CN117705547A - 一种适用于3d培养模型和细胞学样本的组织病理学包埋方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包埋模具及类器官/细胞球预包埋方法，所述包埋模具包括：包埋本体、包埋盖、注水口、橡胶塞和分离杆，所述包埋本体为锥形台形状，包埋本体中心处有包埋孔，包埋孔纵向贯穿包埋本体；所述包埋盖与包埋孔的底部开口相配合；所述注水口开设在包埋本体的顶部；所述橡胶塞与注水口相配合；所述分离杆的直径小于包埋孔的直径，且分离杆的长度不小于包埋孔的深度。本发明的普适性强，一般普通实验室即可操作，不需要额外昂贵的仪器；本发明的包埋模具，在操作中避免类器官损失的同时可对类器官进行最大成度的的收集和包埋，并完整保存类器官及细胞球内部结构特征，使下游染色实验顺利进行；本发明还可适用于细胞学样本以及微小组织。

Description

一种适用于3D培养模型和细胞学样本的组织病理学包埋方法

技术领域

本发明属于细胞病理学分析领域，具体涉及一种包埋模具及类器官/细胞球预包埋方法。

背景技术

3D培养模型(类器官/细胞球)是细胞培养技术的一个新的创新,随着新型支架发明与应用及细胞成像和分析系统的日新月异，3D细胞培养以其更贴和人体内部细胞生长方式而获得传统2D细胞培养所没有的优势,已在精准医学、基础研究和再生医学等领域崭露头角。其中基于精准预测药物治疗反应对保护人类生命健康安全具有重要意义。为了避免动物实验固有的物种间差异性和局限性，提高药物敏感性实验通量，人体生理功能直接相关的体外模型起到至关重要的作用。

对于3D培养模型而言，对其内部结构的组织病理学分析鉴定及其重要，通过组织学切片、染色可以了解其微观结构，探测其表面标志物，探究其与来源组织的相似度。然而，对3D培养物进行病理学分析缺乏有效的分析方法。3D培养模型和细胞学样本都有其共同的特点，样本珍贵，数量有限，在病理学分析时经常遇到难以切片的挑战。特别是肿瘤类器官，培养周期长，所需试剂昂贵，在初期培养未进行扩增时，依据肿瘤样本(细针穿刺活检、肿瘤小体积样本等)消化的所获得的细胞量，可能难以满足大规模培养，只能先进行初代培养，随后传代扩增培养。有时在原代培养类器官时肿瘤细胞数量可能只够24孔细胞培养板的1-3个孔，其中所含类器官数量较少，只能取用少量的类器官来进行组织学分析鉴定，而少量类器官的组织病理学包埋对研究人员而言是有挑战性的。

现有的3D培养物病理学分析方法存在的问题有：

1.类器官在培养板上培养，体积小，直径在100-200um左右，培养费用昂贵，肉眼无法直接观察，难以直接进行常规石蜡包埋。

2.目前关于对类器官包埋缺乏合适的预包埋模具。

3.据已有文献报道，研究人员通常使用琼脂糖溶液等包埋胶对类器官进行包埋，但是在琼脂糖溶液包埋时容易凝固，导致类器官悬浮在琼脂糖块中，未能聚集到一个平面，在切片时只能切到少数类器官，甚至切不到类器官，最终导致实验失败。

4.据目前已有的类器官包埋方法，在对类器官包埋进行组织学分析时，通常需要合并培养板中多个孔的类器官(24孔板)，通过增加类器官的通量提高切片效率。但是在精准医学中对类器官药物敏感性检测时，需要将类器官培养在96孔板甚至384孔板中，单孔类器官的数量通常是很少的，有时需要进行单孔组织学微观分析来评价其药效时，因操作步骤繁多容易造成类器官的丢失最终导致实验失败。

5.琼脂糖溶液的配比不同会导致会导致粘稠度不同，导致类器官或者细胞在离心时的沉降率不同。

6.将类器官收集至同一个平面后，在琼脂糖凝固后，可能在将其完整的取出时破坏类器官的平面。

因此，亟需一种合适的预包埋模具及方便、快捷、经济的包埋方法来解决类器官包埋的难题。

发明内容

本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：

目前文献当中报道的3D培养物病理学分析方法较少，主要有石蜡直接包埋法，包埋胶预包埋法和包埋胶预包埋离心法。石蜡直接包埋法是指挑选体积稍大、肉眼可见的类器官，在经过脱水透明后，采用离心的方法收集类器官之后，直接加入石蜡直接包埋。此方法适合于体积大，数量多的类器官，并且类器官在操作中极其容易丢失。包埋胶预包埋法通过收集类器官，加入包埋胶提前对类器官进行预包埋，随后进行石蜡包埋。此方法对类器官预包埋，类器官则弥散在包埋胶中，不能聚集在同一个层面，适用于大量的类器官，对于少量的类器官则难以实现，不利于切片。包埋胶预包埋离心法是指3D培养物在包埋胶预包埋之后增加了离心的步骤，可以将类器官聚集在同一个平面，让切片变得方便。此方法的关键在于包埋胶离心的时机，在加入包埋胶后应尽快离心，防止包埋胶在3D培养物未沉降至底面前而凝固，从而导致包埋失败；另外预包埋模具的选择也很重要，底面最好是平面，模具的体积不能太大，避免类器官挂壁等造成损失。

为了解决上述问题，本发明的实施例提出一种包埋模具及类器官/细胞球预包埋方法。

本发明的包埋模具，包括：包埋本体，所述包埋本体为锥形台形状，包埋本体中心处有包埋孔，包埋孔纵向贯穿包埋本体；包埋盖，所述包埋盖的顶部开口，包埋盖的底部圆周向外延伸有手持部，所述包埋盖与包埋孔的底部开口相配合；注水口，所述注水口开设在包埋本体的顶部；橡胶塞，所述橡胶塞与注水口相配合；分离杆，所述分离杆的直径小于包埋孔的直径，且分离杆的长度不小于包埋孔的深度。

可选地，所述包埋模具进一步所述包埋管穿过包埋孔与包埋盖可拆卸连接，包埋盖与包埋管的底部开口相配合。

本发明的类器官/细胞球预包埋方法，需采用本发明实施例的包埋模具实现，包括以下步骤：

S1.样本准备；

S2.包埋模具准备；

S3.包埋胶的准备；

S4.预包埋。

所述步骤S1样本准备的具体步骤为：

(5)在培养板选择类器官/细胞球生长状态良好的孔，弃去旧培养基加入4％多聚甲醛固定30min；

(6)用枪头将含有类器官/细胞球的Matrigel(基质胶)吹散，并将类器官/

细胞球转移进1.5ml的EP管中；

(7)在1.5ml的EP管中加入5ul组织染色液，静置30min，让类器官/细胞球着色，防止在后续实验中丢失样本；

(8)将类器官/细胞球离心，去除上清后将其转入60℃金属浴备用。

所述步骤S2包埋模具准备的具体步骤为：

(1)向包埋本体的注水口中注入60℃热水，盖上橡胶塞；

(2)将包埋孔底部扣紧包埋盖，加入抗粘连润洗液润洗，抗粘连润洗液为含有0.1-5％BSA的PBS溶液；

(3)将组装好的包埋本体放入50ml离心管中待用。

所述步骤(2)替换为：将包埋管竖直插入包埋孔中，包埋管底部扣紧包埋盖。

所述步骤S3包埋胶的准备步骤为：称量琼脂糖粉末，将其加入100ml的超纯水中，微波炉加热使其溶解，配制成1％-5％琼脂糖溶液，将其部分分装在10支1ml的EP管中，室温保存。

所述步骤S4预包埋的具体步骤为：

(1)使用前取出1ml琼脂糖溶液放入100℃金属浴中预热融化，琼脂糖融化后将金属浴调整至60℃，降至该温度20min后将琼脂糖溶液转移至类器官/细胞球中；

(2)再将含有类器官/细胞球的琼脂糖溶液加入至包埋模具中；

(3)迅速将包埋模具离心3min；

(4)离心后将包埋模具从50ml离心管取出，转移至4℃冰箱静置10min，使琼脂制糖完全冷却；

(5)琼脂糖凝固后，将包埋模具进行拆卸，打开包埋盖，使用分离杆将琼脂块轻轻推出；

(6)对琼脂块进行适当修剪后放入包埋盒进行脱水处理，随后进行石蜡包埋；

(7)包埋后进行石蜡切片，HE染色。

本发明实施例的有益效果是，

1.本发明普适性强，操作简便，一般普通实验室即可操作，不需要额外昂贵的仪器。

2.本发明的包埋模具，可对类器官进行最大成度的的收集并避免损失，本发明还可适用于细胞学样本。

3.通过在包埋模具中注入60度温水，起到保温的作用，在离心等后续操作中，可最大程度的保证琼脂糖等包埋胶呈现液体状态。

4.在琼脂糖凝固后，利用包埋盖上的手持部，小心打开包埋盖，可在不破坏类器官平面的同时将琼脂糖凝块完整取出。

5.对于数量很少的类器官，本发明也可适用。

6.配制出合适的琼脂糖浓度，可对类器官及细胞进行很好的包埋。

7.经本发明所制作的切片，可有效的保留类器官/细胞球的内部蛋白等结构和特征，有利于进行免疫荧光等下游染色实验。

8.本发明使用抗粘连润洗液(含有0.1-5％BSA的PBS溶液)对包埋管壁、枪头进行润洗，采用蛋白包被的方式，防止管壁粘连类器官，在操作中有效降低类器官的损失。

9.在融化包埋胶(琼脂糖等)后，避免在高温时(约90℃)直接包埋类器官/细胞球，本发明在温度降低为60℃时包埋类器官/细胞球(医院病理科包埋组织时的温度)，在操作流程中尽可能的降低高温对类器官/细胞球的损伤，保护其结构完整性。

附图说明

图1是本发明包埋模具的结构示意图一。

图2是本发明包埋模具的结构示意图二。

图3是本发明实施例1的一种操作流程。

图4是本发明实施例1的第二种操作流程。

图5是本发明的对比例1-3的操作流程示意图。

图6是本发明实施例1与对比例1-3的结果对比。

图7是本发明的实施例2的结果。

图8是本发明的实施例3的结果。

图9是本发明的实施例4-5的结果。

图10是本发明的实施例6的结果。

附图标记：

包埋本体1；包埋管2；包埋盖3；注水口4；橡胶塞5；分离杆6；手持部7。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的包埋模具有两种结构，第一种结构如图1所示，包括包埋本体1、包埋盖3、注水口4、橡胶塞5和分离杆6，包埋本体1为锥形台形状，包埋本体1中心处有包埋孔，包埋孔纵向贯穿包埋本体1；包埋盖3的顶部开口，包埋盖3与包埋孔的底部开口相配合，具体地，包埋本体1底部包埋孔的圆周有容纳包埋盖3的凹槽，包埋盖3与包埋本体1底部的凹槽相配合，包埋盖3的内径不小于包埋孔的内径，包埋盖3的外径略小于包埋本体1底部凹槽的内径，也就是说包埋盖3能够卡在包埋本体1底部盖住包埋孔，且能够脱离包埋孔；包埋盖3的底部圆周向外延伸有手持部7，手持部7的设置是方便将包埋盖3与包埋本体1分离，手持部7可以是包埋盖3底部对称设置的一对凸起，也可以是沿包埋盖3底部圆周向外延伸一圈的帽檐，手持部7超出包埋本体1下端，有利于分离，但手持部7的设置不影响包埋模具整体装入50ml离心管中；注水口4开设在包埋本体1的顶部；橡胶塞5与注水口4相配合；分离杆6的直径小于包埋孔的直径，且分离杆6的长度不小于包埋孔的深度。

包埋模具的第二种结构如图2所示，相对于第一种结构增加了包埋管2，即包括包埋本体1、包埋管2、包埋盖3、注水口4、橡胶塞5和分离杆6；包埋管2是两端开口的空心管，包埋管2穿过包埋孔与包埋盖3可拆卸连接，包埋管2的外径略小于包埋孔，也就是说包埋管2可以插入包埋孔中，也可以从包埋孔中取出；包埋盖3与包埋管2的底部开口相配合，即包埋盖3能够与包埋管2底部相扣合，也能够脱离包埋管2。

本发明的类器官/细胞球预包埋方法，需采用本发明实施例的包埋模具实现，如图3-图4所示，包括以下步骤：

S1.样本准备：

(1)在培养板选择类器官/细胞球生长状态良好的孔，弃去旧培养基加入4％多聚甲醛固定30min；

(2)用枪头将含有类器官/细胞球的Matrigel吹散，并将类器官/细胞球转移进1.5ml的EP管中；

(3)在1.5ml的EP管中加入5ul组织染色液，静置30min，让类器官/细胞球着色，防止在后续实验中丢失样本；

(4)将类器官/细胞球离心，去除上清后将其转入60℃金属浴备用。

S2.包埋模具准备：

方法一：如图1所示，(1)向包埋本体1的注水口4中注入60℃热水，盖上橡胶塞5；

(2)将包埋孔底部扣紧包埋盖3，，加入含有0.1-5％BSA的PBS溶液即抗粘连润洗液润洗，防止类器官/细胞球等粘连管壁；

(3)将组装好的包埋本体1放入50ml离心管中待用。

方法二：如图2所示，将方法一中的步骤(2)可替换为：将包埋管2竖直插入包埋孔中，包埋管2底部扣紧包埋盖3。

S3.包埋胶的准备：称量琼脂糖粉末，将其加入100ml的超纯水中，微波炉加热使其溶解，配制成1％-5％琼脂糖溶液，将其部分分装在10支1ml的EP管中，室温保存。

S4.预包埋：

(1)使用前取出1ml琼脂糖溶液放入100℃金属浴中预热融化，琼脂糖融化后将金属浴调整至60℃，降至该温度20min后将琼脂糖溶液转移至类器官/细胞球中；

(2)再将含有类器官/细胞球的琼脂糖溶液加入至包埋模具中；

(3)迅速将包埋模具离心3min；

(4)离心后将包埋模具从50ml离心管取出，转移至4℃冰箱静置10min，使琼脂制糖完全冷却；

(5)琼脂糖凝固后，将包埋模具进行拆卸，打开包埋盖，使用分离杆将琼脂块轻轻推出；

(6)对琼脂块进行适当修剪后放入包埋盒后进行脱水处理，随后进行石蜡包埋；

(7)包埋后进行石蜡切片，HE染色。

为了更清楚的说明本发明的类器官/细胞球预包埋方法，下面用几个实施例进行比较。

涉及包埋的主要试剂：琼脂糖、10％缓冲福尔马林、乙醇、石蜡、二甲苯、苏木精和伊红染料、PBS、BSA(牛血清白蛋白)。涉及包埋的实验主要耗材：1.5ml离心管、200ul离心管、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板、清洁刀片、15ml离心管、50ml离心管、载玻片和盖玻片。涉及包埋的实验仪器装备：金属浴、离心机、切片机和水浴锅。

类器官的培养

1.在通过医院医学伦理委员会审查通过之后，收集食管鳞癌组织样本进行食管鳞癌类器官的培养。将收取的食管鳞癌样本快速放入组织保存液中，4℃冰上运输回实验室，立即进行培养工作，使用生理盐水将样本组织冲洗干净，使用组织剪将标本周围坏死、污染的边缘修剪干净，随后再次用生理盐水冲洗干净。随后使用组织剪将肿瘤样本剪成碎片，大小为2mm³左右。

2.将组织碎片转移至原代组织消化液中，在37℃培养箱中消化约30-40min，待消化成细胞团或单细胞状态时加入基础培养基停止消化，随后过滤。

3.将过滤后的细胞悬液离心去除上清，并加入组织保存液清洗重悬，重复该步骤2遍，在类器官沉淀中加入1ml组织保存液并计数，计算所需要的细胞量(24孔板:10000-30000个/孔；96孔板：3000-10000个/孔)。

4.吸取合适体积的细胞悬液，再次离心去除上清。

5.在细胞悬液中加入合适体积的Matrigel，24孔板每孔25ul，96孔板每孔5ul。

6.在37℃二氧化碳培养箱固化15-30min。

7.固化后加入类器官培养基(24孔板/500ul,96孔板/100ul)，培养基成分为：DMEM/F12、HEPES、Glutamax、Penicillin-Streptomycin、B27、N2、R-spondin1、Noggin、EGF、N-acetyl-L-cysteine、A83-01、SB202190、Gastrin。

8.对类器官每3-5天换液，每日密切观测类器官的生长情况。

食管鳞癌类器官的扩增培养(24孔板)

1.类器官在生长超过75um时，可准备进行传代。

2.将需要传代的孔在孔板上将旧的培养及去除，加入DPBS缓冲液清洗孔板后吸除干净，随即加入基础培养基。

3.使用1000μl的移液器将含有类器官的Matrigel吹打散，向15ml的离心管中转移类器官。

4.离心后去除上清液，随后加入1ml类器官传代消化液，消化成细胞团块或者单细胞时终止消化，时间约为10min。

5.在15ml离心管中加入10倍体积的基础培养基终止消化，离心后去除上清液。

6.再次加入组织保存液对细胞进行重悬，重悬后对细胞计数。

7.离心后依据细胞数加入合适体积的Matrigel，4℃冰上操作，在培养板上播种含有细胞的Matrigel，每孔25ul。

8.在37℃二氧化碳培养箱固化15-30min后，加入类器官培养基。

肿瘤细胞球(TE-1/Hela/Siha)的培养方式：

1.将培养瓶中的贴壁肿瘤细胞消化，消化完全后加入含有血清的培养基终止消化。

2.将细胞悬液离心后去除上清，加入1ml的完全培养基，随后计数。

3.吸取所需要的的细胞量对应的细胞悬液体积，离心后去除上清。

4.加入Matrigel，4℃冰上操作，在96孔培养板上播种含有细胞的Matrigel，每孔5ul。

5.在37℃二氧化碳培养箱固化15-30min后，加入细胞系对应的完全培养基。

6.显微镜观察每天生长状态，每3-4天换液。

HE染色步骤：

1.将切片机切好的玻片放置在烤片机上烤至15min至蜡融化，随后依次将切片放入二甲苯Ⅰ5min；二甲苯Ⅱ5min；无水乙醇Ⅰ5min；无水乙醇Ⅱ5min；95％酒精5min；90％酒精5min；80％酒精5min；70％酒精5min；蒸馏水洗3次，每次1min；

2.切片放入苏木素中染细胞核3-8min，自来水洗3次，每次3min；

3.切片放入伊红染液中染色细胞质1-3min，自来水洗3次，每次3min；

4.封片：将切片依次放入75％酒精5min；85％乙醇5min；95％酒精5min；无水乙醇Ⅰ5min；无水乙醇Ⅱ5min；二甲苯Ⅰ5min；二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

5.显微镜观察，图像采集分析。

实施例1

通过本发明的类器官/细胞球预包埋方法，对宫颈癌细胞球Hela进行包埋、切片、HE染色。

在1.5mlEP管加入组织染色液对3D培养模型(Hela球)染色后，离心收集，弃去上清，随后在60℃金属浴上预热，加入预热的60℃琼脂糖溶液50ul，将其转移至包埋模具中，迅速离心后分离50ml离心管和包埋模具，将包埋模具放入4℃冰箱预冷10min，沿着管盖手持部小心分离管盖，用分离杆小心推出琼脂凝块，随后放入包埋盒中进行石蜡包埋、切片、HE染色。

实施例2

通过本发明的类器官/细胞球预包埋方法，对宫颈癌细胞球Hela进行包埋，在切片后进行免疫荧光染色。步骤如下：

1.将切片放在烤片机烤片30-40min。

2.二甲苯脱蜡，5min/2缸，酒精脱水5min/2缸，玻片浸水。

3.使用柠檬酸盐缓冲液高压修复2min。

4.PBS洗3次，每次1min，洗完后擦干玻片，用免疫组化笔画圈，圈住组织。

5.滴加血清封闭5min，PBS清洗1min*3次。

6.滴加目的抗体Ki67(CST，#9449)4℃过夜。

7.PBS清洗1min×3次。

8.滴加荧光二抗(Alexa594 Conjugate，CST，#8890)，染色60min(避光)，随后PBS清洗1min×3次。

9.加入DAPI染色15min，随后PBS清洗1min×3次。

10.加入防荧光淬灭剂，盖上盖玻片置于荧光显微镜观察(注意避光)。

实施例3

通过本发明的类器官/细胞球预包埋方法，对食管鳞癌细胞球TE-1进行包埋、切片、染色。

实施例4

通过本发明的类器官/细胞球预包埋方法，对人食管鳞癌肿瘤类器官进行包埋、切片、染色。

实施例5

通过本发明本发明的类器官/细胞球预包埋方法，对宫颈癌细胞球Siha进行包埋、切片、染色。

实施例6

通过本发明的类器官/细胞球预包埋方法，对细胞学样本食管鳞癌细胞EC109(5×10⁵个)进行包埋、切片、染色。

对比例1：

如图5所示，在1.5mlEP管加入组织染色液对3D培养模型(Hela球)染色后，离心收集，弃去上清，随后在60℃金属浴上预热，加入预热的60℃琼脂糖溶液50ul，将其转移至200ul的离心管管盖中，放入4℃冰箱预冷10min，放入包埋盒随后进行石蜡包埋、切片、染色。

对比例2：

如图5所示，在1.5mlEP管加入组织染色液对3D培养模型(Hela球)染色后，离心收集，弃去上清，随后在60℃金属浴上预热，加入预热的60℃琼脂糖溶液50ul，将其转移至200ul的离心管中，放入4℃冰箱预冷10min，随后用注射器针头小心取出，用刀片从中间劈开，放入包埋盒随后进行石蜡包埋(2个切面朝下)、切片、染色。

对比例3：

如图5所示，在1.5mlEP管加入组织染色液对3D培养模型(Hela球)染色后，离心收集，弃去上清，随后在60℃金属浴上预热，加入预热的60℃琼脂糖溶液50ul，快速离心，将其转移至200ul的离心管中，放入4℃冰箱预冷10min，随后用注射器针头小心取出，用刀片修剪琼脂糖凝块后，放入包埋盒进行石蜡包埋、切片、染色。

结果分析：

1、宫颈癌细胞球Hela在96孔板培养5-6天后，通过收集4个孔的细胞球于1.5mlEP管中，在均分成4等份后分别采用实施例1和对比例1、2、3的方法进行包埋、切片和HE染色，实施例1和对比例1、2、3均重复三次实验，对包埋染色结果进行计数，计数每组全视野下类器官的个数。采用SPSS25.0统计软件分析实验数据，定量资料以(x±s)表示，多组比较进行单因素方差分析与LSD-t比较，检验标准是α＝0.05。切片染色结果如图6和表1所示：实施例1类器官个数为57.00±2.64；对比例1类器官个数为2.00±1.00，P<0.001；对比例2类器官个数为4.66±1.53，P<0.001；对比例3类器官个数为22.00±2.65，P<0.001。

表1实施例1和对比例1-3的类器官个数比较

注：a表示和实施例1比较，P＜0.001；b表示和实施例1比较，P＜0.001；c表示和实施例1比较，P＜0.001；所有的两两比较均经过LSD-t校正。

根据统计结果显示，实施例1同对比例1、2、3相比，实施例1的类器官包埋个数最多，实施例1的包埋效果好于对比例1、2、3。

实施例1预先向模具加入60℃的温水保温，采用预包埋后离心的方式，在琼脂糖溶液凝固前可以最大程度的将类器官聚集至同一个平面即包埋盖底面完成切片染色。对比例1和对比例2，预包埋未经离心的步骤，细胞球在琼脂块中弥散，导致难以对细胞球切片，切片效率极低，常常在切片上不见类器官。如果要提高类器官的包埋效率，只能大幅提高类器官的数量。对比例3则是通过包埋胶离心的方式进行包埋，其包埋个数多于对比例1、2，但远低于实施例1，原因之一是包埋模具(1.5ml EP管)的底面近似为半球形，离心机离心时在离心力的作用下细胞沉淀会稍偏向其中一侧，冷却后在进行石蜡包埋时，难以正好将细胞沉淀的一侧放入包埋金属模具的底面(底面即切面)，最终导致切片的效率降低。另外则是类器官在离心时琼脂糖过快的凝固，有部分细胞球弥散在琼脂糖块中。在类器官显微镜成像的美观性方面，实施例1要优于对比例3。对比例3相对于实施例1，其模具为锥形EP管，Hela细胞球在离心时有些过于集中，相互之间重叠过于严重，导致单个类器官的边缘轮廓显示不清。比例尺均为100μm。

2、实施例2—Hela细胞球免疫荧光染色结果(红色为Ki67，蓝色为DAPI)，染色均匀，通过本发明做制作的切片可有效的保持其内部蛋白等结构的稳定性，如图7。比例尺为100μm。

3、实施例3—在96孔板中培养的食管鳞癌细胞球TE-1包埋HE染色结果(单孔)，如图8，比例尺为100μm。

4、图9中展示实施例4-5。实施例4是食管肿瘤类器官的包埋HE染色结果；实施例5是宫颈癌细胞球Siha包埋HE染色结果。比例尺为100μm。

5、图10为实施例6，本发明对食管鳞癌细胞系EC109细胞进行包埋的效果展示，可以看出本发明的预包埋方法不仅对于3D细胞培养物有很好的效果，在对细胞学样本方面，也有很好的效果。比例尺为100μm。

本发明所涉及的包埋方法不仅涉及类器官、细胞球，还可应用于细胞学样本(如悬浮细胞、胸水或腹水细胞)和微小组织(如细针穿刺活检)等。

尽管已经示出和描述了上述实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域普通技术人员对上述实施例进行的变化、修改、替换和变型均在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种包埋模具，其特征在于，包括：

包埋本体，所述包埋本体为锥形台形状，包埋本体中心处有包埋孔，包埋孔纵向贯穿包埋本体；

包埋盖，所述包埋盖的顶部开口，包埋盖的底部圆周向外延伸有手持部，包埋盖与包埋孔的底部开口相配合；

注水口，所述注水口开设在包埋本体的顶部；

橡胶塞，所述橡胶塞与注水口相配合；

分离杆，所述分离杆的直径小于包埋孔的直径。

2.根据权利要求1所述的包埋模具，其特征在于，所述包埋模具进一步包括包埋管，所述包埋管穿过包埋孔与包埋盖可拆卸连接，包埋盖与包埋管的底部开口相配合。

3.一种类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述预包埋方法需采用权利要求1或2任一项所述的包埋模具实现，包括以下步骤：

S1.样本准备；

S2.包埋模具准备；

S3.包埋胶的准备；

S4.预包埋。

4.根据权利要求3所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤S1样本准备的具体步骤为：

(1)在培养板选择类器官/细胞球生长状态良好的孔，弃去旧培养基加入4％多聚甲醛固定30min；

(2)用枪头将含有类器官/细胞球的基质胶吹散，并将类器官/细胞球转移进1.5ml的EP管中；

(3)在1.5ml的EP管中加入5ul组织染色液，静置30min，让类器官/细胞球着色，防止在后续实验中丢失样本；

(4)将类器官/细胞球离心，去除上清后将其转入60℃金属浴备用。

5.根据权利要求3所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤S2包埋模具准备的具体步骤为：

(1)向包埋本体的注水口中注入60℃热水，盖上橡胶塞；

(2)将包埋孔底部扣紧包埋盖，加入抗粘连润洗液润洗；

(3)将组装好的包埋本体放入50ml离心管中待用。

6.根据权利要求5所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤(2)替换为：将包埋管竖直插入包埋孔中，包埋管底部扣紧包埋盖。

7.根据权利要求6所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤S3包埋胶的准备步骤为：称量琼脂糖粉末，将其加入100ml的超纯水中，微波炉加热使其溶解，配制成1％-5％琼脂糖溶液，将其部分分装在10支1ml的EP管中，室温保存。

8.根据权利要求7所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤S4预包埋的具体步骤为：

(1)使用前取出1ml琼脂糖溶液放入100℃金属浴中预热融化，琼脂糖融化后将金属浴调整至60℃，20min后将琼脂糖溶液转移至类器官/细胞球中；

(2)再将含有类器官/细胞球的琼脂糖溶液加入至包埋模具中；

(3)迅速将包埋模具离心3min；

(4)离心后将包埋模具从50ml离心管取出，转移至4℃冰箱静置10min，使琼脂制糖完全冷却；

(5)琼脂糖凝固后，将包埋模具进行拆卸，打开包埋盖，使用分离杆将琼脂块轻轻推出；

(6)对琼脂块进行适当修剪后放入包埋盒进行脱水处理，随后进行石蜡包埋；

(7)包埋后进行石蜡切片，HE染色。