CN117700408A - 一种新的蛋白酪氨酸磷酸酶shp-1抑制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP‑1抑制剂及其应用。式(I)所示的化合物F065‑0410在制备蛋白质酪氨酸磷酸酶shp‑1特异性抑制剂中的应用。该化合物对SHP‑1的活性有强烈的抑制作用，而对SHP‑2的活性几乎没有影响。实验证明F065‑0410能够调控II型糖尿病模型小鼠血糖浓度，给荷瘤小鼠注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP‑1抑制剂F065‑0410后，肿瘤生长受到强烈抑制，小鼠的生存率显著提高。可见，F065‑0410能够在制备蛋白质酪氨酸磷酸酶shp‑1抑制剂中应用，能够在制备与蛋白质酪氨酸磷酸酶shp‑1活力过高或过表达异常相关的疾病的药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，涉及一种新的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂及其应用。
背景技术
SHP-1(又称HCP、SHPTP1、PTP1C或PTPN6)是主要在造血细胞和上皮细胞中表达，在其他组织的细胞中仅有少量表达的蛋白质酪氨酸磷酸酶。SHP-1除了包含保守的酪氨酸磷酸酶催化序列外，其N端还含有两个串联Src同源结构域(SH2)，这两个结构域是磷酸化的蛋白质酪氨酸的结合结构域，介导PTP与其底物的相互作用，C端尾部含有两个磷酸化位点。SHP-1的酶活性受到其SH2结构域的调控，在缺乏激活信号时，N端SH2结构域会与磷酸酶结构域形成分子内相互作用，并且使蛋白处于自抑制的非活化状态；当有配体与两个SH2结构域结合时，SHP-1的N端SH2结构域转移到C端SH2结构域的另一侧，并使C端SH2结构域逆时针旋转，导致磷酸酶结构域的暴露，从而与底物结合，从而磷酸化修饰底物。SHP-1在细胞内信号调节过程中发挥了十分重要的作用，其活性的异常变化会导致细胞内环境的紊乱，从而导致包括癌症、糖尿病等多种疾病。
因此，鉴定SHP-1的特异性抑制剂不仅可用于多种癌症的治疗，还有望应用于糖尿病等代谢性疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供F065-0410作为蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
式(I)所示的化合物F065-0410在制备蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1特异性抑制剂中的应用，
F065-0410在制备治疗与蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1活力过高或过表达异常相关的疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的与蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1活力过高或过表达异常相关的疾病包括但不限于糖尿病、肥胖症、免疫缺陷、癌症中的任意一种。
作为本发明的一种优选，所述的癌症为白血病或实体癌，所述的实体癌优选黑色素瘤、肺癌、结肠癌。
作为本发明的一种优选，所述药物的剂型包括注射剂、片剂或胶囊。
一种蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1特异性抑制剂组合物，包含所述的化合物F065-0410和药用辅料。
所述的药用辅料优选以化合物F065-0410为有效成分制备注射剂、片剂或胶囊所需的药用辅料。
有益效果：
本发明通过特定方法从250万种化合物中筛选出一种具有蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1特异性抑制活性的化合物F065-0410，该化合物对SHP-1的活性有强烈的抑制作用，而对SHP-2的活性几乎没有影响。实验证明F065-0410能够调控II型糖尿病模型小鼠血糖浓度，在体内可以发挥降低血糖、治疗糖尿病的作用。并且给荷瘤小鼠注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410后，肿瘤生长受到强烈抑制，小鼠的生存率显著提高。由此说明，蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410在体内可以发挥抑制肿瘤生长的作用。可见，F065-0410能够在制备蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1抑制剂中应用，能够在制备与蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1活力过高或过表达异常相关的疾病的药物中应用。
附图说明
图1化合物F065-0410对SHP-1和SHP-2活性的抑制效果。
图2化合物F065-0410的合成路径。
图3化合物F065-0410核磁图谱。
图4蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410调控II型糖尿病模型小鼠血糖浓度。
图5蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410抑制黑色素瘤生长(A)，提高小鼠生存率(B)。
图6蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410抑制肺癌生长(A)，提高小鼠生存率(B)。
图7蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410抑制结肠癌生长(A)，提高小鼠生存率(B)。
具体实施方式
实施例1蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂筛选
1)从PDB蛋白质数据库下载人SHP-1蛋白结构数据(PDB ID:2B30),定义其单体形式中别构位点为分子对接活性位点,使用薛定谔软件包(Schrodinger)中Glide对接算法对ChemDiv商用化合物数据库包含的约250万种化合物进行虚拟筛选，计算完成后对排名前1000的化合物分子进行基于Lipinski类药规则、聚类分析等筛选，获得排序前100的多样性分子并进行化学合成。
2)基于蛋白质酪氨酸磷酸酶可以催化对硝基苯磷酸Tris盐(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)分解形成黄色的对硝基苯酚，而对硝基苯酚在405nm有特异性吸收峰的原理，我们构建了筛选SHP-1抑制剂的实验体系。自abcam公司购买纯化的SHP-1蛋白(abcam,ab51289)按照下列反应体系筛选SHP-1抑制剂。反应体系：Mops(3-(N-吗啉代)丙磺酸)-NaOH(25Mm)、DTT(1Mm)、NaCl(0.1M)、EDTA(1mM)、BSA(1mg/mL)、p-NPP(4Mm)、SHP-1重组蛋白(10ug/ml)、待筛选小分子化合物按照溶解度进行2倍梯度稀释(实验孔)。以不加小分子化合物为对照(对照孔)，反应体系：Mops(3-(N-吗啉代)丙磺酸)-NaOH(25Mm)、DTT(1Mm)、NaCl(0.1M)、EDTA(1mM)、BSA(1mg/mL)、p-NPP(4Mm)、SHP-1重组蛋白(10ug/ml)。以不加小分子化合物和SHP-1蛋白为空白对照(空白对照孔)，反应体系：Mops(3-(N-吗啉代)丙磺酸)-NaOH(25Mm)、DTT(1Mm)、NaCl(0.1M)、EDTA(1mM)、BSA(1mg/mL)、p-NPP(4Mm)。上述反应体系在37℃反应30分钟，以NaHCO3终止反应，在405nm处测定其OD值。抑制效率计算公式为Inhibitory rate＝[实验孔OD值-空白对照孔OD值]/[对照孔OD值-空白对照孔OD值]。
3)利用SHP-2蛋白(abcam,ab268899)筛查由第2)步筛选出的潜在的SHP-1抑制剂，观察其对SHP-2的抑制作用。反应体系：Mops(3-(N-吗啉代)丙磺酸)-NaOH(25Mm)、DTT(1Mm)、NaCl(0.1M)、EDTA(1mM)、BSA(1mg/mL)、p-NPP(4Mm)、SHP-2重组蛋白(10ug/ml)、小分子化合物按照溶解度进行2倍梯度稀释。以不加小分子化合物为对照(对照孔)，反应体系：Mops(3-(N-吗啉代)丙磺酸)-NaOH(25Mm)、DTT(1Mm)、NaCl(0.1M)、EDTA(1mM)、BSA(1mg/mL)、p-NPP(4Mm)、SHP-2重组蛋白(10ug/ml)。以不加小分子化合物和SHP-2蛋白为空白对照(空白对照孔)，反应体系：Mops(3-(N-吗啉代)丙磺酸)-NaOH(25Mm)、DTT(1Mm)、NaCl(0.1M)、EDTA(1mM)、BSA(1mg/mL)、p-NPP(4Mm)。上述反应体系在37℃反应30分钟，以NaHCO3终止反应，在405nm处测定其OD值。抑制效率计算公式为Inhibitory rate＝[实验孔OD值-空白对照孔OD值]/[对照孔OD值-空白对照孔OD值]。
测试结果：根据虚拟筛选，我们一共获得了100个潜在的可能抑制SHP-1活性的小分子抑制剂。随后利用自abcam公司购买的纯化的SHP-1蛋白(abcam,ab51289)对由虚拟筛选的小分子抑制剂进行筛选。筛选结果显示化合物F065-0410能够显著抑制SHP-1的活性。进一步的利用SHP-2蛋白，我们发现物F065-0410对SHP-1的活性有强烈的抑制作用，而SHP-2的活性几乎没有影响(图1)。上述结果说明，物F065-0410是SHP-1特异性抑制剂。
实施例2.化合物F065-0410的合成
1)将2.4mmol 2-amino-6-methoxybenzothiazole(图2化合物1),3.6mmol N-Bocproline(图2化合物2)与3.6mmol l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)，3.6mmol diisopropylethylamine和0.5mmol 4-dimethylaminopyridine在8ml无水N，N-二甲基甲酰胺(anhydrous N,N-dimethylformamide)种搅拌反应20小时。用5ml水终止上述反应后，加入50ml乙酸乙酯,随后用5ml乙酸乙酯提取水层两次。将有机层合并，并分别用1NHCL(10ml)、10ml饱和碳酸氢钠(saturated NaHC03)、20ml水(两次)和10ml生理盐水洗涤。洗涤后的有机层在减压状态下通过浓缩的Na2S04过滤，随后使用20-30％的乙酸乙酯通过快速柱层析纯化得到白色固体。将白色固体溶解在含有1：1混合的1,4-dioxane:1,4-dioxane的4N HCl中搅拌3小时。搅拌结束后，在减压条件下去除溶剂，并分别用5ml乙酸乙酯和5ml乙醚洗涤沉淀。沉淀干燥后即得到化合物3(图2化合物3)。
2)向圆底烧瓶中加入化合物3(1.0当量)，乙基4-(氯磺酰基)-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸磺酰氯(ethyl 4-(chlorosulfonyl)-1-methyl-1H-pyrrole-2-carboxylatesulfonylchloride)(图2化合物4)(1.0当量)和乙腈(acetonitrile)。向混合物中加入吡啶(Pyridine)(2.5当量)搅拌14小时。搅拌14小时后，将反应液通过硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯：环己烷＝1:1+0.1％TFA)即可得到化合物F065-0410。利用核磁鉴定合成的化合物，核磁数据如下：'HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(d,J＝8.9Hz,1H),7.32(d,J＝17Hz,1H),7.28(d,J＝25Hz,1H),7.21(d,J＝20Hz,1H),7.04(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),4.30(q,J＝7.1Hz,2H),3.98(s,3H),3.87(s,3H),3.71-3.61(m,1H),2.39-2.16(m,2H),1.89-1.80(m,4H),1.36(t,J＝7.1Hz,3H)(图3)。
实施例3.蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410调控II型糖尿病模型小鼠血糖浓度
1)取健康C57BL/6小鼠20只，每日上午给予腹腔注射5mg/ml STZ溶液，连续注射5天。另设10只对照组小鼠，每日腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。小鼠饮用自来水，饲以小鼠常规饲料。每天观察饮水进食情况，造模后每天检测一次体重，造模一周后每周检测一次血糖。
2)在注射STZ溶液后的第14天，对于注射STZ溶液的小鼠随机分成两组，一组小鼠正常培养，另一组小鼠注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410(5mg/kg),每两天注射一次。注射抑制剂后，每天检测一次体重，每5天检测一次血糖。
测试结果：采用STZ建模后，每周检测一次血糖。结果显示建模第14天后，小鼠平均血糖明显升高(图3)。注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410后，每隔5天进行一次空腹血糖浓度的测定。将注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410(STZ+F065-0410)的小鼠血糖浓度与不注射抑制剂的小鼠模型(STZ)对比,没有经过治疗的STZ小鼠血糖长期维持在30mmol/L的高血糖水平，而注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410的STZ小鼠，其血糖水平逐渐降低，病最终恢复到正常水平(图4)。由此说明，蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410在体内可以发挥降低血糖、治疗糖尿病的作用。
实施例4.蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410抑制黑色素瘤生长
30只8周的C57BL/6雄性小鼠，每只小鼠在腋下植入106个小鼠黑色素瘤B16肿瘤细胞，每天测量肿瘤大小，待肿瘤生长至5毫米×5毫米×5毫米时，随机将小鼠分成三组，每组10只。第一组，不做处理，继续观察肿瘤生长情况；第二组，腹腔注射生理盐水；第三组，腹腔注射生理盐水溶解的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410(5毫克/千克/天)。每两天检测一次肿瘤大小。待有小鼠肿瘤生长至1000立方毫米时，处死小鼠。观察小鼠生存率(小鼠肿瘤生长至1000立方毫米即认为小鼠死亡)。
测试结果：如图5所示，注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410后，肿瘤生长受到强烈抑制(图5A)，小鼠的生存率显著提高(图5B)。由此说明，蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410在体内可以发挥抑制肿瘤生长的作用。
实施例5.蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410抑制肺癌生长
购买30只8周的C57BL/6雄性小鼠，每只小鼠在腋下植入106个小鼠肺癌细胞LLC细胞，每天测量肿瘤大小，待肿瘤生长至5毫米×5毫米×5毫米时，随机将小鼠分成三组，每组10只。第一组，不做处理，继续观察肿瘤生长情况；第二组，腹腔注射生理盐水；第三组，腹腔注射生理盐水溶解的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410(5毫克/千克/天)。每两天检测一次肿瘤大小。待有小鼠肿瘤生长至1000立方毫米时，处死小鼠。观察小鼠生存率(小鼠肿瘤生长至1000立方毫米即认为小鼠死亡)。
测试结果：如图6所示，注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410后，肺癌细胞生长受到强烈抑制(图6A)，小鼠的生存率显著提高(图6B)。由此说明，蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410在体内可以发挥抑制肺癌生长的作用。
实施例6.蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410抑制结肠癌生长
购买30只8周的C57BL/6雄性小鼠，每只小鼠在腋下植入106个小鼠结肠癌MC38细胞，每天测量肿瘤大小，待肿瘤生长至5毫米×5毫米×5毫米时，随机将小鼠分成三组，每组10只。第一组，不做处理，继续观察肿瘤生长情况；第二组，腹腔注射生理盐水；第三组，腹腔注射生理盐水溶解的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410(5mg/kg/daily)。每两天检测一次肿瘤大小。待有小鼠肿瘤生长至1000立方毫米时，处死小鼠。观察小鼠生存率(小鼠肿瘤生长至1000立方毫米即认为小鼠死亡)。
测试结果：如图7所示，注射蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410后，结肠癌生长受到强烈抑制(图7A)，小鼠的生存率显著提高(图7B)。由此说明，蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂F065-0410在体内可以发挥抑制结肠癌生长的作用。
Claims (7)
1.式(I)所示的化合物F065-0410在制备蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1特异性抑制剂中的应用，
2.F065-0410在制备治疗与蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1活力过高或过表达异常相关的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述的与蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1活力过高或过表达异常相关的疾病包括但不限于糖尿病、肥胖症、免疫缺陷、癌症中的任意一种。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述的癌症为白血病或实体癌，所述的实体癌选自黑色素瘤、肺癌、结肠癌。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、片剂或胶囊。
6.一种蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1特异性抑制剂组合物，其特征在于包含权利要求1中所述的化合物F065-0410和药用辅料。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于所述的药用辅料为以化合物F065-0410为有效成分制备注射剂、片剂或胶囊所需的药用辅料。
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