CN117701681A - 基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,包括连接反应、消化反应和杂交链式反应。本发明以非小细胞肺癌潜在生物标志物miR‑196a2T为检测目标物,通过连接反应生成能够激发后续杂交链式反应的AB链,通过消化反应去除与AB链互补的miR‑196a2T,通过杂交链式反应生成不同长度的双链DNA,由于发夹中两种荧光基团的相互靠近,发生荧光共振能量转移,实现了对单碱基发生突变的miR‑196a2T的零背景、精确定量。本发明提供了一种简单、快速、超灵敏、低成本的miRNA‑SNPs准确定量策略,有望为miRNA相关单核苷酸多态性相关的人类癌症预后提供强大而通用的即时检测平台。
Description
技术领域
本发明一种属于基因检测及生物传感器检测方法,具体涉及基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一种内源性、高度保守的、短的(长度为18-22个核苷酸)、非编码单链RNA,参与转录后基因表达调控。miRNA相关的单核苷酸多态性(miRNA-SNPs)包括miRNA中特定位点单碱基替换、插入与缺失,对miRNA的表达、miRNA与信使RNA间的相互作用产生重要影响。由于miRNA参与调控人类基因组中30%以上的蛋白质编码基因,miRNA所发生的微小变异可能对数千条细胞通路产生不可估量的影响,导致基因表达紊乱、多种功能障碍,进而诱发多种疾病与癌症。因此,对人体组织中miRNA-SNPs进行精确定量对临床肿瘤学发展具有重要意义。
然而,识别单核苷酸差异的高难度、miRNA的序列同源性和小尺寸特性、以及miRNA-SNPs在人体内的低丰度表达等问题对miRNA-SNPs简单、灵敏、特异的定量构成挑战。RNA测序是筛选miRNA-SNPs的经典技术之一,但大量的样本消耗、繁琐的程序以及欠佳的灵敏度阻碍其广泛应用。聚合酶链式反应作为传统扩增方法而备受关注,然而严格的操作程序和复杂的实验参数增加了其对操作人员的要求及设备依赖性。因此,迫切需要开发出一种简单、灵敏、低成本的miRNA-SNPs准确定量的生物传感新策略。
杂交链式反应作为一种等温核酸扩增技术,因其无酶、高效、成本低、结构灵活等诸多优势,深受科学家们的青睐,被广泛应用于生物传感器的构建中。遗憾的是,目前并没有将杂交链式反应应用到miRNA-SNPs检测中的研究。因此,利用杂交链式反应构建miRNA-SNPs的传感策略,有望为资源匮乏地区的疾病监测、现场检测提供新方案。
发明内容
发明目的:本发明的目的在于针对现有miRNA-SNPs检测技术存在的问题,选择非小细胞肺癌潜在生物标志物miR-196a2T作为检测目标物,开发一种基于杂交链式反应的等温核酸扩增方法构建miRNA-SNPs的荧光生物传感器,灵敏度高、简单易操作、快速、低成本、减少对酶及变温设备的依赖性。
技术方案:本发明所述的基于杂交链式反应的miRNA-SNPs超灵敏荧光传感方法,包括三个步骤:连接反应、消化反应、杂交链式反应。
基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,所述荧光传感方法包括连接反应、消化反应、杂交链式反应三个步骤:
(1)连接反应,杂交链式反应激发链(AB链)的生成:将待测miRNA样品加入到连接反应体系中,通过碱基互补配对原理以及SplintR连接酶的作用,在35~39℃下进行连接反应,生成miRNA互补的DNA链,即AB链;优选地,在37℃下进行连接反应;
(2)消化反应,步骤(1)所生成的miRNA-AB链复合物中miRNA的消化:将消化反应缓冲液稀释的RNase H酶加入到步骤(1)反应液中,35~39℃下反应5~30min,使RNase H酶特异性降解miRNA-AB链复合物中的miRNA,保留AB链;优选地,在37℃下反应5~30min;
(3)杂交链式反应,步骤(2)消化保留的AB链激发杂交链式反应:将经退火程序处理的荧光发夹H1和荧光发夹H2加入到步骤(2)反应液中,在16~37℃下孵育0.5~4h,使得激发链AB打开荧光发夹H1,H1所暴露的部分进一步打开荧光发夹H2,H2所暴露的部分再进一步打开荧光发夹H1,进而生成不同长度的DNA双链。其中,荧光发夹H1中的FAM荧光基团与荧光发夹H2中的TAMRA荧光基团相互靠近,发生荧光共振能量转移。
所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,步骤(1)中,所述连接反应体系由A链、B链、SplintR连接酶、连接反应缓冲液组成;在35~39℃下孵育5~30min,SplintR连接酶连接A链与B链的相邻接头,生成AB链;其中,连接反应缓冲液含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT,pH7.0~8.0;A链的DNA序列为:GTAACTCAG;所述B链的DNA序列为:*ACAGTTTCTTGT,其中*代表的是磷酸基团修饰;所述AB链的DNA序列为:GTAACTCAGACAGTTTCTTGT。优选地,在37℃下进行连接反应;连接反应缓冲液pH7.5。
所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,步骤(2)中,所述消化反应缓冲液含有Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT,pH7.3~9.3。优选地,消化反应缓冲液pH8.3。
所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,步骤(3)中,所述退火程序优选为95℃,10min+92.5℃,2min+90.0℃,2min+87.5℃,2min+85.0℃,2min+82.5℃,2min+80.0℃,2min+77.5℃,2min+75.0℃,2min+72.5℃,2min+70.0℃,2min+67.5℃,2min+65.0℃,2min+62.5℃,2min+60.0℃,2min+57.5℃,2min+55.0℃,2min+52.5℃,2min+50.0℃,2min+47.5℃,2min+45.0℃,2min+42.5℃,2min+40.0℃,2min+37.5℃,2min+35.0℃,2min+32.5℃,2min+30.0℃,2min+27.5℃,2min+25.0℃,2min,退火完成后将发夹置于4℃保存。
所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,步骤(3)中,所述荧光发夹H1的DNA序列为:AGAAACTGTCTGAGTTACGTTCTTGT(FAM)AACTCAGACA;
荧光发夹H2的DNA序列为:
GTAACTCAGACAGTTTCTTGTCT(TAMRA)GAGTTACAAGAAC。
所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法在制备非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。
所述的应用,所述诊断试剂盒检测的待测miRNA为非小细胞肺癌潜在生物标志物miR-196a2T。
所述的应用,将待测miR-196a2T和/或miR-196a2C作为待测miRNA样品使用所述的方法进行反应,反应结束后,测其荧光光谱。
检测非小细胞肺癌生物标志物miR-196a2T的诊断试剂盒,包含RNase H酶、荧光发夹H1、荧光发夹H2、A链、B链、SplintR连接酶、连接反应缓冲液、消化反应缓冲液;
荧光发夹H1的DNA序列为:AGAAACTGTCTGAGTTACGTTCTTGT(FAM)AACTCAGACA;荧光发夹H2的DNA序列为:GTAACTCAGACAGTTTCTTGTCT(TAMRA)GAGTTACAAGAAC;
A链的DNA序列为:GTAACTCAG;B链的DNA序列为:*ACAGTTTCTTGT,其中*代表的是磷酸基团修饰。
所述的诊断试剂盒,连接反应缓冲液含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT,pH7.0~8.0。优选地,连接反应缓冲液pH7.5。
所述的诊断试剂盒,消化反应缓冲液含有Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT,pH7.3~9.3。优选地,消化反应缓冲液pH8.3。
所述miR-196a2T的序列为ACAAGAAACUGUCUGAGUUAC,miR-196a2C的序列为ACAAGAAACUGCCUGAGUUAC。
作为一种优选技术方案,步骤(1)中,所述连接反应体系中A链与B链的终浓度为500nM,SplintR连接酶终浓度为0.125~1.25U/μL;连接反应缓冲液组分为50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、10mM DTT,pH7.5。进一步优选的,所述孵育时间为10min。
作为一种优选技术方案,步骤(2)中所述消化反应缓冲液为10×消化反应缓冲液,稀释后的RNase H酶浓度为0.02~0.5U/μL。其中,10×消化反应缓冲液组分为:500mMTris-HCl、750mM KCl、30mM MgCl2、100mM DTT,pH8.3。优选的,稀释后的RNase H酶浓度为0.2U/μL,孵育时间为20min。
作为一种优选技术方案,步骤(3)中,将经退火程序处理的比例为1:0.5~4的荧光发夹H1和H2加入到步骤(2)反应液中,在16~37℃下孵育0.5~4h,使得激发链AB打开荧光发夹H1,H1所暴露的部分进一步打开荧光发夹H2,H2所暴露的部分再进一步打开荧光发夹H1,进而生成不同长度的DNA双链。在所述杂交链式反应中,荧光发夹H1中的FAM荧光基团与荧光发夹H2中的TAMRA荧光基团相互靠近,在485nm的激发波长下,发生荧光共振能量转移,使得518nm处(FAM荧光基团发射波长)荧光下降,584nm处(TAMRA荧光基团发射波长)荧光上升。优选的,荧光发夹H1和H2比例为1:1,浓度为250nM,温度为16℃,孵育时间为2h。
作为一种优选技术方案,所述荧光发夹H1和H2为H1.1/H2.1、H1.1/H2.2、H1.1/H2.3、H1.1/H2.4、H1.2/H2.1、H1.2/H2.2、H1.2/H2.3、H1.2/H2.4中任意一对荧光发夹组合,优选为H1.1/H2.2。荧光发夹序列信息如下:
H1.1:AGAAACTGTCTGAGTTACGTTCTTGT(FAM)AACTCAGACA;
H1.2:AGAAACTGTCTGAGTTACGTTCTTGTAACT(FAM)CAGACA;
H2.1:GTAACTCAGACAGTTTCTTGTCTGAGTT(TAMRA)ACAAGAAC;
H2.2:GTAACTCAGACAGTTTCTTGTCT(TAMRA)GAGTTACAAGAAC;
H2.3:GTAACTCAGACAGTTTCTTGT(TAMRA)CTGAGTTACAAGAAC;
H2.4:GTAACTCAGACAGTTTCTT(TAMRA)GTCTGAGTTACAAGAAC。
本发明的原理图见附图1。将miR-196a2作为检测目标,当发生单碱基位点突变时,特定位点的C碱基突变为U碱基。当miRNA未发生突变时,B链5’端的第一个碱基无法与miR-196a2C可能发生的突变位点互补结合,那么SplintR连接酶无法催化连接反应,A链与B链无法通过连接生成AB链,后续的杂交链式反应便无法发生,荧光发夹H1和H2在体系中亚稳态共存。当miRNA发生突变时,B链5’端的第一个碱基与miR-196a2T的突变位点互补结合,SplintR连接酶发挥作用并连接A链与B链相邻接头,AB链生成。经RNase H酶的消化作用,miR-196a2T-AB链复合物中的miR-196a2T被降解,AB链保留。AB链能够与亚稳态荧光发夹H1中的a*、b部分结合,从而打开荧光发夹H1。H1中所暴露的b*、c部分进一步与亚稳态荧光发夹H2中的b、c*部分结合,从而打开荧光发夹H2。H2中所暴露的a、b*部分又与H1中的a*、b部分结合以打开H1。最后,通过交叉打开荧光发夹H1和H2来生成长的双链DNA,使得H1中的FAM荧光基团与H2中的TAMRA荧光基团相互靠近,发生荧光共振能量转移。在检测过程中,检测目标物miR-196a2T的浓度越高,参与杂交链式反应的发夹越多,荧光共振能量转移现象越明显,518nm处荧光下降越多,584nm处荧光上升越多,即IF(584)/IF(518)值越大。其中,IF(518)为518nm处荧光强度,IF(584)为584nm处荧光强度。
本发明建立一种基于杂交链式反应的生物传感器用于检测miRNA相关单核苷酸多态性,DNA发夹可通过与杂交链式反应的激发链结合,兼具识别底物并放大信号的作用,具有高效等温扩增、超高灵敏度、结构灵活性等优势。与传统RNA测序、聚合酶链式反应等miRNA相关单核苷酸多态性检测方法相比,展现出反应条件温和、操作简单、减少核酸扩增酶的使用等优势,降低对精密仪器和训练有素的操作人员的需求,降低检测成本,更适合在家庭以及资源匮乏地区的现场检测。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有以下显著优点:(1)本发明利用SplintR连接酶对单碱基突变的强敏感性,实现了对癌症相关生物标志物miR-196a2野生型与单碱基突变型的区分。通过对连接反应中连接时间、SplintR酶量等条件的优化,保证了野生型miR-196a2C的零信号检出,避免非特异性扩增所导致的假阳性结果,实现了零背景检测。(2)本发明引入RNase H核酸酶以清除连接产物miRNA-AB链复合物中的miRNA,保证从双链结构中释放出的AB链顺利激发后续杂交链式反应进行扩增,实现了连接反应与杂交链式反应之间的联用。(3)本发明通过荧光共振能量转移信号强弱反映杂交链式反应程度。当发生杂交链式反应时,IF(518)值下降,IF(584)值上升,两者的比值IF(584)/IF(518)被进一步放大。选择IF(584)/IF(518)作为目标物的定量参考数值,提高了检测的灵敏度。此外,本发明与利用SYBRGreen I染料嵌入双链DNA的杂交链式反应方法相比,大大降低了荧光背景信号。(4)本发明基于杂交链式反应的超灵敏荧光传感方法用于非小细胞肺癌潜在生物标志物miR-196a2T精确定量,通过连接反应中SplintR连接酶对连接接头处碱基配对的敏感度进行了第一次特异性筛选,通过杂交链式反应中激发链与发夹H1之间的完全互补的必要性进行了第二次特异性筛选,实现了对单碱基突变型miR-196a2T的零背景信号检测,即所发明的传感方法对未发生单碱基突变的野生型miR-196a2C无信号检出。
附图说明
图1是基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法的原理图;
图2是本发明用于miR-196a2相关单核苷酸多态性检测的可行性;其中,A为检测结果的15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图,B为检测野生型与突变型miR-196a2的荧光光谱图;
图3是本发明对不同浓度的miR-196a2T检测所建立的线性关系;
图4是本发明用于临床样品检测的能力;其中,A为非小细胞肺癌患者和健康人的miR-196a2T分布曲线,B为区分非小细胞肺癌患者和健康人的miR-196a2T的接受者操作特性曲线(ROC曲线)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。药品和试剂:实验中使用的DNA、RNA均由生工生物工程(上海,中国)合成,并且经HPLC纯化。SplintR连接酶、10×连接反应缓冲液(500mM Tris-HCl、100mM MgCl2、10 mM ATP、100mM DTT,pH7.5@25℃)、RNaseH酶、10×消化反应缓冲液(500mM Tris-HCl、750mM KCl、30mM MgCl2、100mM DTT,pH8.3@25℃)、MonarchTotal RNAMiniprep Kit购自New England Biolabs(NEB)有限公司(美国)。荧光数据获得自日立科学仪器有限公司F-7100荧光分光光度计(日本),NanoDrop 2000购自Thermo Fisher(美国)。其他试剂均购买自国药试剂(上海,中国),并且均为分析纯。
实验中用到的核酸序列见表1所示。
表1实验中用到的核酸序列
注:*代表的是硫代磷酸化修饰,FAM和TAMRA是标记的荧光基团。
实施例1
基于杂交链式反应的传感方法用于miR-196a2相关单核苷酸多态性检测
(1)配制连接反应体系:将0.25μL 20μM A链、0.25μL 20μM B链、8μL 1μM miR-196a2T/miR-196a2C、0.2μL 25U/μL SplintR连接酶混合在1×连接反应缓冲液中,37℃下孵育10min。
(2)配制消化反应体系:将1μL 0.2U/μL RNase H酶(10×消化反应缓冲液稀释)加入到(1)反应液中,37℃下孵育20min。
(3)配制杂交链式反应体系并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:将0.5μL 10μM发夹H1和0.5μL 10μM发夹H2加入到(2)反应液中,16℃下孵育2h。反应液进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果如图2A所示。泳道4和泳道5分别为miR-196a2T和miR-196a2C的连接反应产物,miR-196a2T组(泳道4)在B链上方出现新条带,推断为miR-196a2T-AB链复合物,即表明连接反应成功进行。虽然miR-196a2C组(泳道5)在相同位置出现条带,但条带亮度很暗,推断为miR-196a2T-A链-B链复合物,并未发生连接反应。泳道6和泳道7分别为miR-196a2T和miR-196a2C的消化反应产物,miR-196a2T组(泳道6)在AB链位置出现明显的条带,而miR-196a2C组(泳道7)在相同位置处无条带生成,说明仅有miR-196a2T存在时才能生成AB链,而miR-196a2C存在时不能生成AB链。泳道8和泳道9分别为miR-196a2T和miR-196a2C的杂交链式反应产物,miR-196a2T组(泳道8)在不同位置出现了多个条带,说明了杂交链式反应的成功进行,而miR-196a2C组(泳道9)除发夹H1和H2外,无其他任何条带生成,表明其未发生杂交链式反应,进一步验证了本发明的整体可行性。
(4)配制杂交链式反应体系并进行荧光光谱扫描:将5μL 1μM荧光发夹H1和5μL 1μM荧光发夹H2加入到(2)反应液中,16℃下避光孵育2h。反应结束后向管内加入79μL ddH2O并混合均匀,吸取80μL混合液,进行荧光光谱扫描。采用荧光分光光度计,选用比色皿模式进行检测,检测条件为:激发波长设置485nm,收集发射光谱设置505~650nm,PMT=940V,激发与发射的狭缝均为10nm。荧光光谱结果如图2B所示,without miRNA组为H2O替换(1)反应体系中的miRNA。miR-196a2C组的荧光光谱与without miRNA组一致,说明该传感体系在检测miR-196a2C时,无任何荧光信号变化,证实该传感体系的零背景检测。miR-196a2T组的荧光光谱发生显著变化,即518nm处荧光下降,584nm处荧光上升并出现一个峰,说明了荧光共振能量转移的发生,进一步说明在miR-196a2T存在时杂交链式反应的成功进行。
实施例2
本发明对不同浓度的miR-196a2T检测的荧光结果
如上述实施例1中的(1)、(2)和(4)依次制备反应体系,其中实施例1中(1)的miR-196a2T浓度换成:0.05pM、5pM、50pM、100pM、250pM、500pM、1000pM、2500pM、5000pM。检测结果如图3所示,结果用IF(584)/IF(518)表示。通过线性拟合处理,建立了本发明对不同浓度的miR-196a2T检测所建立的线性关系:Y=0.00012X+0.28026,R2=0.9988。式中,X为miR-196a2T的浓度,Y为对应浓度下所测得的IF(584)/IF(518)值。
此外,通过3倍信噪比法,测得本发明检测miR-196a2T的检测限为10aM。
实施例3
本发明用于非小细胞肺癌患者和健康人临床样品中miR-196a2T检测的性能
收取15个非小细胞肺癌患者肺组织样品,15个健康人肺组织样品(良性囊肿,病理检查无癌变),使用Monarch Total RNA Miniprep Kit提取样品总RNA,使用NanoDrop2000进行定量,并用无RNA核酸酶的超纯水归一化,使所有样品的总RNA浓度为10μg/mL。
如上述实施例1中的(1)、(2)和(4)依次制备反应体系,其中实施例1中(1)的8μL 1μM miR-196a2T/miR-196a2C换成8μL10μg/mL非小细胞肺癌患者/健康人提取的总RNA。检测结果如图4所示。图4A为非小细胞肺癌患者和健康人样品检测结果的分布图,非小细胞肺癌患者的IF(584)/IF(518)值高于健康人(P=0.04),这意味着miR-196a2T在非小细胞肺癌患者肺组织中的表达水平高于健康人。值得注意的是,不同非小细胞肺癌患者的IF(584)/IF(518)值差异很大,表明miR-196a2T在早期或晚期非小细胞肺癌患者中的存在不同水平的表达。图4B为非小细胞肺癌患者和健康人的ROC曲线,用于评估本发明对区分非小细胞肺癌患者和健康人的诊断能力。曲线下面积(AUC)是ROC曲线的积分面积,用于说明诊断效果,即AUC值越大,说明本发明的诊断准确度越高。图4B中,计算出AUC为0.77,表明本发明在区分miR-196a2T和miR-196a2C方面表现出高精度。因此,本发明有望为miRNA-SNPs相关的非侵入性诊断和人类癌症预后提供强大而通用的即时检测平台。
对比例1
通过一个对比实施例来说明本发明提出的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法的优秀性能指标,具体见表2。
表2本发明与其他传感方法对miRNA-SNPs检测性能的区别
从表2可以看出,本发明提出的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法相比于对比例,摆脱对精密仪器的需求,进而降低了检测成本,适用于资源匮乏地区的现场检测;另外,本发明未观察到非特异性扩增,能够实现零背景检测,检测时间短,检测限也足够低,适用于实际样品的检测,是一种简单快速、低成本、无背景信号的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏传感方法。
Claims (10)
1.基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,其特征在于,所述荧光传感方法包括连接反应、消化反应、杂交链式反应三个步骤:
(1)连接反应,杂交链式反应激发链的生成:将待测miRNA样品加入到连接反应体系中,通过碱基互补配对原理以及SplintR连接酶的作用,在35~39℃下进行连接反应,生成miRNA互补的DNA链,即AB链;
(2)消化反应,步骤(1)所生成的miRNA-AB链复合物中miRNA的消化:将消化反应缓冲液稀释的RNase H酶加入到步骤(1)反应液中,35~39℃下反应5~30min,使RNase H酶特异性降解miRNA-AB链复合物中的miRNA,保留AB链;
(3)杂交链式反应,步骤(2)消化保留的AB链激发杂交链式反应:将经退火程序处理的荧光发夹H1和荧光发夹H2加入到步骤(2)反应液中,在16~37℃下孵育0.5~4h,使得激发链AB打开荧光发夹H1,H1所暴露的部分进一步打开荧光发夹H2,H2所暴露的部分再进一步打开荧光发夹H1,进而生成不同长度的DNA双链。
2.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,其特征在于,步骤(1)中,所述连接反应体系由A链、B链、SplintR连接酶、连接反应缓冲液组成;在35~39℃下孵育5~30min,SplintR连接酶连接A链与B链的相邻接头,生成AB链;其中,连接反应缓冲液含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT,pH7.0~8.0;A链的DNA序列为:GTAACTCAG;所述B链的DNA序列为:*ACAGTTTCTTGT,其中*代表的是磷酸基团修饰;所述AB链的DNA序列为:GTAACTCAGACAGTTTCTTGT。
3.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,其特征在于,步骤(2)中,所述消化反应缓冲液含有Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT,pH7.3~9.3。
4.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法,其特征在于,步骤(3)中,所述荧光发夹H1的DNA序列为:AGAAACTGTCTGAGTTACGTTCTTGT(FAM)AACTCAGACA;
荧光发夹H2的DNA序列为:
GTAACTCAGACAGTTTCTTGTCT(TAMRA)GAGTTACAAGAAC。
5.权利要求1~4中任意一种所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法在制备非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述诊断试剂盒检测的待测miRNA为非小细胞肺癌潜在生物标志物miR-196a2T。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,将待测miR-196a2T和/或miR-196a2C作为待测miRNA样品使用权利要求1~4中任意一项所述的方法进行反应,反应结束后,测其荧光光谱。
8.一种检测非小细胞肺癌生物标志物miR-196a2T的诊断试剂盒,其特征在于,包含RNase H酶、荧光发夹H1、荧光发夹H2、A链、B链、SplintR连接酶、连接反应缓冲液、消化反应缓冲液;
荧光发夹H1的DNA序列为:AGAAACTGTCTGAGTTACGTTCTTGT(FAM)AACTCAGACA;荧光发夹H2的DNA序列为:GTAACTCAGACAGTTTCTTGTCT(TAMRA)GAGTTACAAGAAC;
A链的DNA序列为:GTAACTCAG;B链的DNA序列为:*ACAGTTTCTTGT,其中*代表的是磷酸基团修饰。
9.根据权利要求8所述的诊断试剂盒,其特征在于,连接反应缓冲液含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT,pH7.0~8.0。
10.根据权利要求8所述的诊断试剂盒,其特征在于,消化反应缓冲液含有Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT,pH7.3~9.3。
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