CN117701676A - 一种自动化ngs文库制备分装试剂盒及建库方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种自动化NGS文库制备分装试剂盒及建库方法，本试剂盒为自动化NGS文库制备试剂盒，采用预分装的试剂盒与自动化仪器配合进行文库制备，一键式自动化制备出文库，仪器操作稳定，重复性高；只需1人加入样本后全程无需人员参与，手动操作时间5分钟，同时夜间无人值守也可运行，提高了制备效率；此外，采用全封闭式卡盒，在密封空间内进行反应，实现文库制备零污染。

Description

一种自动化NGS文库制备分装试剂盒及建库方法
技术领域
本发明涉及生物高通量测序领域，尤指一种自动化NGS文库制备分装试剂盒及建库方法。
背景技术
高通量测序技术(NGS)凭借其高通量、精确度高和信息量丰富等优势，在基础研究、产前诊断、遗传病诊断、肿瘤诊断与精准医疗等领域应用广泛。然而，相比于传统分子检测技术，NGS操作十分复杂和繁琐，实验流程较长，对实验人员要求较高，需要大量专业技术人员较长时间的培训才能顺利操作。这些情况严重制约了NGS技术的大规模推广和应用，为此开发自动化NGS建库产品成为打破束缚，大规模推广NGS技术的必由之路。
现有文库制备都是采用的手工法，手工制备文库的方法十分繁琐，对操作人员专业水平要求较高；且手工制备步骤繁多，出错概率高，且不同人员间不稳定，波动较大；同时文库制备工作量大，需要3-4名专业操作人员，至少两天时间的操作。另外，多管操作，多次开盖移液，不可避免的会产生污染。
发明内容
本发明提供一种自动化NGS文库制备分装试剂盒及建库方法，解决现有技术中手动检测以及自动化检测过程中的试剂盒不配套的问题，避免现有的商用试剂盒无法直接使用到自动化建库的过程中。
本发明提供一种自动化NGS文库制备分装试剂盒，包括：第一分装试剂组合和第二分装试剂组合以及第二分装试剂组合，所述第一分装试剂组合包括第一热洗液、清洗液、洗脱液，所述第二分装试剂组合包括第二热洗液、常温洗液、建库试剂、捕获试剂；所述第三分装试剂组合包括磁珠试剂。
在一个实施方式中，所述第一分装试剂组合中的第一热洗液包括洗液1；清洗液包括乙醇、水；洗脱液包括水；
所述第二分装试剂组合中的第二热洗液包括增强洗液；常温洗液包括磁珠清洗液、洗液1、洗液2、洗液3；建库试剂包括末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓冲液、接头、连接酶、PCR扩增引物、PCR反应液；捕获试剂包括封闭液、杂交反应液，磁珠重悬液、PCR扩增引物、PCR反应液；
第三分装试剂组合中的磁珠试剂包括AmpureXPbeads、链霉亲和素磁珠。
在一个实施方式中，所述末端修复缓冲液包括：Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP；
所述末端修复酶包括：T4多聚核苷酸激酶、T4DNAPolymerase、TaqDNA聚合酶、Klenow片段、甘油；
所述连接反应液包括：Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dNTP、PEG8000、水；
所述接头包括adapter
所述连接酶包括T4连接酶；
所述PCR反应液包括KAPAHiFihotstartreadymix；
所述PCR扩增引物包括P5、P7primer；
所述封闭液包括HumanCotDNA、BlockerOligoTSMix；
所述杂交反应液包括柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、甜菜碱、甲酰胺、四甲基氯化铵、NaCl、Probe、水、甘油、吐温；
所述磁珠清洗液包括NaCl、Tris-HCl、EDTA、吐温、水；
所述洗液1包括柠檬酸钠、NaCl、SDS；
所述增强洗液包括柠檬酸钠、NaCl、吐温；
所述洗液2包括柠檬酸钠、NaCl、水；
所述洗液3包括柠檬酸钠、NaCl、水；
所述磁珠重悬液包括柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、甜菜碱、甲酰胺、四甲基氯化铵、NaCl、水、甘油、吐温。
在一个实施方式中，所述热洗液中水的体积为2000μl，洗液1的体积为150μl；
所述第一清洗液中乙醇等体积分为三份，且每份乙醇的体积为500μl，乙醇的浓度为80％；
所述洗脱液中分装为两份水，两份所述水的体积分别为50μl和60μl；
所述第二热洗液中的增强洗液分装成两份，体积均为200μl；
所述常温洗液中的磁珠清洗液的体积为320μl，洗液1、洗液2、洗液3的体积均为175μl；
所述建库试剂中末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓冲液、接头、连接酶、PCR扩增引物以及PCR反应液的体积分别为10μl、4.3μl、40μl、5μl、15μl、30μl、30μl；
所述捕获试剂中的封闭液、杂交反应液、磁珠重悬液、PCR扩增引物、PCR反应液的体积分别为25μl、20μl、20μl、30μl、30μl；
所述磁珠试剂中的AmpureXPbeads分为三份，体积分别为120μl、150μl、100μl；所述链霉亲和素磁珠的体积为60μl。
在一个实施方式中，所述末端修复缓冲液中：Tris-HCl的终浓度为150-250mM、MgCl2的终浓度为35-45mM、DTT的终浓度为35-45mM、ATP的终浓度为3.5-4.5mM、dATP终浓度为10-20mM、dCTP终浓度为1.0-2.0mM、dGTP的终浓度为1.0-2.0mM、dTTP的终浓度为1.0-2.0mM；
所述末端修复酶中T4多聚核苷酸激酶的终浓度为3.5-4.5U/μL、T4DNAPolymerase终浓度为0.8-1.2U/μL、TaqDNA聚合酶终浓度为0.8-1.2U/μL、Klenow片段终浓度为0.8-1.2U/μL、甘油终浓度为5％～30％；
所述连接反应液中Tris-HCl的终浓度为100-150nM、MgCl2的终浓度为25-30mM、DTT的终浓度为25-30mM、ATP的终浓度为2-3mM、dNTP的终浓度为2-3mM、PEG8000的终浓度为20％-30％；
所述接头中adapter的终浓度为0.5-0.8uM；
所述连接酶中T4连接酶的终浓度为250-350U/μL；
所述PCR扩增引物中P5、P7primer的终浓度为5-15uM；
所述封闭液中HumanCotDNA的终浓度为0.25-0.5mg/μL；
所述杂交反应液中柠檬酸钠的终浓度为10-20mM、硫酸葡聚糖的终浓度为4.5-5.5％、甜菜碱的终浓度为0.8-1.2M、甲酰胺的终浓度为15％～25％、四甲基氯化铵的终浓度为0.8-1.2M、NaCl的终浓度为135-165mM、Probe的终浓度为0.1-0.2nM、甘油的终浓度为5％-30％、吐温的终浓度为0.05％-0.5％；
所述磁珠清洗液中NaCl的终浓度为0.8-1.2M、Tris-HCl的终浓度为5-15mM、EDTA的终浓度为0.8-1.2mM、吐温的终浓度为0.05％-0.5％；
所述洗液1中柠檬酸钠的终浓度为13.5-16.5mM、NaCl的终浓度为135-165mM、SDS的终浓度为0.05％-0.3％；
所述增强洗液中柠檬酸钠的终浓度为13.5-16.5mM、NaCl的终浓度为50-100mM、吐温的终浓度为0.05％-0.5％；
所述洗液2中柠檬酸钠的终浓度为5-10mM、NaCl的终浓度为50-100mM；
所述洗液3中柠檬酸钠的终浓度为2-5mM、NaCl的终浓度为25-35mM；
所述磁珠重悬液中柠檬酸钠的终浓度为10-20mM、硫酸葡聚糖的终浓度为4.5-5.5％、甜菜碱的终浓度为0.8-1.2M、甲酰胺的终浓度为15％～25％、四甲基氯化铵的终浓度为0.8-1.2M、NaCl的终浓度为135-165mM、甘油的终浓度为5％-30％、吐温的终浓度为0.05％-0.5％。
本发明还提供一种自动化NGS文库制备分装试剂盒的自动建库方法包括如下步骤：
S10、试剂和样本准备：将自动化建库试剂盒取出，平衡至室温后振荡混匀，取50μL片段化后的样本至第一反应孔中并离心后备用，转速为1000rpm/min；
S20、末端修复：取末端修复缓冲液至含有末端修复酶的末端修复酶孔中吹打混匀；取末端修复酶孔中的混合液10μL至离心样本中吹打混匀；
S30、接头连接：将连接缓冲液孔中与接头吹打混匀后，取40μL至第一反应孔中；取连接酶10μL至第一反应孔中，吹打混匀；
S40、连接产物纯化：连接程序运行结束后，取99μL吹打混匀的AmpureXPbeads至第一反应孔中并吹打混匀；并进行样本纯化和80％乙醇洗涤；
S50、PCR扩增：取25μLPCR扩增引物至第一反应孔里洗脱晾干的磁珠，并取洗脱上清液至第二反应孔，同时使用水清洗第一反应孔；取25μLPCR反应液至第二反应孔，吹打混匀；
S60、PCR产物纯化：PCR运行结束后，取45μL吹打混匀的AmpureXPbeads至第二反应孔吹打混匀；并对样本进行纯化和80％乙醇洗涤；取40μL水至第二反应孔，吹打混匀；
S70、文库封闭与浓缩：取20μL洗脱液上清至第一反应孔，并清洗第二反应孔并用第一水孔里的水；取20μL封闭液至第一反应，吹打混匀；然后取72μL吹打混匀的AmpureXPbeads至第一反应孔吹打混匀；孵育后进行纯化和并使用80％乙醇进行洗涤；
S80、杂交捕获：从杂交反应液孔取17μL杂交反应液至第一反应孔，吹打混匀；孵育后取全部洗脱上清液至第二反应孔中，运行如下杂交程序；
反应温度 反应时间
95℃ 30s
65℃ 12h
S90、洗涤富集。
在一个实施方式中，所述步骤S90中的洗涤富集包括如下步骤：
从链霉亲和素磁珠孔取50μL吹打混匀的链霉亲和素磁珠至待用孔，并使用磁珠清洗液孔中的磁珠清洗液清洗链霉亲和素磁珠三次；
取磁珠重悬液孔里17μL磁珠重悬液加入待用孔重悬链霉亲和素磁珠；
待杂交程序结束后，将待用孔里的重悬链霉亲和素磁珠全部加入到第二反应孔的杂交液中，吹打混匀，65℃条件下继续孵育45分钟，期间每15min吹打混匀一次；
孵育结束后，使用第一热洗液孔组合中洗液1孔的100μL预热65℃的洗液1清洗一次，然后使用第二热洗液孔组合中两个增强洗液孔里150μL预热65℃的增强洗液清洗两次；之后分别使用常温洗液孔组合中洗液1孔、洗液2孔以及洗液3孔里150μL洗液1、洗液2和洗液3清洗一次；
捕获PCR扩增
取PCR扩增引物孔里25μLPCR扩增引物和PCR反应液孔里25μLPCR反应液至第二反应孔，吹打混匀，运行PCR扩增程序：
运行结束后，PCR产物用第三AmpureXPbeads孔里75μLAMpureXPBeads(1.5X)和第三乙醇孔里80％乙醇进行纯化，取第三水孔里30μL水洗脱文库。
在一个实施方式中，所述步骤2中运行的程序如：反应温度为20℃，反应时间为30min；反应温度为65℃，反应时间为30min；
所述接头连接中的运行程序如：反应温度为20℃；反应时间为25min；
所述杂交捕获运行的程序如：反应温度为95℃，反应时间为30S；反应温度为65℃，反应时间为12h。
在一个实施方式中，所述PCR扩增运行的程序如下：
在一个实施方式中，所述捕获PCR扩增运行的PCR程序为如下：
与现有技术相比，本发明提供的一种自动化NGS文库制备分装试剂盒及建库方法的实施方式至少具有以下有益效果：
本试剂盒为自动化NGS文库制备试剂盒，采用预分装的试剂盒与自动化仪器配合进行文库制备，一键式自动化制备出文库，仪器操作稳定，重复性高；只需1人加入样本后全程无需人员参与，手动操作时间5分钟，同时夜间无人值守也可运行，提高了制备效率；此外，采用全封闭式卡盒，在密封空间内进行反应，实现文库制备零污染。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种自动化NGS文库制备分装试剂盒及建库方法的实施方式的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1为本发明手动建库和仪器自动化建库上靶率比较图。
图2为本发明手动建库和仪器自动化建库上靶率CV值比较。
图3为本发明手动建库和仪器自动化建库均一性比较图。
图4为本发明手动建库和仪器自动化建库均一性CV值比较图。
图5为本发明自动化建库试剂盒各组分孔位分布图。
具体实施方式
现有商业化建库试剂都是手动的，与自动化相比，手动无需考虑体积大小，而自动化试剂首先就要考虑组分体积是否适配于自动化仪器，而日常使用的手动建库试剂盒，其组分之复杂，部分体积之小是无法适配到自动化建库过程中的。
实施例1
为此本发明提供一种自动化NGS文库制备分装试剂盒，包括第一分装试剂组合和第二分装试剂组合以及第二分装试剂组合，所述第一分装试剂组合包括第一热洗液、清洗液、洗脱液，所述第二分装试剂组合包括第二热洗液、常温洗液、建库试剂、捕获试剂；所述第三分装试剂组合包括磁珠试剂。
其中试剂盒中第一分装试剂组合中的第一热洗液包括洗液1；清洗液包括乙醇、水；洗脱液包括水；
第二分装试剂组合中的第二热洗液包括增强洗液；常温洗液包括磁珠清洗液、洗液1、洗液2、洗液3；建库试剂包括末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓冲液、接头、连接酶、PCR扩增引物、PCR反应液；捕获试剂包括封闭液、杂交反应液，磁珠重悬液、PCR扩增引物、PCR反应液；
第三分装试剂组合中的磁珠试剂包括AmpureXPbeads、链霉亲和素磁珠。
本发明自动化NGS文库制备试剂盒采用提前将试剂预分装试剂分装至如图5所示的卡盒底座上，根据不同组分性质以及卡盒底座孔容量，位置、形状等差异，将孔位划分为反应孔组合、热洗液孔组合、常温洗液孔组合、清洗液孔组合、洗脱液孔组合、建库试剂孔组合、捕获试剂孔组合和磁珠试剂孔组合等不同区域，本发明试剂孔位分布和装量如表1所示。
表1
其中在使用自动化NGS文库制备分装试剂盒自动建库时，所需要的第二分装试剂组合的试剂组分及其终浓度、最佳浓度以及第二分装试剂组合中的各试剂的体积比如下表2所示：
/>
表1
除上述自配试剂外，第三分装试剂组合中的Blocker Oligo TS Mix(IDT公司)、KAPA HiFi hotstart ready mix(KAPA Biosysterms)、链霉亲和素磁珠(Invitrogen)、AMpure XP Beads(贝克曼公司)、无水乙醇(国药集团)和水(Invitrogen)等均购自商业化试剂。
实施例2
本发明采用上述自动化建库试剂盒分装至卡盒底座上与自动化建库设备配合自动化建库仪器使用，具体仪器内部运行流程如下：本发明还提供一种自动化NGS文库制备分装试剂盒的自动建库方法包括如下步骤，
S10、试剂和样本准备
将自动化建库试剂盒取出，平衡至室温后振荡混匀，取50μL片段化后的样本并加入到反应孔1。将自动化建库试剂盒放入离心机中离心，1000rpm/min，然后将自动化建库试剂盒放入配套一键式自动化建库仪中，选择对应程序后开始运行，仪器具体运行流程如下：
S20、末端修复
取28号孔里末端修复缓冲液10μL至含有4.3μL末端修复酶的29号孔中，吹打混匀；
取29号孔中末端修复混合液10μL至加入了50μL打断后样本的反应孔1中，吹打混匀；
运行如下末端修复程序：
反应温度 反应时间
20℃ 30min
65℃ 30min
S30、接头连接：末端修复程序运行结束后，取30号孔中35μL连接缓冲液至含有5μL的接头的31号孔中，吹打混匀后，取40μL至反应孔1中；
取32号孔中连接酶10μL至反应孔1中，吹打混匀；
运行如下连接程序：
S40、连接产物纯化
连接程序运行结束后，从44号孔取99μL吹打混匀的Ampure XP beads至1号反应孔，并吹打混匀；
使用自动化建库仪器对样本进行纯化和洗涤(使用12号孔里80％乙醇)；
S50、PCR扩增
取33号孔里25μL PCR扩增引物至1号孔里洗脱晾干的磁珠，并取洗脱上清液至反应孔2，同时清洗反应孔1(使用9号孔里的水)；
取34号孔里25μL PCR反应液至反应孔2，吹打混匀；
运行PCR扩增程序：
S60、PCR产物纯化
PCR运行结束后，从45号孔取45μL吹打混匀的Ampure XP beads至反应孔2，吹打混匀；
使用自动化建库仪器对样本进行纯化和洗涤(使用12号孔里80％乙醇)；
从16号孔取40μL水至反应孔2，吹打混匀；
S70、文库封闭与浓缩
从反应孔2取20μL洗脱液上清至反应孔1，并清洗反应孔2(用9号孔里的水)；
从37号孔取20μL封闭液至反应孔1，吹打混匀；
然后从45号孔取72μL吹打混匀的Ampure XP beads至反应孔1，吹打混匀；
孵育后使用自动化建库仪器对样本进行纯化和洗涤(使用13号孔里80％乙醇)；
S80、杂交捕获
从38号孔取17μL杂交反应液至反应孔1，吹打混匀；
孵育后取全部洗脱上清液至2号反应孔中，运行如下杂交程序：
反应温度 反应时间
95℃ 30s
65℃ 12h
S90、洗涤富集
从46号孔取50μL吹打混匀的链霉亲和素磁珠至11号孔，并使用22号孔磁珠清洗液，清洗链霉亲和素磁珠三次；
取40号孔里17μL磁珠重悬液加入11号孔重悬链霉亲和素磁珠；
待杂交程序结束后，将11号孔里的重悬链霉亲和素磁珠全部加入到2号反应孔的杂交液中，吹打混匀，65℃条件下继续孵育45分钟，期间每15min吹打混匀一次；
孵育结束后，使用10号孔里100μL预热65℃的洗液1清洗一次，然后使用19、20号孔里150μL预热65℃的增强洗液清洗两次；之后分别使用23、24和25号孔里150μL洗液1、洗液2和洗液3清洗一次；
捕获PCR扩增
取42号孔里25μL PCR扩增引物和43号孔25μL PCR反应液至反应孔2，吹打混匀，运行PCR扩增程序：
运行结束后，PCR产物用47号孔里75μL AMpure XP Beads(1.5X)进行纯化(使用15号孔里80％乙醇)，取17号孔里30μL水洗脱文库。
实施例3
对比实验：按照第二分装试剂组合中的组分采用手动建库捕获流程如下：步骤1：末端修复：
在PCR管中加入50μL片段化后DNA，根据以下体系配制反应液；
末端修复组分配方：
组分 体积(μL)
片段化DNA 50
末端修复缓冲液 7
末端修复酶 3
总体积 60
震荡混匀，短暂离心，置于PCR仪上，在PCR仪上运行末端修复程序：
末端修复程序：
反应温度 反应时间
20℃ 30min
65℃ 30min
4℃ ∞
步骤2：连接：程序运行结束后，按照下表加入连接反应液：
接头连接组分配方：
组分 体积(μL)
接头 5
连接缓冲液 30
连接酶 10
无酶水 5
总体积 110
加入连接混合液后，涡旋混匀，短暂离心后在PCR仪上运行连接程序：
接头连接程序：
步骤3：连接反应产物纯化
反应结束后取出PCR反应管，加入99μL(0.9X)已室温平衡30min的XP磁珠对连接反应产物进行纯化；并使用21μL无酶水进行洗脱，取20μL上清至新的PCR管中。
步骤4：PCR扩增
按照下表配制PCR反应体系，加入PCR管充分混匀，短暂离心，此时管内总体积为50μL。
在PCR仪上运行Pre-PCR程序：
Pre-PCR程序:
步骤5：PCR产物回收
PCR结束后，取出PCR反应管，加入45μL(0.9X)AMpure Beads进行纯化，加入41μL无酶水洗脱，并取40μL上清至新的1.5mL离心管中；
对文库进行Qubit定量并记录文库浓度。文库制备完成后可用于捕获。
步骤6：文库封闭与浓缩
在500ng待捕获文库中加入6μL封闭液，混匀后用真空浓缩仪抽干。
步骤7：文库杂交
取17μL杂交反应液加入到上述抽干管中，混匀后静置10min，置于PCR仪上运行杂交程序；
杂交程序:
/>
步骤8：洗涤富集
(1)取50μL平衡至室温的链霉亲和素磁珠，加入100μL磁珠清洗液，混匀后置于磁力架，磁珠完全分离后，去掉上清，同样的方式再清洗所述磁珠两次。
(2)用17μL磁珠重悬液重悬所述磁珠，待杂交程序结束后，将重悬磁珠全部加入杂交结束后的杂交液中，涡旋震荡混匀然后放回PCR仪上在65℃条件下继续孵育45分钟，期间每15min涡旋混匀一次。
(3)孵育结束后，将100μL预热65℃的洗液1加入到上述杂交液中，混匀后置于磁力架。所述磁珠完全分离后，立即去掉上清，然后加入150μL预热65℃的增强洗液，混匀后置于磁力架，所述磁珠完全分离，立即去掉上清，同样的方式用150μL预热65℃的所述增强洗液重复清洗一次。
(4)加入室温保存的150μL洗液1，涡旋震荡30s，静置30s，2min后短暂离心，然后静置于磁力架上，所述磁珠完全分离后去掉上清，然后以同样的方式依次用室温保存的150μL的洗液2、150μL的洗液3清洗所述磁珠。
(5)加入21μL无酶水重悬所述磁珠，取20μL上清至新的PCR管中，然后加入25μLPCR反应液和5μLPCR扩增引物，混匀后PCR仪上运行Post-PCR程序：
Post-PCR反应程序:
所述PCR产物用75μL AMpure XP Beads(1.5X)进行纯化，对捕获文库进行Qubit定量及片段大小分析。
实施例4
手动建库和自动化建库比较
为了比较手动建库和自动化建库之间的准确性和稳定性，分别使用三个人员，三台仪器，对四个样本进行建库，并对测序结果进行分析，考察手动和仪器之间的差异。手动操作流程见对比实施例1.
本发明自动化建库试剂盒与自动化建库仪配套使用，操作流程如下：
将自动化建库试剂盒底座从-20±5℃冰箱中取出，平衡至室温后振荡混匀；将磁珠部分从2-8℃取出，使用震荡仪充分混匀后放入试剂底座中。取25μL打断后的样本并加入到1号反应孔，将自动化建库试剂盒放入离心机中离心，1000rpm/min，然后将自动化建库试剂盒放入配套一键式自动化建库仪中，选择对应程序后开始运行。具体运行流程见实施例1.
仪器运行结束后，弹出卡盒，将2号反应孔中所有组分全部转移至新的1.5mLEP管中，做好标记，然后将EP管置于磁力架上，待溶液澄清后小心吸取上清至与新的样本收集管中，即为纯化好的文库，文库-20±5℃保存。对捕获文库进行生信分析，上靶率分析结果如图1、图2，均一性分析结果如图3、图4.
从图1和图2中可以看出，不同人员手动建库上靶率有高有低，波动较大，上靶率CV值较仪器建库大，结果不如仪器建库稳定。从图3和图4中可以看出，无论仪器还是手动建库，均一性都较好，但是从稳定性方面来看，仪器建库均一性CV值更小，更加稳定。相较于手动，仪器能把NGS文库制备做好很不容易，目前市面上商品化的手动试剂盒组分比本申请要复杂，组分更多，体积要更小，还没有自动化试剂盒，而且并非所有的试剂都是适合自动化建库的试剂；本发明对试剂盒进行预分装并对试剂体系进行调整，以使试剂盒更加适应仪器进行检测，且建库均一性CV值更小，更加稳定。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种自动化NGS文库制备分装试剂盒，其特征在于，包括：第一分装试剂组合和第二分装试剂组合以及第三分装试剂组合，所述第一分装试剂组合包括第一热洗液、清洗液、洗脱液，所述第二分装试剂组合包括第二热洗液、常温洗液、建库试剂、捕获试剂；所述第三分装试剂组合包括磁珠试剂。
2.根据权利要求1所述的一种自动化NGS文库制备分装试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中：
所述第一分装试剂组合中的第一热洗液包括洗液1；清洗液包括乙醇、水；洗脱液包括水；
所述第二分装试剂组合中的第二热洗液包括增强洗液；常温洗液包括磁珠清洗液、洗液1、洗液2、洗液3；建库试剂包括末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓冲液、接头、连接酶、PCR扩增引物、PCR反应液；捕获试剂包括封闭液、杂交反应液，磁珠重悬液、PCR扩增引物、PCR反应液；
第三分装试剂组合中的磁珠试剂包括Ampure XP beads、链霉亲和素磁珠。
3.根据权利要求2所述的一种自动化NGS文库制备分装试剂盒，其特征在于：
所述末端修复缓冲液包括：Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP；
所述末端修复酶包括：T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA Polymerase、Taq DNA聚合酶、Klenow片段、甘油；
所述连接反应液包括：Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dNTP、PEG8000、水；
所述接头包括adapter；
所述连接酶包括T4连接酶；
所述PCR反应液包括KAPA HiFi hotstart ready mix；
所述PCR扩增引物包括P5、P7 primer；
所述封闭液包括Human Cot DNA、Blocker Oligo TS Mix；
所述杂交反应液包括柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、甜菜碱、甲酰胺、四甲基氯化铵、NaCl、Probe、水、甘油、吐温；
所述磁珠清洗液包括NaCl、Tris-HCl、EDTA、吐温、水；
所述洗液1包括柠檬酸钠、NaCl、SDS；
所述增强洗液包括柠檬酸钠、NaCl、吐温；
所述洗液2包括柠檬酸钠、NaCl、水；
所述洗液3包括柠檬酸钠、NaCl、水；
所述磁珠重悬液包括柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、甜菜碱、甲酰胺、四甲基氯化铵、NaCl、水、甘油、吐温。
4.根据权利要求2所述的一种自动化NGS文库制备分装试剂盒，其特征在于：
所述热洗液中洗液1的体积为150μl；
所述第一清洗液中乙醇等体积分为三份，且每份乙醇的体积为500μl，乙醇的浓度为80％；
所述洗脱液中分装为两份水，两份所述水的体积分别为50μl和60μl；
所述第二热洗液中的增强洗液分装成两份，体积均为200μl；
所述常温洗液中的磁珠清洗液的体积为320μl，洗液1、洗液2、洗液3的体积均为175μl；
所述建库试剂中末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓冲液、接头、连接酶、PCR扩增引物以及PCR反应液的体积分别为10μl、4.3μl、40μl、5μl、15μl、30μl、30μl；
所述捕获试剂中的封闭液、杂交反应液、磁珠重悬液、PCR扩增引物、PCR反应液的体积分别为25μl、20μl、20μl、30μl、30μl；
所述磁珠试剂中的Ampure XP beads分为三份，体积分别为120μl、150μl、100μl；所述链霉亲和素磁珠的体积为60μl。
5.根据权利要求2-4任一所述的一种自动化NGS文库制备分装试剂盒，其特征在于：
所述末端修复缓冲液中：Tris-HCl的终浓度为150-250mM、MgCl2的终浓度为35-45mM、DTT的终浓度为35-45mM、ATP的终浓度为3.5-4.5mM、dATP终浓度为10-20mM、dCTP终浓度为1.0-2.0mM、dGTP的终浓度为1.0-2.0mM、dTTP的终浓度为1.0-2.0mM；
所述末端修复酶中T4多聚核苷酸激酶的终浓度为3.5-4.5U/μL、T4 DNA Polymerase终浓度为0.8-1.2U/μL、Taq DNA聚合酶终浓度为0.8-1.2U/μL、Klenow片段终浓度为0.8-1.2U/μL、甘油终浓度为5％-30％；
所述连接反应液中Tris-HCl的终浓度为100-150nM、MgCl2的终浓度为25-30mM、DTT的终浓度为25-30mM、ATP的终浓度为2-3mM、dNTP的终浓度为2-3mM、PEG8000的终浓度为20％-30％；
所述接头中adapter的终浓度为0.5-0.8uM；
所述连接酶中T4连接酶的终浓度为250-350U/μL；
所述PCR扩增引物中P5、P7 primer的终浓度为5-15uM；
所述封闭液中Human Cot DNA的终浓度为0.25-0.5mg/μL；
所述杂交反应液中柠檬酸钠的终浓度为10-20mM、硫酸葡聚糖的终浓度为4.5-5.5％、甜菜碱的终浓度为0.8-1.2M、甲酰胺的终浓度为15％～25％、四甲基氯化铵的终浓度为0.8-1.2M、NaCl的终浓度为135-165mM、Probe的终浓度为0.1-0.2nM、甘油的终浓度为5％-30％、吐温的终浓度为0.05％-0.5％；
所述磁珠清洗液中NaCl的终浓度为0.8-1.2M、Tris-HCl的终浓度为5-15mM、EDTA的终浓度为0.8-1.2mM、吐温的终浓度为0.05％-0.5％；
所述洗液1中柠檬酸钠的终浓度为13.5-16.5mM、NaCl的终浓度为135-165mM、SDS的终浓度为0.05％-0.3％；
所述增强洗液中柠檬酸钠的终浓度为13.5-16.5mM、NaCl的终浓度为50-100mM、吐温的终浓度为0.05％-0.5％；
所述洗液2中柠檬酸钠的终浓度为5-10mM、NaCl的终浓度为50-100mM；
所述洗液3中柠檬酸钠的终浓度为2-5mM、NaCl的终浓度为25-35mM；
所述磁珠重悬液中柠檬酸钠的终浓度为10-20mM、硫酸葡聚糖的终浓度为4.5-5.5％、甜菜碱的终浓度为0.8-1.2M、甲酰胺的终浓度为15％～25％、四甲基氯化铵的终浓度为0.8-1.2M、NaCl的终浓度为135-165mM、甘油的终浓度为5％-30％、吐温的终浓度为0.05％-0.5％。
6.应用自动化NGS文库分装卡盒底座的自动建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10、试剂和样本准备：将自动化建库试剂盒取出，平衡至室温后振荡混匀，取50μL片段化后的样本至第一反应孔中并离心后备用，转速为1000rpm/min；
S20、末端修复：取末端修复缓冲液至含有末端修复酶的末端修复酶孔中吹打混匀；取末端修复酶孔中的混合液10μL至离心样本中吹打混匀；
S30、接头连接：将连接缓冲液孔中与接头吹打混匀后，取40μL至第一反应孔中；取连接酶10μL至第一反应孔中，吹打混匀；
S40、连接产物纯化：连接程序运行结束后，取99μL吹打混匀的Ampure XP beads至第一反应孔中并吹打混匀；并进行样本纯化和80％乙醇洗涤；
S50、PCR扩增：取25μL PCR扩增引物至第一反应孔里洗脱晾干的磁珠，并取洗脱上清液至第二反应孔，同时使用水清洗第一反应孔；取25μL PCR反应液至第二反应孔，吹打混匀；
S60、PCR产物纯化：PCR运行结束后，取45μL吹打混匀的Ampure XP beads至第二反应孔吹打混匀；并对样本进行纯化和80％乙醇洗涤；取40μL水至第二反应孔，吹打混匀；
S70、文库封闭与浓缩：取20μL洗脱液上清至第一反应孔，并清洗第二反应孔并用第一水孔里的水；取20μL封闭液至第一反应，吹打混匀；然后取72μL吹打混匀的Ampure XPbeads至第一反应孔吹打混匀；孵育后进行纯化和并使用80％乙醇进行洗涤；
S80、杂交捕获：从杂交反应液孔取17μL杂交反应液至第一反应孔，吹打混匀；孵育后取全部洗脱上清液至第二反应孔中，运行如下杂交程序；
反应温度 反应时间 95℃ 30s 65℃ 12h
S90、洗涤富集。
7.根据权利要求6中应用自动化NGS文库分装卡盒底座的自动建库方法，其特征在于：所述步骤S90中的洗涤富集包括如下步骤：
从链霉亲和素磁珠孔取50μL吹打混匀的链霉亲和素磁珠至待用孔，并使用磁珠清洗液孔中的磁珠清洗液清洗链霉亲和素磁珠三次；
取磁珠重悬液孔里17μL磁珠重悬液加入待用孔重悬链霉亲和素磁珠；
待杂交程序结束后，将待用孔里的重悬链霉亲和素磁珠全部加入到第二反应孔的杂交液中，吹打混匀，65℃条件下继续孵育45分钟，期间每15min吹打混匀一次；
孵育结束后，使用第一热洗液孔组合中洗液1孔的100μL预热65℃的洗液1清洗一次，然后使用第二热洗液孔组合中两个增强洗液孔里150μL预热65℃的增强洗液清洗两次；之后分别使用常温洗液孔组合中洗液1孔、洗液2孔以及洗液3孔里150μL洗液1、洗液2和洗液3清洗一次；
捕获PCR扩增
取PCR扩增引物孔里25μL PCR扩增引物和PCR反应液孔里25μL PCR反应液至第二反应孔，吹打混匀，运行PCR扩增程序：
运行结束后，PCR产物用第三Ampure XP beads孔里75μL1.5X AMpure XP Beads和第三乙醇孔里80％乙醇进行纯化，取第三水孔里30μL水洗脱文库。
8.根据权利要求6所述的应用自动化NGS文库分装卡盒底座的自动建库方法，其特征在于：
所述步骤2中运行的程序如：反应温度为20℃，反应时间为30min；反应温度为65℃，反应时间为30min；
所述接头连接中的运行程序如：反应温度为20℃；反应时间为25min；
所述杂交捕获运行的程序如：反应温度为95℃，反应时间为30S；反应温度为65℃，反应时间为12h。
9.根据权利要求6所述的应用自动化NGS文库分装卡盒底座的自动建库方法，其特征在于：所述PCR扩增运行的程序如下：
10.根据权利要求9所述的应用自动化NGS文库分装卡盒底座的自动建库方法，其特征在于：所述捕获捕获PCR扩增运行的PCR程序为如下：
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