是由于烷基链易于疏水相互作用，而肽序列可以形成分子间氢键。磷脂，如DPPC和DOPE，也能够自组装成脂质体。因此，当掺入PA时，其中PAL-KTTKS是代表性实例(尽管也可以使用其它脂肽)，烷基链能够与DPPC和DOPE形成疏水性相互作用，从而产生脂质体结构。
同时，硅纳米颗粒为整个复合物提供了结构稳定性，并能够通过非共价(静电)相互作用与脂质和其它配体(如脂肽、NAD、QUE或TYR)相互作用，从而促进核酸的长期稳定性和结合。

Claims (24)

1.一种制备储存稳定的注射用或口服制剂的方法，其包括：
(i)使生物制品与包括生物相容性固体颗粒的递送系统接触以形成复合物；然后
(ii)任选地，将所述复合物冻干以形成粉末；并且然后
(iii)将所述复合物分散在可生物降解的凝胶材料中以形成所述制剂，其包括包埋在所述可生物降解的凝胶材料中的所述复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述递送系统还包括：脂质组分，其包括阳离子脂质和/或可电离脂质；和任选的非还原性二糖。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物相容性固体颗粒包括可水解的硅。
4.一种储存稳定的注射用或口服制剂，其包括可生物降解的凝胶材料，其中包埋有与递送系统复合的生物制品，所述递送系统包括生物相容性固体颗粒、包括阳离子脂质和/或可电离脂质的脂质组分、以及任选的非还原性二糖。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述生物相容性固体颗粒包括可水解的硅。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的制剂，其根据权利要求2或权利要求3所述的方法获得。
7.一种制备用于口服给药或通过注射给药的包括生物制品的药物的方法，所述方法包括：
(i)根据权利要求1-3中任一项所述的方法制备制剂，或提供根据权利要求4-6中任一项所述的制剂；然后
(ii)任选地，储存所述制剂；并且然后
(iii)制备用于口服给药或通过注射给药的包括所述生物制品和递送系统的所述药物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中制备所述药物的步骤(iii)不包括任何提取步骤，使得所述药物包括所述制剂的所有成分。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中在储存所述制剂的步骤(ii)中，在高于4℃的温度下将所述制剂储存至少3个月；或根据权利要求4-6中任一项所述的制剂，其中所述制剂中的所述生物制品在4℃下的半衰期为至少3个月。
10.一种口服或注射用药物，其由权利要求7-9中任一项所述的方法获得，
所述药物包括：与递送系统复合的生物制品，其中所述复合物包埋在可生物降解的凝胶材料中；或
所述药物包括：生物制品和递送系统的复合物，以及能够形成分散在载体系统中的可生物降解的凝胶的基质的化合物，
其中所述递送系统包括可水解的硅颗粒、包括阳离子脂质的脂质组分、以及任选的非还原性二糖。
11.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，或根据权利要求10所述的药物，其中所述药物为注射用溶液的形式。
12.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括将根据权利要求10或权利要求11所述的药物口服或通过注射施用于有需要的受试者。
13.一种保护生物制品免受降解的方法，其包括：
(i)使所述生物制品与包括生物相容性固体颗粒的递送系统接触以形成复合物；然后
(ii)任选地，将所述复合物冻干以形成粉末；并且然后
(iii)将所述复合物分散在可生物降解的凝胶材料中以形成口服或注射用制剂，其包括包埋在所述可生物降解的凝胶材料中的所述复合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述递送系统还包括脂质组分，所述脂质组分包括阳离子脂质和/或可电离脂质；和任选的非还原性二糖。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述生物相容性固体颗粒包括可水解的硅。
16.一种注射装置，其包括根据权利要求4-6或9中任一项所述的制剂，或根据权利要求10或权利要求11所述的药物。
17.一种口服剂型，其包括根据权利要求4-6或9中任一项所述的制剂，或根据权利要求10或权利要求11所述的药物。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法、制剂、药物、注射装置或口服剂型，其中所述递送系统包括非还原性二糖海藻糖。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法、制剂、药物、注射装置或口服剂型，其中所述生物制品包括核酸、抗原和疫苗中的一种或多种。
20.根据权利要求19所述的方法、制剂、药物、注射装置或口服剂型，其中所述生物制品包括核酸，比如RNA(例如siRNA或mRNA，任选自扩增的mRNA)或质粒DNA；以及任选的一种或多种酶。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法、制剂、药物、注射装置或口服剂型，其中所述脂质组分包括阳离子脂质和/或可电离脂质，并且所述脂质组分还包括磷脂和任选的PEG脂质和/或者结构脂质。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法、制剂、药物、注射装置或口服剂型，其中所述递送系统包括氨基酸。
23.根据权利要求22所述的方法、制剂、药物、注射装置或口服剂型，其中所述氨基酸选自以下中的一种或多种：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
24.根据权利要求23所述的方法、制剂、药物、注射装置或口服剂型，其中所述氨基酸为甘氨酸或者甘氨酸与精氨酸或赖氨酸的组合。
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