CN117677691A - 用于生成人中脑神经祖细胞的方法和组合物 - Google Patents

用于生成人中脑神经祖细胞的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供使用化学成分确定的培养基从人多能干细胞产生人定向中脑神经干细胞(KSC)和中脑神经祖细胞(中脑NPC)的方法，所述培养基允许在少至6天内产生中脑NPC。中脑NPC可以进一步分化为成熟多巴胺能神经元。还提供培养基、分离的细胞群和试剂盒。

Description

用于生成人中脑神经祖细胞的方法和组合物
相关应用
本申请要求2021年7月19日提交的美国临时申请号63/223,139的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
政府许可权利
本发明是由美国陆军ACC-AGP-RTP授予的授权号：W911NF-17-3-0003、在政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
背景技术
帕金森病(PD)是继阿尔茨海默病之后第二常见的进行性神经退行性疾病，其特征是黑质致密部中脑多巴胺(mDA)神经元变性。目前的治疗通常采用旨在通过施用左旋多巴(也称为L-多巴)(多巴胺的前体)来增加多巴胺的生物利用度的药理学方法。然而，长期左旋多巴治疗的副作用对其在PD后期的使用提出了挑战。首先通过移植人类胎儿中脑组织来探索在PD患者体内重建功能性多巴胺能神经元的能力(Lindvall等人(2004)NeuroRx 1:383-393对此进行了综述)。结果各不相同，并且该方法引起了对胎儿组织的可用性和使用的伦理担忧，从而导致了在体内重建多巴胺能神经元的替代方法。
多能干细胞(PSC)(包括胚胎干(ES)细胞系和诱导多能干细胞(iPSC))的可用性，开启了在体外产生mDA神经元的祖细胞的可能性。发育研究表明，中脑多巴胺能神经元起源于腹侧中脑底板(mFP)，可以通过标志物FOXA2和LMX1A的共表达来鉴定。用于衍生中脑底板前体的早期分化方案涉及PSC中音猬因子(SHH)的激活和典型WNT信号转导，以及双重SMAD抑制和FGF8激活，以及需要11天以实现表达FOXA2和LMX1A的前体(Kriks等人(2011)Nature480:547-551)或涉及SHH、WNT和FGF8的激活，以及添加视黄酸(RA)，为期22天的方案(Cooper等人(2010)Mol.Cell.Neurosci.45:258-266)。据报道，类似的方案中，其中将人类iPSC衍生的胚状体暴露于双重SMAD抑制五天，然后进行SHH和FGF8激活，在16天内产生mDA前体(Hartfield等人(2014)PLoS One 92:e87388)。
最近，报道了从人多能干细胞中获得MB多巴胺能祖细胞的其他方案。例如，Nolbrant等人报告了一个16天的方案，该方案涉及前11天暴露于N-2补充剂，后5天暴露于B27补充剂，以及SHH和WNT激活以及ALK抑制(Nolbrant定等人(2017)Nature Protocols12:1962-1979)。Precious等人报告了一个方案，该方案涉及MEK抑制两天以阻断FGF信号转导，然后单独SHH激活三天，并从第5天开始SHH和FGF8激活，从而在第7天产生FOXA2+LMX1A+祖细胞(Precious等人(2020)Front.Neurosci.14:312)。Gartner等人报告无异种物质、无饲喂物的化学成分确定的方案，其中涉及(i)在第0-5天在补充有LDN193189和SB431542的培养基中孵育，在第5-10天单独在补充有LDN193189的培养基中孵育，(ii)第2-13天在补充有CHIR99021的培养基中孵育，(iii)第1-7天在补充有SHH和嘌吗啡胺的培养基中孵育(Gartner等人(2020)Star Protocols 1:100065)。
使用方案也已将人多巴胺能神经元祖细胞与人精原干细胞(hSSC)区分开来，所述方案涉及在补充有RA、SB、VPA和毛喉素的嗅鞘细胞条件培养基(OECCM)中培养hSSC四天，然后在补充有SHH、FGF8A和TFGβ3的OECCM中培养(Yang等人(2019)Stem CellRes.Therap.10:195)。
还已经描述了用于扩增中脑神经祖细胞的方法(Fedele等人(2017)Sci.Reports7:6036)，以及冷冻保存此类祖细胞的方法(Drummond等人(2020)Front.Cell.Dev.Biol.8:578907)。
例如，用于将多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经元前体的方案在Arenas等人(2015)Development 142:1918-1936和Wang等人(2020)Cells 9:1489中进行了综述。
因此，虽然已经取得了一些进展，但仍然需要用于从人多能干细胞产生中脑神经祖细胞的有效且稳健的方法和组合物。
发明内容
本公开提供了使用化学成分确定的培养基从多能干细胞产生人定向中脑(MB)神经干细胞(NSC)和中脑神经祖细胞(NPC)的方法，该培养基允许在最少六天的培养时间内产生OTX2+FOXA2+LMX1A+MB NPC。培养基缺乏血清或其他外源添加的生长因子，并包含小分子试剂，所述小分子试剂激动或拮抗多能干细胞中的特定信号转导通路活性，从而促进沿中脑神经谱系的分化，导致细胞成熟和中脑神经祖细胞相关的生物标志物的表达。本公开的方法具有以下优点：在培养基中使用小分子试剂允许精确控制培养物组分并且与现有技术方案相比显著缩短分化时间。
因此，在一方面，本公开涉及产生人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞(NPC)的方法，其包括：
(a)在第0-3天，在缺乏外源添加的生长因子并包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂的培养基中培养人多能干细胞，以获得定向中脑神经干细胞(NSC)；和
(b)在第4-6天，在缺乏外源添加的生长因子并包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGFβ通路拮抗剂的培养基中培养定向中脑NSC，以在培养的第6天获得人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑NPC。
在另一方面，本公开涉及产生人OTX2+LMX1A+定向中脑神经干细胞(NSC)的方法，其包括：
第0-3天，在缺乏外源添加的生长因子并包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂的培养基中培养人多能干细胞，以在培养第3天获得OTX2+LMX1A+定向中脑NSC。
本文进一步详细描述了用于本公开的方法中的合适的激动剂和拮抗剂及其浓度的非限制性实例。
在一个实施方案中，人多能干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。在另一个实施方案中，人多能干细胞是胚胎干细胞。
在一个实施方案中，在培养期间将人多能干细胞附着至玻连蛋白包被的板上。
在另一方面，本公开涉及用于获得人定向中脑神经干细胞的培养基，其包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
在另一方面，本公开涉及用于获得人中脑神经祖细胞的培养基，其包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGFβ通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
在另一方面，本公开涉及人定向中脑神经干细胞的分离的细胞培养物，该培养物包含在培养基中培养的人OTX2+LMX1A+定向中脑神经干细胞，该培养基包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
在另一方面，本公开涉及人中脑神经祖细胞的分离的细胞培养物，该培养物包含在培养基中培养的人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞，该培养基包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGFβ通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
在另一个方面，本公开涉及通过本公开的方法产生的人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞。
在另一个方面，本公开涉及包含人中脑神经祖细胞(NPC)的组合物，其中人中脑NPC表达OTX2、FOXA2和LMX1A并且缺乏GBX2的表达。
在另一个方面，本公开涉及人中脑神经祖细胞(NPC)的分离的细胞群，其包含至少1×106个OTX2+FOXA2+LMX1A+人中脑NPC，其中该细胞群缺乏表达GBX2的神经干细胞。在一个实施方案中，人中脑NPC与至少一种抗体结合，该抗体结合由人中脑NPC表达的至少一种标志物。
从下面的详细描述和权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1显示针对OTX2的最大表达而优化的13因子实验的HD-DoE模型的结果。模型的上部显示针对OTX2优化时预选53个基因的表达水平的预测。模型的下部显示在此模型中测试的效应物及其对OTX2最大表达的贡献。值列是指模拟模型所需的每个效应物的浓度。
图2显示针对FOXA2的最大表达而优化的13因子实验的HD-DoE模型的结果。上部和下部如图1所述。这种情况突出了因子贡献为22.2的效应物嘌吗啡胺作为FOXA2高表达的重要输入。
图3显示OTX2、LMX1A、DMBX1和FOXA2基因的表达水平相对于所测试的13个效应物的浓度的动态概况。嘌吗啡胺、CHIR99021和LDN193189对FOXA2表达的正向影响及其因子贡献通过每个效应物的图的斜率显示。
图4显示OTX2、LMX1A、DMBX1和FOXA2基因的表达水平相对于所测试的13个效应物的浓度的动态概况。MK2206、PD0325901、LDN193189和CHIR99021对OTX2表达的正向影响及其因子贡献通过每个效应物图的斜率显示。
图5显示应用于第1阶段神经干细胞以生成第2阶段分化配方的12因子实验的HD-DoE模型的结果。此模型针对LMX1A的最大表达进行了优化。此设定突出了TTNPB在LMX1A表达中的作用，因子贡献为19.5。
图6显示应用于第1阶段神经干细胞以生成第2阶段分化配方的12因子实验的HD-DoE模型的结果。此设定突出了嘌吗啡胺和CHIR99021对FOXA2表达的正向作用，因子贡献分别为15.3和10.7。
图7显示LMX1A、FOXA2和GBX2基因的表达水平相对于所测试的12个效应物的浓度的动态概况。TTNPB、CHIR99021和GW3965对FMX1A表达的正向影响以及嘌吗啡胺、MK2206和GW3965对FOXA2表达的正向影响及其因子贡献由每个效应物的图的斜率显示。
图8显示了应用于第1阶段神经干细胞以生成第2阶段分化配方的12因子实验的HD-DoE模型的结果。此设定突出了BMP7和MK2206对FOXA2表达的正向作用，因子贡献分别为13.7和14.2。
图9显示应用于第1阶段神经干细胞以生成第2阶段分化配方的12因子实验的HD-DoE模型的结果。此设定突出了MK2206对LMX1A表达的正向作用和FGF8b对LMX1A表达的消极作用，因子贡献分别为12和16.9。
图10显示LMX1A、FOXA2和GBX2基因的表达水平相对于所测试的12个效应物的浓度的动态概况。BMP7和MK2206对FOXA2表达和AZD 3147对LMX1 A表达的正向影响及其因子贡献由每个效应物的图的斜率显示。
图11A-B显示了OTX2、DMBX1、FOXA2和LMX1A基因的表达水平相对于在第1阶段分化配方中测试的5个经验证效应物的浓度的动态概况。图11A显示在所有五个最终效应物存在的情况下目标基因的表达水平。图11B显示当存在其他区域时，在最终效应物之一不存在的情况下目标基因的表达水平。
图12A-B显示LMX1A、FOXA2和GBX2基因的表达水平相对于在第2阶段分化配方中测试的3个经验证的效应物(TTNPB、A 83-01和GW3965)的浓度的动态概况。图12A显示在所有三个最终效应物存在的情况下目标基因的表达水平。图12B显示当存在其他区域时，在最终效应物之一不存在的情况下目标基因的表达水平。
图13A-B显示LMX1A、FOXA2和GBX2基因的表达水平相对于在第2阶段分化配方中测试的3个经验证的效应物(MK2206、AZD 3147和BMP7)的浓度的动态概况。图13A显示在所有三个最终效应物存在的情况下目标基因的表达水平。图13B显示当存在其他区域时，在最终效应物之一不存在的情况下目标基因的表达水平。
图14显示在第1阶段处理结束时MB来源的神经干细胞的荧光图像的照片。细胞用中脑生物标志物染色，所述中脑生物标志物包括FOXA2、LMX1A、OTX2、中后脑边界生物标志物PAX2、早期神经元生物标志物巢蛋白和后脑生物标志物GBX2。在此阶段，细胞对除FOXA2之外的所有标志物均呈阳性。
图15显示在第2阶段处理结束时MB来源的神经干细胞的荧光图像的照片。细胞用中脑生物标志物染色，所述中脑生物标志物包括FOXA2、LMX1A、OTX2和后脑生物标志物GBX2。在此阶段，细胞的所有中脑生物标志物均呈阳性，并且观察到GBX2的表达非常低。
图16显示在六天内从hiPC产生中脑神经祖细胞的两阶段培养方案的示意图。
图17A-C显示三天(第1阶段)和六天(第2阶段)后在MB分化培养基中培养的细胞的RNA-seq数据。图17A显示选定基因在第1阶段的差异表达的条形图。在第1阶段结束时，干细胞基因NANOG和POU5F1的表达水平下降，而涉及中脑区域早期发育和神经元身份的基因则升高。图17B显示选定基因在第2阶段的差异表达的条形图。在第2阶段结束时，包括DDC、LMX1B、SOX6和EN1的MB祖基因的表达水平增加。图17C显示与第0天的hiPSC的基因谱相比，第6天的MB神经祖细胞的基因谱的热图。
具体实施方式
本文描述的是使用基于小分子的方法，允许在化学成分确定的培养条件下从人多能干细胞产生中脑神经祖细胞的方法和组合物。本公开的方法以两阶段方案产生中脑神经祖细胞，其中在培养的三天内产生OTX2+LMX1A+定向MB神经干细胞(NSC)，随后在培养的第六天产生OTX2+LMX1A+FOX2A+MB神经祖细胞(NPC)。因此，本公开使用化学成分确定的培养条件，允许在比的现有技术方案显著更短的时间内获得MB NPC。
如实施例1中所述，使用高维实验设计(HD-DoE)方法同时测试多个过程输入(例如，小分子激动剂或拮抗剂)对输出响应(例如基因表达)的影响。这些实验允许鉴定化学成分确定的培养基，其包含特定信号转导通路的激动剂和/或拮抗剂，其足以在非常短的时间内产生定向中脑多能干细胞和中脑祖细胞。如实施例2所述，通过因子关键性分析进一步验证优化的培养基，该因子关键性分析检查排除单独激动剂或拮抗剂的效果。如实施例3所述，免疫组织化学进一步证实了通过分化方案产生的细胞的表型。此外，如实施例4所述，根据分化方案培养的细胞的RNA-seq分析也证实了MB祖基因的表达。
图16示意性地示出了本公开的生成MB NSC和MB NPC的方法的实施方案。
在以下小节中进一步详细描述本发明的各个方面。
I.细胞
本公开的培养物中使用的起始细胞是人多能干细胞。如本文所用，术语“人多能干细胞”(缩写为hPSC)是指具有分化成多种不同细胞类型的能力的人干细胞。本文使用的术语“多能”是指在不同条件下具有分化为所有三个胚细胞层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞类型特征的能力的细胞。例如，使用裸鼠和畸胎瘤形成试验，多能细胞的主要特征在于其分化为所有三个胚层的能力。尽管多能性的优选测试是证明分化为三个胚层中每一个的细胞的能力，多能性也可以通过胚胎干(ES)细胞标志物的表达来证明。
人多能干细胞例如包括诱导多能干细胞(iPSC)和人胚胎干细胞如ES细胞系。诱导性多能干细胞(iPSC)的非限制性实例包括19-11-1、19-9-7或6-9-9细胞(例如，如Yu,J等人(2009)Science 324:797-801所述)。人胚胎干细胞系的非限制性实例包括ES03细胞(WiCell研究所)和H9细胞(Thomson,J.A.等人(1998)Science 282:1145-1147)。人多能干细胞(PSC)表达可用于鉴定细胞是否为PSC的细胞标志物。多能干细胞标志物的非限制性实例包括TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3、SSEA4、CD9、CD24、OCT3、OCT4、NANOG和/或SOX2。由于本公开的产生定向中脑神经干细胞和中脑神经祖细胞的方法用于分化(成熟)起始多能干细胞群，因此在各种实施方案中，通过本公开的方法产生的中脑定向神经细胞群缺乏一种或多种干细胞标志物的表达，例如选自TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3、SSEA4、CD9、CD24、OCT3、OCT4、NANOG和/或SOX2的一种或多种干细胞标志物的表达。
如本文所述，将多能干细胞置于诱导细胞分化的培养条件下。如本文所用，术语“分化”是指细胞从更原始阶段向更成熟(即较不原始)细胞的发育，通常表现出定向特定细胞谱系的表型特征。
如本文所用，“神经干细胞”是指比多能干细胞分化程度更高的细胞，原因在于它定向神经谱系，但仍具有沿神经谱系分化为不同类型细胞的能力。
如本文所用，“神经祖细胞”是指比神经干细胞分化程度更高并且可以进一步分化为特定类型的神经细胞的细胞。
在实施方案中，可以基于一种或多种生物标志物的表达来鉴定和表征细胞，所述生物标志物例如神经祖细胞或中脑区域定向神经细胞的特定生物标志物。可以在目标细胞的表征中评估生物标志物表达的生物标志物的非限制性实例包括OTX2，其是参与中脑的定位和维持中后脑边界的中脑标志物(Vernay等人(2005)J.Neurosci.25:4856-4867)；LMX1A，其参与中脑多巴胺能祖细胞的生成和分化(Yan等人(2011)J.Neurosci.31:12413-12425)；FOXA2，其在发育的早期和晚期阶段调节中脑多巴胺能神经元的生成(Ferri等人(2007)Development 134:2761-2769)；PAX2，其在中脑和前后脑中表达(Urbanek等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5703-5708)；巢蛋白，其是一种早期神经元标志物；KI67，其是增殖标志物；GBX2，其是后脑标志物。
如本文所用，细胞仅表达“低”水平的目标生物标志物旨在指高于背景水平(例如，其中背景水平对应于被认为不由细胞表达的阴性对照标志物的表达水平)至多20％、更优选地小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的水平。
在实施方案中，通过本公开的方法产生的细胞是定向中脑(MB)神经干细胞(NSC)。如本文所用，“定向中脑神经干细胞”或“定向MB NSC”是指表达生物标志物OTX2和LMX1A的干细胞来源的神经干细胞。在一个实施方案中，定向MB NSC不表达或仅表达低水平的生物标志物FOXA2。在一个实施方案中，定向MB NSC不表达或仅表达低水平的生物标志物GBX2。除OTX2和LMX1A之外，定向MB NSC还可表达其他生物标志物，包括但不限于PAX2、巢蛋白和/或KI67。
在实施方案中，通过本公开的方法产生的细胞是中脑神经祖细胞，其是比定向MBNSC分化程度更高(更加成熟)的细胞。如本文所用，“中脑神经祖细胞”或“MB NPC”是指表达生物标志物OTX2、LMX1A和FOXA2的干细胞来源的祖细胞。在一个实施方案中，MB NPC不表达或仅表达低水平的生物标志物GBX2。除OTX2、LMX1A和FOXA2之外，MB NPC还可表达其他生物标志物，包括但不限于PAX2、巢蛋白和/或KI67。
通过本公开的方法产生的定向MB NSC和MB NPC可以在体外进一步培养以产生成熟的多巴胺能神经元。将中脑神经祖细胞分化为成熟多巴胺能神经元的方法是本领域已建立的方法，包括涉及在含有BDNF、GDNF、抗坏血酸、DAPT和/或TGF-β的培养基中进一步培养祖细胞的方案。
II.培养基组分
本公开的用于产生MB NSC或MB NPC的方法包括在缺乏外源添加的生长因子并且包含细胞信号转导通路的特异性激动剂和/或拮抗剂的培养基中培养人多能干细胞。
如实施例1所述，对于总体为两阶段六天的方案，包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂的培养基在少至三天(本文称为分化方案的“第1阶段”)内足以产生表达OTX2和LMX1A的MB NSC。MB NSC在包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGF-β通路拮抗剂的培养基中的进一步分化在另外的三天(本文称为“第2阶段”)内足以产生OTX2+FOXA2+LMX1A+MB。
如本文所用，细胞信号转导通路的“激动剂”旨在指刺激(上调)细胞信号转导通路的试剂。细胞信号转导通路的刺激可以例如通过使用激活参与信号转导通路的细胞表面受体的激动剂(例如，激动剂可以是受体配体)在细胞外启动。另外地或替代地，细胞信号转导的刺激可以例如通过使用与信号转导通路的组分(一个或多个)在细胞内相互作用的小分子激动剂在细胞内启动。
如本文所用，细胞信号转导通路的“拮抗剂”旨在指抑制(下调)细胞信号转导通路的试剂。细胞信号转导通路的抑制可以例如通过使用阻断参与信号转导通路的细胞表面受体的拮抗剂在细胞外启动。另外地或替代地，细胞信号转导的抑制可以例如通过使用与信号转导通路的组分(一个或多个)在细胞内相互作用的小分子拮抗剂在细胞内启动。
本公开的方法中使用的激动剂和拮抗剂是本领域已知的并且可商购。它们以有效实现预期结果(例如产生表达中脑NSC和/或中脑NPC的目标中脑标志物)的浓度在培养基中使用。合适的激动剂和拮抗剂的非限制性实例以及有效浓度范围在下文进一步描述。
WNT通路的激动剂包括能够刺激(上调)典型Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的试剂、分子、化合物或物质，其通过Wnt-蛋白配体与卷曲家族受体的结合而在生物学上被激活。在一个实施方案中，WNT通路激动剂是糖原合酶激酶3(Gsk3)抑制剂。在一个实施方案中，WNT通路激动剂选自：CHIR99021、CHIR98014、SB 216763、SB 415286、LY2090314、3F8、A1070722、AR-A 014418、BIO、AZD1080、WNT3A及其组合。在一个实施方案中，WNT通路激动剂以0.3-3.0μM、0.5-2.0μM、0.75-1.5μM或1.0-1.2μM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，WNT通路激动剂是CHIR99021。在一个实施方案中，WNT通路激动剂是CHIR99021，其以0.3-3.0μM、0.5-2.0μM、0.75-1.5μM或1.0-1.2μM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，WNT通路激动剂是CHIR99021，其以1.1μM的浓度存在于培养基中。
SHH(音猬因子)通路的激动剂包括能够通过SHH通路刺激(激活)信号转导的试剂、分子、化合物或物质，该SHH通路在生物学上涉及SHH与Patched-1(PTCH1)受体的结合以及通过Smoothened(SMO)跨膜蛋白的转导。在一个实施方案中，SHH通路激动剂选自嘌吗啡胺、GSA 10、SAG及其组合。在一个实施方案中，SHH通路激动剂以100-1000nM、200-800nM、250-750nM或500-600nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，SHH通路激动剂是嘌吗啡胺。在一个实施方案中，SHH通路激动剂是嘌吗啡胺，其以100-1000nM、200-800nM、250-750nM或500-600nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，SHH通路激动剂是嘌吗啡胺，其以550nM的浓度存在于培养基中。
BMP(骨形态发生蛋白)通路的拮抗剂包括能够抑制(下调)BMP信号转导通路的试剂、分子、化合物或物质，该信号转导通路通过BMP与作为激活素受体样激酶(ALK)(例如，I型BMP受体，包括但不限于ALK2和ALK3)的BMP受体结合而在生物学上被激活。在一个实施方案中，BMP通路拮抗剂选自：LDN193189、DMH1、DMH2、多索吗啡、K02288、LDN214117、LDN212854、卵泡抑素、ML347、头蛋白及其组合。在一个实施方案中，BMP通路拮抗剂以100-500nM、100-400nM、150-350nM或200-300nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，BMP通路拮抗剂是LDN193189。在一个实施方案中，BMP通路拮抗剂是LDN193189，其以100-500nM、100-400nM、150-350nM或200-300nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，BMP通路拮抗剂是LDN193189，其以275nM的浓度存在于培养基中。
AKT通路的拮抗剂包括能够抑制(下调)丝氨酸/苏氨酸激酶AKT家族成员中的一种或多种的信号转导通路的试剂、分子、化合物或物质，所述AKT家族成员包括AKT1(也称为PKB或RacPK)、AKT2(也称为PKBβ或RacPK-β)、和AKT 3(也称为PKBγ或胸腺瘤病毒原癌基因3)。在一个实施方案中，AKT通路拮抗剂选自：MK2206、GSK690693、哌立福辛(Perifosine)(KRX-0401)、帕他色替(Ipatasertib)(GDC-0068)、卡帕塞替尼(AZD5363)、PF-04691502、AT7867、曲西利滨(Triciribine)(NSC154020)、ARQ751、Miransertib(ab235550)、Bomssertib、Cerisertib及其组合。在一个实施方案中，AKT通路拮抗剂以25-300nM、50-250nM、75-200nM或125-150nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，AKT通路拮抗剂是MK2206。在一个实施方案中，AKT通路拮抗剂是MK2206，其以25-300nM、50-250nM、75-200nM或125-150nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，AKT通路拮抗剂是MK2206，其以138nM的浓度存在于培养基中。
在一个实施方案中，步骤(a)中的培养基中存在的AKT通路拮抗剂与步骤(b)中的培养基中存在的AKT通路拮抗剂相同。在一个实施方案中，步骤(a)中的培养基中存在的AKT通路拮抗剂是与步骤(b)中的培养基中存在的AKT通路拮抗剂不同的AKT通路拮抗剂。在一个实施方案中，步骤(a)和步骤(b)二者中的培养基中存在的AKT通路拮抗剂是MK2206，例如，其以25-300nM、50-250nM、75-200nM或125-150nM的浓度存在于两个步骤中的培养基中，例如在两个步骤中均为138nM。
MEK通路的拮抗剂包括能够抑制(下调)MAPK/ERK通路(也称为Ras-Raf-MEK-ERK通路)的一种或多种组分的信号转导通路的试剂、分子、化合物或物质。在一个实施方案中，MEK通路拮抗剂选自：PD0325901、贝美替尼(Binimetinib)(MEK162)、考比替尼(Cobimetinib)(XL518)、司美替尼(Selumetinib)、曲美替尼(Trametinib)(GSK1120212)、CI-1040(PD-184352)、瑞法替尼(Refametinib)、ARRY-142886(AZD-6244)、PD98059、U0126、BI-847325、RO 5126766及其组合。在一个实施方案中，MEK通路拮抗剂以25-300nM、50-250nM、75-200nM或100-120nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，MEK通路拮抗剂是PD0325901。在一个实施方案中，MEK通路拮抗剂是PD0325901，其以25-300nM、50-250nM、75-200nM或100-120nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，MEK通路拮抗剂是PD0325901，其以110nM的浓度存在于培养基中。
RA通路的激动剂包括能够刺激由全反式视黄酸和9-顺式视黄酸二者激活的视黄酸受体(RAR)的试剂、分子、化合物或物质。RAR共有三种：RAR-α、RAR-β和RAR-γ，分别由RARA、RARB、RARG基因编码。已经合成了不同的可以激活视黄酸通路的视黄酸类似物。此类化合物的非限制性实例包括TTNPB(RAR-α、β和γ的激动剂)、AM 580(RARα激动剂)、CD 1530(有效且选择性的RARγ激动剂)、CD 2314(选择性RARβ激动剂)、Ch 55(有效的RAR激动剂)、BMS 753(RARα选择性激动剂)、他扎罗汀(Tazarotene)(受体选择性类视黄醇；结合RAR-β和RAR-γ)、异维A酸(Isotretinoin)(视黄酸受体的内源性激动剂；神经元分化诱导剂)和AC261066(RARβ2激动剂)。在一些实施方案中，RA信号转导通路激动剂选自以下：i)类视黄醇化合物，ii)类视黄醇X受体(RXR)激动剂，和iii)25视黄酸受体(RAR)激动剂。在具体实施方案中，RA通路激动剂选自以下：视黄酸、Sr11237、阿达帕林(adapalene)、EC23、9-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸、4-氧代视黄酸和全反式视黄酸(ATRA)。
因此，在一个实施方案中，RA通路激动剂选自：TTNPB、AM 580、CD 1530、CD 2314、Ch 55、BMS 753、他扎罗汀、异维A酸、AC 261066、视黄酸(RA)、Sr11237、阿达帕林、EC23、9-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸、4-氧代视黄酸和全反式视黄酸(ATRA)或其组合。在一个实施方案中，RA通路激动剂以5-500nM、25-250nM、10-100nM或25-75nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，RA通路激动剂是TTNPB。在一个实施方案中，RA通路激动剂是TTNPB，其以5-500nM、25-250nM、10-100nM或25-75nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，RA通路激动剂是TTNPB，其以50nM的浓度存在于培养基中。
LXR(肝X受体)通路的激动剂包括能够通过LXR通路刺激(激活)信号转导的试剂、分子、化合物或物质，其生物学上涉及LXR与类视黄醇X受体(RXR)的异二聚化以及氧化甾醇的激活。在一个实施方案中，LXR通路激动剂选自：GW3965、T0901317、DMHCA、AZ876及其组合。在一个实施方案中，LXR通路激动剂以100-1000nM、200-800nM、250-750nM或550-650nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，LXR通路激动剂是GW3965。在一个实施方案中，LXR通路激动剂是GW3965，其以100-1000nM、200-800nM、250-750nM或550-650nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，LXR通路激动剂是GW3965，其以500nM的浓度存在于培养基中。
BMP(骨形态发生蛋白)通路的激动剂包括能够刺激(上调)BMP信号转导通路的试剂、分子、化合物或物质，该信号转导通路通过BMP与作为激活素受体样激酶(ALK)(例如，I型BMP受体，包括但不限于ALK2和ALK3)的BMP受体的结合而在生物学上被激活。在一个实施方案中，BMP通路激动剂选自BMP、sb4、ventromorphins(例如，如Genthe等人(2017)ACSChem.Biol.12:2436-2447中所述)及其组合。在一个实施方案中，BMP通路激动剂以1-100ng/ml、5-50ng/ml、10-25ng/ml或12.5-17.5ng/ml的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，BMP通路激动剂是BMP7。在一个实施方案中，BMP通路激动剂是BMP7，其以1-100ng/ml、5-50ng/ml、10-25ng/ml或12.5-17.5ng/ml的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，BMP通路激动剂是BMP7，其以15ng/ml的浓度存在于该方法的步骤(b)(即第2阶段)的培养基中。
TGFβ(转化生长因子β)通路的拮抗剂包括能够通过TGFβ受体家族成员、丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族抑制(下调)信号转导的试剂、分子、化合物或物质。在一个实施方案中，TGFβ通路拮抗剂选自：A83-01、SB-431542、GW788388、SB525334、TP0427736、RepSox、SD-208及其组合。在一个实施方案中，TGFβ通路拮抗剂以100-500nM、200-400nM、250-350nM或275-325nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，TGFβ通路拮抗剂是A83-01。在一个实施方案中，TGFβ通路拮抗剂是A83-01，其以100-500nM、200-400nM、250-350nM或275-325nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，TGFβ通路拮抗剂是A 83-01，其以300nM的浓度存在于该方法的步骤(b)(即第2阶段)的培养基中。
mTOR(雷帕霉素(rapamycin)的哺乳动物靶标)通路的拮抗剂包括能够抑制(下调)通过mTOR的信号转导的试剂、分子、化合物或物质，该mTOR是PI3K相关激酶家族成员，其是mTORC1和mTORC2复合物的核心组分。在一个实施方案中，mTOR通路拮抗剂选自：AZD3147、雷帕霉素、西罗莫司(sirolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、优美莫司(umirolimus)、佐他莫司(zotarolimus)、torin-1、torin-2、维妥色替、MHY1485、AZD8055及其组合。在一个实施方案中，mTOR通路拮抗剂以5-100nM、5-50nM、10-30nM或10-20nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，mTOR通路拮抗剂是AZD3147。在一个实施方案中，mTOR通路拮抗剂是AZD3147，其以5-100nM、5-50nM、10-30nM或10-20nM的浓度存在于培养基中。在一个实施方案中，mTOR通路拮抗剂是AZD3147，其以15nM的浓度存在于该方法的步骤(b)(即第2阶段)的培养基中。
III.培养条件
与上文第II小节中描述的化学成分确定且优化的培养基相组合，本公开产生定向MB NSC和MB NPC的方法利用本领域建立的用于细胞培养的标准培养条件。例如，细胞可以在37℃、5％ O2和5％ CO2条件下培养。细胞可以在标准培养皿或板，例如96孔板上培养。在某些实施方案中，起始多能干细胞粘附至板，优选地包被有细胞外基质材料例如玻连蛋白的板上。在一个实施方案中，干细胞在玻连蛋白包被的培养表面(例如，玻连蛋白包被的96孔板)上培养。
多能干细胞可以在分化前在市售培养基中培养。例如，在开始分化方案之前，干细胞可以在Essential 8Flex培养基(Thermo Fisher#A2858501)中培养至少一天。在非限制性示例性实施方案中，干细胞以150,000个细胞/cm2的密度传代到玻连蛋白(ThermoFisher#A14700)包被的96孔板上，并在分化前在Essential 8Flex培养基中培养一天。
为了开始分化方案，将培养干细胞的培养基改为补充有如上文第II小节中所述的信号通路激动剂和/或拮抗剂的基础分化培养基。例如，基础分化培养基可以包括补充有维持细胞活力和生长所需的额外标准培养基组分，但缺乏血清(基础分化培养基是无血清培养基)或任何其他外源添加的生长因子，如FGF2、PDGF、IGF或HGF的市售基质。在非限制性示例性实施方案中，基础分化培养基含有1mg/ml的1x IMDM(Thermo Fisher#12440046)、1xF12(Thermo Fisher#11765047)、聚(乙烯醇)(Sigma#p8136)、1％的化学成分确定的脂质浓缩液(Thermo Fisher#11905031)、450μM 1-硫代甘油(Sigma#M6145)、0.7μg/ml胰岛素(Sigma#11376497001)和15μg/ml转铁蛋白(Sigma#10652202001)(本文也称为“CDM2”培养基，如图16中所示的示例性分化方案中所使用)。
通常将培养基定期更换为新鲜培养基。例如，在一个实施例方案中，每24小时更换一次培养基。
为了产生定向MB NSC和MB NPC，将干细胞在优化的培养基中培养足够的时间，以进行细胞分化和定向MB NSC或MB NPC相关标志物的表达。如实施例中所述，已发现在两阶段方法(对一个阶段进行优化以产生MB NSC，对另一个阶段进行优化以产生MB NPC)中培养的多能干细胞可以引起在少至六天的培养中产生MB NPC，其中第一阶段(产生MB NSC)的培养期为第0-3天，第二阶段(产生MB NPC)的培养期为第4-6天。
因此，在产生MB NSC的方法的第一阶段(本文也称为“步骤(a)”或“第1阶段”)，在第0-3天，或从第0天开始并持续到第3天，或持续72小时(3天)、至少60小时、至少64小时、至少68小时、至少70小时、至少72小时、60小时、64小时、68小时、70小时、72小时在第1阶段优化的培养基中培养多能干细胞。
因此，在产生MB NPC的方法的第二阶段(文也称为“步骤(b)”或“第2阶段”)，在第4-6天，或从第4天开始并持续到第6天，或从第4天开始并持续72小时(3天)，或从第4天开始并持续至少60小时、或至少64小时、或至少68小时、或至少70小时、或至少72小时，或从第4天开始并持续60小时、或64小时、或68小时、或70小时或72小时在第2阶段优化的培养基中进一步培养在步骤(a)中产生的MB NSC。
IV.用途
本公开的用于产生定向MB NSC和MB NPC的方法和组合物允许这些细胞群有效且稳健地用于多种用途。例如，该方法和组合物可用于研究中脑神经祖细胞发育和生物学(包括分化为多巴胺能神经元)，以帮助理解和潜在治疗神经元疾病和病症，例如帕金森病。例如，使用本公开的方法产生的定向MB NSC和/或MB NPC可以使用与细胞上表达的表面标志物结合的试剂根据本领域建立的方法进一步纯化。因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种分离定向中脑神经干细胞(定向MB NSC)或中脑神经祖细胞(MB NPC)的方法，该方法包括：
将通过本公开的方法产生的MP NSC或MP NPC与至少一种结合剂接触，该结合剂结合至由MB NSC或MB NPC表达的细胞表面标志物；以及
分离结合至结合剂的细胞，从而分离MB NSC或MB NPC。
在一个实施方案中，结合剂是抗体，例如结合至细胞表面标志物的单克隆抗体(mAb)。结合抗体的细胞可以通过本领域已知的方法，包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)和磁激活细胞分选(MACS)来分离。
中脑多巴胺能神经谱系的祖细胞还预期用于通过将细胞递送至患有疾病或病症(包括但不限于帕金森病)的受试者来治疗神经疾病和病症。
V.组合物
在其他方面，本公开提供了与产生定向MB NSC和MB NPC的方法相关的组合物(包括培养基和细胞培养物)，以及分离的祖细胞和细胞群。
一方面，本公开提供了用于获得人定向中脑神经干细胞的培养基，其包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
在另一方面，本公开提供了用于获得人中脑神经祖细胞的培养基，其包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGF-β通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
在另一方面，本公开提供了人定向中脑神经干细胞的分离的细胞培养物，所述培养物包含：在包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂并且缺乏外源添加的生长因子的培养基中培养的人OTX2+LMX1A+定向中脑神经干细胞。
在另一方面，本公开提供了人中脑神经祖细胞的分离的细胞培养物，所述培养物包含：在包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGF-β通路拮抗剂并且缺乏外源添加的生长因子的培养基中培养的人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞。
在另一方面，本公开提供了通过本公开的方法产生的人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞。在一个实施方案中，本公开涉及包含人中脑神经祖细胞(NPC)的组合物，其中人中脑NPC表达OTX2、FOXA2和LMX1A并且缺乏GBX2的表达，或仅具有低水平的GBX2的表达。在一个实施方案中，本公开涉及人中脑神经祖细胞(NPC)的分离的细胞群，其包含至少1x106个OTX2+FOXA2+LMX1A+人中脑NPC，其中该细胞群缺乏表达GBX2的神经干细胞。在分离的细胞群的一个实施方案中，人中脑NPC与至少一种结合人中脑NPC表达的至少一种标志物的抗体结合。
本发明通过以下实施例进一步说明，但不应将其视为进一步限制。本申请通篇引用的附图以及所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均明确地通过引用并入本文。
实施例
实施例1：用于产生表达FOXA2和LMX1A的干细胞来源的中脑神经祖细胞的培养方案的开发
在此实施例中，开发了用于生成中脑来源的神经祖细胞的两阶段培养方案，其可以在培养6天后引导人多能干细胞成为表达FOXA2和LMX1A的祖细胞。这些细胞可以进一步分化为成熟的多巴胺能神经元。
此实施例采用先前如Bukys等人(2020)Iscience 23:101346所述的高维实验设计(HD-DoE)方法。该方法采用计算机化的设计几何结构来同时测试多个过程输入，并提供深层效应物/响应空间的数学建模。该方法允许找到控制复杂过程(例如在细胞分化过程中)的组合信号输入。它允许测试多个看似合理的关键过程参数，原因在于这些参数会影响输出响应，例如基因表达。因为基因表达提供了例如人类细胞的表型的标志性特征，所以该方法可用于鉴定和理解哪些信号转导通路控制细胞命运。在当前实施例中，应用HD-DOE方法的意图是寻找直接从多能干细胞状态诱导中脑神经祖细胞表达基因的条件。
为了开发每个阶段的配方，在3天的治疗后测试并建模了多种信号转导通路的激动剂和拮抗剂(本文称为“效应物”)对两组53个预选基因表达的影响。这些效应物是小分子或蛋白，通常在干细胞逐步分化为特定命运的过程中使用。要测试的效应物的选择是基于当前关于发育中大脑中脑区域的神经诱导和干细胞向神经祖细胞分化的文献。
为了测试效应物，设计了至少8个因子的实验，可以评估细胞对一定浓度范围内48种或更多种不同效应物组合的反应。为了分析模型，我们关注中脑区域表达的基因(包括OTX2、DMBX1、FOXA2、LMX1A)的表达，以及后脑标志物GBX2的缺失。每个效应物对基因表达水平的影响由称为因子贡献的参数定义，该参数是在建模过程中为每个效应物计算的。
为了确定分化第1阶段的配方，用各种效应物处理细胞3天，并对细胞的基因表达进行建模。具体地，当针对OTX2的最大表达12760.1进行优化时，一种模型在DMBX1、LMX1A和OTX2上调以及GBX2下调方面显示出有希望的结果。该模型由LDN193189、PD173074、BLU9931、嘌吗啡胺、SC79、MK2206、ZM336372、PD0325901、CHIR99021、XAV939、UCLA-gpl30、托法替尼(Tofacitinib)和GO 6983等13个因子组成。其中四种效应物，AKT信号通路拮抗剂MK2206、MEK信号通路拮抗剂PD0325901、WNT信号通路激动剂CHIR99021和BMP信号通路拮抗剂FDN193189对目的基因的表达有显著的正向影响，分别具有22.3、18.1、13.5和11.9因子贡献(图1)。
由于OTX2的优化并未上调FOXA2，因此我们接下来优化了模型，以实现FOXA2的最大表达1581。鉴定出对FOXA2表达具有显著正向作用的三个效应物，包括分别具有13.6、15.6和22.2的因子贡献的FDN193189、CHIR99021和嘌吗啡胺(图2)。LDN193189和CHIR99021在两种优化设定中都很常见，除嘌吗啡胺外，其余因子的因子贡献均小于10。因此，我们关注添加嘌吗啡胺对原始4个效应物的影响。
该评估是通过模型的动态概况分析完成的，关注OTX2、DMBX1、LMX1A和FOXA2的表达(图3)。由于嘌吗啡胺在之前的设定中对OTX2、DMBX1和LMX1A的表达没有产生正向影响，因此我们预计这些基因的表达水平会下降，然而，观察到它们的表达水平与之前的条件相比保持在相同的附近，DMBX1、LMX1A和OTX2分别为3000、450和11000(图4)。
下表1总结了方案的第一阶段(生成中脑定向神经干细胞)经验证的效应物：
表1：方案的第1阶段经验证的效应物
效应物 作用 浓度
LDN193189 BMP拮抗剂 275nM
PD0325901 MEK拮抗剂 110nM
CHIR99021 WNT激动剂 1.1uM
MK2206 AKT拮抗剂 138nM
嘌吗啡胺 SHH激动剂 550nM
为了进一步指导第2阶段中脑定向神经干细胞向神经祖细胞的分化，我们进行了额外的HD-DoE实验。由此，我们获得了用于准备分化方案的额外基因调控模型。其基础是12因子HD-DoE实验，重点是在第1阶段处理终止后的另外3天，细胞开始向中脑神经祖细胞分化。本文我们关注GBX2表达低至零的神经祖细胞中LMX1A和FOXA2的表达。LMX1A在模型中具有显著的高表达水平，值为47888。因此，我们对该基因使用了优化设定来鉴定正向因子。本实验中的因子包括SC79、MK2206、ZM336372、PD0325901、CHIR99021、A83-01、TTNPB、AGN193109、GW3965、SR9243、嘌吗啡胺和GSI-XX。当针对LMX1A(一个因子)进行优化时，TTNPB(一种RA信号通路的小分子激动剂)对因子具有显著的正向影响，因子贡献为19.5。CHIR99021、SC79和GW3965也具有正向影响，但它们的因子贡献小于10(分别为8.3、7.3和5.4)并且AGN193109具有<1的正因子贡献(图5)。
当对相同的实验进行优化以达到FOXA2的最大表达为33193时，鉴定出对FOXA2表达具有显著正向影响的三个效应物，其中包括TTNPB、A83-01和嘌吗啡胺，具有10.7、6.7和15.3因子贡献(图6)。
与第一阶段的实验模型类似，分析再次表明，嘌吗啡胺对FOXA2表达水平有正向影响，对LMX1A表达水平有负向影响，因子贡献为26.2。该模型还揭示了A83-01和CHIR99021的相同趋势，分别仅对FOXA2和LMX1A产生正向影响。因此，我们使用动态概况分析来调整配方以优化LMX1A和FOXA2两个基因的表达以及GBX2的最小表达(图7)。据观察，即使不添加嘌吗啡胺，FOXA2的表达水平也为5000，因此包含该效应物不是必需的，但它可以提高FOXA2的表达。基于动态概况图，还得出结论，尽管CHIR99021对LMX1A有正向作用，但它也会增加GBX2的表达水平并降低FOXA2的相对表达，因此在最终配方中排除了该因子。A83-01是包含在最终配方中的另一个对FOXA2和LMX1A产生相反影响的因子。动态概况分析表明，添加中等浓度(300nM)的A83-01可以提高FOXA2的表达，并有助于将GBX2的水平降低至几乎为0。
为了测试中脑分化方案中常规使用的FGF8等其他因子，我们进行了另一项12因子实验，该12因子由LDN193189、BMP7、A83-01、激活素A、Takinib、PD0325901、MK2206、FGF8b、AZD3147、MHY1485、GSI-XX和Yhhu 3792组成。与先前的实验类似，用第1阶段培养基处理hiPSC3天，然后用96种条件的因子组合再处理3天。当对该模型进行优化以最大表达FOXA2时，因子贡献为13.7的BMP7和因子贡献为14.2的MK2206对其表达影响最大，其次是因子贡献为10.9的AZD 3147。Yhhu 3792和takinib也有正向影响，但因子贡献小于10。令人惊讶的是，FGF8具有负向影响，因子贡献为12.8(图8)。
还对该模型进行优化以最大表达LMX1A，因子贡献为12的MK2206具有最高的正向影响。AZD3147、GSI-XX、激活素A和Takinib也对其表达有正向影响，但因子贡献均小于10(图9)。该模型显示Yhhu 3792对LMX1A的表达有负向影响，因子贡献为11.7，这与FOXA2条件相反。另一个差异是BMP7，它对LMX1A有负向影响，但因子贡献小于10。因此，为了评估因子之间相互作用的影响以及FOXA2和LMX1A两者表达的最佳条件，我们使用动态概况分析(图10)。
使用动态概况分析，我们排除了GSI-XX、激活素A和Takinib，原因在于它们没有对FOXA2和LMX1A二者的表达水平产生有意义的正向变化。Yhhu 3792也被排除，原因在于它对LMX1A有相当大的负向影响，但对GBX2有正向影响。BMP7和AZD 3147分别对FOXA2和LMX1A具有显著的正向影响，同时它们不会降低其他基因的表达，因此它们被包含在最终配方中。还表明，尽管MK2206降低了LMX1A的水平，但它对FOXA2和GBX2具有理想的影响，因此它以中等水平包含在最终配方中。
表2总结了方案第2阶段(生成中脑源性神经祖细胞)经验证的效应物：
表2：方案的第2阶段经验证的效应物
效应物 作用 浓度
TTNPB RA激动剂 50nM
BMP7 BMP通路 15ng/ml
GW3965 LXR激动剂 500nM
A 83-01 TGF-β拮抗剂 300nM
AZD 3147 mTOR拮抗剂 15nM
MK2206 AKT拮抗剂 50nM
考虑到这两种模型，使细胞最大化分化为具有神经祖细胞身份的中脑区域的条件与OTX2、FOXA2和LMX1A的强大和升高的表达相关，包括以下效应物输入：TTNPB、BMP7、A83-01、GW3965、AZD 3147和MK2206。
如实施例2所述，进一步评估了第1阶段和第2阶段方案中每单个经验证的效应物的关键性。
实施例2：干细胞来源的中脑神经祖细胞诱导培养条件的因子关键性分析
为了评估排除每个经验证的因子的影响，我们使用动态概况分析并比较了在不存在每个最终因子而存在其他因子的情况下目标基因的表达水平。由于目标基因的表达水平揭示了是否可以达到期望的结果，因此该因子关键性分析揭示了每个输入效应物的重要性程度。
在第1阶段配方中，去除五个最终因子中的每一个，同时存在其他四个因子，并评估OTX2、DMBX1、FOXA2和LMX1A的表达水平，并且与所有五个因子存在下的水平进行比较(图11A-B)。当去除MK2206时，OTX2和DMBX1的值分别从12000和3000下降到9500和1500，而FOXA2和LMX1A保持不变。PD0325901的缺失导致DMBX1的表达减少并达到900，而FOXA2和LMX1A的表达从600和300增加到700和500。在LDN193189缺失的情况下，DMBX1的表达水平增加，但OTX2、FOXA2和LMX1A的值降低。去除CHIR99021后，所有目标基因的值均降低，这进一步证明了其在第1阶段配方中的重要性，并且正如预期的那样，缺乏嘌吗啡胺会导致FOXA2降低，同时对其他基因有益。
在第2阶段配方中，去除六个最终因子中的每一个，同时存在其他五个因子，并评估了FOXA2、LMX1A和GBX2的表达水平，并与所有因子存在时的水平进行比较。根据第一个实验模型，TTNPB的缺失导致GBX2表达升高，而FOXA2和LMX1A的值分别从10,000急剧降低至0和30,000至15,000。A 83-01的缺失使FOXA2的表达从10,000降低至7000，然而，正如预期的那样，LMX1A的值从30,000增加至40,000。GW3965的删除使LMX1A的值从30,000急剧降低至10,000，并且使FOXA2的值增加至17,000(图12A-B)。根据第二个实验模型，BMP7和MK2206的缺失均降低了FOXA2的水平，同时增加了LMX1A的值，其中BMP7是导致FOXA2表达为0的主要效应物。AZD 3147的缺乏将LMX1A的水平从4000降低至2000，同时对FOXA2的值几乎没有影响(图13A-B)，因此这些因子被添加到最终配方中。
实施例3：表达FOXA2和LMX1A的干细胞来源的中脑神经祖细胞的免疫细胞化学验证
为了进一步验证如实施例1中所述开发的培养方案，用第1阶段和第2阶段分化培养基处理细胞，并使用免疫细胞化学来评估每个阶段结束时中脑区域和神经祖细胞的生物标志物的表达。测试的生物标志物包括OTX2(参与中脑定位和维持中后脑边界的中脑标志物(Vernay等人(2005)J.Neurosci.25:4856-4867))、LMX1A(参与中脑多巴胺能祖细胞的生成和分化(Yan等人(2011)J.Neurosci.31:12413-12425))、FOXA2(在发育的早期和晚期阶段调节中脑多巴胺能神经元的生成(Ferri等人(2007)Development 134:2761-2769))、PAX2(在中脑和前后脑中表达(Urbanek等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5703-5708))、巢蛋白(早期神经元标志物)、KI67(增殖标志物)和GBX2(后脑标志物)。
免疫细胞化学图像证实，到第1阶段培养基处理结束时，90％以上的细胞中都有OTX2和LMX1A的表达。在一些细胞中观察到标志物PAX2、巢蛋白和KI67，以及GBX2的一些表达。然而，FOXA2没有表达(图14)。用第2阶段培养基处理后，我们观察到LMX1A和OTX2的表达得以维持，而FOXA2的表达显著增加，在超过90％的细胞中检测到FOXA2。在第2阶段结束时GBX2表达也几乎被排除(图15)。在分化第2阶段结束时检测到OTX2、LMX1A和FOXA2，而未检测到GBX2，证实了经过6天处理后，人诱导多能干细胞分化为中脑神经祖细胞的第1阶段和第2阶段的配方。
实施例4：表达LMX1A和FOXA2的干细胞来源的中脑神经祖细胞的RNA-seq验证
RNA测序用于获取候选配方中培养细胞的基因谱。人iPSC在第1阶段和第2阶段培养基中总共培养6天，并在每个阶段结束时对生成的细胞的RNA进行测序。图17显示了三个重复中代表发育中脑的中脑区域(OTX2、DMBX1、FOXA2、LMX1A)、早期神经身份(巢蛋白、SOX1、SOX2、波形蛋白)和干细胞状态(NANOG、POU5F1)的所选基因在第0天、第3天和第6天的归一化表达水平。如图17A和图17B所示，神经祖细胞中干细胞基因的水平降低，而源自中脑区域的神经元基因的水平升高；这验证了hiPSC向具有中脑身份的神经谱系的分化。图17A显示了与阶段0相比，用第1阶段培养基处理3天后19个选定基因的倍数变化；与hiPSC相比，FOXA2、LMX1A和SOX1的正向差异表达水平最高(分别为10.6、9.5和9.1)。干性基因NANOG和POU5F1以及后脑基因GBX2处于最低水平(分别为-8.7、-3.5和-3.8)。图17B显示与hiPSC相比，用第1阶段和第2阶段培养基处理的细胞的21个选定基因的倍数变化。FOXA2、SOX1和DDC的阳性差异表达最高，分别为11.3、10和7.7。与第1阶段类似，NANOG、POUF51和GBX2观察到最低的差异表达。hiPSC在第0天和MB神经祖细胞在第6天的18个选定基因的缩放基因谱的热图(图17C)显示使用第1阶段和第2阶段培养基处理后中脑祖基因(包括DDC、LMX1A/B、SOX6、NEUROG2、FOXA2和EN1)的表达增加。还观察到胶质细胞中表达的基因GFAP的表达水平在6天分化期间保持不变，这表明培养物主要是神经元。该数据证明了第1阶段和第2阶段配方作为分阶段分化培养基引导细胞朝向中脑神经元身份的能力。
等同物
本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在被所附权利要求所涵盖。

Claims (43)

1.一种产生人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞(NPC)的方法，其包括：
(a)在第0-3天，在缺乏外源添加的生长因子并包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂的培养基中培养人多能干细胞，以获得定向中脑神经干细胞(NSC)；和
(b)在第4-6天，在缺乏外源添加的生长因子并包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGFβ通路拮抗剂的培养基中培养所述定向中脑NSC，以在培养的第6天获得人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑NPC。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是胚胎干细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞在培养期间附着至玻连蛋白包被的板上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述WNT通路激动剂选自：CHIR99021、CHIR98014、SB 216763、SB 415286、LY2090314、3F8、A 1070722、AR-A 014418、BIO、AZD1080、WNT3A及其组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述WNT通路激动剂以0.5-2.0μM的浓度存在于所述培养基中。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述WNT通路激动剂是CHIR99021，所述CHIR99021在步骤(a)和(b)中以1.1μM的浓度存在于所述培养基中。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述SHH通路激动剂选自：嘌吗啡胺、GSA10、SAG及其组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述SHH通路激动剂以200-800nM的浓度存在于所述培养基中。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述SHH通路激动剂是嘌吗啡胺，所述嘌吗啡胺以550nM的浓度存在于所述培养基中。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述BMP通路拮抗剂选自：LDN193189、DMH1、DMH2、多索吗啡、K02288、LDN214117、LDN212854、卵泡抑素、ML347、头蛋白及其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述BMP通路拮抗剂以100-500nM的浓度存在于所述培养基中。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述BMP通路拮抗剂是LDN193189，所述LDN193189以275nM的浓度存在于所述培养基中。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述AKT通路拮抗剂选自：MK2206、GSK690693、哌立福辛(KRX-0401)、帕他色替(GDC-0068)、卡帕塞替尼(AZD5363)、PF-04691502、AT 7867、曲西利滨(NSC154020)、ARQ751、Miransertib(ab235550)、Bomssertib、Cerisertib及其组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述AKT通路拮抗剂以25-300nM的浓度存在于所述培养基中。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述AKT通路拮抗剂是MK2206，所述MK2206在步骤(a)中以138nM的浓度存在于所述培养基中，在步骤(b)中以50nM的浓度存在于所述培养基中。
17.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述MEK通路拮抗剂选自：PD0325901、贝美替尼(MEK162)、考比替尼(XL518)、司美替尼、曲美替尼(GSK1120212)、CI-1040(PD-184352)、瑞法替尼、ARRY-142886(AZD-6244)、PD98059、U0126、BI-847325、RO 5126766及其组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述MEK通路拮抗剂以25-300nM的浓度存在于所述培养基中。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述MEK通路拮抗剂是PD0325901，所述PD0325901以110nM的浓度存在于所述培养基中。
20.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述BMP通路激动剂选自：BMP、sb4、ventromorphins及其组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述BMP通路激动剂以10-25ng/ml的浓度存在于所述培养基中。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述BMP通路激动剂是BMP7，所述BMP7以15ng/ml的浓度存在于所述培养基中。
23.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RA通路激动剂选自：TTNPB、AM580、CD 1530、CD 2314、Ch 55、BMS 753、他扎罗汀、异维A酸、AC 261066、视黄酸(RA)、Sr11237、阿达帕林、EC23、9-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸、4-氧代视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)及其组合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述RA通路激动剂以10-100nM的浓度存在于所述培养基中。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述RA通路激动剂是TTNPB，所述TTNPB以50nM的浓度存在于所述培养基中。
26.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述LXR通路激动剂选自：GW3965、T0901317、DMHCA、AZ876及其组合。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述LXR通路激动剂以250-750nM的浓度存在于所述培养基中。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述LXR通路激动剂是GW3965，所述GW3965以500nM的浓度存在于所述培养基中。
29.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述mTOR通路拮抗剂选自：AZD3147、雷帕霉素、西罗莫司、替西罗莫司、依维莫司、地磷莫司、优美莫司、佐他莫司、torin-1、torin-2、维妥色替、MHY1485、AZD8055及其组合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述mTOR通路拮抗剂以10-30nM的浓度存在于所述培养基中。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述mTOR通路拮抗剂是AZD3147，所述AZD3147以15nM的浓度存在于所述培养基中。
32.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述TGFβ通路拮抗剂选自：A 83-01、SB-431542、GW788388、SB525334、TP0427736、RepSox、SD-208及其组合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述TGFβ通路拮抗剂以100-500nM的浓度存在于所述培养基中。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述TGFβ通路拮抗剂是A 83-01，所述A 83-01在步骤(b)中以300nM的浓度存在于所述培养基中。
35.一种产生人OTX2+LMX1A+定向中脑神经干细胞(NSC)的方法，其包括：
在第0-3天，在缺乏外源添加的生长因子并包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂的培养基中培养人多能干细胞，以在培养的第3天获得OTX2+LMX1A+定向中脑NSC。
36.一种用于获得人定向中脑神经干细胞的培养基，其包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
37.一种用于获得人中脑神经祖细胞的培养基，其包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGFβ通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
38.一种人定向中脑神经干细胞的分离的细胞培养物，所述培养物包含人OTX2+LMX1A+定向中脑神经干细胞，所述人OTX2+LMX1A+定向中脑神经干细胞在包含WNT通路激动剂、SHH通路激动剂、BMP通路拮抗剂、AKT通路拮抗剂和MEK通路拮抗剂并且缺乏外源添加的生长因子的培养基中培养。
39.一种人中脑神经祖细胞的分离的细胞培养物，所述培养物包含人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞，所述人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞在包含BMP通路激动剂、RA通路激动剂、LXR通路激动剂、AKT通路拮抗剂、mTOR通路拮抗剂和TGFβ通路拮抗剂并且缺乏外源添加的生长因子的培养基中培养。
40.一种人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞，其通过权利要求1-34中任一项所述的方法产生。
41.一种包含人中脑神经祖细胞(NPC)的组合物，其中所述人中脑NPC表达OTX2、FOXA2和LMX1A并且缺乏GBX2的表达。
42.一种人中脑神经祖细胞(NPC)的分离的细胞群，其包含至少1×106个OTX2+FOXA2+LMX1A+人中脑NPC，其中所述细胞群缺乏表达GBX2的神经干细胞。
43.根据权利要求42所述的分离的细胞群，其中所述人中脑NPC与至少一种抗体结合，所述抗体结合由所述人中脑NPC表达的至少一种标志物。
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