CN117695242A - 环二核苷酸自组装纳米粒子及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物递送技术领域，具体涉及环二核苷酸自组装纳米粒子及其制备和应用。本发明提供一种自组装纳米粒子CDN NPs及其制备方法和在制备疫苗佐剂、疫苗组合物、抗肿瘤药物中的用途，本发明提供的无载体递送的CDN自组装纳米粒子(CDN NPs)可显著提升CDNs的细胞摄取效率；此外，CDN NPs可显著激活抗原提呈细胞、抑制肿瘤生长和提升荷瘤小鼠的存活期；CDN NPs与免疫检查点抑制剂的联用可以进一步提升肿瘤免疫治疗效果；CDN NPs可作为疫苗佐剂，显著提升抗原特异性抗体滴度。
Description
技术领域
本发明涉及药物递送技术领域，具体涉及环二核苷酸自组装纳米粒子及其制备和应用。
背景技术
近年来，基于免疫调控的免疫治疗逐渐成为免疫性疾病治疗的主流趋势，以肿瘤的免疫治疗为例，如何打破肿瘤微环境的免疫抑制、提升肿瘤免疫原性是决定肿瘤免疫治疗疗效的关键因素。干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)是近年来发现的一种表达于内质网膜上的跨膜蛋白，它分布于各类哺乳动物细胞中，天然的环二核苷酸(cyclic dinucleotides,CDNs)是STING蛋白的主要配体。CDNs结合STING后引起信号通路的活化，从而促进I型干扰素等各种促炎细胞因子的表达，进而启动适应性免疫反应。作为抗病毒、抗菌和抗肿瘤免疫治疗的重要靶点，STING激动剂的开发已成为当前的研究热潮，以环二核苷酸及其衍生物为主的STING激动剂已逐步进入临床研究阶段，全球众多知名药企如诺华、默克、百时美施贵宝、成都先导等纷纷报道了STING激动剂的临床研究项目。然而，CDNs分子量小，亲水性强、负电荷多、易酶解等缺陷导致其生物利用率低、半衰期短和成药性不足，这成为CDNs临床应用的主要障碍。因此，设计、开发新型CDNs递送平台对推动其后续临床应用十分重要。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种自组装纳米粒子CDN NPs及其制备方法和在制备疫苗佐剂、疫苗组合物、抗肿瘤药物中的用途，本发明提供的无载体递送的CDN自组装纳米粒子(CDN NPs)可显著提升CDNs的细胞摄取效率；此外，CDN NPs可显著激活抗原提呈细胞、抑制肿瘤生长和提升荷瘤小鼠的存活期；CDN NPs与免疫检查点抑制剂的联用可以进一步提升肿瘤免疫治疗效果；CDN NPs可作为疫苗佐剂，显著提升抗原特异性抗体滴度。
为此，本发明第一方面提供一种自组装纳米粒子。根据本发明的一些实施方案，所述自组装纳米粒子包括二价或三价金属离子中的至少之一、一价金属离子、CDN类化合物或其衍生物，
其中，所述一价金属离子与所述CDN类化合物或其衍生物相互作用(如氢键、π-π堆积等)形成CDN寡聚体，所述二价或三价金属离子中的至少之一与所述CDN寡聚体相互作用(如正负电荷相互作用等)组装为纳米粒子；
所述CDN类化合物为含有至少一个碱基G的环二核苷酸或其衍生物。
关于CDNs类药物的递送，通常是将CDNs包载于脂质体、聚合物、外泌体、脂质纳米颗粒、水凝胶等纳米载体中，可提升CDNs的生物利用率和半衰期，同时提升其免疫治疗效果。但是纳米载体本身具有生物安全性隐患、载药能力有限等问题，这种纳米载体内源性问题不利于纳米药物的临床转化。发明人发现，通过掺入正电荷可以有效屏蔽CDNs的负电荷，使得CDNs的无载体递送方式可规避纳米载体的内源性问题，有利于快速实现CDNs的临床转化。并且，发明人创造性地发现上述的无载体递送的CDN自组装纳米粒子(CDN NPs)可显著提升CDNs的细胞摄取效率；此外，CDN NPs可显著激活抗原提呈细胞、抑制肿瘤生长和提升荷瘤小鼠的存活期；CDN NPs与免疫检查点抑制剂的联用可以进一步提升肿瘤免疫治疗效果；CDN NPs可作为疫苗佐剂，显著提升抗原特异性抗体滴度。因此，本发明提供的无载体递送的CDN NPs可广泛应用于癌症免疫治疗和抗病毒、抗菌等领域。
根据本发明的一些实施方案，所述CDN类化合物的结构通式为：
其中，B选自天然碱基A、T、C、G、U及非天然碱基中的任一种；
X1和X2各自独立地选自-H、-OH、卤素、-NH2、-N3、-CH＝CH2、-C≡CH中的任一种；
Y1和Y2各自独立地选自O、S中的任一种。
根据本发明的一些实施方案，所述非天然碱基选自人造碱基或经修饰的天然碱基。
根据本发明的一些实施方案，所述经修饰的天然碱基为I(次黄嘌呤)或mC(5-甲基胞嘧啶)。
根据本发明的一些实施方案，所述一价金属离子选自Na+、K+、NH4 +、Li+中的至少之一。根据本发明的一些实施方案，所述二价金属离子选自Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Co2 +、Ni2+、Pb2+、Sn2+、Cr2+、Sr2+、Ba2+、Hg2+、Cd2+中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案，所述三价金属离子选自Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、镧系三价金属离子(例如Ln3+或其他的镧系金属离子)、锕系三价金属离子中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案，所述相互作用包括正负电荷相互作用、氢键、π-π堆积作用。
根据本发明的一些实施方案，本发明提供的一价金属离子与CDN类化合物之间通过共价键或非共价键，例如氢键或者CDN类化合物之间的π-π堆积，获得CDNs寡聚体。
根据本发明的一些实施方案，本发明提供的二价和/或三价金属离子与CDNs寡聚体之间通过正负电荷相互作用(静电相互作用)，从而获得自组装纳米粒子CDN NPs。
根据本发明的一些实施方案，所述自组装纳米粒子的直径为100nm-2μm，优选100-500nm，进一步优选150-200nm。
本发明提供的自组装纳米粒子，直径在100nm-2μm范围内，能够进一步提升CDNs的细胞摄取效率，显著激活抗原提呈细胞。
本发明第二方面提供制备第一方面所述的自组装纳米粒子的方法。根据本发明的一些实施方案，所述方法包括：
(1)将所述CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子接触，获得CDN寡聚体；
(2)将所述CDN寡聚体与所述二价或三价金属离子中的至少之一接触，获得自组装纳米粒子。
本发明采用一锅法制备无载体递送的CDNs自组装纳米粒子(CDN NPs)，本发明方法制备的CDN NPs可显著提升CDNs的细胞摄取效率；CDN NPs可显著激活抗原提呈细胞、抑制肿瘤生长和提升荷瘤小鼠的存活期；CDN NPs与免疫检查点抑制剂的联用可以进一步提升肿瘤免疫治疗效果；CDN NPs可作为疫苗佐剂，显著提升抗原特异性抗体滴度。因此，本发明提供的无载体递送的CDN NPs可广泛应用于癌症免疫治疗和抗病毒、抗菌等领域。
根据本发明的一些实施方案，步骤(1)中，所述CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子的摩尔比不大于1:2。过量的一价金属离子，特别是CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子的摩尔比不大于1:2时，更有利于CDN类化合物或其衍生物形成寡聚体，便于CDN寡聚体自组装为CDN NPs。
根据本发明的一些实施方案，所述CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子的摩尔比为1:10-1:200，例如可以是1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:70、1:100、1:150、1:200及其中间的任意值。
在CDN NPs的制备过程中，当CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子的摩尔比1:10-1:200，优选为1:20-1:100，能够进一步提升CDN类化合物或其衍生物形成寡聚体的效率，提升CDN寡聚体自组装为CDN NPs的效率。
根据本发明的一些实施方案，步骤(2)中，所述CDN类化合物或其衍生物与二价或三价金属离子的摩尔比不大于1:1，优选1:2-1:200，例如1:2、1:4、1:8、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:70、1:100、1:150、1:200，进一步优选1:2-1:10，更进一步优选1:4。由此能够进一步提升CDN寡聚体自组装为CDN NPs的效率。
根据本发明的一些实施方案，步骤(1)中，所述CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子是在缓冲液中接触的，所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案，步骤(1)中的接触时间为1-12h。
根据本发明的一些实施方案，步骤(2)中的接触时间为4-24h。
本发明第三方面提供一种药物组合物。根据本发明的一些实施方案，所述药物组合物包括第一方面所述的自组装纳米粒子和/或第二方面所述的方法制备获得的自组装纳米粒子。
根据本发明的一些实施方案，所述药物组合物进一步包括免疫检查点抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂包括选自anti-PD-1、anti-PD-L1、anti-CTLA-4、anti-LAG-3、anti-TIM-3、anti-TIGIT、anti-CD47中的至少之一。
本发明第四方面提供一种疫苗佐剂。根据本发明的一些实施方案，所述疫苗佐剂包括第一方面所述的自组装纳米粒子和/或第二方面所述的方法制备获得的自组装纳米粒子。
本发明第五方面提供一种疫苗组合物。根据本发明的一些实施方案，所述疫苗组合物包括：
疫苗；以及
第一方面所述的自组装纳米粒子和/或第二方面所述的方法制备获得的自组装纳米粒子。
根据本发明的一些实施方案，所述疫苗选自癌症疫苗、病毒疫苗、细菌疫苗。
本发明第六方面提供第一方面所述的自组装纳米粒子和/或第二方面所述的方法制备获得的自组装纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的用途。
根据本发明的一些实施方案，所述肿瘤包括选自黑色素瘤、结肠癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、淋巴癌、肺癌。
本发明第七方面提供第一方面所述的自组装纳米粒子和/或第二方面所述的方法制备获得的自组装纳米粒子在制备疫苗佐剂或疫苗组合物中的用途。根据本发明的一些实施方案，所述疫苗组合物中含有的疫苗选自癌症疫苗、病毒疫苗、细菌疫苗。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了CDN NPs的制备流程，其中，CDN为含G碱基的环二核苷酸及其衍生物；
图2显示了CDN NPs制备过程中CDNs寡聚体的形成以及自组装过程
图3显示了不同形式的CDNs；
图4显示了CDG NPs的透射电镜(TEM)表征结果；
图5显示了CDG NPs的高分辨透射电镜/能谱(HR-TEM/EDS)表征结果，展示了P、N、O、K、Mn的元素分布；
图6显示了空白对照组(Control组)、游离的CDGSF(CDGSF组)和添加转染试剂Lipofectamine 3000(CDGSF+Lipo)的对照组以及CDGSFNPs实验组的细胞内F元素含量；
图7显示了对鼠源巨噬细胞进行不同处理后，标志物以及细胞因子的表达量变化，其中，A图显示了不同组别的细胞表面活化标志物CD86的表达量；B-D图分别显示了不同组别的细胞因子IFN-β、TNF-α和IL-6的表达量；
图8显示了对小鼠进行不同处理后，小鼠体内抗原提呈细胞APCs的激活情况；
图9显示了对照组(Saline，生理盐水)、CDG组以及CDG NPs实验组在黑色素瘤B16-F10模型中的抗肿瘤效果，其中，左图显示了肿瘤体积曲线；右图显示了荷瘤小鼠的生存率曲线；
图10显示了对照组(Saline，生理盐水)、CDG组以及CDG NPs实验组在结肠癌MC38模型中的抗肿瘤效果，其中，左图显示了肿瘤体积曲线；右图显示了荷瘤小鼠的生存率曲线；
图11显示了对照组(Saline，生理盐水)、CDG NPs组、αPD-1(即anti-PD-1)组以及CDG NPs+αPD-1组在结肠癌MC38模型中的抗肿瘤效果，其中，左图显示了肿瘤体积曲线；右图显示了荷瘤小鼠的生存率曲线；
图12显示了不同组别处理对模型抗原OVA的特异性抗体滴度的影响，其中，左图显示了不同组别免疫的小鼠血清稀释度-OD450曲线；右图显示了OVA抗原特异性IgG抗体滴度统计结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的融合蛋白或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、瘤内注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用皮下注射或瘤内注射方式被给药。
在本文中，术语“癌症”或“肿瘤”均可以是任何不受调控的细胞生长。示例性地，可以是非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌、宫颈癌、皮肤癌、神经胶质瘤、食道癌、口腔鳞状细胞癌或胃癌等等。
在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
在本文中，术语“抗肿瘤药物”包括减小实体瘤体积、抑制肿瘤细胞增殖、缓解肿瘤临床症状、抑制肿瘤复发等方面的药物。
CDNs及CDN NPs
本发明提供的CDNs可为天然CDNs和非天然CDNs，非天然CDNs主要包括非天然磷酸二酯键连接的CDNs、含人工碱基的CDNs、天然CDNs的修饰物和衍生物等。
根据本发明的一个具体的实施方案，本发明提供的自组装纳米粒子CDN NPs包括二价或三价金属离子中的至少之一、一价金属离子、CDN类化合物或其衍生物，
其中，所述一价金属离子与所述CDN类化合物或其衍生物相互作用(如：氢键、π-π堆积等)形成CDN寡聚体，所述二价或三价金属离子中的至少之一与所述CDN寡聚体相互作用(如正负电荷相互作用)组装为纳米粒子；
所述CDN类化合物的结构通式为：
其中，B选自天然碱基A、T、C、G、U及非天然碱基中的任一种；
X1和X2各自独立地选自-H、-OH、-NH2、-N3、-CH＝CH2、-C≡CH卤素中的任一种；Y1和Y2各自独立地选自O、S中的任一种。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述非天然碱基选自人造碱基或经修饰的天然碱基；所述经修饰的天然碱基为I或mC。所述人造碱基可以是本领域已公开的任意一种人工合成碱基，均包含在本发明的保护范围内。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述卤素包括氟、氯、溴、碘。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述一价金属离子选自Na+、K+、NH4 +、Li+中的至少之一；所述二价金属离子选自Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Sn2+、Cr2+、Sr2+、Ba2+、Hg2+、Cd2+中的至少之一；所述三价金属离子选自Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、镧系三价金属离子(例如Ln3+或其他的镧系金属离子)、锕系三价金属离子中的至少之一；所述相互作用包括正负电荷相互作用、氢键、π-π堆积作用。
需要说明的是，本发明提供的自组装纳米粒子CDN NPs中，含有的三价金属离子可以是任意种类的镧系金属离子和/或锕系三价金属离子或其组合。发明人发现，一价金属离子与CDN类化合物之间通过共价键或非共价键，例如氢键或者CDN类化合物之间的π-π堆积，获得CDNs寡聚体，二价和/或三价金属离子与CDNs寡聚体之间通过静电相互作用，从而获得自组装纳米粒子CDN NPs。通过掺入正电荷，可以有效屏蔽CDNs的负电荷；促使CDNs自组装和纳米颗粒化可提升生物利用效率和抵抗磷酸二酯酶降解的能力；而CDNs的无载体递送方式可规避纳米载体的内源性问题，有利于快速实现CDNs的临床转化。
需要说明的是，本发明提供的自组装纳米粒子CDN NPs，其中含有的一价金属离子与CDN类化合物或其衍生物之间也可以通过除氢键、π-π堆积之外的其他相互作用方式获得CDNs寡聚体；其中含有的二价和/或三价金属离子与CDNs寡聚体之间可以通过除正负电荷相互作用之外的其他相互作用方式，从而获得自组装纳米粒子CDN NPs。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述自组装纳米粒子的直径为100nm-2μm，优选100-500nm，进一步优选150-200nm。
本发明提供药物组合物可以作为抗肿瘤药物，所述肿瘤的类型包括但不限于于黑色素瘤、结肠癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、淋巴癌、肺癌。与STING信号通路相关的所有癌症种类均包含在本发明保护的抗肿瘤药物中的肿瘤类型之内。
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供环二鸟苷酸(CDG)及其衍生物CDGSF(2’-F取代和硫代磷酸酯修饰的CDG，即CDN类化合物的结构通式中B为碱基G，X1和X2中一个为F一个为OH，Y1和Y2中一个为O一个为S)的自组装纳米粒子CDG NPs和CDGSFNPs，分别验证CDN NPs的免疫治疗效果和细胞摄取效率。在此制备了无载体递送的CDG自组装纳米粒子(CDG NPs)和CDGSF自组装纳米粒子(CDGSFNPs)。后续的研究结果表明，F元素标记的CDGSFNPs可显著提升CDGSF的细胞摄取效率；此外，CDG NPs可显著激活抗原提呈细胞、抑制肿瘤生长和提升荷瘤小鼠的存活期；CDG NPs与免疫检查点抑制剂的联用可以进一步提升肿瘤免疫治疗效果；CDG NPs可作为疫苗佐剂，显著提升抗原特异性抗体滴度。因此，制备的无载体递送的CDN NPs可广泛应用于癌症免疫治疗和抗病毒、抗菌等领域。
需要说明的是，CDN类化合物的通式中进行的取代(如含有F取代的CDGSF)对自组装纳米颗粒的整体结构影响不大，也不影响游离化合物自组装为纳米颗粒，因此，本发明实施例中涉及的CDG NPs或者CDGSFNPs的相关实验结论可推广至其他类型CDN NPs。例如，CDN类化合物的通式中，当X1和X2各自独立地选自-NH2、-N3、-CH＝CH2、-C≡CH以及F以外的其他卤素时，此类的环二核苷酸化合物通过本发明方法自组装获得的纳米粒子，相比游离的环二核苷酸化合物，也能够进一步提升CDNs的细胞摄取效率，显著激活抗原提呈细胞、抑制肿瘤生长和提升荷瘤小鼠的存活期等。即通过本发明方法制备的无载体递送的CDN NPs，提升了CDNs的细胞摄取效率，显著激活抗原提呈细胞、抑制肿瘤生长和提升荷瘤小鼠的存活期；CDN NPs与免疫检查点抑制剂的联用可以进一步提升肿瘤免疫治疗效果；CDN NPs可作为疫苗佐剂，显著提升抗原特异性抗体滴度。
药物组合物
根据本发明一个实施方案，本发明提供一种药物组合物，包括治疗有效量的前面所述的自组装纳米粒子。
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供的药物组合物，包含以所述自组装纳米以及药学上可接受的辅料、赋形剂、溶媒或其组合。
根据本发明的一个实施方案，本发明提供的药物组合物可通过注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体，但并不限于此。需要的时候，可以在上述药物中加入药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。所述药物组合物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
疫苗佐剂和疫苗组合物
根据本发明一个实施方案，本发明提供一种疫苗佐剂，包括前面所述的自组装纳米粒子CDN NPs。发明人发现，利用鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作为模型抗原，以C57BL/6小鼠作为模型小鼠，以CDG NPs作为疫苗佐剂进行OVA特异性抗体滴度评价，实验结果表明CDG NPs为例的CDN NPs可作为疫苗佐剂，提升抗原特异性抗体滴度，表明CDN NPs有望作为癌症疫苗、病毒疫苗和细菌疫苗的疫苗佐剂。
根据本发明一个实施方案，本发明提供一种疫苗组合物，包括：
疫苗；以及
前面所述的自组装纳米粒子，所述疫苗选自癌症疫苗、病毒疫苗、细菌疫苗。
本发明提供的CDG NPs作为疫苗佐剂加入疫苗组合物种，能够进一步提升机体对癌症疫苗、病毒疫苗或细菌疫苗中抗原的特异性免疫应答，提升抗原特异性抗体滴度。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1CDN NPs的制备以及结构表征
1、CDN NPs的制备
按照如图1所示的制备流程。首先，CDNs与过量的钾离子在pH 7.4的缓冲溶液中孵育一小时。随后，加入二价金属离子继续过夜孵育。制备全程无菌操作，所制备的纳米粒子无需进一步纯化。
图2展示了CDN NPs的制备过程中，CDNs寡聚体的形成以及自组装。图3展示了不同形式的CDNs。
以CDG及其衍生物(CDGSF)为例：首先，CDG或CDGSF与过量的钾离子(CDG或CDGSF与钾离子摩尔比均为1：50)在pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中孵育一小时。随后，加入Mn2+(CDG或CDGSF与Mn2+摩尔比均为1：4)继续过夜孵育，即可获得CDG NPs或CDGSFNPs。
2、CDN NPs的结构表征
图4展示了上述制备获得的CDG NPs的透射电镜(TEM)表征结果，表明CDN NPs为球状纳米颗粒。图5展示了上述制备获得的CDG NPs中的元素分布，通过高分辨透射电镜/能谱(HR-TEM/EDS)进行表征，表明CDG NPs中的CDG与钾离子和Mn2+组装形成纳米颗粒。
实施例2细胞摄取效率评价
采用鼠源巨噬细胞J774A.1作为评价细胞系，利用具有能量色散X射线光谱测试功能的场发射扫描电子显微镜(FE-SEM/EDS)检测胞内F元素含量，作为评价CDGSF的细胞摄取效率的指标。实验上，将J774A.1细胞培养在无菌硅片上，用20μM CDGSFNPs(实施例1制备获得)处理细胞8-16小时，之后收集细胞，经洗涤、固定、冻干后进行FE-SEM/EDS测试，统计细胞内的F元素含量。结果如图6所示，表明相对于游离的CDGSF和添加转染试剂Lipofectamine3000(CDGSF+Lipo)的对照组(Control组为不加环二核苷酸的空白对照组)，经CDGSFNPs处理的细胞内F元素含量显著提升，表明本发明方法制备的无载体递送的CDGSFNPs有利于提升CDGSF的细胞摄取效率。由于CDGSFNPs中的F元素取代对自组装纳米颗粒的整体结构影响不大，因此，该结论由此可推广至其他类型CDN NPs。即本发明方法制备的无载体递送的CDNNPs提升CDNs的细胞摄取效率。
实施例3CDG NPs的抗原提呈细胞APCs活化评价
在体外，采用鼠源巨噬细胞J774A.1作为评价细胞系：用20μM CDG NPs(实施例1制备获得)处理细胞24小时，随后收集细胞用PE-anti CD86(活化标记物)抗体染色并进行流式分析；收集细胞培养基上清用ELISA试剂盒测试细胞因子IFN-β、TNF-α和IL-6的表达量(图7)。在体内，用20μg/只的CDG NPs对C57BL/6小鼠进行一次免疫，24小时后取其淋巴结获取单分散的细胞，然后对APCs进行PE-anti CD86染色并进行流式分析(图8)。按照上述方式来评价CDG NPs的体内/体外免疫刺激效果。
图7结果表明，相比游离的CDG，本发明制备获得的CDG NPs在体外更能够显著活化抗原提呈细胞APCs。图8结果表明，相比游离的CDG，本发明制备获得的CDG NPs在体内能够有效激活抗原提呈细胞APCs。
实施例4CDG NPs抗肿瘤效果评价
作为抗肿瘤效果评价的实验，本发明构建了两种代表性肿瘤模型：①负荷黑色素瘤(B16-F10)的C57BL/6小鼠模型；②负荷结肠癌(MC38)的C57BL/6小鼠模型。对于模型①，每组8只小鼠，肿瘤种植5天后进行CDG NPs(实施例1制备获得)瘤内注射，每三天给药一次，一共给药三次，给药剂量20μg/只(图9)。对于模型②，每组6只小鼠，肿瘤种植10天后进行CDG NPs皮下注射，每四天给药一次，一共给药三次，给药剂量25μg/只(图10)。
图9和图10结果表明，CDG NPs瘤内注射可以显著抑制肿瘤生长，并可延长荷瘤小鼠的生存期。其中在黑色素瘤B16-F10模型中，62.5％的荷瘤小鼠(5/8)最终到达无瘤生存状态。
实施例5CDG NPs与免疫检查点抑制剂联用的抗肿瘤效果评价
通过构建负荷结肠癌(MC38)的C57BL/6小鼠模型来验证CDG NPs与免疫检查点抑制剂αPD-1联用的效果。每组6只小鼠，肿瘤种植10天后进行CDG NPs皮下注射，每四天给药一次，一共给药三次，给药剂量25μg/只；αPD-1则通过腹腔注射方式进行给药，每四天给药一次(与CDG NPs给药间隔两天)，给药剂量为100μg/只。图11结果表明CDG NPs与αPD-1的联合治疗可以显著抑制小鼠结肠癌的生长和延长荷瘤小鼠的生存期。
实施例6CDG NPs作为疫苗佐剂提升抗原特异性抗体滴度的效果评价
采用鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作为模型抗原，以C57BL/6小鼠作为模型小鼠，以CDG NPs作为疫苗佐剂进行OVA特异性抗体滴度评价。OVA蛋白抗原剂量为20μg/只，CDGNPs剂量为20μg/只，间隔两周免疫一次，一共免疫两次。免疫完成后隔一周获取小鼠血清，采用ELISA方法进行OVA蛋白抗原特异性抗体滴度分析。结果如图12所示，表明CDG NPs可以显著提高OVA抗原的特异性抗体滴度。这显示出以CDG NPs为例的CDN NPs可作为疫苗佐剂，提升抗原特异性抗体滴度，有望用于癌症疫苗、病毒疫苗和细菌疫苗的制备。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (16)
1.一种自组装纳米粒子，其特征在于，包括二价或三价金属离子中的至少之一、一价金属离子、CDN类化合物或其衍生物，
其中，所述一价金属离子与所述CDN类化合物或其衍生物相互作用形成CDN寡聚体，所述二价或三价金属离子中的至少之一与所述CDN寡聚体相互作用组装为纳米粒子；
所述CDN类化合物为含有至少一个碱基G的环二核苷酸或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的自组装纳米粒子，其特征在于，所述CDN类化合物的结构通式为：
其中，B选自天然碱基A、T、C、G、U及非天然碱基中的任一种；
X1和X2各自独立地选自-H、-OH、卤素、-NH2、-N3、-CH＝CH2、-C≡CH中的任一种；
Y1和Y2各自独立地选自O、S中的任一种。
3.根据权利要求2所述的自组装纳米粒子，其特征在于，所述非天然碱基选自人造碱基或经修饰的天然碱基；
任选地，所述经修饰的天然碱基为I或mC。
4.根据权利要求1所述的自组装纳米粒子，其特征在于，所述一价金属离子选自Na+、K+、NH4 +、Li+中的至少之一；
任选地，所述二价金属离子选自Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Sn2+、Cr2 +、Sr2+、Ba2+、Hg2+、Cd2+中的至少之一；
任选地，所述三价金属离子选自Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、镧系三价金属离子、锕系三价金属离子中的至少之一；
任选地，所述相互作用包括正负电荷相互作用、氢键、π-π堆积作用。
5.根据权利要求1所述的自组装纳米粒子，其特征在于，所述自组装纳米粒子的直径为100nm-2μm，优选100-500nm，进一步优选150-200nm。
6.权利要求1-5中任一项所述的自组装纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将所述CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子接触，获得CDN寡聚体；
(2)将所述CDN寡聚体与所述二价或三价金属离子中的至少之一接触，获得自组装纳米粒子。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子的摩尔比不大于1:2；
任选地，所述CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子的摩尔比为1:10-1:200；
任选地，步骤(2)中，所述CDN类化合物或其衍生物与二价或三价金属离子的摩尔比不大于1:1，优选1:2-1:200。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述CDN类化合物或其衍生物与所述一价金属离子是在缓冲液中接触的，所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液中的至少之一；
任选地，步骤(1)中的接触时间为1-12h；
任选地，步骤(2)中的接触时间为4-24h。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-5中任一项所述的自组装纳米粒子和/或权利要求6-8中任一项所述的制备方法制备获得的自组装纳米粒子。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包括免疫检查点抑制剂；
任选地，所述免疫检查点抑制剂包括选自anti-PD-1、anti-PD-L1、anti-CTLA-4、anti-LAG-3、anti-TIM-3、anti-TIGIT、anti-CD47中的至少之一。
11.一种疫苗佐剂，其特征在于，包括权利要求1-5中任一项所述的自组装纳米粒子和/或权利要求6-8中任一项所述的制备方法制备获得的自组装纳米粒子。
12.一种疫苗组合物，其特征在于，包括：
疫苗；以及
权利要求1-5中任一项所述的自组装纳米粒子和/或权利要求6-8中任一项所述的制备方法制备获得的自组装纳米粒子。
13.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗选自癌症疫苗、病毒疫苗、细菌疫苗。
14.权利要求1-5中任一项所述的自组装纳米粒子和/或权利要求6-8中任一项所述的制备方法制备获得的自组装纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括选自黑色素瘤、结肠癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、淋巴癌、肺癌。
16.权利要求1-5中任一项所述的自组装纳米粒子和/或权利要求6-8中任一项所述的制备方法制备获得的自组装纳米粒子在制备疫苗佐剂或疫苗组合物中的用途，其特征在于，所述疫苗组合物中含有的疫苗选自癌症疫苗、病毒疫苗、细菌疫苗。
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