CN117693358A

CN117693358A - 用于免疫原性目的的来自冠状病毒的反向肽

Info

Publication number: CN117693358A
Application number: CN202280027798.1A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·拉德马赫; 黄小芳; 理查德·佩林斯; 妮可·贝德克; 阿萨纳西奥斯·帕帕多普洛斯; 菲利普·威廉姆斯
Original assignee: Emergex Vaccines Holding Ltd
Current assignee: Emergex Vaccines Holding Ltd
Priority date: 2021-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2024-03-12

Abstract

本发明涉及由开放阅读框(ORF)编码的免疫原性肽，该开放阅读框由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。本发明还涉及编码此类肽的多核苷酸、此类肽和多核苷酸用于治疗和预防病毒感染的用途，以及包含本发明的肽的复合物。

Description

用于免疫原性目的的来自冠状病毒的反向肽

反向肽

优先权权利

本申请要求2021年2月16日提交的GR20210100099和2021年6月2日提交的US63/196,128的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文。

技术领域

背景技术

冠状病毒是一组在哺乳动物和鸟类中引起疾病的相关病毒。冠状病毒感染的症状因物种而异。例如，鸡的冠状病毒感染会引起上呼吸道疾病，而牛和猪的冠状病毒感染往往会引起腹泻。

在人类中，冠状病毒会引起呼吸道感染。由一些冠状病毒感染引起的疾病可能是轻微的，诸如普通感冒。其他冠状病毒引起更严重和潜在致命的疾病，诸如SARS(SARS-CoV-1)、MERS(MERS-CoV)和COVID-19(SARS-CoV-2)。由于冠状病毒感染爆发的控制依赖于涉及准确检测和/或有效接种的策略，因此非常需要提供疫苗和检测。

发明内容

本发明涉及由开放阅读框(ORF)编码的免疫原性肽，该开放阅读框由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。换句话说，免疫原性肽由开放阅读框(ORF)编码，该开放阅读框由冠状病毒的基因组的反向互补序列的至少一部分编码。免疫原性肽包含表位，诸如CD8+T细胞表位、CD4+T细胞表位或B细胞表位。本发明还涉及编码免疫原性肽的多核苷酸，涉及此类免疫原性肽和多核苷酸用于治疗和预防病毒感染的用途，以及涉及包含该免疫原性肽的复合物。

本发明人已经令人惊讶地鉴定了许多免疫原性肽，它们由冠状病毒SARS-CoV-2感染的细胞上的MHC I类分子呈递，并由ORF以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码(即，由orf1ab多蛋白基因的反向互补序列的一部分编码)。ORF在SARS-CoV-2毒株中广泛保守，因此被认为赋予SARS-CoV-2选择性优势。在药物组合物中包含由保守ORF编码的一种或多种免疫原性肽可赋予针对SARS-CoV-2的保护和/或治疗能力。在药物组合物中包含由保守ORF编码的一种或多种免疫原性肽可赋予针对除了SARS-CoV-2之外的一种或多种冠状病毒(或冠状病毒毒株)的保护和/或治疗能力。在药物组合物中包含多种这样的免疫原性肽(例如，每种免疫原性肽能够结合不同的HLA超型)可提供在具有不同HLA类型的个体中具有预防和/或治疗效果的广谱组合物。类似地，针对SARS-CoV-2的保护能力可被赋予基于多核苷酸(例如，RNA或mRNA)的组合物，该组合物包含编码由本发明人鉴定的免疫原性肽的一种或多种多核苷酸(例如，RNA或mRNA)。

本发明人鉴定的免疫原性肽也可用于研究SARS-CoV-2特异性免疫应答，和/或对其他冠状病毒具有特异性的免疫应答。为此，本发明的免疫原性肽可作为包含与MHC分子结合的免疫原性肽的复合物提供。

本发明人还令人惊讶地鉴定了免疫原性肽，这些免疫原性肽由感染地方性普通感冒冠状病毒229E的细胞上的MHC I类分子呈递，并且由ORF编码，该ORF由该基因组的部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码(即，由基因组的反向互补序列的一部分编码)。

因此，本发明提供了一种免疫原性肽，该免疫原性肽包含来自由开放阅读框(ORF)编码的多肽的表位，该开放阅读框由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。

本发明还提供了：

-编码本发明的免疫原性肽的多核苷酸(例如，RNA、mRNA)；

-包含本发明的免疫原性肽或本发明的多核苷酸(例如，RNA、mRNA)的药物组合物；

-一种预防和/或治疗冠状病毒感染的方法，包括向个体施用本发明的药物组合物；

-本发明的药物组合物用于预防和/或治疗个体的冠状病毒感染的方法中；和

-包含与MHC分子结合的本发明的免疫原性肽的复合物。

本文所述的发明包括各方面和/或优选特征的所有组合，除非这种组合是明显不允许的或明确避免的。

附图说明

图1：显示由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的位置的示意图。

图2：显示由SARS-CoV-2的基因组的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码ORF内SEQ ID NO:2至12的肽的位置的示意图。

图3：肽ALLTCQTIGLCN(SEQ ID NO:2)的片段质谱。

图4：肽LHSRTSFCMVGFS(SEQ ID NO:3)的片段质谱。

图5：肽LSIPCASSDFST(SEQ ID NO:4)的片段质谱。

图6：肽LTCQTIGLCNNLAPF(SEQ ID NO:5)的片段质谱。

图7：肽LYVALLVALLTCQ(SEQ ID NO:6)的片段质谱。

图8：肽QTIGLCNNLAP(SEQ ID NO:7)的片段质谱。

图9：肽RLSIPCASSDF(SEQ ID NO:8)的片段质谱。

图10：肽TCQTIGLCNNLAPFL(SEQ ID NO:9)的片段质谱。

图11：肽TLHSRTSFCMV(SEQ ID NO:10)的片段质谱。

图12：肽VALLTCQTIGLCN(SEQ ID NO:11)的片段质谱。

图13：肽VFTLHSRTSF(SEQ ID NO:12)的片段质谱。

图14：UK SARS-CoV-2毒株中的ORF100变异性(实施例3)。图显示了ORF100中每个位置的归一化香农熵。注意0值对应于高度保守的位置，而1表示存在20个氨基酸中的任一个氨基酸的概率相等的位置。

图15：SARS-CoV-2毒株中的ORF100变异性，与进化枝、取样日期、地理位置无关(实施例4)。图显示了ORF100中每个位置的归一化香农熵。注意0值对应于高度保守的位置，而1表示存在20个氨基酸中的任一个氨基酸的概率相等的位置。

图16：图15的展开。

图17：与早期SARS-CoV-2和蝙蝠-冠状病毒ORF100序列的共有序列比对。

图18：来自用负义SARS-CoV-2肽刺激PBMC(来自供体EVB00028、EVB00031和EVB00033)的ELISPOT数据。

图19：刺激来自EVB00028的PBMC后T细胞表面标志物的流式细胞术分析。

图20：刺激来自EVB00033的PBMC后T细胞表面标志物的流式细胞术分析。

图21：A*2402/VFTLHSRTSF-APC MHC Dextramer染色分析。

图22：与编码ORF100的多核苷酸的预期大小的多核苷酸相关的条带。

图23：肽RLSIPCASSDF的质谱验证(已确认)。A.来自细胞裂解物的片段质谱；B.来自合成肽的片段质谱。箭头指一些典型的离子峰，以显示每个组中的同一性。

图24：肽TLHSRTSFCMV的质谱验证(已确认)。A.来自细胞裂解物的片段质谱；B.来自合成肽的片段质谱。箭头指一些典型的离子峰，以显示每个组中的同一性。两个基团具有相同的前体离子峰：A(641.43)和B(641.45)。另一个匹配离子峰是Y6：图A(344.24)和图B(335.21)。该差异是由于失去了水分子和+2价电荷，因此图B显示质荷比减少8。

图25：肽VALLTCQTIGLCN的质谱验证(已确认)。A.来自细胞裂解物的片段质谱；B.来自合成肽的片段质谱。箭头指一些典型的离子峰，以显示每个组中的同一性。与合成肽(图B)相比，细胞裂解物中的肽(图A)显示低丰度，这导致在800-1200(m/z)区域中较少的片段离子峰。然而，在两个图中仍然存在特征性片段离子峰，诸如Y4、B8(见箭头)。

图26：肽VFTLHSRTSF的质谱验证(已确认)。A.来自细胞裂解物的片段质谱；B.来自合成肽的片段质谱。箭头指一些典型的离子峰，以显示每个组中的同一性。

图27：对照组和感染组中HcoV229E衍生肽的汇总。

图28：对照组和感染组中自身衍生肽的汇总。

序列表的描述

SEQ ID NO:1—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的多核苷酸序列。每个n独立地选自t和u。在一个方面，每个n可例如为t。也就是说，所有n都可为t。在另一个方面，每个n可例如为u。也就是说，所有n都可以是u。在进一步的方面，n中的一些可以是t，并且n中的一些可以是u。也就是说，序列可包含t和u的组合。

SEQ ID NO:2—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:3—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:4—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:5—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:6—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:7—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:8—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:9—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:10—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:11—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:12—由SARS-CoV-2的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的免疫原性肽

SEQ ID NO:13—由SARS-CoV-2毒株的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF编码的共有氨基酸序列。

SEQ ID NO:14—由严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株WIV04(MN996528.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15—由肺炎病毒分离株Wuhan-Hu-1(NC045512.2)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16—由蝙蝠冠状病毒分离株RaTG13(MN996532.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17—由蝙蝠SARS样冠状病毒分离株bat-SL-CoVZXC21(MG772934.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18—由蝙蝠SARS样冠状病毒分离株bat-SL-CoVZC45(MG772933.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19—实施例中使用的寡核苷酸。

SEQ ID NO:20—实施例中使用的寡核苷酸。

SEQ ID NO:21—实施例中使用的寡核苷酸。

SEQ ID NO:22—实施例中使用的寡核苷酸。

SEQ ID NO:23—实施例中使用的扩增引物。

SEQ ID NO:24—实施例中使用的扩增引物。

SEQ ID NO:25—实施例中使用的T7 RNA聚合酶模板引物。

关键词：T7启动子Kozak用于LNSORF100的引物

SEQ ID NO:26—实施例中使用的T7 RNA聚合酶模板引物。

关键词：Poly(A)引物

SEQ ID NO:27至45—由地方性普通感冒冠状病毒229E(NP_073549.1)的基因组编码的氨基酸序列，该基因组与能够翻译的正义RNA反义。

SEQ ID NO:46—由地方性普通感冒冠状病毒(NP_073549.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:57至52—由地方性普通感冒冠状病毒229E的基因组编码的氨基酸序列，该基因组与能够翻译的正义RNA反义。

SEQ ID NO:53—由地方性普通感冒冠状病毒229E(NP_073549.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:54至62—由地方性普通感冒冠状病毒229E(NP_073549.1)的基因组编码的氨基酸序列，该基因组与能够翻译的正义RNA反义。

具体实施方式

现在将参照附图讨论本发明的方面和实施方案。其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提到的所有文件均以引用方式并入本文。

单链RNA(ssRNA)病毒根据其基因组RNA的有义或极性分为正义或反义。在反义ssRNA病毒中，反义(3’到5’)基因组RNA与mRNA互补，并且通常必须在翻译前通过RNA聚合酶转化为正义RNA。在正义ssRNA病毒诸如冠状病毒中，正义(5’到3’)基因组RNA也可用作mRNA，并且可在宿主细胞中翻译成蛋白质。也就是说，反义ssRNA病毒的复制通常发生在基因组转录形成与基因组互补的mRNA和mRNA翻译之后。正义ssRNA病毒的复制通常发生在兼作mRNA的基因组RNA的翻译之后。

传统上，已经认为ssRNA病毒的负义RNA是非编码的。然而，非经典翻译可为可能的。似乎某些反义ssRNA病毒诸如流感病毒的反义基因组RNA实际上能够以5’到3’方向翻译，产生与通过经典翻译(即，3’到5’转录形成互补mRNA，并且mRNA 5’到3’的翻译)获得的那些基因产物的不同基因产物。类似地，与正义ssRNA病毒的基因组互补的RNA实际上是可翻译的。

冠状病毒是正义ssRNA病毒。本发明人已获得的数据表明，从冠状病毒中的非经典翻译获得的多肽可包含被冠状病毒感染个体的免疫系统识别的肽。例如，获自冠状病毒中非经典翻译的多肽可包含能够由MHC I类分子呈递并由CD8+T细胞上存在的T细胞受体(TCR)识别的肽。换句话说，获自冠状病毒中非经典翻译的多肽可包含作为CD8+T细胞表位的肽。获自冠状病毒中非经典翻译的多肽可例如包含能够由MHC II类分子呈递并由CD4+T细胞上存在的T细胞受体(TCR)识别的肽。换句话说，获自冠状病毒中非经典翻译的多肽可包含作为CD4+T细胞表位的肽。获自冠状病毒中非经典翻译的多肽可例如包含能够特异性结合抗体和/或由B细胞上存在的B细胞受体(BCR)识别的肽。换句话说，获自冠状病毒中非经典翻译的多肽可包含作为B细胞表位的肽。任何此类免疫原性肽可例如以药物组合物的形式施用于个体，以便诱导针对冠状病毒的免疫应答。这样，可实现预防和/或治疗。

一般定义

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。

如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，提及“多核苷酸”包括“多个多核苷酸”，提及“免疫原性肽”包括两个或更多个这样的免疫原性肽，等等。

通常，术语“包括”旨在表示包括但不限于。例如，短语“包含表位的免疫原性肽”应当解释为是指免疫原性肽含有表位，但是免疫原性肽也可含有另外的氨基酸。

在本公开的一些方面，词语“包括”被短语“由……组成”代替。术语“由……组成”旨在是限制性的。例如，短语“由表位组成的免疫原性肽”应当理解为是指免疫原性肽含有表位并且不含另外的氨基酸。

出于本公开的目的，为了确定两个序列(诸如两个多核苷酸或两个氨基酸序列)的同一性百分比，出于最佳比较的目的将序列进行比对(例如，为了与第二序列进行最佳比对，可在第一序列中引入空位)。然后比较核苷酸/氨基酸位置处的核苷酸/氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的核苷酸或氨基酸残基占据时，则核苷酸或氨基酸在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/参考序列中位置的总数×100)。

通常，在参考序列的长度上进行序列比较。例如，如果用户希望确定给定(“测试”)序列是否与SEQ ID NO:X具有一定百分比的同一性，则SEQ ID NO:X将是参考序列。例如，为了评估序列是否与SEQ ID NO:X(参考序列的示例)至少80％相同，技术人员将在SEQ IDNO:X的长度上进行比对，并鉴定测试序列中有多少位置与SEQ ID NO:X的位置相同。如果至少80％的位置相同，则测试序列与SEQ ID NO:X至少80％相同。如果序列短于SEQ ID NO:X，则空位或缺失的位置应被认为是不相同的位置。

技术人员知道可用于确定两个序列之间的同源性或同一性的不同计算机程序。例如，序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。对于标准分子生物学技术，参见Sambrook,J.、Russel,D.W.Molecular Cloning,A LaboratoryManual.第3版，2001年，Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，其以引用方式全文并入本文。

本发明的免疫原性肽

本发明提供了一种免疫原性肽，该免疫原性肽包含来自由开放阅读框(ORF)编码的多肽的表位，该开放阅读框由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。这种免疫原性肽具有许多益处，从下面的讨论中这些益处将变得显而易见。关键益处总结如下。

首先，免疫原性肽包含表位。表位可例如为CD8+T细胞表位，诸如SEQ ID NO:2至12、46和53之一所示的肽，并且由本发明人新鉴定。因此，免疫原性肽能够刺激针对一种或多种冠状病毒的免疫应答。当表位为CD8+T细胞表位时，免疫应答可例如为细胞免疫应答(例如，CD8+T细胞应答)。CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)通过其对感染细胞的细胞毒性活性介导病毒清除。因此，刺激细胞免疫可提供针对冠状病毒感染的有益防御。当表位为B细胞表位时，免疫应答可例如为体液免疫应答(例如，B细胞应答或抗体应答)。体液免疫应答通过抗体结合介导病毒的中和和/或清除。因此，刺激体液免疫可提供针对冠状病毒感染的有益防御。当表位为CD4+T细胞表位时，免疫应答可例如为辅助T细胞应答(例如，CD4+T细胞应答)。辅助T淋巴细胞通过分泌免疫介质诸如细胞因子来“帮助”其他免疫细胞的活性。因此，刺激辅助T细胞应答可促进或增强针对冠状病毒的细胞和/或体液免疫应答，提供针对病毒的有益防御。

其次，编码衍生出免疫原性肽中包含的表位的多肽的ORF在多种冠状病毒或冠状病毒毒株之间可以是保守的。因此，该多肽在多种冠状病毒或冠状病毒毒株之间可以是保守的。因此，表位本身在多种冠状病毒或冠状病毒毒株之间可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在SARS-CoV-2的不同毒株之间可以是保守的。因此，包含该免疫原性肽的药物组合物可提供针对SARS-CoV-2的多种不同毒株的交叉保护和/或治疗益处。这样，包含该免疫原性肽的药物组合物适于提供针对SARS-CoV-2的广谱预防或治疗，对抗由突变引起的问题，例如本领域最近报道的那些。换句话说，包含免疫原性肽的单一药物组合物可诱导针对多种现有和新出现的SARS-CoV-2毒株的保护性和/或治疗性免疫。这可减少或消除因SARS-CoV-2突变而开发的新疫苗或治疗的需要。ORF和/或表位在不同的人类冠状病毒之间可以是保守的。因此，包含该免疫原性肽的药物组合物可提供针对多种不同人类冠状病毒的交叉保护和/或治疗益处。这样，包含该免疫原性肽(或编码该免疫原性肽的多核苷酸)的药物组合物适于提供针对各种人类冠状病毒的广谱预防和/或治疗，这些人类冠状病毒包括现有的和新出现的人类冠状病毒。

ORF、多肽和/或表位在人类冠状病毒和其他动物的冠状病毒之间可以是保守的。这样，包含本发明的免疫原性肽的药物组合物可防止动物冠状病毒在人群中建立。换句话说，除了保护免受现有的人类冠状病毒的侵害，包含本发明的免疫原性肽的药物组合物可防止动物冠状病毒跨越物种鸿沟。这可防止进一步的流行性人类冠状病毒的出现。

第三，免疫原性肽可能能够结合不同的HLA超型。在药物组合物中包含多种本发明的免疫原性肽，每种免疫原性肽包含能够结合不同HLA超型的表位，导致在具有不同HLA类型的个体中有效的药物组合物。这样，单一药物组合物可用于在大部分人群中赋予针对冠状病毒的保护。这为控制病毒感染的发生和传播提供了成本有效的方法。类似地，单一治疗组合物可用于治疗大部分人群中的冠状病毒。这为治疗冠状病毒感染提供了成本有效的方法。

第四，由编码该免疫原性肽的ORF编码的多肽可增强冠状病毒在人类中的适应性。换句话说，多肽可赋予编码它的冠状病毒选择性优势。因此，包含本发明的免疫原性肽的药物组合物可靶向与被赋予选择性优势的冠状病毒相关的表位。因此，本发明的药物组合物可被很好地设计以提供针对新出现的和/或潜在大流行的冠状病毒毒株的有效预防或治疗。因此，本发明的药物组合物可被很好地设计以提供针对地方性冠状病毒毒株或季节性冠状病毒毒株的有效预防或治疗。

第五，免疫原性肽可附接到纳米颗粒，例如金纳米颗粒。如下文更详细描述的，与纳米颗粒的附接减少或消除了在包含免疫原性肽的药物(例如，疫苗)组合物中包含佐剂的需要。因此，包含本发明的免疫原性肽的药物组合物在施用于个体时不太可能引起不利的临床效应。

免疫原性肽

免疫原性肽是能够引发免疫应答的肽。本发明的免疫原性肽包含来自ORF编码的多肽的表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的其正义RNA反义地编码。

表位可例如为CD8+T细胞表位、CD4+T细胞表位或B细胞表位。表位可例如为嵌套表位，诸如包含CD4+T细胞表位的CD8+T细胞表位。优选地，表位是CD8+T细胞表位。

CD8+T细胞表位是能够(i)通过MHC I类分子呈递和(ii)通过CD8+T细胞上存在的T细胞受体(TCR)识别的肽。优选地，TCR的识别导致CD8+T细胞的活化。CD8+T细胞活化可导致增殖、细胞因子产生和/或细胞毒性作用增加。通常，CD8+T细胞表位的长度为约9个氨基酸。CD8+T细胞表位可以更短或更长。例如，CD8+T细胞表位的长度可为约8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。CD8+T细胞表位的长度可为约8个至15个、9个至14个、10个至13个或11个至12个氨基酸。

CD4+T细胞表位是能够(i)通过MHC II类分子呈递和(ii)通过CD4+T细胞上存在的T细胞受体(TCR)识别的肽。优选地，TCR的识别导致CD4+T细胞的活化。CD4+T细胞活化可导致增殖和/或细胞因子产生增加。通常，CD4+T细胞表位的长度为约12个至15个氨基酸。CD4+T细胞表位可以更短或更长。例如，CD4+T细胞表位的长度可为约8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个氨基酸。CD8+T细胞表位的长度可为约8个至19个、9个至18个、10个至17个、11个至16个、12个至14个或13个至15个氨基酸。

B细胞表位是能够被B细胞上存在的B细胞受体(BCR)或抗体识别的肽。因此，B细胞表位可以是抗体结合表位。BCR的识别可例如导致B细胞的活化和/或成熟。B细胞活化可导致增殖和/或抗体产生增加。B细胞表位可以是线性表位，即由ORF编码的一级氨基酸序列定义的表位。另选地，表位可以是构象表位，即由ORF编码的天然蛋白质的构象结构定义的表位。在这种情况下，表位可以是连续的(即，与抗体相互作用的组分在蛋白质上顺序地彼此相邻)或不连续的(即，与抗体相互作用的组分位于蛋白质的不同部分上，在折叠的天然蛋白质结构中彼此靠近)。通常，B细胞表位或抗体结合表位的长度为约5至20个氨基酸。例如，B细胞表位的长度可为约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸。B细胞表位的长度可为约6至19、7至18、8至17、9至16、10至15、11至14或12至13个氨基酸。

免疫原性肽中包含的表位来自ORF编码的多肽，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码，该基因组的至少一部分与能够翻译的正义RNA反义。换句话说，该表位在本质上可包含在由ORF编码的多肽中或形成该多肽的一部分，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。也就是说，表位可包含在由ORF编码的多肽中或形成该多肽的一部分，该ORF由冠状病毒的基因组的反向互补序列的至少一部分编码。多肽可在冠状病毒的表面上表达，或在冠状病毒的病毒体内表达。病毒对多肽的表达可以是瞬时的，即，多肽仅可由冠状病毒在其生命周期中的某些点和/或在某些环境条件下表达。另选地，冠状病毒可具有多肽的持续表达。多肽可以是结构肽或功能肽，诸如参与冠状病毒代谢或复制的肽。然而，在一些情况下，多肽的目的和/或功能可能是未知的。

产生表位的多肽可增强冠状病毒在人类中的适应性。例如，多肽可改善病毒在人宿主细胞中的存活和/或复制。因此，多肽可赋予冠状病毒选择性优势。换句话说，多肽的表达可使冠状病毒比不表达该多肽的冠状病毒更好地存活和/或复制。在这种情况下，进化选择过程可选择其中基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码ORF的病毒，该ORF编码多肽。因此，ORF(以及因此多肽和/或表位)在不同冠状病毒或给定冠状病毒的不同毒株之间可以是保守的。

ORF、多肽和/或表位例如在两种或更多种(诸如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或1000种或更多种)人类冠状病毒之间可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在SARS-CoV-2的两个或更多个不同毒株之间可以是保守的。ORF、多肽和/或表位例如在SARS-CoV-2和一种或多种其他人类冠状病毒之间可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在SARS-CoV-2与(a)SARS-CoV-1、(b)229E、(c)NL63、(d)OC43、(E)HKU1和(f)MERS-CoV中的一者或多者之间可以是保守的。ORF、多肽和/或表位例如在SARS-CoV-2和：(a)；(b)；(c)；(d)；(e)；(f)；(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(a)和(f)；(b)和(c)；(b)和(d)；(b)和(e)；(b)和(f)；(c)和(d)；(c)和(e)；(c)和(f)；(d)和(e)；(d)和(f)；(e)和(f)；(a)、(b)和(c)；(a)、(b)和(d)；(a)、(b)和(e)；(a)、(b)和(f)；(a)、(c)和(d)；(a)、(c)和(e)；(a)、(c)和(f)；(a)、(d)和(e)；(a)、(d)和(f)；(a)、(e)和(f)；(b)、(c)和(d)；(b)、(c)和(e)；(b)、(c)和(f)；(b)、(d)和(e)；(b)、(d)和(f)；(b)、(e)和(f)；(c)、(d)和(e)；(c)、(d)和(f)；(c)、(e)和(f)；(d)、(e)和(f)；(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(c)和(f)；(a)(b)、(d)和(e)；(a)、(b)、(d)和(f)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(c)、(d)和(e)；(a)、(c)、(d)和(f)；(a)、(c)、(e)和(f)；(a)、(d)、(e)和(f)；(b)、(c)、(d)和(e)；(b)、(c)、(d)和(f)；(b)(c)、(e)和(f)；(b)、(d)、(e)和(f)；(c)(d)、(e)和(f)；(a)、(b)、(c)、(d)和(e)；(a)、(b)、(c)、(d)和(f)；(a)、(b)、(c)、(e)和(f)；(a)、(b)、(d)、(e)和(f)；(a)、(c)、(d)、(e)和(f)；(b)、(c)、(d)、(e)和(f)；或(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)之间可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在SARS-CoV-2和一种或多种地方性普通感冒冠状病毒之间可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在SARS-CoV-2与(i)229E、(ii)NL63、(iii)OC43和(iv)HKU1中的一者或多者之间可以是保守的。ORF、多肽和/或表位例如在SARS-CoV-2和(i)(ii)；(iii)；(iv)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(iii)和(iv)；(i)、(ii)和(iii)；(i)、(ii)和(iv)；(i)、(iii)和(iv)；(ii)、(iii)和(iv)；或(i)、(ii)、(iii)和(iv)之间可以是保守的。。ORF、多肽和/或表位在229E和一种或多种其他人类冠状病毒之间可以是保守的。

ORF、多肽和/或表位例如在一种或多种(例如，两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或1000种或更多种)人类冠状病毒和一种或多种(例如，2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或1000种或更多种)动物冠状病毒之间可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在例如一种或多种SARS-CoV-2病毒和一种或多种动物冠状病毒之间可以是保守的。该一种或多种动物冠状病毒可包括能够感染蝙蝠的冠状病毒。

ORF、多肽和/或表位例如在两种或更多种动物冠状病毒之间可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或1000种或更多种动物冠状病毒之间可以是保守的。该两种或更多种动物冠状病毒可包括能够感染相同物种动物的冠状病毒。该两种或更多种动物冠状病毒可包括能够感染不同物种动物的冠状病毒。该两种或更多种动物冠状病毒可包括能够感染蝙蝠的冠状病毒。

如果由每种病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF之间存在至少20％(诸如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的同一性，则ORF(以及因此多肽和/或表位)在两种或更多种不同的冠状病毒之间是保守的。

免疫原性肽中包含的表位可存在于由(a)SARS-CoV-1、(b)229E、(c)NL63、(d)OC43、(E)HKU1和(f)MERS-CoV中的一者或多者中的约100个密码子长度的预测ORF编码的多肽中。在这种情况下，(a)至(f)的一者或多者中CD8+T细胞表位在约100个密码子长度的预测ORF中的存在可表明包含免疫原性肽的药物组合物提供了针对(a)至(f)的一者或多者的感染的保护和/或治疗。免疫原性肽中包含的表位可存在于由SARS-CoV-2中约100个密码子长度的ORF编码的多肽中和由(a)SARS-CoV-1、(b)229E、(c)NL63、(d)OC43、(E)HKU1和(f)MERS-CoV中的一者或多者中的约100个密码子长度的预测ORF编码的多肽中。在这种情况下，(a)至(f)的一者或多者中表位在约100个密码子长度的预测ORF中的存在可表明包含免疫原性肽的药物组合物提供了针对SARS-CoV-2和(a)至(f)的一者或多者的交叉保护和/或治疗益处。

免疫原性肽可仅包含一个来自ORF编码的多肽的表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。另选地，免疫原性肽可包含两个或更多个，诸如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个这样的表位。当免疫原性肽包含两个或更多个表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽时，这些表位中的每个表位可独立地选自CD8+T细胞表位、CD4+T细胞表位和B细胞表位。例如，免疫原性肽可包含两个或更多个CD8+T细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽。免疫原性肽可包含两个或更多个CD4+T细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽。免疫原性肽可包含两个或更多个B细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽。免疫原性肽可包含一个或多个(例如，两个或更多个)CD8+T细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽，和一个或多个(例如，两个或更多个)CD4+T细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽。免疫原性肽可包含一个或多个(例如，两个或更多个)CD8+T细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽，和一个或多个(例如，两个或更多个)B细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽。免疫原性肽可包含一个或多个(例如，两个或更多个)CD4+T细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽，和一个或多个(例如，两个或更多个)B细胞表位，每个表位来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽。

除了来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽的表位之外，免疫原性肽可包含一个或多个其他的CD8+T细胞表位、一个或多个其他的CD4+T细胞表位和/或一个或多个其他的B细胞表位。例如，免疫原性肽可包含一个或多个，诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个CD8+T细胞表位，这些表位不是来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽的CD8+T细胞表位。免疫原性肽可包含一个或多个，诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个CD4+T细胞表位，这些表位不是来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽的CD4+T细胞表位。免疫原性肽可包含一个或多个，诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个B细胞表位，这些表位不是来自由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF所编码的多肽的B细胞表位。

许多冠状病毒B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位是本领域已知的。鉴定B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位的方法是本领域已知的。表位作图方法包括X射线共结晶学、基于阵列的寡肽扫描(有时称为重叠肽扫描或pepscan分析)、定点诱变、高通量诱变作图、氢-氘交换、交联偶联质谱、噬菌体展示和有限蛋白水解。也可使用MHC基序预测方法。可鉴定由冠状病毒感染的细胞呈递的CD8+T细胞表位，以便直接鉴定CD8+T细胞表位，如下所述。

优选地，免疫原性肽包含SEQ ID NO:2至12、46和53所示的一个或多个序列，或其与选自SEQ ID NO:2至12、46和53的相关序列具有至少50％序列同一性的变体，或由其组成。该变体可例如与选自SEQ ID NO:2至12、46和53的相关序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。SEQ ID NO:2至12中的每一者表示来自由ORF编码的多肽的CD8+T细胞表位，该ORF由SARS-Cov-2的基因组的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。SEQ ID NO:46和53中的每一者表示来自由ORF编码的多肽的CD8+T细胞表位，该ORF由229E的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。SEQ IDNO:2至12列于表1中。表1还显示了HLA超型，SEQ ID NO:2至12中的每一者与该超型结合。表1所示的HLA结合代表了来自(i)传统基序模式的分析和(ii)两个结合预测程序(MHCflurry和PSSMHCpan，选择KD＜＝1μM)的输出的合并结果。

表1

SEQ ID NO:46和53列于表15中。

免疫原性肽可包含SEQ ID NO:2至12所示的所有序列或由其组成。免疫原性肽可包含SEQ ID NO:2至12中的每一者的变体或由其组成，其中该变体与选自SEQ ID NO:2至12的相关序列具有至少50％的序列同一性。该变体可例如与选自SEQ ID NO:2至12的相关序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。免疫原性肽可包含SEQ ID NO:46和53所示的两个序列或由其组成。免疫原性肽可包含SEQ ID NO:46和53中的每一者的变体或由其组成，其中该变体与选自SEQ ID NO:46和53的相关序列具有至少50％的序列同一性。该变体可例如与选自SEQ ID NO:46和53的相关序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

免疫原性肽可包含含有以下序列的多肽：MSPTTSVVFTLHSRTSFCMVGFSTTSSE TGFRSSQARLSIPCASSDFSTSNEFDVSTGFVLQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLC NNLAPFLKEGV(SEQ IDNO:13)或与该序列具有至少50％序列同一性的变体。该变体可例如与SEQ ID NO:13具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

免疫原性肽可包含含有SEQ ID NO:14至18中的任一者的序列或与该序列具有至少50％序列同一性的变体的多肽。该变体可例如与选自SEQ ID NO:14至18的相应序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

本文所述的任何免疫原性肽可含有任何数目的氨基酸，即具有任何长度。例如，免疫原性肽的长度可为约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100个氨基酸。例如，免疫原性肽的长度可为约8至约100、约9至约95、约10至约90、约15至约85、约20至约80、约25至约75、约30至约70、约35至约65、约40至约60、约45至约55或约50个氨基酸。通常，免疫原性肽的长度为约8至约30、35或40个氨基酸，诸如长度为约9至约29、约10至约28、约11至约27、约12至约26、约13至约25、约13至约24、约14至约23、约15至约22、约16至约21、约17至约20或约18至约29个氨基酸。

本文所述的任何免疫原性肽可以化学方式衍生自多肽抗原，例如通过蛋白水解切割。更典型地，免疫原性肽可使用本领域公知的方法合成。

术语“肽”不仅包括其中氨基酸残基通过肽(-CO-NH-)键连接的分子，而且还包括其中肽键反转的分子。这种反转肽模拟物可使用本领域已知的方法制备，例如Meziere等人(1997年)J.Immunol.，第159卷，第3230-3237页，其以引用方式全文并入本文。这种方法涉及制备包含涉及主链而不是侧链取向的变化的假肽。Meziere等人(1997年)表明，至少对于MHC II类和辅助T细胞应答，这些假肽是有用的。含有NH-CO键而不是CO-NH肽键的反转肽对蛋白水解的抗性高得多。

类似地，只要使用保持氨基酸残基的碳原子之间间距的合适的接头部分，则肽键可完全省略；特别优选的是，接头部分具有与肽键基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性。还应当理解，肽可方便地在其N末端或C末端被封闭，以帮助降低对外蛋白水解消化的易感性。例如，肽的N末端氨基可通过与羧酸反应来保护，并且肽的C末端羧基可通过与胺反应来保护。修饰的其他示例包括糖基化和磷酸化。另一种潜在的修饰是R或K的侧链胺上的氢可被亚甲基取代(-NH2可被修饰为-NH(Me)或-N(Me)₂)。

术语“肽”还包括增加或减少肽在体内的半衰期的肽变体。能够增加根据本发明使用的肽的半衰期的类似物的示例包括肽的类肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合体。根据本发明使用的变体多肽的另一个实施方案包含多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸制备多肽大大减少了这种药物由于正常代谢过程而引起的任何不希望的分解，减少了需要施用的药物量及其施用频率。

免疫原性肽可例如与至少两种不同的HLA超型相互作用。这使得免疫原性肽在更大比例的个体或来自这些个体的细胞样品中引发CD8+T细胞应答。免疫原性肽可例如与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的HLA超型相互作用。每种免疫原性肽可例如与A1、A10、A11、A19、A2、A203、A210、A23、A24、A2403、A25、A26、A28、A29、A3、A30、A31、A32、A33、A34、A36、A43、A66、A68、A69、A74、A80、A9、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B21、B22、B27、B35、B37、B38、B39、B40、B41、B42、B44、B45、B46、B47、B48、B49、B5、B50、B51、B5102、B5103、B52、B53、B54、B55、B56、B57、B58、B59、B60、B61、B62、B63、B64、B65、B67、B7、B70、B703、B71、B72、B73、B75、B76、B77、B78、B8、B81、B82、C1、C10、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9或本领域已知的任何其他HLA超型中的两者或更多者以任何组合相互作用。

CD8+T细胞表位

本发明的免疫原性肽包含来自ORF编码的多肽的表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义地编码。换句话说，本发明的免疫原性肽包含来自ORF编码的多肽的表位，该ORF由冠状病毒的基因组的反向互补序列的至少一部分编码。表位优选是CD8+T细胞表位。因此，本发明的免疫原性肽可包含来自ORF编码的多肽的CD8+T细胞表位，该ORF由冠状病毒的基因组的反向互补序列的至少一部分编码。

可鉴定由冠状病毒感染的细胞呈递的CD8+T细胞表位，以便直接鉴定包含在免疫原性多肽中的CD8+T细胞表位。这是一种有效且合乎逻辑的方法，可单独使用或用于确认通过MHC基序预测方法鉴定的潜在CD8+T细胞表位的效用。

为了实施该方法，用冠状病毒(诸如SARS-CoV-2)感染细胞，并在约37℃的温度下在培养物中维持约72小时的时间。培养后，收获并洗涤细胞。接下来，例如通过匀浆和在缓冲液中冷冻/解冻来裂解细胞。裂解缓冲液可例如含有约1％NP40。例如，可通过以例如约3000rpm离心约10分钟来清除裂解物中的细胞碎片。然后可从裂解物中分离MHC/肽复合物。这样做的多种方式是本领域已知的。例如，免疫亲和层析可用于分离MHC/肽复合物，如WO2019/186199中所述，其以引用方式全文并入本文。可替代地使用免疫蛋白质组学方案。在任何情况下，含肽级分可随后被纯化，例如使用高效液相色谱。通过质谱分析含肽级分以鉴定级分的序列。然后可针对冠状病毒的所有数据库蛋白质搜索获得的光谱数据，以鉴定与冠状病毒相关的肽序列。合成肽可任选地根据所鉴定的序列制备并进行质谱分析，以确认它们与含肽级分中的肽的同一性。

在该方法和本领域已知的类似方法中，任何类型的细胞可被任何类型的冠状病毒感染。冠状病毒详细描述如下。细胞可以是抗原呈递细胞(APC)。细胞可以是肝癌细胞诸如HepG2细胞、EBV转化的类淋巴母细胞B细胞诸如JY细胞或淋巴母细胞诸如T2细胞。

与MHC基序预测方法相比，直接鉴定由ssRNA病毒感染的细胞呈递的CD8+T细胞表位是有利的。免疫表位数据库(IEDB；http://www.iedb.org)是通过基序预测方法而非功能性方法产生的，并且含有许多预测的HLA特异性ssRNA病毒T细胞表位，包括一些具有高MHC结合分数和有限CTL表征的共有表位。由于优势表位和次优势表位均可由病毒感染的细胞呈递，因此难以使用数据库挑选出天然呈递的表位的优势层次。因此，仅从免疫表位数据库中尚不清楚列出的表位中的哪一个表位在包含在药物组合物中时可预期有效诱导CD8+T细胞应答。上述直接鉴定方法提供了一种确认表位效用的机制。

基于冠状病毒感染的细胞所呈递的表位的药物组合物可优于基于病毒蛋白亚基或基序预测表位的疫苗。免疫系统的蛋白质加工可能改变天然病毒表位。将药物组合物基于被证明由受感染细胞呈递的肽消除了这种不确定性来源，因为肽已经经历了蛋白质加工。

多肽

本发明的免疫原性肽包含来自多肽的表位。该多肽由ORF编码，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。也就是说，多肽由ORF编码，该ORF由冠状病毒的基因组的反向互补序列的至少一部分编码。

多肽可含有任何数目的氨基酸，即具有任何长度。通常，多肽的长度为约100个氨基酸，诸如长度为约90至约110、约91至约109、约92至约108、约93至约107、约94至约106、约95至约105、约96至约104、约97至约103、约98至约102或约99至约101个氨基酸。

多肽可由包含在本发明的免疫原性肽中的表位组成。另选地，多肽可包含在本发明的免疫原性肽中所包含的表位。例如，多肽可包含两个或更多个不同的表位，每个表位包含在本发明的不同免疫原性肽中。例如，多肽可包含两个或更多个不同的CD8+T细胞表位，每个表位包含在本发明的不同免疫原性肽中。例如，多肽可包含两个或更多个不同的CD8+T细胞表位，每个表位选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12。多肽可例如包含三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、或11个或更多个不同的CD8+T细胞表位，每个表位选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

多肽可例如包含两个或更多个不同的CD8+T细胞表位，每个表位选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:53。多肽可例如包含三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、或11个或更多个不同的CD8+T细胞表位，每个表位选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:46和SEQ ID NO:53。多肽可例如包含两个不同的CD8+T细胞表位，每个表位选自：SEQ IDNO:46和SEQ ID NO:53。

多肽可包含SEQ ID NO:2至12所示的所有序列或由其组成。多肽可包含SEQ IDNO:2至12、46和53所示的所有序列或由其组成。多肽可包含SEQ ID NO:2至12中的一者或多者或全部的变体或由其组成，其中该变体与选自SEQ ID NO:2至12的相关序列具有至少50％的序列同一性。该变体可例如与选自SEQ ID NO:2至12的相关序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。多肽可包含SEQ ID NO:46和53中的一者或多者或全部的变体或由其组成，其中该变体与选自SEQ ID NO:46和53的相关序列具有至少50％的序列同一性。该变体可例如与选自SEQ ID NO:46和53的相关序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

多肽可例如包含序列MSPTTSVVFTLHSRTSFCMVGFSTTSSETGFRSSQARLSIPCA SSDFSTSNEFDVSTGFVLQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV(SEQ ID NO:13)或与该序列具有至少50％序列同一性的变体。该变体可例如与SEQ ID NO:13具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

多肽可包含含有SEQ ID NO:14至18中的任一者的序列或与该序列具有至少50％序列同一性的变体的多肽。该变体可例如与选自SEQ ID NO:14至18的相应序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

多肽可包含SEQ ID NO:46和52所示的两个序列或由其组成。多肽可包含SEQ IDNO:46和53中的一者或多者或两个序列的变体或由其组成，其中该变体与选自SEQ ID NO:46和53的相关序列具有至少50％的序列同一性。该变体可例如与选自SEQ ID NO:46和53的相关序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

开放阅读框(ORF)

免疫原性肽中包含的表位来源于ORF编码的多肽，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码，该基因组的至少一部分与能够翻译的正义RNA反义。换句话说，包含在免疫原性肽中的表位来自由ORF编码的多肽，该ORF由冠状病毒的基因组的反向互补序列的至少一部分编码。

阅读框是核酸序列(诸如RNA序列)中三个连续核苷酸的分组，其构成由核酸序列编码的氨基酸的密码子。ORF(开放阅读框)是可被翻译的阅读框的一部分。ORF是一段连续的密码子，包含起始密码子和终止密码子。在ORF内，起始密码子(例如ATG)可用作RNA翻译成蛋白质的起始位点。

在本发明中，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。冠状病毒是正义ssRNA病毒。在正义ssRNA病毒中，病毒基因组RNA与mRNA的意义相同，并且可在不干扰转录的情况下翻译，即基因组RNA兼作mRNA。此处，ORF以与病毒基因组RNA反义(因此也与mRNA反义)的方式编码。因此，ORF可以是负义的。也就是说，ORF可能需要基因组RNA在其能够翻译之前被转录。

ORF可例如由冠状病毒的整个基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。另选地，ORF可仅由冠状病毒的基因组的一些以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。例如，ORF可由冠状病毒的基因组的约1％至约99％，诸如约2％至约98％、约3％至约97％、约5％至约95％、约10％至约90％、约15％至约85％、约20％至约80％、约25％至约75％、约30％至约70％、约40％至约60％或约50％以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。

ORF可为任何长度。优选地，ORF的长度为约100个密码子，诸如长度为约90至约110、约91至约109、约92至约108、约93至约107、约94至约106、约95至约105、约96至约104、约97至约103、约98至约102或约99至约101个密码子。ORF的长度可为例如至少90个，诸如至少91个、至少92个、至少93个、至少94个、至少95个、至少96个、至少97个、至少98个、至少99个、至少100个、至少101个、至少102个、至少103个、至少104个、至少105个、至少106个、至少107个、至少108个、或至少109个、至少110个密码子。ORF的长度可为约300个核苷酸，诸如长度为约270至约330、约273至约327、约276至约324、约279至约321、约282至约318、约285至约315、约288至约312、约291至约309、约294至约306或约297至约303个核苷酸。ORF的长度可为例如至少270个，诸如至少273个、至少275个、至少278个、至少291个、至少294个、至少297个、至少300个、至少303个、至少306个、至少309个、至少312个、至少315个、至少318个、至少321个、至少324个、或至少327个、至少330个核苷酸。

ORF可例如由SARS-CoV-2病毒基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。正义基因组中对应于ORF的部分可例如编码pp1a/pp1ab/nsp3。正义基因组中对应于ORF的部分可例如包含严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株Wuhan-Hu-1(GenBank登录号NC_045512)的完整基因组序列的残基6189至6489或由其组成。

ORF可例如包含以下序列：angncnccnacaacnncggnagnnnncacannacacncaagaacgncnn ncngnanggnaggannnnccacnacnncnncagagacnggnnnnagancnncgcaggcaagannanccanncccngcgcgnccncngacnncagnacancaaacgaannngangnnncaacnggnnnngngcnccaaagacaacgnanacaccaggnannnggnnnanacgnggcnnnannagnngcanngnnaacangccaaacaanaggnnnangnaacaannnagcnccnnncnnaaaagagggngngnag(SEQ ID NO:1)或与该序列具有至少50％序列同一性的变体。在SEQ ID NO:1中，每个n独立地选自t和u。在一个方面，每个n可例如为t。也就是说，所有n都可为t。在另一个方面，每个n可例如为u。也就是说，所有n都可以是u。在进一步的方面，n中的一些可以是t，并且n中的一些可以是u。也就是说，序列可包含t和u的组合。该变体可例如与SEQ ID NO:1具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

ORF可例如编码包含以下序列的多肽：MSPTTSVVFTLHSRTSFCMVGFSTTSSETGF RSSQARLSIPCASSDFSTSNEFDVSTGFVLQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNL APFLKEGV(SEQ ID NO:13)或与该序列具有至少50％序列同一性的变体。该变体可例如与SEQ ID NO:13具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

ORF可例如编码多肽，该多肽可包含含有SEQ ID NO:14至18中的任一者的序列或与该序列具有至少50％序列同一性的变体的多肽。该变体可例如与选自SEQ ID NO:14至18的相应序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

如上所述，编码产生免疫原性肽中包含的表位的多肽的ORF在不同冠状病毒或冠状病毒毒株之间可以是保守的。例如，ORF在SARS-CoV-2的不同毒株之间，或在SARS-CoV-2和一种或多种其他人类冠状病毒之间可以是保守的，该一种或多种其他人类冠状病毒诸如(a)SARS-CoV-1、(b)229E、(c)NL63、(d)OC43、(e)HKU1和/或(f)MERS-CoV。ORF在人类冠状病毒(诸如SARS-CoV-2)和一种或多种动物冠状病毒之间可以是保守的。ORF在229E的不同毒株之间，或在229E和一种或多种其他人类冠状病毒之间可以是保守的，该一种或多种其他人类冠状病毒诸如(a)SARS-CoV-1、(b)SARS-CoV-2、(c)NL63、(d)OC43、(e)HKU1和/或(f)MERS-CoV。如果由每种病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF之间存在至少50％(诸如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的同一性，则ORF在两种或更多种不同的冠状病毒或冠状病毒毒株之间可以是保守的。例如，如果由每种病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF之间存在约75％(诸如约70％至约80％，例如约71％、约72％、约73％、约74％、约76％、约77％、约78％或约79％)的同一性，则ORF在两种或更多种不同的冠状病毒或冠状病毒毒株之间可以是保守的。ORF编码的多肽可增强冠状病毒在人类中的适应性，即赋予冠状病毒选择性优势。

ORF在两种或更多种(诸如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或1000种或更多种)冠状病毒或冠状病毒株之间可以是保守的。例如，ORF在两种或更多种SARS-CoV-2毒株之间可以是保守的。ORF在以下的两者或更多者之间可以是保守的：(a)一种或多种SARS-CoV-2病毒；(b)一种或多种SARS-CoV-1病毒；(c)一种或多种229E病毒；(d)一种或多种NL63病毒；(e)一种或多种OC43病毒；(f)一种或多种HKU1病毒；和(g)一种或多种MERS-CoV病毒。

由ORF编码的多肽和/或其包括的表位类似地在两种或更多种冠状病毒或冠状病毒毒株之间可以是保守的。因此，包含本发明的免疫原性肽的药物组合物(例如，疫苗)可能能够提供针对多种冠状病毒或冠状病毒毒株的交叉保护。因此，包含本发明的免疫原性肽的单一药物组合物可能能够诱导针对多种现有和新出现的冠状病毒的保护性免疫。包含本发明的免疫原性肽的单一药物组合物可能能够诱导针对多种地方性和季节性的冠状病毒的保护性免疫。例如，在一个方面，多肽和/或表位在两种或更多种SARS-CoV-2病毒之间可以是保守的。在这种情况下，包含本发明的免疫原性肽的药物组合物(例如，疫苗)可能能够提供针对SARS-CoV-2的两种或更多种毒株的保护。在另一方面，多肽和/或表位在SARS-CoV-2病毒与(a)SARS-CoV-1、(b)229E、(c)NL63、(d)OC43、(E)HKU1和(f)MERS-CoV中的一者或多者之间可以是保守的。多肽和/或表位例如在SARS-CoV-2和：(a)；(b)；(c)；(d)；(e)；(f)；(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(a)和(f)；(b)和(c)；(b)和(d)；(b)和(e)；(b)和(f)；(c)和(d)；(c)和(e)；(c)和(f)；(d)和(e)；(d)和(f)；(e)和(f)；(a)、(b)和(c)；(a)、(b)和(d)；(a)、(b)和(e)；(a)、(b)和(f)；(a)、(c)和(d)；(a)、(c)和(e)；(a)、(c)和(f)；(a)、(d)和(e)；(a)、(d)和(f)；(a)、(e)和(f)；(b)、(c)和(d)；(b)、(c)和(e)；(b)、(c)和(f)；(b)、(d)和(e)；(b)、(d)和(f)；(b)、(e)和(f)；(c)、(d)和(e)；(c)、(d)和(f)；(c)、(e)和(f)；(d)、(e)和(f)；(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(c)和(f)；(a)(b)、(d)和(e)；(a)、(b)、(d)和(f)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(c)、(d)和(e)；(a)、(c)、(d)和(f)；(a)、(c)、(e)和(f)；(a)、(d)、(e)和(f)；(b)、(c)、(d)和(e)；(b)、(c)、(d)和(f)；(b)(c)、(e)和(f)；(b)、(d)、(e)和(f)；(c)(d)、(e)和(f)；(a)、(b)、(c)、(d)和(e)；(a)、(b)、(c)、(d)和(f)；(a)、(b)、(c)、(e)和(f)；(a)、(b)、(d)、(e)和(f)；(a)、(c)、(d)、(e)和(f)；(b)、(c)、(d)、(e)和(f)；或(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)之间可以是保守的。在这种情况下，包含本发明的免疫原性肽的药物组合物(例如，疫苗)可能能够保护人类受试者免受多种不同的人类冠状病毒的感染。多肽和/或表位在人类冠状病毒(诸如SARS-CoV-2)和一种或多种动物冠状病毒之间可以是保守的。在这种情况下，包含本发明的免疫原性肽的药物组合物(例如，疫苗)可能能够防止动物冠状病毒跨越物种鸿沟。

冠状病毒

ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。如上所述，冠状病毒是正义ssRNA病毒。

ORF可例如由冠状病毒的所有基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。优选地，ORF由冠状病毒的基因组的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。例如，ORF可由冠状病毒的基因组的约1％至约99％，诸如约2％至约98％、约3％至约97％、约5％至约95％、约10％至约90％、约15％至约85％、约20％至约80％、约25％至约75％、约30％至约70％、约40％至约60％或约50％以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。如上所述，ORF可为任何长度。

冠状病毒可例如为人类冠状病毒。冠状病毒可例如为动物冠状病毒，诸如蝙蝠冠状病毒。冠状病毒可例如为人畜共患冠状病毒。示例性的人类、动物和人畜共患冠状病毒是本领域熟知的。

冠状病毒可例如为β冠状病毒(Betacoronavirus)属的成员。冠状病毒可例如为沙贝冠状病毒(Sarbecoronavirus)亚属的成员。

冠状病毒可例如为SARS-CoV-2病毒。冠状病毒可例如为SARS-CoV-1病毒。冠状病毒可例如为MERS-CoV病毒。冠状病毒可例如为地方性普通感冒冠状病毒。地方性普通感冒冠状病毒包括229E、NL63、OC43和HKU1。冠状病毒可例如为地方性普通感冒冠状病毒229E。

冠状病毒可例如为大流行性冠状病毒。大流行性冠状病毒可被定义为已经引起或有可能引起大流行的冠状病毒。冠状病毒可例如为地方性冠状病毒。地方性冠状病毒可被定义为在没有外部输入的情况下，在给定地理区域中其感染持续维持在基线水平的冠状病毒。地方性冠状病毒是本领域熟知的，包括普通感冒冠状病毒。冠状病毒可例如为季节性冠状病毒。季节性冠状病毒是一种具有显示出季节性的感染模式的冠状病毒，即一个或多个有规律的年度高峰。

某些冠状病毒诸如SARS-CoV-2和229E的正义基因组包含基因“orf1ab”。在SARS-CoV-2中，orf1ab基因对应于NCBI基因ID 43740578。当以正常方式翻译时(即，不转录形成互补mRNA)，orf1ab基因含有编码多蛋白PP1ab和PP1a的重叠开放阅读框。多蛋白被切割以产生16种非结构蛋白NSP1-16。本发明人已发现，orf1ab基因也以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码ORF，该ORF编码产生包含在本发明的免疫原性肽中的CD8+T细胞表位的多肽。换句话说，本发明人已发现，orf1ab基因的负义(即，其反向互补序列)也编码ORF，该ORF编码产生包含在本发明的免疫原性肽中的CD8+T细胞表位的多肽。换句话说，orf1ab基因的至少一部分可被转录以产生互补mRNA，该互补mRNA包含编码多肽的ORF，该多肽产生在本发明的免疫原性肽中包含的表位。因此，编码产生本发明的免疫原性肽中包含的表位的多肽的ORF可由orf1ab基因的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。

ORF可例如由冠状病毒的所有orf1ab基因以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。优选地，ORF由冠状病毒的orf1ab基因的一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。例如，ORF可由冠状病毒的orf1ab基因的约1％至约99％，诸如约2％至约98％、约3％至约97％、约5％至约95％、约10％至约90％、约15％至约85％、约20％至约80％、约25％至约75％、约30％至约70％、约40％至约60％或约50％以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。如上所述，ORF可为任何长度。orf1ab基因可例如包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。ORF可例如由SEQ ID NO:1的核苷酸1至303编码。

本发明的多核苷酸

本发明提供了编码本发明的免疫原性肽的多核苷酸。上文详细描述了本发明的免疫原性肽。上文结合本发明的免疫原性肽描述的任何方面可适用于本发明的多核苷酸。

多核苷酸可包括RNA。多核苷酸可包括DNA。多核苷酸可包括RNA和DNA两者。优选地，多核苷酸包括RNA或由RNA组成。更优选地，多核苷酸包括mRNA或由mRNA组成。

多核苷酸可包含以下序列：angncnccnacaacnncggnagnnnncacannacacncaagaacgncnnncngnanggnaggannnnccacnacnncnncagagacnggnnnnagancnncgcaggcaagannanccanncccngcgcgnccncngacnncagnacancaaacgaannngangnnncaacnggnnnngngcnccaaagacaacgnanacaccaggnannnggnnnanacgnggcnnnannagnngcanngnnaacangccaaacaanaggnnnangnaacaannnagcnccnnncnnaaaagagggngngnag(SEQ ID NO:1)或与该序列具有至少50％序列同一性的变体。在SEQ ID NO:1中，每个n独立地选自t和u。在一个方面，每个n可例如为t。也就是说，所有n都可为t。在另一个方面，每个n可例如为u。也就是说，所有n都可以是u。在进一步的方面，n中的一些可以是t，并且n中的一些可以是u。也就是说，序列可包含t和u的组合。该变体可例如与SEQ ID NO:1具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

多核苷酸可包含以下序列的一部分：angncnccnacaacnncggnagnnnncacannacacncaagaacgncnnncngnanggnaggannnnccacnacnncnncagagacnggnnnnagancnncgcaggcaagannanccanncccngcgcgnccncngacnncagnacancaaacgaannngangnnncaacnggnnnngngcnccaaagacaacgnanacaccaggnannnggnnnanacgnggcnnnannagnngcanngnnaacangccaaacaanaggnnnangnaacaannnagcnccnnncnnaaaagagggngngnag(SEQ ID NO:1)或与该序列具有至少50％序列同一性的变体。在SEQ ID NO:1中，每个n独立地选自t和u。在一个方面，每个n可例如为t。也就是说，所有n都可为t。在另一个方面，每个n可例如为u。也就是说，所有n都可以是u。在进一步的方面，n中的一些可以是t，并且n中的一些可以是u。也就是说，序列可包含t和u的组合。该变体可例如与SEQ ID NO:1的一部分具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。SEQ ID NO:1的部分可例如与SEQ ID NO:1相同，除了起始密码子(ATG)被排除之外。SEQ ID NO:1的部分可例如与SEQ ID NO:1相同，除了终止密码子(TAG)被排除之外。SEQ IDNO:1的部分可例如与SEQ ID NO:1相同，除了起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)被排除之外。SEQ ID NO:1的部分可例如编码SEQ ID NO:2至12的序列或其与选自SEQ ID NO:2至12的相关序列以任何组合具有至少50％序列同一性的变体中的一者或多者(诸如两者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者、七者或更多者、八者或更多者、九者或更多者、十者或更多者或十一者)。

药物组合物

本发明提供了包含本发明的免疫原性肽或本发明的多核苷酸的药物组合物。上文详细描述了本发明的免疫原性肽和本发明的多核苷酸。上文结合本发明的免疫原性肽或本发明的多核苷酸描述的任何方面可适用于本发明的多核苷酸。

药物组合物可例如为预防性组合物诸如疫苗。药物组合物可例如为治疗性组合物。药物组合物可具有预防效果、治疗效果、或同时具有预防和治疗效果。换句话说，药物组合物可用于预防冠状病毒感染、治疗冠状病毒感染或同时预防和治疗冠状病毒感染。

肽组合物

药物组合物可包含一种或多种免疫原性肽，诸如约1种至约50种、约2种至约40种、约3种至约30种、约4种至约25种、约5种至约20种、约6种至约15种、约7种、约8种、约9种或约10种免疫原性肽。该一种或多种免疫原性肽中的每种免疫原性肽可例如为本发明的免疫原性肽。另选地，药物组合物可含有(i)本发明的免疫原性肽和(ii)其他免疫原性肽的混合物。

在一个方面，药物组合物包含两种或更多种免疫原性肽。该两种或更多种免疫原性肽中的每种免疫原性肽可为本发明的免疫原性肽。药物组合物可例如包含两种或更多种免疫原性肽，每种免疫原性肽包含本发明的不同免疫原性肽。换句话说，药物组合物可包含两种或更多种免疫原性肽，每种免疫原性肽包含由ORF编码的多肽的不同片段，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。药物组合物可包含约1种至约50种、约2种至约40种、约3种至约30种、约4种至约25种、约5种至约20种、约6种至约15种、约7种、约8种、约9种或约10种免疫原性肽，每种免疫原性肽包含与由ORF编码的多肽不同的表位(诸如CD8+T细胞表位)，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。在一些方面，这些免疫原性肽中的每种免疫原性肽可与不同的HLA亚型相互作用。

药物组合物可包含(i)一种或多种(诸如约2种至约40种、约3种至约30种、约4种至约25种、约5种至约20种、约6种至约15种、约7种、约8种、约9种或约10种)免疫原性肽，每种免疫原性肽包含来自由ORF编码的多肽的表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码，和(ii)一种或多种其他免疫原性肽(即，不包含来自由ORF编码的多肽的表位的免疫原性肽，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码)。其他免疫原性肽可包含一个或多个表位，诸如约2个至约40个、约3个至约30个、约4个至约25个、约5个至约20个、约6个至约15个、约7个、约8个、约9个或约10个表位。该一个或多个表位中的每个表位可例如为B细胞表位、CD4+T细胞表位或CD8+T细胞表位。CD4+T细胞表位可例如为由一种或多种冠状病毒表达并且能够(i)由MHCII类分子呈递和(ii)由CD4+T细胞上存在的T细胞受体(TCR)识别的肽。另选地，CD4+T细胞表位可为不被一种或多种冠状病毒表达的CD4+T细胞表位。CD8+T细胞表位可例如为由一种或多种冠状病毒表达并且能够(i)由MHC I类分子呈递和(ii)由CD8+T细胞上存在的T细胞受体(TCR)识别的肽。优选地，CD8+T细胞表位为如下CD8+T细胞表位：不是来自ORF编码的多肽的CD8+T细胞表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。CD8+T细胞表位可为不被一种或多种冠状病毒表达的CD8+T细胞表位。B细胞表位可例如为由一种或多种冠状病毒表达并且能够由B细胞上存在的B细胞受体(BCR)识别的肽。优选地，B细胞表位为如下B细胞表位：不是来自ORF编码的多肽的B细胞表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。B细胞表位可为不被一种或多种冠状病毒表达的B细胞表位。

许多B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位(诸如来自冠状病毒的B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位)是本领域已知的。鉴定B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位的方法是本领域已知的。表位作图方法包括X射线共结晶学、基于阵列的寡肽扫描(有时称为重叠肽扫描或pepscan分析)、定点诱变、高通量诱变作图、氢-氘交换、交联偶联质谱、噬菌体展示和有限蛋白水解。也可使用MHC基序预测方法。如上所述，可鉴定由冠状病毒感染的细胞呈递的CD8+T细胞表位，以便直接鉴定包含在药物组合物中的CD8+T细胞表位。B细胞表位可使用表位作图方法来鉴定。这些方法包括结构方法和功能方法，在结构方法中，在基于算法的方法中使用蛋白质的已知或模型化结构来预测表面表位，在功能方法中，例如使用酶联免疫吸附测定(ELISA)可定量整个蛋白质、蛋白质片段或肽与抗体的结合。也可使用竞争作图、抗原修饰或蛋白质片段化方法。

药物组合物可包含与至少两种不同的HLA超型相互作用的至少一种免疫原性肽。这可使得药物组合物在更大比例的接收该药物组合物施用的个体中引发免疫应答。这是因为该药物组合物应该能够在与免疫原性肽相互作用的HLA超型的所有个体中引发免疫应答(诸如T细胞应答，例如CD8+T细胞应答)。药物组合物可例如包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少十种、至少十五种或至少二十种免疫原性肽，每种免疫原性肽包含来自由ORF编码并与至少两种不同的HLA超型相互作用的多肽的CD8+T细胞表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。每种免疫原性肽可与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的HLA超型相互作用。每种免疫原性肽可与A1、A10、A11、A19、A2、A203、A210、A23、A24、A2403、A25、A26、A28、A29、A3、A30、A31、A32、A33、A34、A36、A43、A66、A68、A69、A74、A80、A9、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B21、B22、B27、B35、B37、B38、B39、B40、B41、B42、B44、B45、B46、B47、B48、B49、B5、B50、B51、B5102、B5103、B52、B53、B54、B55、B56、B57、B58、B59、B60、B61、B62、B63、B64、B65、B67、B7、B70、B703、B71、B72、B73、B75、B76、B77、B78、B8、B81、B82、C1、C10、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9或本领域已知的任何其他HLA超型中的两者或更多者以任何组合相互作用。

药物组合物可包含至少两种免疫原性肽，每种免疫原性肽与不同的HLA超型相互作用。例如，药物组合物可包含两种或更多种免疫原性肽，(i)每种免疫原性肽包含来自由ORF编码的多肽的不同表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码，和(ii)每种免疫原性肽与不同的HLA超型相互作用。在药物组合物中包含两种或更多种这样的免疫原性肽使得药物组合物在更大比例的接收该药物组合物施用的个体中引发免疫应答。这是因为药物组合物应该能够在HLA超型的所有个体中引发免疫应答(诸如T细胞应答)，该HLA超型与包含在两种或更多种免疫原性肽中的表位之一相互作用。每个表位可与A1、A10、A11、A19、A2、A203、A210、A23、A24、A2403、A25、A26、A28、A29、A3、A30、A31、A32、A33、A34、A36、A43、A66、A68、A69、A74、A80、A9、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B21、B22、B27、B35、B37、B38、B39、B40、B41、B42、B44、B45、B46、B47、B48、B49、B5、B50、B51、B5102、B5103、B52、B53、B54、B55、B56、B57、B58、B59、B60、B61、B62、B63、B64、B65、B67、B7、B70、B703、B71、B72、B73、B75、B76、B77、B78、B8、B81、B82、C1、C10、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8或C9或本领域已知的任何其他HLA超型相互作用。包含这种表位的免疫原性肽的任何组合都是可能的。

多核苷酸组合物

药物组合物可包含一种或多种多核苷酸，诸如约1种至约50种、约2种至约40种、约3种至约30种、约4种至约25种、约5种至约20种、约6种至约15种、约7种、约8种、约9种或约10种多核苷酸。该一种或多种多核苷酸中的每种多核苷酸都可例如为本发明的多核苷酸。另选地，药物组合物可含有(i)本发明的多核苷酸和(ii)其他多核苷酸的混合物。

每种多核苷酸可包括RNA，诸如mRNA。每种多核苷酸可包括DNA。每种多核苷酸可包括RNA和DNA。优选地，每种多核苷酸包括RNA或由RNA组成。更优选地，每种多核苷酸包括mRNA或由mRNA组成。

在一个方面，药物组合物包含两种或更多种多核苷酸。该两种或更多种多核苷酸中的每种多核苷酸都可为本发明的多核苷酸。药物组合物可例如包含两种或更多种多核苷酸，每种多核苷酸编码本发明的不同免疫原性肽。换句话说，药物组合物可包含两种或更多种多核苷酸，每种多核苷酸编码由ORF编码的多肽的不同片段，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。药物组合物可包含约1种至约50种、约2种至约40种、约3种至约30种、约4种至约25种、约5种至约20种、约6种至约15种、约7种、约8种、约9种或约10种多核苷酸，每种多核苷酸编码与由ORF编码的多肽不同的表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。在一些方面，不同表位中的每个表位可与不同的HLA亚型相互作用。

药物组合物可包含一种或多种(诸如约2种至约40种、约3种至约30种、约4种至约25种、约5种至约20种、约6种至约15种、约7种、约8种、约9种或约10种)多核苷酸，每种多核苷酸编码包含表位的免疫原性肽，该表位来自由ORF编码的多肽，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码，和(ii)一种或多种其他多核苷酸(即，不编码包含表位的免疫原性肽的多核苷酸，该表位来自由ORF编码的多肽，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码)。其他多核苷酸可编码一个或多个表位，诸如约2个至约40个、约3个至约30个、约4个至约25个、约5个至约20个、约6个至约15个、约7个、约8个、约9个或约10个表位。表位可例如为B细胞表位、CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位，如上文结合肽疫苗所述。

药物组合物可包含编码免疫原性肽的至少一种多核苷酸，该免疫原性肽与至少两种不同的HLA超型相互作用。这使得药物组合物在更大比例的接收该药物组合物施用的个体中引发免疫应答(诸如T细胞应答，例如CD8+T细胞应答)。这是因为该药物组合物应该能够在与表位相互作用的HLA超型的所有个体中引发免疫应答(诸如T细胞应答，例如CD8+T细胞应答)。药物组合物可例如包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少十种、至少十五种或至少二十种多核苷酸，每种多核苷酸编码免疫原性肽，该免疫原性肽包含来自由ORF编码并与至少两种不同的HLA超型相互作用的多肽的CD8+T细胞表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。每种免疫原性肽可与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的HLA超型相互作用。每种免疫原性肽可与A1、A10、A11、A19、A2、A203、A210、A23、A24、A2403、A25、A26、A28、A29、A3、A30、A31、A32、A33、A34、A36、A43、A66、A68、A69、A74、A80、A9、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B21、B22、B27、B35、B37、B38、B39、B40、B41、B42、B44、B45、B46、B47、B48、B49、B5、B50、B51、B5102、B5103、B52、B53、B54、B55、B56、B57、B58、B59、B60、B61、B62、B63、B64、B65、B67、B7、B70、B703、B71、B72、B73、B75、B76、B77、B78、B8、B81、B82、C1、C10、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9或本领域已知的任何其他HLA超型中的两者或更多者以任何组合相互作用。

药物组合物可包含至少两种多核苷酸，每种多核苷酸编码与不同的HLA超型相互作用的免疫原性肽。例如，药物组合物可包含两种或更多种多核苷酸，每种多核苷酸编码免疫原性肽，该免疫原性肽(i)包含来自由ORF编码的多肽的不同表位，该ORF由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码，和(ii)与不同的HLA超型相互作用。在药物组合物中包含两种或更多种此类多核苷酸使得药物组合物在更大比例的接收该药物组合物施用的个体中引发免疫应答(诸如T细胞应答，例如CD8+T细胞应答)。这是因为该药物组合物应该能够在与由两种或更多种多核苷酸编码的表位之一相互作用的HLA超型的所有个体中引发免疫应答(诸如T细胞应答，例如CD8+T细胞应答)。每个表位可与A1、A10、A11、A19、A2、A203、A210、A23、A24、A2403、A25、A26、A28、A29、A3、A30、A31、A32、A33、A34、A36、A43、A66、A68、A69、A74、A80、A9、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B21、B22、B27、B35、B37、B38、B39、B40、B41、B42、B44、B45、B46、B47、B48、B49、B5、B50、B51、B5102、B5103、B52、B53、B54、B55、B56、B57、B58、B59、B60、B61、B62、B63、B64、B65、B67、B7、B70、B703、B71、B72、B73、B75、B76、B77、B78、B8、B81、B82、C1、C10、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8或C9或本领域已知的任何其他HLA超型相互作用。包含这种表位的免疫原性肽的任何组合都是可能的。

纳米颗粒

本发明的药物组合物中包含的任何免疫原性肽或多核苷酸可附接到纳米颗粒。如本文所述，与纳米颗粒(例如，金纳米颗粒)的附接是有益的。

肽或多核苷酸与纳米颗粒(例如，金纳米颗粒)的附接减少或消除了在药物组合物中包含病毒或佐剂的需要。纳米颗粒可包含免疫“危险信号”，有助于有效诱导对肽或多核苷酸的免疫应答。纳米颗粒可诱导树突状细胞(DC)激活和成熟，这是强免疫应答所必需的。纳米颗粒可包含非自身组分，其改善纳米颗粒的摄取，从而改善细胞(诸如抗原呈递细胞)对肽或多核苷酸的摄取。因此，肽或多核苷酸与纳米颗粒的附接可增强抗原呈递细胞刺激病毒特异性T和/或B细胞的能力。与纳米颗粒的附接还促进药物组合物经由皮下、皮内、透皮和口服/口腔途径的递送，从而提供了施用的灵活性。

纳米颗粒是尺寸在1纳米(nm)至100nm的颗粒，其可用作固定配体的基质。在本发明的药物组合物中，纳米颗粒可具有1nm至100nm、20nm至90nm、30nm至80nm、40nm至70nm或50nm至60nm的平均直径。优选地，纳米颗粒具有20nm至40nm的平均直径。20nm至40nm的平均直径促进纳米颗粒被摄取至细胞溶质。可使用本领域熟知的技术诸如透射电子显微镜来测量平均直径。

适于递送抗原诸如免疫原性肽的纳米颗粒是本领域已知的。用于生产此类纳米颗粒的方法也是已知的。适于递送多核苷酸的纳米颗粒及其生产方法也是本领域已知的。

纳米颗粒可例如为聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)、病毒样颗粒(VLP)或自组装蛋白。纳米颗粒优选为磷酸钙纳米颗粒、硅纳米颗粒或金纳米颗粒。

纳米颗粒可为聚合物纳米颗粒。聚合物纳米颗粒可包含一种或多种合成聚合物，诸如聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚(d,l-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(g-谷氨酸)(g-PGA)m、聚(乙二醇)(PEG)或聚苯乙烯。聚合物纳米颗粒可包含一种或多种天然聚合物，诸如多糖，例如支链淀粉、藻酸盐、菊粉和壳聚糖。由于可包含在纳米颗粒中的聚合物的性质，使用聚合物纳米颗粒可能是有利的。例如，上述天然和合成聚合物可具有良好的生物相容性和生物可降解性、无毒性质和/或被处理成所需形状和尺寸的能力。聚合物纳米颗粒可形成水凝胶纳米颗粒。水凝胶纳米颗粒是一种纳米级亲水性三维聚合物网络。水凝胶纳米颗粒具有有利的性质，包括灵活的筛目尺寸、用于多价缀合的大表面积、高含水量和高抗原负载容量。聚合物诸如聚(L-乳酸)(PLA)、PLGA、PEG和多糖特别适于形成水凝胶纳米颗粒。

纳米颗粒可为无机纳米颗粒。通常，无机纳米颗粒具有刚性结构，并且是不可生物降解的。然而，无机纳米颗粒可以是可生物降解的。无机纳米颗粒可包含其中可包封抗原的外壳。无机纳米颗粒可包括抗原可共价附接到其上的芯。芯可包含金属。例如，芯可包含金(Au)、银(Ag)或铜(Cu)原子。芯可由多于一种类型的原子形成。例如，芯可包含合金，诸如Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd或Au/Ag/Cu/Pd的合金。芯可包含磷酸钙(CaP)。芯可包含半导体材料，例如硒化镉。纳米颗粒可为金纳米颗粒，诸如金乙二醇纳米颗粒。

其他示例性无机纳米颗粒包括碳纳米颗粒和基于二氧化硅的纳米颗粒。碳纳米颗粒具有良好的生物相容性，并且可合成为纳米管和介孔球。基于二氧化硅的纳米颗粒(SiNP)是生物相容的，并且可制备为具有可调的结构参数以适合它们的治疗应用。

纳米颗粒可为硅纳米颗粒，诸如元素硅纳米颗粒。纳米颗粒可为介孔的或具有蜂窝状孔结构。优选地，纳米颗粒为具有蜂窝状孔结构的元素硅颗粒。此类纳米颗粒是本领域已知的，并且提供可调的和受控的药物负载、靶向和释放，其可被调整以适应几乎任何负载、施用途径、靶向或释放曲线。例如，此类纳米颗粒可增加其负载的生物利用度，和/或改善口服活性物质的肠渗透性和吸收。由于纳米颗粒的多孔结构和大表面积，纳米颗粒可具有格外高的负载能力。纳米颗粒可在数天、数周或数月内释放其负载，具体取决于其物理性质。由于硅是人体的天然存在的元素，纳米颗粒可能不会引起来自免疫系统的应答。这有利于纳米颗粒的体内安全性。

上述任一种SiNP都可以是可生物降解的或不可生物降解的。可生物降解的SiNP可溶解成原硅酸，即硅的生物可利用形式。原硅酸已被证明有益于骨骼、结缔组织、头发和皮肤的健康。

纳米颗粒可为脂质体。脂质体通常由可生物降解的无毒磷脂形成，并且包含具有水性芯的自组装磷脂双层壳。脂质体可为包含单个磷脂双层的单层囊泡，或包含被水层分隔的几个同心磷脂壳的多层囊泡。因此，脂质体可被调整为将亲水性分子结合到水性芯中或将疏水性分子结合到磷脂双层内。脂质体可将抗原包封在芯内用于递送。脂质体可将病毒包膜糖蛋白结合到壳上以

形成病毒体。许多基于脂质体的产品已在本领域建立并被批准用于人类用途。

纳米颗粒可为免疫刺激复合物(ISCOM)。ISCOM是笼状颗粒，通常由含胶态皂苷的胶束形成。ISCOM可包含胆固醇、磷脂(诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱)和皂苷(诸如来自皂树的Quil A)。ISCOM传统上用于捕获病毒包膜蛋白，诸如来自1型单纯疱疹病毒、乙型肝炎或流感病毒的包膜蛋白。

纳米颗粒可为病毒样颗粒(VLP)。VLP是缺乏感染性核酸的自组装纳米颗粒，由生物相容性衣壳蛋白的自组装形成。VLP的直径通常为约20nm至约150nm，诸如约20nm至约40nm、约30nm至约140nm、约40nm至约130nm、约50nm至约120nm、约60nm至约110nm、约70nm至约100nm或约80nm至约90nm。VLP有利地利用了进化病毒结构的能力，这种病毒结构天然地被优化用于与免疫系统的相互作用。天然优化的纳米颗粒尺寸和重复结构顺序意味着，即使在没有佐剂的情况下，VLP也能诱导强效免疫应答。

纳米颗粒可为自组装蛋白。例如，纳米颗粒可包含铁蛋白。铁蛋白是一种可自组装成近球形10nm结构的蛋白质。纳米颗粒可包含主要拱顶蛋白(MVP)。九十六个单位的MVP可自组装成桶形拱顶纳米颗粒，尺寸为约40nm宽和70nm长。

纳米颗粒可为磷酸钙(CaP)纳米颗粒。CaP纳米颗粒可包含含有一个或多个(诸如两个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、或500个或更多个)CaP分子的芯。CaP纳米颗粒及其产生方法是本领域已知的。例如，CAP纳米颗粒的稳定纳米悬浮液可通过在恒定混合下以预定比例混合钙和磷酸盐的无机盐溶液来产生。

CaP纳米颗粒可具有约80nm至约100nm，诸如约82nm至约98nm、约84nm至约96nm、约86nm至约94nm或约88nm至约92nm的平均粒度。该粒度可在免疫细胞摄取和免疫应答方面产生比其他更大的粒度更好的性能。例如，当在1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月、36个月或48个月的时间段内测量时，粒度可以是稳定的(即，没有显示出显著变化)。

CaP纳米颗粒可与一种或多种抗原共同配制，该一种或多种抗原或者吸附在纳米颗粒的表面上或者在颗粒合成期间与CaP共沉淀。例如，肽诸如免疫原性肽可通过将肽(例如以约10mg/ml的浓度)溶解在DMSO中，将其与N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)(例如以0.093mol/L)和超纯水一起加入到CaP纳米颗粒的悬浮液中，并在室温下混合约4小时(例如，1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时)的时间段而附接到CaP纳米颗粒上。

药物组合物可包含约0.15％至约0.8％，诸如0.2％至约0.75％、0.25％至约0.7％、0.3％至约0.6％、0.35％至约0.65％、0.4％至约0.6％或0.45％至约0.55％的CaP纳米颗粒。优选地，药物组合物包含约0.3％的CaP纳米颗粒。

CaP纳米颗粒由于其与人类硬组织诸如骨和牙齿的化学相似性而具有高度的生物相容性。因此，有利地，CaP纳米颗粒在用于治疗应用时是无毒的。CaP纳米颗粒对于通过肌内、皮下、口服或吸入途径施用是安全的。商业化合成CaP纳米颗粒也很简单。此外，CaP纳米颗粒可与抗原的缓慢释放相关联，这可增强对附接到纳米颗粒的肽的免疫应答的诱导。CaP纳米颗粒既可用作佐剂，也可用作药物递送载体。

纳米颗粒可为金纳米颗粒，诸如金糖纳米颗粒。金纳米颗粒是本领域已知的，并且特别描述于WO 2002/32404、WO 2006/037979、WO 2007/122388、WO 2007/015105和WO2013/034726中，这些专利中的每一篇以引用方式全文并入本文。附接到每个肽的金纳米颗粒可以是WO 2002/32404、WO 2006/037979、WO 2007/122388、WO 2007/015105和WO 2013/034726中的任一篇中描述的金纳米颗粒，这些专利中的每一篇以引用方式全文并入本文。

金纳米颗粒包括含有金(Au)原子的芯。芯还可包含一个或多个Fe、Cu或Gd原子。芯可由金合金形成，诸如Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd。芯中的原子总数可为100个至500个原子，诸如150个至450个、200个至400个或250个至350个原子。金纳米颗粒可具有1nm至100nm、20nm至90nm、30nm至80nm、40nm至70nm或50nm至60nm的平均直径。优选地，金纳米颗粒具有20nm至40nm的平均直径。

纳米颗粒可包含用α-半乳糖和/或β-GlcNHAc包被的表面。例如，纳米颗粒可包含用α-半乳糖和/或β-GlcNHAc钝化的表面。在这种情况下，纳米颗粒可例如为包含含有金属和/或半导体原子的芯的纳米颗粒。例如，纳米颗粒可为金纳米颗粒。β-GlcNHAc是一种细菌病原体相关分子模式(PAMP)，能够激活抗原呈递细胞。这样，包含用β-GlcNHAc包被或钝化的表面的纳米颗粒可非特异性地刺激免疫应答。因此，免疫原性肽与此类纳米颗粒的附接可改善通过向个体施用本发明的药物组合物而引发的免疫应答。

除了肽或多核苷酸之外的一种或多种配体可连接到纳米颗粒，该纳米颗粒可为上述纳米颗粒类型中的任一种。配体可形成“冠”，即可部分或完全覆盖芯的表面的层或包衣。冠可被认为是围绕或部分围绕纳米颗粒芯的有机层。冠可提供或参与钝化纳米颗粒的芯。因此，在某些情况下，冠可以是足够完整的包衣以稳定芯。冠可促进本发明的纳米颗粒的溶解性，诸如水溶性。

纳米颗粒可包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个或至少50个配体。配体可包括一种或多种肽、蛋白质结构域、核酸分子、脂质基团、碳水化合物基团、阴离子基团或阳离子基团、糖脂和/或糖蛋白。碳水化合物基团可以是多糖、寡糖或单糖基团(例如葡萄糖)。一种或多种配体可以是非自身组分，这使得纳米颗粒由于其与致病组分的相似性而更可能被抗原呈递细胞摄取。例如，一种或多种配体可包含碳水化合物部分(诸如细菌碳水化合物部分)、表面活性剂部分和/或谷胱甘肽部分。示例性配体包括葡萄糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、谷胱甘肽、2'-硫代乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷和2'-硫代乙基-D-吡喃葡萄糖苷。优选的配体包括形成糖纳米颗粒的糖缀合物

配体与芯的连接可通过接头促进。接头可包含硫醇基、烷基、乙二醇基或肽基。例如，接头可包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇基。接头可包含能够共价附接到芯的含硫基团、含氨基基团、含磷酸根基团或含氧基团。另选地，配体可直接连接到芯，例如通过配体中包含的含硫基团、含氨基基团、含磷酸根基团或含氧基团。

附接到纳米颗粒

通常，免疫原性肽或多核苷酸可附接到纳米颗粒的芯，但是附接到冠或配体也可为可能的。免疫原性肽可在其N-末端附接到纳米颗粒。

肽或多核苷酸可直接附接到纳米颗粒，例如通过肽或多核苷酸中的含硫基团、含氨基基团、含磷酸根基团或含氧基团中的原子与纳米颗粒或其芯中的原子共价键合。

可使用接头将肽或多核苷酸连接到纳米颗粒。接头可包含能够共价附接到芯中的原子的含硫基团、含氨基基团、含磷酸根基团或含氧基团。例如，接头可包含硫醇基、烷基、乙二醇基或肽基。

接头可包含肽部分和非肽部分。肽部分可包含序列X₁X₂Z₁，其中X₁为选自A和G的氨基酸；X₂为选自A和G的氨基酸；并且Z₁为选自Y和F的氨基酸。肽部分可包含序列AAY或FLAAY。接头的肽部分可连接到肽的N-末端。接头的非肽部分可包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇，例如硫乙基或硫丙基。

接头可为(i)HS-(CH₂)₂-CONH-AAY；(ii)HS-(CH₂)₂-CONH-LAAY；(iii)HS-(CH₂)₃-CONH-AAY；(iv)HS-(CH₂)₃-CONH-FLAAY；(v)HS-(CH₂)₁₀-(CH₂OCH₂)₇-CONH-AAY；和(vi)HS-(CH₂)₁₀-(CH₂OCH₂)₇-CONH-FLAAY。在这种情况下，接头的非肽部分的硫醇基将接头连接到芯。

用于将肽或多核苷酸附接到纳米颗粒的其他合适的接头是本领域已知的，并且可由技术人员容易地识别和实施。

如上所述，药物组合物可包含多种免疫原性肽或多种多核苷酸。当药物组合物包含多于一种免疫原性肽或多核苷酸时，两种或更多种(诸如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种或二十种或更多种)免疫原性肽或多核苷酸可附接到相同的纳米颗粒。两种或更多种(诸如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种或二十种或更多种)免疫原性肽或多核苷酸可各自附接到不同的纳米颗粒。然而免疫原性肽或多核苷酸所附接到的纳米颗粒也可为相同类型的纳米颗粒。例如，每种免疫原性肽或多核苷酸可附接到金纳米颗粒或金乙二醇纳米颗粒。每种免疫原性肽或多核苷酸可附接到CaP纳米颗粒。免疫原性肽或多核苷酸所附接到的纳米颗粒可为不同类型的纳米颗粒。例如，一种免疫原性肽或多核苷酸可附接到金纳米颗粒，而另一种免疫原性肽或多核苷酸可附接到CaP纳米颗粒。

组合物可与生理学上可接受的载体或稀释剂一起制备。通常，将此类组合物制备为肽和/或肽连接的纳米颗粒的液体悬浮液。

药物、方法和治疗用途

本发明提供了一种预防和/或治疗冠状病毒感染的方法，包括向个体施用本发明的药物组合物。本发明还提供了本发明的药物组合物用于预防和/或治疗个体的冠状病毒感染的方法中。本发明进一步提供了免疫原性肽和编码此类肽的核苷酸在制备用于治疗和/或预防个体的冠状病毒感染的药物中的用途。

通常，个体是人。然而，个体可为动物，诸如狗、猫、兔、豚鼠、马、牛、绵羊、山羊、鸟、蝙蝠等。

冠状病毒感染可由人畜共患病毒引起。冠状病毒感染可为大流行性病毒感染或潜在的大流行性病毒感染。冠状病毒感染可为由地方性冠状病毒引起的感染。冠状病毒感染可为季节性冠状病毒感染。冠状病毒感染可由人类冠状病毒引起。冠状病毒感染可由动物冠状病毒诸如蝙蝠冠状病毒引起。冠状病毒感染可由人畜共患冠状病毒引起。示例性的人类、动物和人畜共患冠状病毒是本领域熟知的。

人类冠状病毒可例如为SARS-CoV-2病毒。人类冠状病毒可例如为SARS-CoV-1病毒。人类冠状病毒可例如为MERS-CoV病毒。人类冠状病毒可例如为地方性普通感冒冠状病毒。如上所述，地方性普通感冒冠状病毒包括229E、NL63、OC43和HKU1。

药物组合物优选地包含药学上可接受的载体或稀释剂。药物组合物可使用任何合适的方法配制。可使用制药领域的常规方法来进行细胞与标准药学上可接受的载体和/或赋形剂的配制。制剂的确切性质将取决于几个因素，包括待施用的细胞和期望的施用途径。合适类型的制剂在Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack PublishingCompany，Eastern Pennsylvania，USA中有充分描述，其以引用方式全文并入本文。

药物组合物可通过任何途径施用。合适的途径包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、皮下、皮内、透皮和口服/口腔途径。

纳米颗粒可以与药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油等，以及它们的组合。

另外，如果需要，药物组合物可含有少量的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂和/或pH缓冲剂。

肽、肽连接的纳米颗粒、多核苷酸或多核苷酸连接的纳米颗粒以与剂量制剂相容的方式施用，并且这样的量将是治疗有效的。待施用的量取决于待治疗的受试者、待治疗的疾病以及受试者的免疫系统的能力。需要施用的肽、多核苷酸或纳米颗粒的精确量可取决于医师的判断，并且可能因每个受试者而异。

可将任何合适数目的肽、肽连接的纳米颗粒、多核苷酸或多核苷酸连接的纳米颗粒施用于受试者。例如，每kg患者可施用至少或约0.2×10⁶、0.25×10⁶、0.5×10⁶、1.5×10⁶、4.0×10⁶或5.0×10⁶个肽、肽连接的纳米颗粒、多核苷酸或多核苷酸连接的纳米颗粒。例如，可施用至少或约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹个肽、肽连接的纳米颗粒、多核苷酸或多核苷酸连接的纳米颗粒。作为指导，待施用的肽、肽连接的纳米颗粒、多核苷酸或多核苷酸连接的纳米颗粒的数目可为10⁵至10⁹，优选10⁶至10⁸。

复合物

本发明提供了包含与MHC分子结合的本发明的免疫原性肽的复合物。因此，复合物可包含例如免疫原性肽，该免疫原性肽包含与MHC分子结合的SEQ ID NO:2至12、46和63中的任一项或由其组成。因此，复合物可例如包含与选自SEQ ID NO:2至12、46和63的相关序列具有至少50％序列同一性的免疫原性肽。变体可例如与选自SEQ ID NO:2至12、46和63的相关序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或99％的序列同一性。

肽:MHC结合是本领域熟知的。优选地，包含在复合物中的肽和MHC分子之间的结合是非共价的。结合可通过例如静电相互作用、氢键、范德华力和/或疏水相互作用介导。

MHC分子可为MHC I类分子或MHC II类分子。优选地，MHC分子为MHC I类分子。MHC分子可为任何HLA超型。例如，MHC I类分子可为超型A1、A10、A11、A19、A2、A203、A210、A23、A24、A2403、A25、A26、A28、A29、A3、A30、A31、A32、A33、A34、A36、A43、A66、A68、A69、A74、A80、A9、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B21、B22、B27、B35、B37、B38、B39、B40、B41、B42、B44、B45、B46、B47、B48、B49、B5、B50、B51、B5102、B5103、B52、B53、B54、B55、B56、B57、B58、B59、B60、B61、B62、B63、B64、B65、B67、B7、B70、B703、B71、B72、B73、B75、B76、B77、B78、B8、B81、B82、C1、C10、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8或C9。

复合物可包含两个或更多个本发明的免疫原性肽和两个或更多个MHC分子。例如，复合物可包含三个或更多个，诸如四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、或20个或更多个本发明的免疫原性肽。复合物可包含三个或更多个，诸如四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、或20个或更多个MHC分子。复合物可例如分别包含三个或更多个，诸如四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、或20个或更多个本发明的免疫原性肽，以及三个或更多个，诸如四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、或20个或更多个MHC分子。复合物可包含与MHC分子相同数目的本发明的免疫原性肽。复合物可包含与MHC分子数目不同数目的本发明的免疫原性肽。复合物可例如包含四个MHC分子。复合物可包含MHC四聚体或由其组成。复合物可例如包含十二个MHC分子。复合物可包含MHC十二聚体或由其组成。

当复合物包含两个或更多个本发明的免疫原性肽时，该两个或更多个免疫原性肽中的每个免疫原性肽可为相同的。另选地，该两个或更多个免疫原性肽中的每个免疫原性肽可为不同的。当复合物包含三个或更多个本发明的免疫原性肽时，该三个或更多个免疫原性肽中的每个免疫原性肽可为相同的。当复合物包含三个或更多个本发明的免疫原性肽时，该三个或更多个肽中的每个肽可为不同的。当复合物包含三个或更多个本发明的免疫原性肽时，该三个或更多个免疫原性肽中的一些免疫原性肽可为相同的，并且该三个或更多个免疫原性肽中的一些免疫原性肽可为不同的。

当复合物包含两个或更多个MHC分子时，该两个或更多个MHC分子中的每个MHC分子可为相同的。另选地，该两个或更多个MHC分子中的每个MHC分子可为不同的。当复合物包含三个或更多个MHC分子时，该三个或更多个MHC分子中的每个MHC分子可为相同的。当复合物包含三个或更多个MHC分子时，该三个或更多个MHC分子中的每个MHC分子可为不同的。当复合物包含三个或更多个MHC分子时，该三个或更多个MHC分子中的一些MHC分子可为相同的，并且该三个或更多个MHC分子中的一些MHC分子可为不同的。

当复合物包含两个或更多个本发明的免疫原性肽和两个或更多个MHC分子时，每个免疫原性肽可与两个或更多个MHC分子之一结合。也就是说，包含在复合物中的每个免疫原性肽可与包含在复合物中的MHC分子结合。优选地，包含在复合物中的每个免疫原性肽与包含在复合物中的不同MHC分子结合。也就是说，包含在复合物中的每个MHC分子优选地与包含在复合物中的不超过一个免疫原性肽结合。然而，复合物可包含一个或多个不与MHC分子结合的本发明的免疫原性肽。复合物可包含一个或多个不与本发明的肽结合的MHC分子。

包含在复合物中的一个或多个MHC分子可彼此连接。例如，复合物中的一个或多个MHC分子中的每个MHC分子可附接到主链分子或纳米颗粒。包含在复合物中的一个或多个MHC分子可附接到葡聚糖主链。也就是说，复合物可包含MHC dextramer或由其组成。将一个或多个MHC分子附接到葡聚糖主链的机制是本领域已知的。任何数目的MHC分子都可附接到葡聚糖主链。例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个，诸如四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、或20个或更多个本发明的肽，以及三个或更多个，诸如四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、或20个或更多个MHC分子可附接到葡聚糖主链。

复合物可包含荧光团。荧光团是本领域熟知的，并且包括FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)和APC(别藻蓝蛋白)。该复合物可包含任何数目的荧光团。例如，复合物可包含两个或更多个、三个或更多个，诸如四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、或20个或更多个本发明的肽，以及三个或更多个，诸如四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、或20个或更多个荧光团。当复合物包含多个荧光团时，包含在复合物中的荧光团可相同或不同。当复合物包含主链诸如葡聚糖主链时，荧光团优选地附接到葡聚糖主链。将荧光团附接到葡聚糖主链的机制是本领域已知的。

在上述说明书或所附权利要求书或附图中公开的特征，以它们的具体形式或以用于执行所公开功能的手段、或用于获得所公开结果的方法或过程来表达，在适当的情况下，可单独地或者以这些特征的任意组合的形式用于以各种形式实现本发明。

虽然已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是当给出本公开时，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，上述本发明的示例性实施方案被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所描述的实施方案进行各种改变。

为了避免任何疑问，本文提供的任何理论解释都是为了增进读者的理解而提供的。本发明人不希望被任何这些理论解释所束缚。

本文所用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。

实施例1—样品制备

使用三步方案来制备样品：

1.病毒原种的产生

2.感染细胞上清液和裂解物样品的产生

3.所收集样品的灭活验证

步骤1：病毒原种的产生

SARS CoV-2菌株(华盛顿和意大利)获自美国典型培养物保藏中心。将Vero细胞接种到T-75烧瓶(4*10^6个细胞/烧瓶)中。将病毒稀释在2mL培养基中，以达到0.02-0.05的MOI。细胞在37℃感染1小时，每15分钟摇动一次以铺展接种物。1小时后，将8mL培养基加入烧瓶中，并将烧瓶放回培养箱中，在37℃和5％CO₂下培养3天。感染后3天，从烧瓶中弃去5mL培养基，并加入5mL新鲜培养基。感染后5天，收集上清液(约10mL)并用注射器过滤(0.2微米PES过滤注射器)到50mL锥形瓶中。将过滤的上清液等分并在-80℃冷冻。使用Vero细胞的标准噬斑测定滴定病毒。

步骤2：感染细胞上清液和裂解物样品的产生

如下收集样品用于分离MHC相关肽。为每个实验产生新的病毒原种，以便感染足够数目的用于样品收集的细胞。HepG2细胞在T-175烧瓶或T-150培养皿(1*10^7个细胞/烧瓶)中生长并用SARS CoV-2感染。将病毒稀释在5ml培养基中，以达到0.01的MOI。细胞在37℃感染1小时，每15分钟摇动一次以铺展接种物。1小时后，将15mL培养基加入烧瓶(总共20mL培养基)中，并将烧瓶放回培养箱中，在37℃和5％CO₂下培养3天。

在72小时，将上清液在新鲜培养基(总体积20mL)中1:1稀释，并用于感染在T-150培养皿中生长的HepG2细胞(1*10^7个细胞/培养皿)。感染后24小时，使用细胞刮刀在补充有2mM EDTA的PBS中收获感染的细胞。将细胞以1500rpm离心，除去上清液，并将细胞沉淀重悬于0.1％三氟乙酸溶液(每个样品3mL)中。将样品在摇床上于室温孵育10分钟，并以1500rpm离心5分钟。收集TFA上清液并储存在-80℃。

将细胞沉淀重悬，并用补充有蛋白酶抑制剂混合物(每个样品3mL)的PBS洗涤两次。将细胞以1500rpm沉淀5分钟。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(150mM NaCl，10mMNa₂HPO₄，1mM EDTA，1％NP-40和蛋白酶抑制剂混合物，每个样品3mL)中。将重悬的细胞在-80℃冷冻，随后在37℃水浴中解冻两次以裂解细胞。将样品以3000rpm离心10分钟以弃去碎片，并将细胞裂解物在-80℃冷冻。

步骤3：所收集样品的灭活验证

在从BSL-3实验室取出所收集样品之前，对每个样品进行单独测试以确认不存在可检测到的病毒。使用Vero细胞的标准噬斑测定进行验证(检测限约50PFU/mL)。在确认灭活后，将样品从BSL-3中取出并运输。

实施例2—从SARS-CoV-2病毒感染的细胞中发现MHC I类肽

方法

1.SCV2感染的HepG2细胞制备

HepG2细胞(1.4×10⁸个总细胞)分两个单独的批次生长，两批均被独立感染。对于批次1，用SCV2(MOI＝0.01)感染细胞72小时并收集上清液。对于批次2，用第1轮感染的上清液(用培养基1:1稀释)感染细胞48小时。使用流式细胞术方法测试SCV2感染后每批的感染效率。将上清液和细胞裂解物在Vero细胞培养基中连续稀释10倍(按照噬斑测定方案)，并用于感染Vero细胞以测量病毒颗粒的存在。感染后48小时计数噬斑数目作为灭活量度。

2.使用质谱样品分析发现SCV2 MHC I类肽

a)样品制备—收获SARS-CoV-2_USA_WA1毒株感染的HepG2细胞并用PBS洗涤一次。用0.1％TFA处理细胞沉淀并收集上清液。用裂解缓冲液处理细胞沉淀，并使用免疫蛋白组学方案处理以分离和纯化MHC I类肽。将两个样品(来自步骤1和2的样品)合并、净化并在离线HPLC系统上分级。在UPLC-Nano-MS/MS系统上分析每个级分。

b)DDA模式—使用与Dionex Ultimate 3000RLSCnano系统(Thermo Scientific)联用的Eclipse三合一质谱仪分析样品。将样品上样到熔融石英捕获柱Acclaim PepMap100(75μm×2cm，ThermoFisher)上。用0.1％TFA洗涤后，将捕获柱与用于LC-MS/MS的分析柱(Nanoease MZ肽BEH C18，130A，1.7μm，75μm×250mm，Waters)串联。使用4％-90％的B(A：0.2％甲酸，B：0.08％甲酸，80％ACN)的分段线性梯度洗脱肽：5分钟内4％-15％的B，50分钟内15％-50％的B，15分钟内50％-90％的B。质谱数据(CID或HCD模式)使用数据相关采集程序以375-1500的全扫描的循环系列来采集，分辨率为240,000，归一化(AGC)目标为正常值的250％(1E6)，最大进样时间为50ms。使用顶部S(1秒)和30秒的动态排除来选择MSMS的电荷阶段2-7的母离子，强度阈值为5E3。将选定离子传输到隔离窗口为1.2m/z、归一化AGC目标为200％的离子阱，以相对碰撞能量35％片段化，并且以快速扫描速率在离子阱中扫描。

3.数据库搜索

使用Proteome Discoverer 1.4(Thermo Fisher Scientific)对所有原始光谱文件进行数据库搜索。SEQUEST用于针对含有正义序列和负义序列两者的SCV2蛋白质序列数据库进行数据库搜索。还针对对应的反向数据库进行了数据库搜索，以评估肽/蛋白质鉴定的错误发现率(FDR)。数据库搜索参数包括最多两次遗漏的无酶消化的切割、10ppm的前体质量容差、0.4Da的产物离子质量容差和作为可变修饰的甲硫氨酸氧化。过滤每次运行的结果，肽置信度值高至获得肽水平低于5％的FDR。在蛋白质水平上，搜索参数包括每种蛋白质的最小数目的肽1、仅计数排名1的肽以及仅计数得分最高的蛋白质中的肽，这些参数应用于所有数据过滤。此外，还启用了蛋白质分组，并应用了严格的最大精简原则。然后，对每个质谱进行手动评估。

结果

结果示于图2至图13和下表2中。

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实施例3—确定由SARS-CoV-2UK毒株的orf1ab基因以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的共有序列

下载几千个UK SARS-CoV-2序列。测定每个序列的由orf1ab基因编码的最长的负义ORF(即，由SARS-CoV-2的orf1ab基因以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的最长的ORF)。计算LNSORF100中每个位置的归一化香农熵。值1表示相关位置可被20个氨基酸中的任一个氨基酸占据。值0表示仅1个氨基酸占据相关位置。换句话说，在归一化香农熵中，数字越小表明给定位置的氨基酸越保守。

氨基酸频率列于下表3中。氨基酸级分示于下表4中。对应的归一化香农熵和衍生的共有序列(SEQ ID NO:13)示于下表5中。如图14所示，ORF在UK SARS-CoV-2毒株之间是非常保守的。

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表5—归一化香农熵和衍生的共有序列

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实施例4—确定由SARS-CoV-2的orf1ab基因以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的ORF的共有序列

从GISAID中下载238,754个SARS-CoV2高质量基因组(即，由提交者验证的具有任何突变、插入或缺失的完整、高覆盖率)。下载基因组时不考虑进化枝、取样日期和地理位置。测定每个序列的由orf1ab基因编码的最长的负义ORF(即，由SARS-CoV-2的orf1ab基因以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码的最长的ORF)。在所有这些序列中，235,354个序列具有100个残基的负义ORF。分析这些ORF序列以确定序列中每个位置的共有序列和香农熵。

氨基酸频率和衍生的共有序列(SEQ ID NO:13)列于下表6中。如图15和图16所示，ORF在SARS-CoV-2毒株之间是非常保守的。

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衍生的共有序列(MSPTTSVVFTLHSRTSFCMVGFSTTSSETGFRSSQARLSIPC ASSDFSTSNEFDVSTGFVLQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKE GV；SEQ ID NO:13)与实施例3中SARS-CoV-2UK毒株衍生的共有序列相同。

与SEQ ID NO:13相同的100个氨基酸的ORF(SEQ ID NO:14)也由严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株WIV04(GenBank：MN996528.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。与SEQ ID NO:13相同的100个氨基酸的ORF(SEQ ID NO:15)也由肺炎病毒(SARS-CoV-2)分离株Wuhan-Hu-1(GenBank：NC045512.2)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。此外，与SEQ ID NO:13具有96％序列同一性的100个氨基酸的ORF(SEQ IDNO:16)由蝙蝠冠状病毒分离株RaTG13(GenBank：MN996532.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。与SEQ ID NO:13具有91％序列同一性的100个氨基酸的ORF(SEQ IDNO:17)由蝙蝠SARS样冠状病毒分离株bat-SL-CoVZXC21(GenBank：MG772934.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。与SEQ ID NO:13具有29％序列同一性的100个氨基酸的ORF(SEQ ID NO:18)由蝙蝠SARS样冠状病毒分离株bat-SL-CoVZC45(GenBank：MG772933.1)的基因组以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。图17显示了共有序列(SEQID NO:13)与这些早期SARS-CoV-2和蝙蝠-冠状病毒ORF100序列的比对。

“离群”序列

由于离群序列的绝对数量(238,754个中的3,400个，1.4％的总下载序列不产生100个残基长度的最长负义ORF)，手动分析每个序列是不可行的。重复的最长负义ORF序列被排除，相同长度的相似序列也被排除。从这244个序列中随机挑选出24个序列，并使用Exonerate将ORF100共有序列与基因组数据进行比对。粗略地浏览一下基因组数据，发现所查看的几个序列中有几段未分配的碱基，LNSORF脚本可能需要调整以应对误读和模糊的碱基。

表7—与“离群”序列的Exonerate比对的汇总。

/>

所分析的所有离群序列均含有ORF100序列，错误鉴定的原因是由于在分析的序列中存在测序空位且存在模糊的碱基。

实施例5—用一组负义SARS-CoV-2肽刺激原代人外周血单核细胞，并用SARS-CoV- 2负义肽MHC dextramer染色

概述

一组7个负义SARS-CoV-2肽用于刺激来自内部献血者(EVB00028、EVB00031、EVB00033)的人PBMC。随后分析细胞的IFN-γ和多种T细胞标志物的产生。

方法

A)PBMC制备

静脉穿刺前获得献血者的知情同意。为献血者分配内部编号。从同意的志愿者身上抽取60mL血液到EDTA管中。将全血在缓冲液(PBS+1％牛血清白蛋白)中稀释如下：30mL血液+20mL缓冲液。

将25mL稀释的血液小心地分层到50mL Falcon管中的18mL Ficoll-paque溶液上。将血样在室温下以300×g离心20分钟，减速度设定为0。

小心取出血浆，并分配到干净的50mL Falcon管中，贴上献血者编号标签，并储存在-800℃下，直到进一步分析。

小心取出血沉棕黄层(PBMC)并分配到干净的50mL Falcon管中。用缓冲液将细胞样品加满至50mL，在40℃、300×g下离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于50mL缓冲液中，并如上所述离心。再重复一次此操作。然后计数细胞，并以2.5×10^6/mL重悬于AB培养基(500mL补充有L-谷氨酰胺的RPMI 1640、50mL热灭活的AB血清、5mL青霉素/链霉素、5mL(200g/L)葡萄糖)。

B)肽刺激

然后将细胞以1mL的体积等分到24孔板的孔中。

制备含有50IU IL-2的AB培养基。在含有50IU IL-2的AB培养基中将以下肽中的每种肽稀释至20μM浓度：

LSIPCASSDFST(SEQ ID NO:4)

LYVALLVALLTCQ(SEQ ID NO:6)

RLSIPCASSDF(SEQ ID NO:8)

TCQTIGLCNNLAPFL(SEQ ID NO:9)

TLHSRTSFCMV(SEQ ID NO:10)

VALLTCQTIGLCN(SEQ ID NO:11)

VFTLHSRTSF(SEQ ID NO:12)

将稀释的肽加入PBMC中，并将平板置于37℃、5％CO2的培养箱中。在第2、4和6天通过半耗尽方式来喂养细胞。简言之，从各孔中取出1mL培养基，并补充1mL含有50IU IL-2的新鲜AB培养基。

C)ELISPOT制备

制备无血清ELISPOT培养基(500mL RPMI 1640+1％v/v青霉素/链霉素)。人IFN-γELISPOT板(Mabtech)用PBS洗涤4次，用AB培养基在室温下封闭至少30分钟。收获PBMC，在40℃下以300×g离心10分钟，重悬于无血清培养基中并计数。细胞以5×10^6个细胞/mL重悬。将PBMC以每孔50μL加入ELISPOT孔中。

制备浓度为400μM的用于再刺激PBMC的肽，并将50μL体积加入ELISPOT孔中，孔中的最终浓度为200μM。

将板在37℃、5％CO2下孵育24小时，盖上盖子并用箔纸包裹。

24小时后，根据Mabtech方案显影ELISPOT板。

干燥后，使用CTL免疫斑点分析仪扫描板，计数斑点并控制质量，将数据绘制为条形图。

D)T细胞标志物的流式细胞术分析

在刺激后第7天，将剩余的PBMC以1×10^6个细胞/mL的浓度重悬于流式细胞术缓冲液(PBS+1％BSA+2mM EDTA)中，并封闭至少10分钟。然后将细胞等分在96孔板中，离心(5分钟/40℃/300×g)，并重悬于45μL缓冲液中。在1000μL溶液加入1μL Live/Dead染色剂(Fixable Near IR)，并将细胞于40℃避光孵育10分钟。加入120μL缓冲液，将样品离心5分钟，弃去上清液，用200μL缓冲液重复洗涤。然后将细胞重悬于含有适当浓度的T细胞标志物抗体的缓冲液中(最终染色体积50μL)，并于40℃避光孵育至少30分钟。

表8—用于T细胞流式细胞仪面板的抗体的汇总

表9—细胞表面标志物的定义。

标志物	定义
		CD25	活化诱导标志物
CD4	辅助T细胞标志物
		CD45RA	幼稚T细胞标志物
CD69	早期活化标志物
		CD197	幼稚T细胞标志物
CD38	活化标志物
		CD103	共表达CD69时的常驻记忆T细胞标志物
CD45RO	记忆T细胞标志物
		CD29	产生IFN-γ的细胞毒性T细胞
CD3	泛T细胞标志物
		PDL-1	活化诱导标志物
CD8a	细胞毒性T细胞标志物

将120μL缓冲液加入细胞样品中，离心5分钟，弃去上清液。然后重复该洗涤步骤。补偿珠与相同浓度的单独抗体一起孵育。使用抗体染色的补偿珠以及未染色的和NIR染色的细胞来调节Attune流式细胞仪上的电压。

采集设置为在CD3门控细胞上采集至少150,000个事件。

E)Dextramer染色样品的流式细胞术分析

如前面章节所述制备PBMC。计数细胞并制备为10-50×10^6/ml。将细胞重悬于含有5％胎牛血清的PBS中，并向U形底96孔板的每孔中加入100μL细胞悬液。在遵循Immudex染色方案之前，如前所述用Live/Dead染色剂(Fixable Near IR)染色细胞。将10μL MHCDextramer加入样品中，充分混合并于室温下避光孵育10分钟。通过加入200μL缓冲液将样品洗涤五次，40℃离心5分钟。然后如前所述对样品进行CD4、CD8和CD3细胞表面标志物染色。将样品通过重悬于200μL流式细胞术缓冲液中洗涤两次，并在Attune流式细胞仪上分析。

使用的MHC Dextramer：A*2402/VFTLHSRTSF-APC

F)HLA分型(Proimmune)

将来自PBMC样品的细胞沉淀冷冻送到ProImmune Ltd进行HLA分型。

G)结合亲和力预测

为了基于单独供体的HLA图谱预测单独肽对MHC分子的结合亲和力，使用PSS MHCPan算法获得KD值。

结果

图18显示了来自用负义SARS-CoV-2肽刺激PBMC(来自供体EVB00028、EVB00031和EVB00033)的ELISPOT数据。如方法章节所述，将PBMC与单独肽一起孵育7天。然后将细胞用于IFN-γELISPOT测定，其中用相同的肽再刺激它们24小时。用CTL免疫斑点分析仪将板显影并计数斑点，将其绘制为三次重复值的平均值-/+标准差。(A)和(B)显示来自使用(A)和不使用(B)抗CD3抗体用作阳性对照的EVB00028的结果。(C)显示了来自EVB00031的结果。(D)和(E)显示来自使用(D)和不使用(E)抗CD3抗体的EVB00033的结果，该抗体用作阳性对照。

来自所有三个受试者供体的结果显示对肽LYVALLVALLTCQ的强反应性。EVB00028和EVB00031也与肽VFTLHSRTSF强烈反应，而EVB00033也与VALLTCQTIGLCN强烈反应。

图19显示了刺激来自EVB00028的PBMC后T细胞表面标志物的流式细胞术分析。用一组针对细胞表面标志物的抗体(如前一章节所列)对PBMC进行染色，以表征不同的T细胞群，诸如幼稚T细胞(A)、中央记忆T细胞(B)、效应记忆T细胞(C)和(D)以及常驻记忆T细胞(E)。此外，还分析了活化标志物(F)至(I)。绘制了在CD3+T细胞群体上门控的阳性细胞的百分比。

与IFN-γELISPOT测定中获得的结果相似，肽LYVALLVALLTCQ和VALLTCQTIGLCN诱导来自EVB00028的CD3+细胞的活化，如CD69、CD38、OX40/CD25、PDL1/CD25的上调所示。

图20显示了刺激来自EVB00033的PBMC后T细胞表面标志物的流式细胞术分析。用一组针对细胞表面标志物的抗体(如前一章节所列)对PBMC进行染色，以表征不同的T细胞群，诸如幼稚T细胞(A)、中央记忆T细胞(B)、效应记忆T细胞(C)和(D)以及常驻记忆T细胞(E)。此外，还分析了活化标志物(F)至(I)。绘制了在CD3+T细胞群体上门控的阳性细胞的百分比。

来自EVB00033的CD3+细胞类似地被肽LYVALLVALLTCQ和VALLTCQTIGLCN活化，尽管后者程度低得多，如CD69、CD38、OX40/CD25、PDL1/CD25的上调所示。

图21显示了A*2402/VFTLHSRTSF-APC MHC Dextramer染色分析。根据前述方案制备来自EVB00028、EVB00031和EVB00033的未刺激PBMC。然后将PBMC与VFTLHSRTSF-APC或阴性对照dextramer一起孵育，随后与CD3、CD4和CD8的抗体一起孵育。细胞仅在CD3+细胞上门控或在CD3+和CD8+细胞上门控，并且VFTLHSRTSF-APC阳性的细胞的百分比绘制为条形图。来自所有3名受试者的PBMC显示存在能够结合VFTLHSRTSF-APC dextramer的CD8+T细胞。

然而，由于完整的HLA分型结果(表10)仅显示具有HLA-A24:02的EVB00033，因此出现了T细胞受体与MHC-Dextramer是否发生一些非特异性结合的问题。

实施例6—编码ORF100的多核苷酸的制备

使用BioTechniques 69,211(以引用方式全文并入本文)中概述的适于21bp重叠和100bp序列长度的方法，使用重叠寡核苷酸合成编码ORF100共有氨基酸序列(SEQ ID NO:13)的多核苷酸序列。图22显示了与编码ORF100的多核苷酸的预期大小的多核苷酸相关的条带。

在该方法中使用以下寡核苷酸：

CVNS100_FO1

正向寡核苷酸1(SEQ ID NO:19)：

atgtctcctacaacttcggtagttttcacattacactcaagaacgtctttctgtatggtaggattttccactacttcttcagagactggtttCVNS100_RO1

反向1(SEQ ID NO:20)：

atcaaattcgtttgatgtactgaagtcagaggacgcgcagggaatggataatcttgcctgcgaagatctaaaaccagtctctgaagaagta

CVNS100_RO2

反向2(SEQ ID NO:21)：

ctaataaagccacgtataaaccaaatacctggtgtatacgttgtctttggagcacaaaaccagttgaaacatcaaattcgtttgatgtact

CVNS100_RO3

反向3(SEQ ID NO:22)：

ctacacaccctcttttaagaaaggagctaaattgttacataaacctattgtttggcatgttaacaatgcaactaataaagccacgtataaac

在该方法中使用以下扩增引物：

CVNS100_Fwd

正向(SEQ ID NO:23)：ATGTCTCCTACAACTTCG Tm＝56℃

CVNS100_Rev

反向(SEQ ID NO:24)：CTACACACCCTCTTTTAAGA Tm＝57℃

合成的多核苷酸具有SEQ ID NO:1的序列(atgtctcctacaacttcggtagttttcacattacactcaagaacgtctttctgtatggtaggattttccactacttcttcagagactggttttagatcttcgcaggcaagattatccattccctgcgcgtcctctgacttcagtacatcaaacgaatttgatgtttcaactggttttgtgctccaaagacaacgtatacaccaggtatttggtttatacgtggctttattagttgcattgttaacatgccaaacaataggtttatgtaacaatttagctcctttcttaaaagagggtgtgtag).

T7启动子可通过第二次PCR附接，随后纯化合成的多核苷酸，该多核苷酸随后用作Invitrogen转录试剂盒的模板(https://www.fishersci.co.uk/shop/products/product/10219104)。GFP将在平行反应中用作阳性对照。第二次PCR的引物是：

CVNS100_Fwd_T7

正向(SEQ ID NO:25)：

gaaatTAATACGACTCACTATAGGGccgccaccATGTCTCCTACAACTTCG

关键词：T7启动子 Kozak 用于LNSORF100的引物CVNS100_Rev_AAA

反向(SEQ ID NO:26)：tttttttttttttttttttttttttttttttttCTACACACCCTCTTTT AAGA

关键词：Poly(A)引物

编码ORF11共有氨基酸序列(SEQ ID NO:13)的多核苷酸序列可用于用ORF100mRNA转染细胞。这种转染可提供有益的研究工具。例如，可纯化转染细胞表面上的MHC上展示的肽，以便确定这些肽是否来自ORF100，以及它们是否与SAR-CoV-2配体组中发现的ORF100序列匹配。在这种情况下，GFP可用作阳性对照，因为它应提供细胞发荧光以及在其MHC I类分子上展示GFP衍生肽的额外读数。

实施例7—SARS-CoV-2病毒的T细胞表位(肽)的确认

目标

使用合成肽质谱分析来确认SARS-CoV-2感染细胞中四种负义肽的鉴定。

方法

合成四种肽(表12)，并产生质谱数据以用于比较目的。我们合成了目标肽并在质谱中运行，以比较实验(从SARS-CoV-2感染细胞分析中分离的肽)和合成肽产生的谱，以确认肽的序列。

质谱分析

使用与Dionex Ultimate 3000RLSCnano系统(Thermo Scientific)联用的Eclipse三合一质谱仪分析样品。将样品上样到熔融石英捕获柱Acclaim PepMap 100(75μm×2cm，ThermoFisher)上。用0.1％TFA洗涤后，将捕获柱与用于LC-MS/MS的分析柱(Nanoease MZ肽BEH C18，130A，1.7μm，75μm×250mm，Waters)串联。使用4％-90％的B(A：0.2％甲酸，B：0.08％甲酸，80％ACN)的分段线性梯度洗脱肽：5分钟内4％-15％的B，50分钟内15％-50％的B，15分钟内50％-90％的B。质谱数据(CID或HCD模式)使用数据相关采集程序以375-1500的全扫描的循环系列来采集，分辨率为240,000，归一化(AGC)目标为正常值的250％(1E6)，最大进样时间为50ms。使用顶部S(1秒)和30秒的动态排除来选择MSMS的电荷阶段2-7的母离子，强度阈值为5E3。将选定离子传输到隔离窗口为1.2m/z、归一化AGC目标为200％的离子阱，以相对碰撞能量35％片段化，并且以快速扫描速率在离子阱中扫描。

通过合成肽进行肽验证

用于验证先前研究中鉴定的肽的合成肽获自China peptides Co.,Ltd(中国苏州)。然后在与上述相同的实验条件下对合成肽进行LC-MS/MS分析，并基于它们的MS/MS数据确认它们的序列。通过比较它们的MS/MS谱与它们的合成类似物的MS/MS谱来确认候选肽序列。

结果

本实施例中提供的数据是通过使用合成肽的确认研究产生的。原因在于，一些肽(天然的或合成的)在质谱中具有差的片段化性质，并且可能产生质量差的谱，这将通过搜索软件将肽分类为中等至低命中。然而，如果使用合成肽进行确认研究，并且如果实验谱和合成肽谱匹配，则即使软件被鉴定为中等至低置信谱，也可确认肽序列。

结果示于表12和表13以及图23至图26中。

表12—来自SARS-CoV-2感染细胞的MHC肽列表

表13—实验肽和合成肽的质谱参数

行	肽序列	XCorr	电荷	M/Z
					1	RLSIPCASSDF(cell)	3.10	2	598.29547
	RLSIPCASSDF(syn.)	3.43	2	598.29218
					2	TLHSRTSFCMV(cell)	2.31	2	649.30481
	TLHSRTSFCMV(syn.)	2.98	2	649.3045
					3	VALLTCQTIGLCN(cell)	2.02	2	674.84967
	VALLTCQTIGLCN(syn.)	4.1	2	674.85162
					4	VFTLHSRTSF(cell)	2.21	2	597.81268
	VFTLHSRTSF(syn.)	2.83	2	597.81702

实施例8

介绍

人类冠状病毒229E(HcoV-229E)属于七种人类冠状病毒之一，包括MERS-CoV、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2。它可以感染人类和蝙蝠。当前的项目旨在鉴定HcoV-229E感染后细胞沉淀和感染后全细胞裂解物中的MHC I类肽。感染、收获、裂解HepG2细胞，并提取MHC I类肽以产生用于质谱分析的肽样品混合物。此外，收集对照样品(模拟感染)并按照与感染样品相同的程序进行处理。超高压液相色谱(UPLC)系统与Eclipse三合一质谱仪联用进行肽的分离和鉴定。一种碰撞模式(CID)应用于感染样品的质谱分析。实施数据相关采集(DDA)方法用于实时样品采集。使用SEQUEST HT软件处理生成的数据集以进行数据库搜索和比较。

方法

1.HcoV-229E感染的HepG2细胞制备(通过GMU进行)

使HepG2细胞(2×10^7个总细胞)生长并用HcoV-229E(MOI＝0.1)感染24小时。

2.使用质谱样品分析发现HcoV-229E MHC I类肽

a)样品制备：收获HcoV-229E毒株感染的HepG2细胞并用PBS洗涤一次。用0.1％TFA处理细胞沉淀并收集上清液(由GMU提供)。用裂解缓冲液处理细胞沉淀，并使用免疫蛋白组学方案处理(由GMU提供)以分离和纯化MHC I类肽。将两个样品(来自步骤1和2的样品)合并、净化并在离线HPLC系统上分级。在UPLC-Nano-MS/MS系统上分析每个级分。

b)DDA模式：使用与Dionex Ultimate 3000RLSCnano系统(Thermo Scientific)联用的Eclipse三合一质谱仪分析样品。将样品上样到熔融石英捕获柱Acclaim PepMap 100(75μm×2cm，ThermoFisher)上。用0.1％TFA洗涤后，将捕获柱与用于LC-MS/MS的分析柱(Nanoease MZ肽BEH C18，130A，1.7μm，75μm×250mm，Waters)串联。使用分段线性梯度洗脱肽：30分钟内梯度为4％-15％的B(其中A：0.2％甲酸，和B：0.16％甲酸，80％乙腈)，40分钟内15％-25％的B，44分钟内25％-50％的B，以及11分钟内50％-90％的B。然后溶液B在5分钟内回到4％以用于下一次运行。质谱数据(CID模式)使用数据相关采集程序以375-1500的全扫描的循环系列来采集，分辨率为240,000，归一化(AGC)目标为正常值的250％(1E6)，最大进样时间为50ms。使用顶部S(1秒)和30秒的动态排除来选择MSMS的电荷阶段2-7的母离子，强度阈值为5E3。将选定离子传输到隔离窗口为1.2m/z、归一化AGC目标为200％的离子阱，以相对碰撞能量35％片段化，并且以快速扫描速率在离子阱中扫描。质谱数据使用数据相关采集程序以350-1500的全扫描的循环系列来采集，分辨率为120,000，对照(AGC)目标(1E6)，最大进样时间为100ms。

3.数据库搜索

使用Proteome Discoverer 1.4(Thermo Fisher Scientific)对所有原始光谱文件进行数据库搜索。使用SEQUEST针对HcoV 229E蛋白质序列数据库1)正义翻译2)负义翻译和3)IPI人类数据库进行数据库搜索。还针对对应的反向数据库进行了数据库搜索，以评估肽/蛋白质鉴定的错误发现率(FDR)。数据库搜索参数包括最多两次遗漏的无酶消化的切割、10ppm的前体质量容差、0.4Da的产物离子质量容差和作为可变修饰的甲硫氨酸氧化。过滤每次运行的结果，肽置信度值高至获得肽水平低于1％的FDR。在蛋白质水平上，搜索参数包括每种蛋白质的最小数目的肽1、仅计数排名1的肽以及仅计数得分最高的蛋白质中的肽，这些参数应用于所有数据过滤。此外，还启用了蛋白质分组，并应用了严格的最大精简原则。然后，对每个质谱进行手动评估。

结果

表14—HcoV-229E配体组汇总

备注：a.通过预筛选标准生成的完整列表(置信度-高，氨基酸长度-8aa至15aa，排名：1，电荷2的XCorr＞1.5，电荷3的XCorr＞2)。

表15—来自HcoV-229E病毒蛋白的MHC I类肽的列表

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SEQ ID NO:46(LIAGKLLPPV)和53(PSLVMPPSPSPLV)是来自普通感冒冠状病毒229E的反向肽。也就是说，SEQ ID NO:46(LIAGKLLPPV)和53(PSLVMPPSPSPLV)是来自由开放阅读框(ORF)编码的多肽的表位，该开放阅读框由229E普通感冒冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。

通过运行SYFPEITHI表位结合预测程序，SEQ ID NO:46(LAIGKLLPPV)被预测为具有以下HLA结合：A2:29。

序列表

SEQ ID NO:1

angncnccnacaacnncggnagnnnncacannacacncaagaacgncnnncngnanggnaggannnnccacnacnncnncagagacnggnnnnagancnncgcaggcaagannanccanncccngcgcgnccncngacnncagnacancaaacgaannngangnnncaacnggnnnngngcnccaaagacaacgnanacaccaggnannnggnnnanacgnggcnnnannagnngcanngnnaacangccaaacaanaggnnnangnaacaannnagcnccnnncnnaaaagagggngngnag

SEQ ID NO:2

ALLTCQTIGLCN

SEQ ID NO:3

LHSRTSFCMVGFS

SEQ ID NO:4

LSIPCASSDFST

SEQ ID NO:5

LTCQTIGLCNNLAPF

SEQ ID NO:6

LYVALLVALLTCQ

SEQ ID NO:7

QTIGLCNNLAP

SEQ ID NO:8

RLSIPCASSDF

SEQ ID NO:9

TCQTIGLCNNLAPFL

SEQ ID NO:10

TLHSRTSFCMV

SEQ ID NO:11

VALLTCQTIGLCN

SEQ ID NO:12

VFTLHSRTSF

SEQ ID NO:13

MSPTTSVVFTLHSRTSFCMVGFSTTSSETGFRSSQARLSIPCASSDFSTSNEFDVSTGFVLQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV

SEQ ID NO:14

SEQ ID NO:15

SEQ ID NO:16

MSPTTSVVFTLHSRMSFCMVGFSTTSSETGFRSSQARLSIPCVSSDFSTSKEFDVSTGFVFQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV

SEQ ID NO:17

MSPTTSVVFTLHSRMSFCMVGFSTTSSETGFRTSQARLSIPCVSPNFSASKEFDVSTGFVLQRQRMHQIFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV

SEQ ID NO:18

MSPTTSVVFTLHSRMSFCMVGFSTTSSETGFRTSQARLSIPCVSPNSSASKEFDVSTGFVLQRQRMHQIFGLYVALLVALLTCQTIGLCSNLAPFLKEGV

SEQ ID NO:19

atgtctcctacaacttcggtagttttcacattacactcaagaacgtctttctgtatggtaggattttccactacttcttcagagactggttt

SEQ ID NO:20

SEQ ID NO:21

SEQ ID NO:22

SEQ ID NO:23

ATGTCTCCTACAACTTCG

SEQ ID NO:24

CTACACACCCTCTTTTAAGA

SEQ ID NO:25

gaaatTAATACGACTCACTATAGGGccgccaccATGTCTCCTACAACTTCG

SEQ ID NO:26

tttttttttttttttttttttttttttttttttCTACACACCCTCTTTTAAGA

SEQ ID NO:27

AMLKCVAFCDE

SEQ ID NO:28

ANGCSTIAQAV

SEQ ID NO:29

AQGVFGVNM

SEQ ID NO:30

ARLEPCNGTDID

SEQ ID NO:31

AVTTGDVKIM

SEQ ID NO:32

DIVVVDEVSMCTNYD

SEQ ID NO:33

DSLCAKAVTAY

SEQ ID NO:34

EDFLNMDIGVFIQ

SEQ ID NO:35

EVNADIVVVDEVSMC

SEQ ID NO:36

FVGADGELPV

SEQ ID NO:37

FVKSICNSAVAV

SEQ ID NO:38

FYCTNNTLVSGDAHI

SEQ ID NO:39

GAKVVNANVLTK

SEQ ID NO:40

GYIADISAF

SEQ ID NO:41

IACSKSARLKRFPVN

SEQ ID NO:42

IADFLAGSSDV

SEQ ID NO:43

IFAQTSDTA

SEQ ID NO:44

IVQMIADFLA

SEQ ID NO:45

KFLNAFDVFVTAIQ

SEQ ID NO:46

LIAGKLLPPV

SEQ ID NO:47

LNCALGAFAIFCC

SEQ ID NO:48

MHGVTLKI

SEQ ID NO:49

MKVKATKGEGDGGI

SEQ ID NO:50

NAMLKCVAF

SEQ ID NO:51

NEADYRCACYA

SEQ ID NO:52

PNLNLGILQVT

SEQ ID NO:53

PSLVMPPSPSPLV

SEQ ID NO:54

QAAAAMYKEARAVN

SEQ ID NO:55

QTSQALQTVATALNK

SEQ ID NO:56

SEISANGCSTIAQA

SEQ ID NO:57

SNFNTLFATTIPN

SEQ ID NO:58

TIQGPPGSGKS

SEQ ID NO:59

TNVPLQVGFSNG

SEQ ID NO:60

VGGTIQIL

SEQ ID NO:61

VLFSATAVKTGGK

SEQ ID NO:62

VLNNGFGGKQI

SEQ ID NO:63

VTSGLGTVDADY

Claims

1.一种免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自由开放阅读框(ORF)编码的多肽的表位，所述开放阅读框由冠状病毒的基因组的至少一部分以与能够翻译的正义RNA反义的方式编码。

2.根据权利要求1所述的免疫原性肽，其中所述多肽增强所述冠状病毒在人类中的适应性。

3.根据权利要求1或2所述的免疫原性肽，其中所述ORF是负义的。

4.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性肽，其中所述冠状病毒为SARS-CoV-2或普通感冒病毒，任选地为299E。

5.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性肽，其中所述ORF由orf1ab基因的至少一部分编码。

6.根据权利要求5所述的免疫原性肽，其中所述ORF的长度为约100个密码子。

7.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性肽，其中所述ORF包含SEQ ID NO:1的序列或其变体，或编码包含SEQ ID NO:13的序列或其变体的多肽。

8.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性肽，其中所述表位是CD8+T细胞表位、CD4+T细胞表位或B细胞表位。

9.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性肽，其中所述表位在两种或更多种冠状病毒之间是保守的，任选地其中所述表位在(i)两种或更多种人类冠状病毒，(ii)两种或更多种动物冠状病毒，或(iii)一种或多种人类冠状病毒和一种或多种动物冠状病毒之间是保守的。

10.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性肽，其中所述表位在SARS-CoV-2与(a)SARS-CoV-1、(b)229E、(c)NL63、(d)OC43、(e)HKU1和(f)MERS-CoV中的一者或多者之间是保守的。

11.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性肽，其中所述表位存在于由(a)SARS-CoV-1、(b)229E、(c)NL63、(d)OC43、(e)HKU1和(f)MERS-CoV中的一者或多者中的约100个密码子长度的预测ORF编码的多肽中。

12.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性肽，所述免疫原性肽包含SEQ ID NO:2至12所示的一种或多种肽。

13.一种编码根据权利要求1至12中任一项所述的免疫原性肽的多核苷酸。

14.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至12中任一项所述的免疫原性肽或根据权利要求13所述的多核苷酸。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，所述药物组合物包含：

(a)两种或更多种免疫原性肽，任选地其中所述两种或更多种免疫原性肽是根据权利要求1至12中任一项所述的免疫原性肽；或者

(b)两种或更多种多核苷酸，任选地其中所述两种或更多种多核苷酸是根据权利要求13所述的多核苷酸。

16.根据权利要求14或15所述的药物组合物，所述药物组合物包含：

(a)与至少两种不同的HLA超型相互作用的至少一种免疫原性肽，或各自与不同的HLA超型相互作用的至少两种免疫原性肽；或

(b)编码与至少两种不同的HLA超型相互作用的免疫原性肽的至少一种多核苷酸，或各自编码不同的免疫原性肽的至少两种多核苷酸，其中每种免疫原性肽与不同的HLA超型相互作用。

17.一种预防和/或治疗冠状病毒感染的方法，包括向个体施用根据权利要求14至16中任一项所述的药物组合物。

18.根据权利要求14至16中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于预防和/或治疗个体的冠状病毒感染的方法中。

19.根据权利要求1至12中任一项所述的免疫原性肽、根据权利要求13所述的多核苷酸或根据权利要求14至16中任一项所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗个体的冠状病毒感染的药物中的用途。

20.根据权利要求17所述的方法、根据权利要求18所述的特定用途的药物组合物或根据权利要求19所述的用途，其中所述冠状病毒感染由人畜共患病毒引起。

21.根据权利要求17或20所述的方法、根据权利要求18或20所述的特定用途的药物组合物或根据权利要求19或20所述的用途，其中所述个体是人。

22.根据权利要求17、20和21中任一项所述的方法；根据权利要求18、20或21中任一项所述的特定用途的药物组合物；或根据权利要求19、20或21中任一项所述的用途，其中所述冠状病毒感染是地方性病毒感染、季节性病毒感染或大流行性病毒感染。

23.一种复合物，所述复合物包含与MHC分子结合的根据权利要求1至12中任一项所述的免疫原性肽。

24.根据权利要求23所述的复合物，其中所述复合物包含两种或更多种根据权利要求1至12中任一项所述的肽和两种或更多种MHC分子，任选地其中每种肽与所述两种或更多种MHC分子中的不同MHC分子结合。

25.根据权利要求24所述的复合物，其中所述两种或更多种MHC分子中的每种MHC分子均附接到葡聚糖主链。

26.根据权利要求25所述的复合物，其中还包含荧光团，任选地其中所述荧光团附接到所述葡聚糖主链。