KR20240035561A - 인간 중뇌 신경 전구 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

인간 중뇌 신경 전구 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20240035561A
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누신 아미니
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트레일헤드 바이오시스템즈 인크.
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Abstract

인간 만능 줄기 세포로부터 인간 수임 중뇌 신경 줄기 세포 (NSC) 및 중뇌 신경 전구 세포 (중뇌 NPC)를 생성하는 방법은 6일만큼 짧은 시간 내에 중뇌 NPC의 생성을 가능하게 하는 화학적으로-규정된 배양 배지를 사용하여 제공된다. 중뇌 NPC는 성숙 도파민성 뉴런으로 추가로 분화될 수 있다. 배양 배지, 단리된 세포 집단 및 키트가 또한 제공된다.

Description

인간 중뇌 신경 전구 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물
<관련 출원>
본원은 2021년 7월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/223,139를 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
<정부 허가 권리>
본 발명은 미국 ARMY ACC-AGP-RTP에 의해 수여된 승인 번호: W911NF-17-3-0003 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
파킨슨병 (PD)은 알츠하이머병 다음으로 두번째로 가장 흔한 진행성 신경변성 질환이고, 흑색질 치밀부에서 중뇌 도파민 (mDA) 뉴런의 변성을 특징으로 한다. 현행 치료는 전형적으로 도파민에 대한 전구체인 레보도파 (L-도파로도 공지됨)를 투여함으로써 도파민 생체이용률을 증가시키는 것을 목표로 하는 약리학적 접근법을 취한다. 그러나, 레보도파를 사용한 장기 치료의 부작용은 PD의 후기 단계에서의 그의 사용에 대한 도전과제를 제시한다. PD 환자의 생체내에서 기능적 도파민성 뉴런을 재구성하는 능력은 인간 태아 중뇌 조직을 이식함으로써 처음으로 조사되었다 (문헌 [Lindvall et al. (2004) NeuroRx 1:383-393]에서 검토됨). 결과는 가변적이었고, 접근법은 태아 조직의 이용가능성 및 사용에 대한 윤리적 우려를 제기하여, 생체내에서 도파민성 뉴런을 재구성하기 위한 대안적 접근법으로 이어졌다.
배아 줄기 (ES) 세포주 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)를 비롯한 만능 줄기 세포 (PSC)의 이용가능성은 시험관내에서 mDA 뉴런의 전구세포를 생성할 가능성을 열었다. 발달 연구는 중뇌 도파민성 뉴런이 복측 중뇌 바닥판 (mFP)으로부터 유래된다는 것을 입증하였고, 이는 마커 FOXA2 및 LMX1A의 공동-발현에 의해 확인될 수 있다. 중뇌 바닥판 전구체를 유도하기 위한 초기 분화 프로토콜은 PSC에서의 소닉 헤지호그 (SHH) 및 정규 WNT 신호전달의 활성화, 뿐만 아니라 이중 SMAD 억제 및 FGF8 활성화를 수반하였고, 22-일 프로토콜의 경우 FOXA2 및 LMX1A를 발현하는 전구체 (문헌 [Kriks et al. (2011) Nature 480:547-551]) 또는 수반되는 SHH, WNT 및 FGF8의 활성화, 뿐만 아니라 레티노산 (RA)의 첨가를 달성하기 위해 11일이 필요하였다 (문헌 [Cooper et al. (2010) Mol. Cell. Neurosci. 45:258-266]). 인간 iPSC-유래 배상체를 5일 동안 이중 SMAD 억제에 노출시킨 후, SHH 및 FGF8 활성화시켜 16일 내에 mDA 전구체를 생성하는 유사한 프로토콜이 보고되었다 (문헌 [Hartfield et al. (2014) PLoS One 92:e87388]).
보다 최근에, 인간 만능 줄기 세포로부터 MB 도파민성 전구세포를 얻기 위한 추가의 프로토콜이 보고되었다. 예를 들어, 놀브란트(Nolbrant) 등은 처음 11일 동안 N-2 보충제 및 마지막 5일 동안 B27 보충제에 대한 노출, 뿐만 아니라 SHH 및 WNT 활성화 및 ALK 억제를 수반하는 16일 프로토콜을 보고하였다 (문헌 [Nolbrant et al. (2017) Nature Protocols 12:1962-1979]). 프리시오스(Precious) 등은 FGF 신호전달을 차단하기 위해 2일 동안 MEK 억제, 이어서 3일 동안 단독 SHH 활성화 및 제5일부터 계속 SHH 및 FGF8 활성화를 수반하여, 제7일에 FOXA2+ LMX1A+ 전구세포로 이어지는 프로토콜을 보고하였다 (문헌 [Precious et al. (2020) Front. Neurosci. 14:312]). 가트너(Gartner) 등은 (i) 제0일-제5일에 LDN193189 및 SB431542 및 제5일-제10일에 LDN193189 단독, (ii) 제2일-제13일에 CHIR99021, 및 (iii) 제1일-제7일에 SHH 및 푸르모르파민으로 보충된 배지에서 인큐베이션을 수반하는 제노-프리(xeno-free), 무-피더의 화학적으로-규정된 프로토콜을 보고하였다 (문헌 [Gartner et al. (2020) Star Protocols 1:100065]).
인간 도파민성 뉴런 전구세포는 또한 RA, SB, VPA 및 포르스콜린으로 보충된 후각 초성 세포-조건화 배지 (OECCM)에서 4일 동안 hSSC의 배양, 이어서 SHH, FGF8A 및 TFGβ3으로 보충된 OECCM에서의 배양을 수반하는 프로토콜을 사용하여 인간 정조 줄기 세포 (hSSC)로부터 분화되었다 (문헌 [Yang et al. (2019) Stem Cell Res. Therap. 10:195]).
중뇌 신경 전구 세포를 확장시키는 방법이 또한 기재되어 있고 (문헌 [Fedele et al. (2017) Sci. Reports 7:6036]), 이러한 전구 세포를 동결보존하는 방법도 기재되어 있다 (문헌 [Drummond et al. (2020) Front. Cell. Dev. Biol. 8:578907]).
만능 줄기 세포를 중뇌 도파민성 뉴런의 전구체로 분화시키기 위한 프로토콜은, 예를 들어 문헌 [Arenas et al. (2015) Development 142:1918-1936 and Wang et al. (2020) Cells 9:1489]에서 검토된다.
따라서, 일부 진전이 있었지만, 인간 만능 줄기 세포로부터 중뇌 신경 전구 세포를 생성하기 위한 효율적이고 강건한 방법 및 조성물에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 개시내용은 6일만큼 짧은 배양에서 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ MB NPC의 생성을 가능하게 하는 화학적으로-규정된 배양 배지를 사용하여 만능 줄기 세포로부터 인간 수임 중뇌 (MB) 신경 줄기 세포 (NSC) 및 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 생성하는 방법을 제공한다. 배양 배지는 혈청 또는 다른 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여되어 있고, 만능 줄기 세포에서 특정한 신호전달 경로 활성을 효능화 또는 길항하는 소분자 작용제를 포함하여, 중뇌 신경 계통에 따른 분화가 촉진되어 중뇌 신경 전구세포-연관 바이오마커의 세포 성숙 및 발현을 유도한다. 본 개시내용의 방법은 배양 배지 중 소분자 작용제의 사용이 선행 기술 프로토콜과 비교하여 배양 성분의 정밀 제어를 가능하게 하고 분화 시간을 유의하게 단축시킨다는 이점을 갖는다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 생성하는 방법에 관한 것이다:
(a) 인간 만능 줄기 세포를, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여되고 WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 제0일-제3일에 배양하여 수임 중뇌 신경 줄기 세포 (NSC)를 수득하는 단계; 및
(b) 수임 중뇌 NSC를, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여되고 BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGFβ 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 제4일-제6일에 배양하여, 배양 제6일에 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 NPC를 수득하는 단계.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 인간 OTX2+ LMX1A+ 수임 중뇌 신경 줄기 세포 (NSC)를 생성하는 방법에 관한 것이다:
인간 만능 줄기 세포를, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여되고 WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 제0일-제3일에 배양하여, 배양 제3일에 OTX2+ LMX1A+ 수임 중뇌 NSC를 수득하는 단계.
본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 적합한 효능제 및 길항제 작용제, 및 그에 대한 농도의 비제한적 예는 본원에 추가로 상세하게 기재된다.
한 실시양태에서, 인간 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 또 다른 실시양태에서, 인간 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다.
한 실시양태에서, 인간 만능 줄기 세포는 배양 동안 비트로넥틴-코팅된 플레이트에 부착된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하고, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된, 인간 수임 중뇌 신경 줄기 세포를 수득하기 위한 배양 배지에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGFβ 경로 길항제를 포함하고, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된, 인간 중뇌 신경 전구 세포를 수득하기 위한 배양 배지에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ LMX1A+ 수임 중뇌 신경 줄기 세포를 포함하는, 인간 수임 중뇌 신경 줄기 세포의 단리된 세포 배양물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGFβ 경로 길항제를 포함하고, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 신경 전구 세포를 포함하는, 인간 중뇌 신경 전구 세포의 단리된 세포 배양물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 신경 전구 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 인간 중뇌 NPC는 OTX2, FOXA2 및 LMX1A를 발현하고, GBX2의 발현이 결여된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 적어도 1 x 106 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 인간 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 포함하는 인간 중뇌 NPC의 단리된 세포 집단에 관한 것이며, 여기서 세포 집단은 GBX2-발현 신경 줄기 세포가 결여되어 있다. 한 실시양태에서, 인간 중뇌 NPC는 인간 중뇌 NPC에 의해 발현되는 적어도 1종의 마커에 결합하는 적어도 1종의 항체와 결합된다.
본 발명의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 OTX2의 최대 발현에 대해 최적화된 13-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 나타낸다. 모델의 상부 섹션은 OTX2에 대해 최적화될 때 미리-선택된 53종의 유전자의 발현 수준의 예측을 나타낸다. 모델의 하부 섹션은 이 모델에서 시험된 이펙터 및 OTX2의 최대 발현에 대한 그의 기여를 나타낸다. 값 열은 모델을 모방하기 위한 각각의 이펙터의 요구되는 농도를 지칭한다.
도 2는 FOXA2의 최대 발현에 대해 최적화된 13-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 나타낸다. 상부 및 하부 섹션은 도 1에 대해 기재된 바와 같다. 이 조건은 이펙터 푸르모르파민을 FOXA2의 높은 발현에 대한 중요한 입력으로서 22.2의 인자 기여도로 강조한다.
도 3은 시험된 13종의 이펙터의 농도에 대한 OTX2, LMX1A, DMBX1 및 FOXA2 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 나타낸다. FOXA2의 발현에 대한 푸르모르파민, CHIR99021 및 LDN193189의 긍정적 영향 및 그의 인자 기여도를 각각의 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 나타낸다.
도 4는 시험된 13종의 이펙터의 농도에 대한 OTX2, LMX1A, DMBX1 및 FOXA2 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 나타낸다. OTX2의 발현에 대한 MK2206, PD0325901, LDN193189 및 CHIR99021의 긍정적 영향 및 그의 인자 기여도를 각각의 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 나타낸다.
도 5는 분화의 단계 2에 대한 레시피를 생성하기 위해 단계 1 신경 줄기 세포에 적용된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 나타낸다. 이 모델은 LMX1A의 최대 발현에 대해 최적화된다. 이러한 설정은 LMX1A의 발현에서의 TTNPB의 역할을 19.5의 인자 기여도로 강조한다.
도 6은 분화의 단계 2에 대한 레시피를 생성하기 위해 단계 1 신경 줄기 세포에 적용된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 나타낸다. 이 설정은 FOXA2의 발현에 대한 푸르모르파민 및 CHIR99021의 긍정적 역할을 각각 15.3 및 10.7의 인자 기여도로 강조한다.
도 7은 시험된 12개의 이펙터의 농도에 대한 LMX1A, FOXA2 및 GBX2 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 나타낸다. LMX1A의 발현에 대한 TTNPB, CHIR99021 및 GW3965의 긍정적 영향, 및 FOXA2의 발현에 대한 푸르모르파민, MK2206 및 GW3965의 긍정적 영향, 및 그의 인자 기여도를 각각의 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 나타낸다.
도 8은 분화의 단계 2에 대한 레시피를 생성하기 위해 단계 1 신경 줄기 세포에 적용된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 나타낸다. 이 설정은 FOXA2의 발현에 대한 BMP7 및 MK2206의 긍정적 역할을 각각 13.7 및 14.2의 인자 기여도로 강조한다.
도 9는 분화의 단계 2에 대한 레시피를 생성하기 위해 단계 1 신경 줄기 세포에 적용된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 나타낸다. 이 설정은 LMX1A의 발현에 대한 MK2206의 긍정적 역할 및 FGF8b의 부정적 역할을 각각 12 및 16.9의 인자 기여도로 강조한다.
도 10은 시험된 12개의 이펙터의 농도에 대한 LMX1A, FOXA2 및 GBX2 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 나타낸다. FOXA2 발현에 대한 BMP7 및 MK2206의 긍정적 영향 및 LMX1A의 발현에 대한 AZD 3147의 긍정적 영향 및 그의 인자 기여도를 각각의 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 나타낸다.
도 11a-b는 분화의 단계 1의 레시피에서 시험된 5종의 검증된 이펙터의 농도에 대한 OTX2, DMBX1, FOXA2 및 LMX1A 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 나타낸다. 도 11a는 5종의 최종 이펙터 모두의 존재 하의 관심 유전자의 발현 수준을 나타낸다. 도 11b는 다른 영역이 존재하는 시점에 최종 이펙터 중 하나의 부재 하의 관심 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
도 12a-b는 분화의 단계 2의 레시피에서 시험된 3종의 검증된 이펙터 (TTNPB, A 83-01 및 GW3965)의 농도에 대한 LMX1A, FOXA2 및 GBX2 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 나타낸다. 도 12a는 3종의 최종 이펙터 모두의 존재 하의 관심 유전자의 발현 수준을 나타낸다. 도 12b는 다른 영역이 존재하는 시점에 최종 이펙터 중 하나의 부재 하의 관심 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
도 13a-b는 분화의 단계 2의 레시피에서 시험된 3종의 검증된 이펙터 (MK2206, AZD 3147 및 BMP7)의 농도에 대한 LMX1A, FOXA2 및 GBX2 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 나타낸다. 도 13a는 3종의 최종 이펙터 모두의 존재 하의 관심 유전자의 발현 수준을 나타낸다. 도 13b는 다른 영역이 존재하는 시점에 최종 이펙터 중 하나의 부재 하의 관심 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
도 14는 단계 1 처리의 종료 시 MB-유래 신경 줄기 세포의 형광 영상의 사진을 나타낸다. 세포를 FOXA2, LMX1A, OTX2를 포함한 중뇌 바이오마커, 중뇌-후뇌 경계 바이오마커 PAX2, 및 초기 뉴런 바이오마커 네스틴, 및 후뇌 바이오마커 GBX2로 염색하였다. 이 단계에서 세포는 FOXA2를 제외한 모든 마커에 대해 양성이었다.
도 15는 단계 2 처리의 종료 시 MB-유래 신경 줄기 세포의 형광 영상의 사진을 나타낸다. 세포를 FOXA2, LMX1A, OTX2를 포함한 중뇌 바이오마커 및 후뇌 바이오마커 GBX2로 염색하였다. 이 단계에서 세포는 모든 중뇌 바이오마커에 대해 양성이었고, GBX2의 매우 낮은 발현이 관찰되었다.
도 16은 6일 내에 hiPC로부터 중뇌 신경 전구 세포를 생성하기 위한 2-단계 배양 프로토콜의 개략적 다이어그램을 나타낸다.
도 17a-c는 3일 (단계 1) 및 6일 (단계 2) 후에 MB 분화 배지에서 배양된 세포의 RNA-seq 데이터를 나타낸다. 도 17a는 단계 1에서의 선택된 유전자의 차등 발현의 막대 플롯을 나타낸다. 단계 1의 종료 시, 줄기 세포 유전자 NANOG 및 POU5F1의 발현 수준은 감소된 반면에, 중뇌 영역의 초기 발달 및 뉴런 동일성에 수반되는 유전자는 상승되었다. 도 17b는 단계 2에서의 선택된 유전자의 차등 발현의 막대 플롯을 나타낸다. 단계 2의 종료 시, DDC, LMX1B, SOX6 및 EN1을 포함한 MB 전구 유전자의 발현 수준이 증가하였다. 도 17c는 제0일의 hiPSC의 유전자 프로파일과 비교한 제6일의 MB 신경 전구 유전자의 유전자 프로파일의 열지도를 나타낸다.
소분자 기반 접근법을 사용하여 화학적으로-규정된 배양 조건 하에 인간 만능 줄기 세포로부터 중뇌 신경 전구세포의 생성을 가능하게 하는 방법론 및 조성물이 본원에 기재된다. 본 개시내용의 방법은 OTX2+ LMX1A+ 수임 MB 신경 줄기 세포 (NSC)가 3일 내에 생성된 후, 배양 제6일에 OTX2+ LMX1A+ FOX2A+ MB 신경 전구 세포 (NPC)가 생성되는 2단계 프로토콜로 중뇌 신경 전구 세포를 생성한다. 따라서, 본 개시내용은 화학적으로-규정된 배양 조건을 사용하는 선행 기술 프로토콜보다 유의하게 더 짧은 시간 내에 MB NPC의 수득을 허용한다.
실시예 1에 기재된 바와 같이, 고차원 실험 설계 (HD-DoE) 접근법을 사용하여 출력 반응, 예컨대 유전자 발현에 대한 다중 공정 입력 (예를 들어, 소분자 효능제 또는 길항제)을 동시에 시험하였다. 이들 실험은 매우 짧은 시간 내에 수임 중뇌 만능 줄기 세포 및 중뇌 전구 세포를 생성하기에 충분한, 특정한 신호전달 경로의 효능제 및/또는 길항제를 포함하는 화학적으로-규정된 배양 배지의 식별을 가능하게 하였다. 최적화된 배양 배지를, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 개별 효능제 또는 길항제 작용제의 제거 효과를 조사하는 인자 중요도 분석에 의해 추가로 검증하였다. 면역조직화학은 실시예 3에 기재된 바와 같이 분화 프로토콜에 의해 생성된 세포의 표현형을 추가로 확인하였다. 게다가, 분화 프로토콜에 따라 배양된 세포의 RNA-seq 분석은 또한 실시예 4에 기재된 바와 같이 MB 전구 유전자의 발현을 확인하였다.
도 16은 MB NSC 및 MB NPC를 생성하기 위한 본 개시내용의 방법의 한 실시양태를 개략적으로 예시한다.
본 발명의 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
I. 세포
본 개시내용의 배양물에 사용된 출발 세포는 인간 만능 줄기 세포이다. 본원에 사용된 용어 "인간 만능 줄기 세포" (hPSC로 약칭됨)는 다양한 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는 인간 줄기 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "만능"은 상이한 조건 하에 모든 3종의 배세포 층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 특징적인 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능 세포는 주로, 예를 들어 누드 마우스 및 기형종 형성 검정을 이용하여 모든 3종의 배엽층으로 분화될 수 있는 그의 능력을 특징으로 한다. 만능성에 대한 바람직한 시험은 3종의 배엽층 각각의 세포로 분화하는 능력을 입증하는 것이지만, 만능성은 또한 배아 줄기 (ES) 세포 마커의 발현에 의해 입증될 수 있다.
인간 만능 줄기 세포는, 예를 들어 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 및 인간 배아 줄기 세포, 예컨대 ES 세포주를 포함한다. 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)의 비제한적 예는 19-11-1, 19-9-7 또는 6-9-9 세포를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Yu, J. et al. (2009) Science 324:797-801]에 기재된 바와 같음). 인간 배아 줄기 세포주의 비제한적 예는 ES03 세포 (와이셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute)) 및 H9 세포 (문헌 [Thomson, J.A. et al. (1998) Science 282:1145-1147])를 포함한다. 인간 만능 줄기 세포 (PSC)는 세포를 PSC인 것으로 확인하는 데 사용될 수 있는 세포 마커를 발현한다. 만능 줄기 세포 마커의 비제한적 예는 TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-54, SSEA1, SSEA3, SSEA4, CD9, CD24, OCT3, OCT4, NANOG 및/또는 SOX2를 포함한다. 본 개시내용의 수임 중뇌 신경 줄기 세포 및 중뇌 신경 전구 세포를 생성하는 방법은 출발 만능 줄기 세포 집단을 분화 (성숙)시키는 데 사용되기 때문에, 다양한 실시양태에서 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 중뇌-수임 신경 세포 집단은 1종 이상의 줄기 세포 마커, 예컨대 TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-54, SSEA1, SSEA3, SSEA4, CD9, CD24, OCT3, OCT4, NANOG 및/또는 SOX2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 줄기 세포 마커의 발현이 결여되어 있다.
만능 줄기 세포는 세포 분화를 유도하는 본원에 기재된 바와 같은 배양 조건에 적용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분화"는 더욱 원시적인 단계로부터 더욱 성숙한 (즉, 덜 원시적인) 세포로의 세포의 발달을 지칭하고, 전형적으로는 특정한 세포 계통으로의 수임의 표현형 특색을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "신경 줄기 세포"는 신경 계통으로 수임되지만 신경 계통을 따라 상이한 유형의 세포로 분화하는 능력을 여전히 갖는다는 점에서 만능 줄기 세포보다 더 분화된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 "신경 전구 세포"는 신경 줄기 세포보다 더 분화되고 특정한 유형의 신경 세포로 추가로 분화될 수 있는 세포를 지칭한다.
실시양태에서, 세포는 1종 이상의 바이오마커, 예컨대 신경 전구세포 또는 중뇌 영역-수임 신경 세포의 특정한 바이오마커의 발현에 기초하여 확인 및 특징화될 수 있다. 그의 발현이 관심 세포의 특징화에서 평가될 수 있는 바이오마커의 비제한적 예는 중뇌의 위치설정 및 중뇌-후뇌 경계의 유지에 수반되는 중간뇌 마커인 OTX2 (문헌 [Vernay et al. (2005) J. Neurosci. 25:4856-4867]), 중뇌 도파민성 전구세포의 생성 및 분화에 수반되는 LMX1A (문헌 [Yan et al. (2011) J. Neurosci. 31:12413-12425]), 발달의 초기 및 후기 단계에서 중뇌 도파민성 뉴런의 생성을 조절하는 FOXA2 (문헌 [Ferri et al. (2007) Development 134:2761-2769]), 중뇌 및 전방 후뇌에서 발현되는 PAX2 (문헌 [Urbanek et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5703-5708]), 초기 뉴런 마커인 네스틴, 증식 마커인 KI67, 및 후뇌 마커인 GBX2를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단지 "낮은" 수준의 관심 바이오마커의 세포에 의한 발현은 배경 수준보다 최대 20%, 보다 바람직하게는 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만 높은 수준을 지칭하는 것으로 의도된다 (여기서 배경 수준은, 예를 들어 세포에 의해 발현되지 않는 것으로 간주되는 음성 대조군 마커의 발현 수준에 상응함).
실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 세포는 수임 중뇌 (MB) 신경 줄기 세포 (NSC)이다. 본원에 사용된 "수임 중뇌 신경 줄기 세포" 또는 "수임 MB NSC"는 바이오마커 OTX2 및 LMX1A를 발현하는 줄기 세포-유래 신경 줄기 세포를 지칭한다. 한 실시양태에서, 수임 MB NSC는 바이오마커 FOXA2를 발현하지 않거나, 또는 낮은 수준으로만 발현한다. 한 실시양태에서, 수임 MB NSC는 바이오마커 GBX2를 발현하지 않거나, 또는 낮은 수준으로만 발현한다. OTX2 및 LMX1A에 추가로, 수임 MB NSC는 PAX2, 네스틴 및/또는 KI67을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가적인 바이오마커를 또한 발현할 수 있다.
실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 세포는 중뇌 신경 전구 세포이며, 이는 수임 MB NSC보다 더 분화된 (더 성숙한) 세포이다. 본원에 사용된 바와 같이, "중뇌 신경 전구 세포" 또는 "MB NPC"는 바이오마커 OTX2, LMX1A 및 FOXA2를 발현하는 줄기 세포-유래 전구 세포를 지칭한다. 한 실시양태에서, MB NPC는 바이오마커 GBX2를 발현하지 않거나, 또는 낮은 수준으로만 발현한다. OTX2, LMX1A 및 FOXA2에 추가로, MB NPC는 PAX2, 네스틴 및/또는 KI67을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가적인 바이오마커를 또한 발현할 수 있다.
본 개시내용의 방법에 의해 생성된 수임 MB NSC 및 MB NPC는 성숙 도파민성 뉴런을 생성하기 위해 시험관내에서 추가로 배양될 수 있다. BDNF, GDNF, 아스코르브산, DAPT 및/또는 TGF-β를 함유하는 배지에서 전구 세포를 추가로 배양하는 것을 수반하는 프로토콜을 비롯한, 중뇌 신경 전구 세포를 성숙 도파민성 뉴런으로 분화시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 확립되어 있다.
II. 배양 배지 성분
MB NSC 또는 MB NPC를 생성하는 본 개시내용의 방법은 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여되고 세포 신호전달 경로의 특이적 효능제 및/또는 길항제를 포함하는 배양 배지에서 인간 만능 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다.
실시예 1에 기재된 바와 같이, WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하는 배양 배지는 3일만큼 짧은 시간 내에 OTX2- 및 LMX1A-발현 MB NSC를 생성하기에 충분하였다 (본원에서 분화 프로토콜의 "단계 1"로 지칭됨). BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGF-β 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 MB NSC의 추가의 분화는 전체 2-단계 6일 프로토콜의 경우 또 다른 3일 내에 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ MB NPC를 생성하기에 충분하였다 (본원에서 "단계 2"로 지칭됨).
본원에 사용된 세포 신호전달 경로의 "효능제"는 세포 신호전달 경로를 자극 (상향조절)하는 작용제를 지칭하는 것으로 의도된다. 세포 신호전달 경로의 자극은, 예를 들어 신호전달 경로에 수반되는 세포 표면 수용체를 활성화시키는 효능제 (예를 들어, 효능제는 수용체 리간드일 수 있음)의 사용에 의해 세포외에서 개시될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세포 신호전달의 자극은, 예를 들어 신호전달 경로의 성분(들)과 세포내 상호작용하는 소분자 효능제의 사용에 의해 세포내에서 개시될 수 있다.
본원에 사용된 세포 신호전달 경로의 "길항제"는 세포 신호전달 경로를 억제 (하향조절)하는 작용제를 지칭하는 것으로 의도된다. 세포 신호전달 경로의 억제는, 예를 들어 신호전달 경로에 관여하는 세포 표면 수용체를 차단하는 길항제의 사용에 의해 세포외에서 개시될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 세포 신호전달의 억제는, 예를 들어 신호전달 경로의 성분(들)과 세포내 상호작용하는 소분자 길항제의 사용에 의해 세포내에서 개시될 수 있다.
본 개시내용의 방법에 사용되는 효능제 및 길항제는 관련 기술분야에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다. 이들은 목적하는 결과, 예를 들어 관심 중뇌 마커를 발현하는 중뇌 NSC 및/또는 중뇌 NPC의 생성을 달성하는 데 효과적인 농도로 배양 배지에서 사용된다. 적합한 효능제 및 길항제 작용제의 비제한적 예, 및 유효 농도 범위는 하기에 추가로 기재된다.
WNT 경로의 효능제는, Wnt-단백질 리간드가 프리즐드 패밀리 수용체에 결합함으로써 생물학적으로 활성화되는 정규 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 자극 (상향조절)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, WNT 경로 효능제는 글리코겐 신타제 키나제 3 (Gsk3) 억제제이다. 한 실시양태에서, WNT 경로 효능제는 CHIR99021, CHIR98014, SB 216763, SB 415286, LY2090314, 3F8, A 1070722, AR-A 014418, BIO, AZD1080, WNT3A, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, WNT 경로 효능제는 0.3-3.0 μM, 0.5-2.0 μM, 0.75-1.5 μM 또는 1.0-1.2 μM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, WNT 경로 효능제는 CHIR99021이다. 한 실시양태에서, WNT 경로 효능제는 CHIR99021이고, 이는 0.3-3.0 μM, 0.5-2.0 μM, 0.75-1.5 μM 또는 1.0-1.2 μM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, WNT 경로 효능제는 CHIR99021이고, 1.1 μM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
SHH (소닉 헤지호그) 경로의 효능제는, 패치드-1 (PTCH1) 수용체에 대한 SHH의 결합 및 스무슨드 (SMO) 막횡단 단백질을 통한 형질도입을 생물학적으로 수반하는 SHH 경로를 통한 신호전달을 자극 (활성화)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민, GSA 10, SAG, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 100-1000 nM, 200-800 nM, 250-750 nM 또는 500-600 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이고, 이는 100-1000 nM, 200-800 nM, 250-750 nM 또는 500-600 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이고, 이는 550 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
BMP (골 형태발생 단백질) 경로의 길항제는, 액티빈 수용체-유사 키나제 (ALK) (예를 들어, ALK2 및 ALK3을 포함하나 이에 제한되지는 않는 유형 I BMP 수용체)인 BMP 수용체 대한 BMP의 결합에 의해 생물학적으로 활성화되는 BMP 신호전달 경로를 억제 (하향조절)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189, DMH1, DMH2, 도르소모르핀, K02288, LDN214117, LDN212854, 폴리스타틴, ML347, 노긴, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 100-500 nM, 100-400 nM, 150-350 nM 또는 200-300 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이고, 100-500 nM, 100-400 nM, 150-350 nM 또는 200-300 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이고, 이는 275 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
AKT 경로의 길항제는, AKT1 (또한 PKB 또는 RacPK로 지정됨), AKT2 (또한 PKBβ 또는 RacPK-β로 지정됨) 및 AKT 3 (또한 PKBγ 또는 흉선종 바이러스 원종양유전자 3으로 지정됨)을 포함하는 세린/트레오닌 키나제 AKT 패밀리 구성원 중 1종 이상의 신호전달 경로를 억제 (하향조절)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206, GSK690693, 페리포신 (KRX-0401), 이파타세르팁 (GDC-0068), 카피바세르팁 (AZD5363), PF-04691502, AT 7867, 트리시리빈 (NSC154020), ARQ751, 미란세르팁 (ab235550), 보루세르팁, 세리세르팁, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 25-300 nM, 50-250 nM, 75-200 nM 또는 125-150 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206이다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206이고, 이는 25-300 nM, 50-250 nM, 75-200 nM 또는 125-150 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206이고, 이는 138 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)에서 배양 배지에 존재하는 AKT 경로 길항제는 단계 (b)에서 배양 배지에 존재하는 AKT 경로 길항제와 동일하다. 한 실시양태에서, 단계 (a)에서 배양 배지에 존재하는 AKT 경로 길항제는 단계 (b)에서 배양 배지에 존재하는 AKT 경로 길항제와 상이한 AKT 경로 길항제이다. 한 실시양태에서, 단계 (a) 및 단계 (b) 둘 다에서 배양 배지에 존재하는 AKT 경로 길항제는, 예를 들어 MK2206이며, 이는 두 단계 모두에서 25-300 nM, 50-250 nM, 75-200 nM 또는 125-150 nM 범위 내의 농도, 예컨대 두 단계 모두에서 138 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
MEK 경로의 길항제는 MAPK/ERK 경로 (Ras-Raf-MEK-ERK 경로로도 공지됨)의 성분 중 1종 이상의 신호전달 경로를 억제 (하향조절)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901, 비니메티닙 (MEK162), 코비메티닙 (XL518), 셀루메티닙, 트라메티닙 (GSK1120212), CI-1040 (PD-184352), 레파메티닙, ARRY-142886 (AZD-6244), PD98059, U0126, BI-847325, RO 5126766, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 25-300 nM, 50-250 nM, 75-200 nM 또는 100-120 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901이다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901이고, 이는 25-300 nM, 50-250 nM, 75-200 nM 또는 100-120 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901이고, 이는 110 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
RA 경로의 효능제는 올-트랜스 레티노산 및 9-시스 레티노산 둘 다에 의해 활성화되는 레티노산 수용체 (RAR)를 자극할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 3종의 RAR: RAR-알파, RAR-베타 및 RAR-감마가 있으며, 이들은 각각 RARA, RARB, RARG 유전자에 의해 코딩된다. 레티노산 경로를 활성화시킬 수 있는 상이한 레티노산 유사체가 합성되었다. 이러한 화합물의 비제한적 예는 TTNPB (RAR-알파, 베타 및 감마의 효능제), AM 580 (RAR알파 효능제), CD 1530 (강력하고 선택적인 RAR감마 효능제), CD 2314 (선택적 RAR베타 효능제), Ch 55 (강력한 RAR 효능제), BMS 753 (RAR알파-선택적 효능제), 타자로텐 (수용체-선택적 레티노이드; RAR-베타 및 -감마에 결합함), 이소트레티노인 (레티노산 수용체에 대한 내인성 효능제; 뉴런 분화의 유도제), 및 AC 261066 (RARβ2 효능제)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RA 신호전달 경로 효능제는 i) 레티노이드 화합물, ii) 레티노이드 X 수용체 (RXR) 효능제, 및 iii) 25 레티노산 수용체 (RAR) 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, RA 경로 효능제는 레티노산, Sr11237, 아다팔렌, EC23, 9-시스 레티노산, 13-시스 레티노산, 4-옥소 레티노산 및 올-트랜스 레티노산 (ATRA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 한 실시양태에서, RA 경로 효능제는 TTNPB, AM 580, CD 1530, CD 2314, Ch 55, BMS 753, 타자로텐, 이소트레티노인, AC 261066, 레티노산 (RA), Sr11237, 아다팔렌, EC23, 9-시스 레티노산, 13-시스 레티노산, 4-옥소 레티노산 및 올-트랜스 레티노산 (ATRA), 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, RA 경로 효능제는 5-500 nM, 25-250 nM, 10-100 nM 또는 25-75 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, RA 경로 효능제는 TTNPB이다. 한 실시양태에서, RA 경로 효능제는 TTNPB이고, 이는 5-500 nM, 25-250 nM, 10-100 nM 또는 25-75 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, RA 경로 효능제는 TTNPB이고, 이는 50 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
LXR (간 X 수용체) 경로의 효능제는, LXR의 레티노이드 X 수용체 (RXR)와의 이종이량체화 및 옥시스테롤에 의한 활성화를 생물학적으로 수반하는 LXR 경로를 통한 신호전달을 자극 (활성화)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, LXR 경로 효능제는 GW3965, T0901317, DMHCA, AZ876, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, LXR 경로 효능제는 100-1000 nM, 200-800 nM, 250-750 nM 또는 550-650 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, LXR 경로 효능제는 GW3965이다. 한 실시양태에서, LXR 경로 효능제는 GW3965이고, 이는 100-1000 nM, 200-800 nM, 250-750 nM 또는 550-650 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, LXR 경로 효능제는 GW3965이고, 이는 500 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
BMP (골 형태발생 단백질) 경로의 효능제는, 액티빈 수용체-유사 키나제 (ALK) (예를 들어, ALK2 및 ALK3을 포함하나 이에 제한되지는 않는 유형 I BMP 수용체)인 BMP 수용체에 대한 BMP의 결합에 의해 생물학적으로 활성화되는 BMP 신호전달 경로를 자극 (상향조절)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 효능제는 BMP, sb4, 벤트로모르핀 (예를 들어, 문헌 [Genthe et al. (2017) ACS Chem. Biol. 12:2436-2447]에 기재된 바와 같음), 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, BMP 경로 효능제는 1-100 ng/ml, 5-50 ng/ml, 10-25 ng/ml 또는 12.5-17.5 ng/ml의 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 효능제는 BMP7이다. 한 실시양태에서, BMP 경로 효능제는 BMP7이고, 이는 1-100 ng/ml, 5-50 ng/ml, 10-25 ng/ml 또는 12.5-17.5 ng/ml의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 효능제는 BMP7이고, 이는 방법의 단계 (b) (즉, 단계 2)에서 15 ng/ml의 농도로 배양 배지에 존재한다.
TGFβ (형질전환 성장 인자 베타) 경로의 길항제는 세린/트레오닌 키나제 수용체의 패밀리인 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 통한 신호전달을 억제 (하향조절)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01, SB-431542, GW788388, SB525334, TP0427736, RepSox, SD-208, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 100-500 nM, 200-400 nM, 250-350 nM 또는 275-325 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01이다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01이고, 100-500 nM, 200-400 nM, 250-350 nM 또는 275-325 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01이고, 이는 방법의 단계 (b) (즉, 단계 2)에서 300 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
mTOR (포유동물 라파마이신 표적) 경로의 길항제는, mTORC1 및 mTORC2 복합체의 코어 성분인 PI3K-관련 키나제 패밀리 구성원인 mTOR을 통한 신호전달을 억제 (하향조절)할 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 길항제는 AZD3147, 라파마이신, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스, 우미롤리무스, 조타롤리무스, 토린-1, 토린-2, 비스투세르팁, MHY1485, AZD8055, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 길항제는 5-100 nM, 5-50 nM, 10-30 nM 또는 10-20 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 길항제는 AZD3147이다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 길항제는 AZD3147이고, 이는 5-100 nM, 5-50 nM, 10-30 nM 또는 10-20 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 길항제는 AZD3147이고, 이는 방법의 단계 (b) (즉, 단계 2)에서 15 nM의 농도로 배양 배지에 존재한다.
III. 배양 조건
상기 서브섹션 II에 기재된 화학적으로-규정된 최적화된 배양 배지와 조합하여, 본 개시내용의 수임 MB NSC 및 MB NPC를 생성하는 방법은 세포 배양을 위해 관련 기술분야에 확립된 표준 배양 조건을 이용한다. 예를 들어, 세포는 37DegC 및 5% O2 및 5% CO2 조건 하에 배양될 수 있다. 세포는 표준 배양 용기 또는 플레이트, 예컨대 96-웰 플레이트에서 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 출발 만능 줄기 세포는 바람직하게는 세포외 매트릭스 물질, 예컨대 비트로넥틴으로 코팅된 플레이트에 부착된다. 한 실시양태에서, 줄기 세포는 비트로넥틴 코팅된 배양 표면 (예를 들어, 비트로넥틴 코팅된 96-웰 플레이트) 상에서 배양된다.
만능 줄기 세포는 분화 전에 상업적으로 입수가능한 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 분화 프로토콜의 시작 전에 에센셜 8 플렉스 배지 (써모 피셔 # A2858501)에서 적어도 1일 동안 배양될 수 있다. 비제한적 예시적 실시양태에서, 줄기 세포를 비트로넥틴 (써모 피셔 # A14700) 코팅된 96-웰 플레이트 상에서 150,000개 세포/cm2 밀도로 계대배양하고, 분화 전에 에센셜 8 플렉스 배지에서 1일 동안 배양한다.
분화 프로토콜을 시작하기 위해, 줄기 세포가 배양되는 배지를 상기 서브섹션 II에서 기재된 바와 같은 신호전달 경로 효능제 및/또는 길항제로 보충된 기초 분화 배지로 교체한다. 기초 분화 배지는, 예를 들어 세포 생존율 및 성장을 유지하는 데 필요한 추가의 표준 배양 배지 성분으로 보충되지만 혈청이 결여되거나 (기초 분화 배지는 무혈청 배지임) 또는 임의의 다른 외인적으로-첨가된 성장 인자, 예컨대 FGF2, PDGF, IGF 또는 HGF가 결여된 상업적으로 입수가능한 베이스를 포함할 수 있다. 비제한적 예시적 실시양태에서, 기초 분화 배지는 1x IMDM (써모 피셔 #12440046), 1x F12 (써모 피셔 #11765047), 1 mg/ml의 폴리(비닐 알콜) (시그마 #p8136), 1%의 화학적으로 규정된 지질 농축물 (써모 피셔 #11905031), 450 uM의 1-티오글리세롤 (시그마 #M6145), 0.7 ug/ml의 인슐린 (시그마 #11376497001) 및 15 ug/ml의 트랜스페린 (시그마 #10652202001) (본원에서 "CDM2" 배지로도 지칭됨, 도 16에 도시된 예시적인 분화 프로토콜에 사용된 바와 같음)을 함유한다.
배양 배지는 전형적으로 신선한 배지로 규칙적으로 교체된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 배지를 24시간마다 교체한다.
수임 MB NSC 및 MB NPC를 생성하기 위해, 줄기 세포를 수임 MB NSC- 또는 MB NPC-연관 마커의 세포 분화 및 발현에 충분한 시간 동안 최적화된 배양 배지에서 배양한다. 실시예에 기재된 바와 같이, 하나는 MB NSC의 생성을 위해 최적화되고 다른 하나는 MB NPC의 생성을 위해 최적화된 2-단계 방법에서의 만능 줄기 세포의 배양은 6일만큼 짧은 배양에서 MB NPC의 생성을 유도할 수 있으며, 제1 단계 (MB NSC를 유도함)에 대한 배양 기간은 제0일 내지 제3일이고, 제2 단계 (MB NPC를 유도함)에 대한 배양 기간은 제4일 내지 제6일인 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본원에서 "단계 (a)" 또는 "단계 1"로도 지칭되는 MB NSC를 생성하는 방법의 제1 단계에서, 만능 줄기 세포를 단계 1-최적화된 배양 배지에서 제0일-제3일에, 또는 제0일에 시작하여 제3일까지, 또는 72시간 (3일) 동안, 또는 적어도 60시간, 또는 적어도 64시간, 또는 적어도 68시간, 또는 적어도 70시간, 또는 적어도 72시간 동안, 또는 60시간 동안, 또는 64시간 동안, 또는 68시간 동안, 또는 70시간 동안 또는 72시간 동안 계속하여 배양한다.
따라서, 본원에서 "단계 (b)" 또는 "단계 2"로도 지칭되는 MB NPC를 생성하는 방법의 제2 단계에서, 단계 (a)에서 생성된 MB NSC를 단계 2-최적화된 배양 배지에서 제4일-제6일에, 또는 제4일에 시작하여 제6일까지 계속하여, 또는 제4일에 시작하여 72시간 (3일) 동안 계속하여, 또는 제4일에 시작하여 적어도 60시간, 또는 적어도 64시간, 또는 적어도 68시간, 또는 적어도 70시간, 또는 적어도 72시간 동안 계속하여, 또는 제4일에 시작하여 60시간, 또는 64시간, 또는 68시간, 또는 70시간 또는 72시간 동안 계속하여 추가로 배양한다.
IV. 용도
수임 MB NSC 및 MB NPC를 생성하기 위한 본 개시내용의 방법 및 조성물은 다양한 용도를 위한 이들 세포 집단의 효율적이고 강건한 이용가능성을 허용한다. 예를 들어, 방법 및 조성물은 중뇌 신경 전구세포 발생 및 생물학, 예컨대 도파민성 뉴런으로의 분화의 연구에 사용되어 뉴런 질환 및 장애, 예컨대 파킨슨병의 이해 및 잠재적 치료를 보조할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법을 사용하여 생성된 수임 MB NSC 및/또는 MB NPC는 세포 상에서 발현된 표면 마커에 결합하는 작용제를 사용하여 관련 기술분야에 확립된 방법에 따라 추가로 정제될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 수임 중뇌 신경 줄기 세포 (수임 MB NSC) 또는 중뇌 신경 전구 세포 (MB NPC)를 단리하는 방법을 제공한다:
본 개시내용의 방법에 의해 생성된 MP NSC 또는 MP NPC를 MB NSC 또는 MB NPC에 의해 발현된 세포 표면 마커에 결합하는 적어도 1종의 결합제와 접촉시키는 단계; 및
결합제에 결합하는 세포를 단리하여 MB NSC 또는 MB NPC를 단리하는 단계.
한 실시양태에서, 결합제는 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 (mAb)이다. 항체에 결합하는 세포는, 형광 활성화 세포-분류 (FACS) 및 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 단리될 수 있다.
중뇌 도파민성 신경 계통의 전구세포는 또한 파킨슨병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 세포를 전달하는 것을 통한 신경 질환 및 장애의 치료에 사용하기 위해 고려된다.
V. 조성물
다른 측면에서, 본 개시내용은 배양 배지 및 세포 배양물, 뿐만 아니라 단리된 전구 세포 및 세포 집단을 포함하는, 수임 MB NSC 및 MB NPC를 생성하는 방법과 관련된 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은, WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된, 인간 수임 중뇌 신경 줄기 세포를 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGF-β 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된, 인간 중뇌 신경 전구 세포를 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ LMX1A+ 수임 중뇌 신경 줄기 세포를 포함하는, 인간 수임 중뇌 신경 줄기 세포의 단리된 세포 배양물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGF-β 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 신경 전구 세포를 포함하는, 인간 중뇌 신경 전구 세포의 단리된 세포 배양물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 신경 전구 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 인간 중뇌 NPC는 OTX2, FOXA2 및 LMX1A를 발현하고, GBX2의 발현이 결여되거나 또는 단지 낮은 수준의 발현을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 적어도 1 x 106 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 인간 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 포함하는 인간 중뇌 NPC의 단리된 세포 집단에 관한 것이며, 여기서 세포 집단은 GBX2-발현 신경 줄기 세포가 결여되어 있다. 단리된 세포 집단의 한 실시양태에서, 인간 중뇌 NPC는 인간 중뇌 NPC에 의해 발현되는 적어도 1종의 마커에 결합하는 적어도 1종의 항체와 결합된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: FOXA2 및 LMX1A를 발현하는 줄기 세포-유래 중뇌 신경 전구세포의 생성을 위한 배양 프로토콜 개발
본 실시예에서, 배양 6일 후 인간 만능 줄기 세포를 FOXA2 및 LMX1A를 발현하는 전구세포로 안내할 수 있는, 중뇌-유래 신경 전구세포의 생성을 위한 2-단계 배양 프로토콜을 개발하였다. 이들 세포는 성숙 도파민성 뉴런으로 추가로 분화될 수 있다.
본 실시예는 이전에 문헌 [Bukys et al. (2020) Iscience 23:101346]에 기재된 바와 같은 고차원 실험 설계 (HD-DoE)의 방법을 이용한다. 방법은, 다중 공정 입력을 동시에 시험하고 깊은 이펙터/반응 공간의 수학적 모델링을 제공하는 컴퓨터화된 설계 기하구조를 사용한다. 방법은, 예컨대 세포 분화 동안 복잡한 과정을 제어하는 조합 신호전달 입력을 발견하는 것을 허용한다. 이는 다수의 타당한 중요한 공정 파라미터의 시험을 허용하는데, 이는 이러한 파라미터가 출력 반응, 예컨대 유전자 발현에 영향을 미치기 때문이다. 유전자 발현이, 예를 들어 인간 세포의 표현형의 특징적 특색을 제공하기 때문에, 방법은 어느 신호전달 경로가 세포 운명을 제어하는지를 확인하고 이해하는 데 적용될 수 있다. 본 실시예에서, HD-DOE 방법은 만능 줄기 세포 상태로부터 직접 중뇌 신경 전구세포-발현 유전자의 유도를 위한 조건을 발견하기 위한 의도로 적용되었다.
각각의 단계에 대한 레시피를 개발하기 위해, 3-일 처리 후의 53종의 미리-선택된 유전자의 2개의 세트의 발현에 대한 다중 신호전달 경로의 효능제 및 길항제 (본원에서 "이펙터"로 지칭됨)의 영향을 시험하고 모델링하였다. 이들 이펙터는 줄기 세포의 특정 운명으로의 단계적 분화 동안 통상적으로 사용되는 소분자 또는 단백질이다. 시험할 이펙터의 선택은 발달 중인 뇌의 중뇌 영역에서의 신경 유도 및 줄기 세포의 신경 전구세포로의 분화에 대한 현행 문헌에 기초하였다.
이펙터를 시험하기 위해, 소정 범위의 농도에서 48개 이상의 상이한 이펙터 조합에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있는 적어도 8종의 인자를 사용한 실험을 설계하였다. 모델을 분석하기 위해, 본 발명자들은 OTX2, DMBX1, FOXA2, LMX1A를 비롯한 중뇌 영역에서 발현되는 유전자의 발현, 및 후뇌 마커인 GBX2의 부재에 초점을 맞추었다. 유전자 발현 수준에 대한 각각의 이펙터의 영향은 모델링 동안 각각의 이펙터에 대해 계산된 인자 기여도로 불리는 파라미터에 의해 규정된다.
분화의 단계 1의 레시피를 확인하기 위해, 세포를 다양한 이펙터로 3일 동안 처리하고, 세포의 유전자 발현을 모델링하였다. 구체적으로, 한 모델은 12760.1의 OTX2의 최대 발현에 대해 최적화될 때 DMBX1, LMX1A 및 OTX2의 상향조절 및 GBX2의 하향조절에 대한 유망한 결과를 나타냈다. 이 모델은 LDN193189, PD173074, BLU9931, 푸르모르파민, SC79, MK2206, ZM336372, PD0325901, CHIR99021, XAV939, UCLA-gp130, 토파시티닙 및 GO 6983을 포함하는 13종의 인자로 이루어졌다. 이펙터 중 4종, AKT 신호전달 경로의 길항제인 MK2206, MEK 신호전달 경로의 길항제인 PD0325901, WNT 신호전달 경로의 효능제인 CHIR99021 및 BMP 신호전달 경로의 길항제인 LDN193189는 각각 22.3, 18.1, 13.5 및 11.9 인자 기여도로 관심 유전자의 발현에 대해 유의한 긍정적 영향을 가졌다 (도 1).
FOXA2는 OTX2의 최적화로 상향조절되지 않았기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 1581의 FOXA2의 최대 발현에 대해 모델을 최적화하였다. 각각 13.6, 15.6 및 22.2 인자 기여도를 갖는 LDN193189, CHIR99021 및 푸르모르파민을 포함한, FOXA2의 발현에 대해 유의한 긍적적 효과를 갖는 3종의 이펙터가 확인되었다 (도 2). LDN193189 및 CHIR99021은 최적화 설정 둘 다에서 공통적이고, 푸르모르파민을 제외한 나머지 인자는 10 미만의 인자 기여도를 갖는다. 따라서, 본 발명자들은 원래의 4종의 이펙터에 대한 푸르모르파민의 첨가의 영향에 초점을 맞추었다.
OTX2, DMBX1, LMX1A 및 FOXA2의 발현에 초점을 맞춘 모델의 동적 프로파일 분석을 통해 이러한 평가를 수행하였다 (도 3). 푸르모르파민은 이전 설정에서 OTX2, DMBX1 및 LMX1A의 발현에 긍정적 영향을 미치지 않았기 때문에, 본 발명자들은 유전자의 발현 수준의 하락을 예상하였으나, 그의 발현 수준은 DMBX1, LMX1A 및 OTX2에 대해 각각 3000, 450 및 11000으로 이전 조건과 동일한 부근에 머물렀음이 관찰되었다 (도 4).
프로토콜의 단계 1 (중뇌 수임 신경 줄기 세포 생성)에 대해 검증된 이펙터를 하기 표 1에 요약한다:
표 1: 프로토콜의 단계 1에서 검증된 이펙터
Figure pct00001
단계 2에서 중뇌-수임 신경 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화를 추가로 안내하기 위해, 본 발명자들은 추가의 HD-DoE 실험을 수행하였다. 그에 의해, 본 발명자들은 분화 프로토콜의 제조에 사용된 추가의 유전자 조절 모델을 수득하였다. 이것의 기초는 단계 1 처리의 종결 후 추가의 3일 동안 중뇌 신경 전구 세포로의 세포의 분화의 개시에 초점을 맞춘 12-인자 HD-DoE 실험이었다. 여기서, 본 발명자들은 GBX2의 발현이 낮거나 0인 신경 전구 세포에서의 LMX1A 및 FOXA2의 발현에 초점을 맞추었다. LMX1A는 47888의 값으로 모델에서 유의하게 높은 발현 수준을 가졌다. 따라서, 본 발명자들은 양성 인자를 확인하기 위해 이 유전자에 대한 최적화 설정을 사용하였다. 본 실험에서의 인자는 SC79, MK2206, ZM336372, PD0325901, CHIR99021, A 83-01, TTNPB, AGN193109, GW3965, SR9243, 푸르모르파민 및 GSI-XX를 포함하였다. LMX1A에 대해 최적화될 때, RA 신호전달 경로의 소분자 효능제인 한 인자 TTNPB는 19.5의 인자 기여도로 유의한 긍정적 영향을 가졌다. CHIR99021, SC79 및 GW3965 또한 긍정적 영향을 가졌지만, 그의 인자 기여도는 10 미만이었고 (각각 8.3,7.3 및 5.4), AGN193109는 <1의 양성 인자 기여도를 가졌다 (도 5).
동일한 실험이 33193의 FOXA2의 최대 발현에 대해 최적화되었을 때, 10.7, 6.7 및 15.3 인자 기여도를 갖는 TTNPB, A 83-01 및 푸르모르파민을 포함한, FOXA2의 발현에 대해 유의한 긍정적 영향을 갖는 3종의 이펙터가 확인되었다 (도 6).
단계 1의 실험 모델과 유사하게, 분석은 다시 푸르모르파민이 FOXA2 발현 수준에 대해 긍정적 효과 및 LMX1A 발현 수준에 대해 26.2의 인자 기여도로 부정적 효과를 가졌음을 나타냈다. 모델은 또한 A 83-01 및 CHIR99021에 대해 동일한 경향을 나타냈고, 각각 FOXA2 및 LMX1A에 대해서만 긍정적 영향이 있었다. 따라서, 본 발명자들은 동적 프로파일 분석을 사용하여 LMX1A 및 FOXA2 유전자 둘 다의 최적화된 발현 및 GBX2의 최소 발현에 대한 레시피를 조정하였다 (도 7). 푸르모르파민의 첨가 없이도 FOXA2의 발현 수준이 5000이었으며, 따라서 이러한 이펙터의 포함은 필수적이지 않지만, FOXA2의 발현을 개선시킬 수 있는 것으로 관찰되었다. 동적 프로파일 플롯에 기초하여, CHIR99021이 LMX1A에 대해 긍정적 효과를 갖더라도, 이는 또한 GBX2의 발현 수준을 증가시키고 FOXA2의 상대 발현을 감소시키므로, 상기 인자가 최종 레시피에서 제거되었다고 또한 결론지었다. A 83-01은 최종 레시피에 포함된 FOXA2 및 LMX1A에 대한 반대 효과를 갖는 또 다른 인자였다. 동적 프로파일 분석은 중간 농도 (300 nM)의 A 83-01의 첨가가 FOXA2의 발현을 개선할 수 있고 GBX2의 수준을 거의 0으로 감소시키는 것을 도울 수 있다는 것을 나타냈다.
중뇌 분화 프로토콜에서 상용적으로 사용되는 FGF8과 같은 추가의 인자를 시험하기 위해, 본 발명자들은 LDN193189, BMP7, A 83-01, 액티빈 A, 타키닙, PD0325901, MK2206, FGF8b, AZD3147, MHY1485, GSI-XX 및 Yhhu 3792로 구성된 또 다른 12-인자 실험을 실행하였다. 이전 실험과 유사하게, hiPSC를 단계 1 배지로 3일 동안 처리한 후, 96개의 인자 조합 조건으로 추가 3일 동안 처리하였다. 이러한 모델이 FOXA2의 최대 발현에 대해 최적화되었을 때, 13.7의 인자 기여도를 갖는 BMP7 및 14.2의 인자 기여도를 갖는 MK2206이 그의 발현에 가장 큰 영향을 미쳤고, 이어서 AZD 3147이 10.9의 인자 기여도를 가졌다. Yhhu 3792 및 타키닙 또한 긍정적 영향을 가졌만, 인자 기여도는 10 미만이었다. 놀랍게도, FGF8은 12.8의 인자 기여도로 부정적 영향을 가졌다 (도 8).
이 모델은 또한 LMX1A의 최대 발현에 대해 최적화되었고, 12의 인자 기여도를 갖는 MK2206이 가장 높은 긍정적 영향을 가졌다. AZD 3147, GSI-XX, 액티빈 A 및 타키닙 또한 그의 발현에 긍정적 영향을 가졌지만, 인자 기여도는 10 미만이었다 (도 9). 모델은 Yhhu 3792가 11.7의 인자 기여도로 LMX1A의 발현에 부정적 영향을 가졌음을 나타냈고, 이는 FOXA2 조건과 반대이다. 또 다른 차이는 LMX1A에 부정적 영향을 미치는 BMP7이었다. 그러나, 인자 기여도는 10 미만이다. 따라서, 인자와 FOXA2 및 LMX1A 양쪽 모두의 발현에 대한 최적 조건 사이의 상호작용의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 동적 프로파일 분석을 사용하였다 (도 10).
동적 프로파일 분석을 사용하여, 본 발명자들은 GSI-XX, 액티빈 A 및 타키닙을 제거하였는데, 이들이 FOXA2 및 LMX1A 양쪽 모두 발현 수준에서 의미있는 긍정적 변화를 일으키지 않았기 때문이다. Yhhu 3792 또한 LMX1A에 대해 상당한 부정적 효과 및 GBX2에 대해 상당한 긍정적 효과를 갖기 때문에 제거되었다. BMP7 및 AZD 3147은 각각 FOXA2 및 LMX1A에 대해 유의한 긍정적 영향을 가졌지만, 다른 유전자의 발현은 감소시키지 않았고, 따라서 이들은 최종 레시피에 포함되었다. 또한, MK2206이 LMX1A의 수준을 감소시키더라도, 이는 FOXA2 및 GBX2에 대해 바람직한 영향을 미치며, 따라서 이는 중간 수준으로 최종 레시피에 포함되는 것으로 나타났다.
프로토콜의 단계 2 (중뇌-유래 신경 전구 세포 생성)에 대해 검증된 이펙터는 하기 표 2에 요약된다:
표 2: 프로토콜의 단계 2에서 검증된 이펙터
Figure pct00002
두 모델을 고려하여, 신경 전구 세포 동일성을 갖는 중뇌 영역으로의 세포의 분화를 최대화하는 조건은 OTX2, FOXA2 및 LMX1A의 강건하고 상승된 발현과 관련되어 하기 이펙터 입력을 포함하였다: TTNPB, BMP7, A 83-01, GW3965, AZD 3147 및 MK2206.
단계 1 및 단계 2 프로토콜에 대한 각각의 개별적인 검증된 이펙터의 중요도를 실시예 2에 기재된 바와 같이 추가로 평가하였다.
실시예 2: 줄기 세포 유래 중뇌 신경 전구세포-유도 배양 조건의 인자 중요도 분석
각각의 검증된 인자의 제거의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 동적 프로파일 분석을 사용하고, 다른 것들이 존재하는 동안 각각의 최종 인자의 부재 하에 관심 유전자의 발현 수준을 비교하였다. 관심 유전자의 발현 수준이 원하는 결과에 도달가능할지 여부를 밝혀내기 때문에, 이러한 인자 중요도 분석은 각각의 입력 이펙터의 중요성의 정도를 밝혀냈다.
단계 1 레시피에서, 다른 4종의 인자가 존재하는 동안 5종의 최종 인자 각각을 제거하고, OTX2, DMBX1, FOXA2 및 LMX1A의 발현 수준을 5종의 인자 모두의 존재 하의 수준과 비교하여 평가하였다 (도 11a-b). MK2206이 제거되었을 때, OTX2 및 DMBX1 값은 각각 12000 및 3000에서 9500 및 1500으로 감소한 반면에, FOXA2 및 LMX1A는 동일하게 유지되었다. PD0325901의 부재는 DMBX1의 감소된 발현을 초래하였고, 이는 900에 도달한 한편, FOXA2 및 LMX1A의 발현은 600 및 300에서 700 및 500으로 증가하였다. DMBX1의 발현 수준은 LDN193189의 부재 하에 증가하였지만, OTX2, FOXA2 및 LMX1A의 값은 감소하였다. 모든 관심 유전자의 값이 CHIR99021을 제거한 후에 감소되었고, 이는 단계 1 레시피에서의 그의 중요성을 추가로 증명하였고, 예상된 바와 같이, 푸르모르파민의 부재는 FOXA2의 감소로 이어지는 한편, 다른 유전자에 대해서는 유익하였다.
단계 2 레시피에서, 6종의 최종 인자 각각을 제거한 한편, 다른 5종의 인자는 존재하였고, FOXA2, LMX1A 및 GBX2의 발현 수준을 모든 인자의 존재 하의 수준과 비교하여 평가하였다. 제1 실험 모델에 따르면, TTNPB의 부재는 GBX2 발현의 상승으로 이어지는 반면에, FOXA2 및 LMX1A의 값은 각각 10,000에서 0으로 및 30,000에서 15,000으로 극적으로 감소하였다. A 83-01의 부재는 FOXA2의 발현을 10,000에서 7000으로 감소시켰지만, 예상된 바와 같이, LMX1A의 값은 30,000에서 40,000으로 증가하였다. GW3965의 결실은 LMX1A의 값을 30,000에서 10,000으로 극적으로 감소시켰고, FOXA2의 값을 17,000으로 증가시켰다 (도 12a-b). 제2 실험 모델에 따르면, BMP7 및 MK2206 둘 다의 부재는 FOXA2의 수준을 감소시킨 한편, LMX1A의 값을 증가시켰고, 여기서 BMP7은 FOXA2의 발현을 유도하는 주요 이펙터였다. AZD 3147의 부재는 FOXA2의 값에 거의 영향을 미치지 않으면서 LMX1A의 수준을 4000에서 2000으로 감소시켰고 (도 13a-b), 따라서 이들 인자를 최종 레시피에 추가하였다.
실시예 3: FOXA2 및 LMX1A를 발현하는 줄기 세포-유래 중뇌 신경 전구세포의 면역세포화학 검증
실시예 1에 기재된 바와 같이 개발된 배양 프로토콜을 추가로 검증하기 위해, 세포를 단계 1 및 단계 2 분화 배지로 처리하고, 면역세포화학을 사용하여 각 단계의 종료 시 중뇌 영역 및 신경 전구세포의 바이오마커의 발현을 평가하였다. 시험된 바이오마커는 중뇌의 위치설정 및 중뇌-후뇌 경계의 유지에 수반되는 중간뇌 마커인 OTX2 (문헌 [Vernay et al. (2005) J. Neurosci. 25:4856-4867]), 중뇌 도파민성 전구세포의 생성 및 분화에 수반되는 LMX1A (문헌 [Yan et al. (2011) J. Neurosci. 31:12413-12425]), 발달의 초기 및 후기 단계에서 중뇌 도파민성 뉴런의 생성을 조절하는 FOXA2 (문헌 [Ferri et al. (2007) Development 134:2761-2769), 중뇌 및 전방 후뇌에서 발현되는 PAX2 (문헌 [Urbanek et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5703-5708]), 초기 뉴런 마커인 네스틴, 증식 마커인 KI67, 및 후뇌 마커인 GBX2를 포함하였다.
면역세포화학 영상은 단계 1 배지로의 처리 종료 시까지 90% 초과의 세포에서 OTX2 및 LMX1A의 발현을 확인하였다. 마커 PAX2, 네스틴 및 KI67이 일부 세포에서 관찰되었고, GBX2의 일부 발현도 관찰되었다. 그러나, FOXA2는 발현되지 않았다 (도 14). 단계 2 배지로의 처리 후, 본 발명자들은 LMX1A 및 OTX2의 발현이 유지된 반면에, FOXA2의 발현은 유의하게 증가하였고, 세포의 90% 초과에서 FOXA2가 검출되었음을 관찰하였다. GBX2 발현은 또한 단계 2의 종료까지 거의 제거되었다 (도 15). 분화의 단계 2의 종료까지 OTX2, LMX1A 및 FOXA2의 검출 (GBX2는 검출되지 않았음)은 6-일 처리 후 인간 유도된 만능 줄기 세포의 중뇌 신경 전구세포로의 분화의 단계 1 및 단계 2에 대한 레시피를 확증하였다.
실시예 4: LMX1A 및 FOXA2를 발현하는 줄기 세포-유래 중뇌 신경 전구세포의 RNA-seq 검증
RNA 서열분석을 사용하여 후보 레시피에서 배양된 세포의 유전자 프로파일을 수득하였다. 인간 iPSC를 단계 1 및 2 배지에서 총 6일 동안 배양하고, 생성된 세포의 RNA를 각각의 단계의 종료 시에 서열분석하였다. 도 17은 발달 중인 뇌의 중뇌 영역 (OTX2, DMBX1, FOXA2, LMX1A), 초기 신경 정체성 (네스틴, SOX1, SOX2, 비멘틴) 및 줄기 세포 상태 (NANOG, POU5F1)를 대표하는 선택된 유전자의 정규화된 발현 수준을 제0일, 제3일 및 제6일에 3회 반복하여 나타낸다. 도 17a 및 도 17b에 나타낸 바와 같이, 줄기 세포 유전자의 수준은 신경 전구세포에서 감소한 반면에, 중뇌 영역으로부터 기원하는 뉴런 유전자의 수준은 증가하였고; 이는 hiPSC의 중뇌 정체성을 갖는 신경 계통으로의 분화를 입증한다. 도 17a는 단계 0과 비교하여 단계 1 배지로의 3일 처리 후 19종의 선택된 유전자의 배수 변화를 보여주고; FOXA2, LMX1A 및 SOX1은 hiPSC와 비교하여 가장 높은 양성 차등 발현 수준 (각각 10.6, 9.5 및 9.1)을 갖는다. 줄기세포성 유전자 NANOG 및 POU5F1, 및 또한 후뇌 유전자 GBX2는 최저 수준 (각각 -8.7, -3.5 및 -3.8)이다. 도 17b는 hiPSC와 비교하여 단계 1 및 단계 2 배지로 처리된 세포의 21종의 선택된 유전자의 변화 배수를 나타낸다. FOXA2, SOX1 및 DDC는 11.3, 10 및 7.7로 가장 높은 양성 차등 발현을 갖는다. 단계 1과 유사하게, 최저 차등 발현이 NANOG, POUF51 및 GBX2에서 관찰되었다. 제0일의 hiPSC 및 제6일의 MB 신경 전구세포의 18종의 선택된 유전자의 규모화된 유전자 프로파일의 열지도 (도 17c)는 DDC, LMX1A/B, SOX6, NEUROG2, FOXA2 및 EN1을 비롯한 중뇌 전구세포 유전자의 발현이 단계 1 및 2 배지로 처리한 후에 증가하였음을 나타낸다. 신경교 세포에서 발현되는 유전자인 GFAP의 발현 수준이 또한 관찰되었고, 6-일 분화 동안 동일하게 유지되었으며, 이는 배양물이 주로 뉴런임을 나타낸다. 이 데이터는, 세포를 중뇌 뉴런 정체성으로 향하게 하는 단계별 분화 배지로서의 단계 1 및 단계 2 레시피의 능력을 입증한다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (43)

  1. 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 생성하는 방법으로서,
    (a) 인간 만능 줄기 세포를, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여되고 WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 제0일-제3일에 배양하여, 수임 중뇌 신경 줄기 세포 (NSC)를 수득하는 단계; 및
    (b) 수임 중뇌 NSC를, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여되고 BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGFβ 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 제4일-제6일에 배양하여, 배양 제6일에 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 NPC를 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인간 만능 줄기 세포가 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 만능 줄기 세포가 배양 동안 비트로넥틴-코팅된 플레이트에 부착되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, WNT 경로 효능제가 CHIR99021, CHIR98014, SB 216763, SB 415286, LY2090314, 3F8, A 1070722, AR-A 014418, BIO, AZD1080, WNT3A 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, WNT 경로 효능제가 0.5-2.0 μM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, WNT 경로 효능제가 CHIR99021이고, 이는 단계 (a) 및 (b)에서 1.1 μM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, SHH 경로 효능제가 푸르모르파민, GSA 10, SAG 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, SHH 경로 효능제가 200-800 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, SHH 경로 효능제가 푸르모르파민이고, 이는 550 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 경로 길항제가 LDN193189, DMH1, DMH2, 도르소모르핀, K02288, LDN214117, LDN212854, 폴리스타틴, ML347, 노긴 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, BMP 경로 길항제가 100-500 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, BMP 경로 길항제가 LDN193189이고, 이는 275 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AKT 경로 길항제가 MK2206, GSK690693, 페리포신 (KRX-0401), 이파타세르팁 (GDC-0068), 카피바세르팁 (AZD5363), PF-04691502, AT 7867, 트리시리빈 (NSC154020), ARQ751, 미란세르팁 (ab235550), 보루세르팁, 세리세르팁 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, AKT 경로 길항제가 25-300 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, AKT 경로 길항제가 MK2206이고, 이는 단계 (a)에서 138 nM 및 단계 (b)에서 50 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, MEK 경로 길항제가 PD0325901, 비니메티닙 (MEK162), 코비메티닙 (XL518), 셀루메티닙, 트라메티닙 (GSK1120212), CI-1040 (PD-184352), 레파메티닙, ARRY-142886 (AZD-6244), PD98059, U0126, BI-847325, RO 5126766 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, MEK 경로 길항제가 25-300 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, MEK 경로 길항제가 PD0325901이고, 이는 110 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 경로 효능제가 BMP, sb4, 벤트로모르핀 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, BMP 경로 효능제가 10-25 ng/ml 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, BMP 경로 효능제가 BMP7이고, 이는 15 ng/ml의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, RA 경로 효능제가 TTNPB, AM 580, CD 1530, CD 2314, Ch 55, BMS 753, 타자로텐, 이소트레티노인, AC 261066, 레티노산 (RA), Sr11237, 아다팔렌, EC23, 9-시스 레티노산, 13-시스 레티노산, 4-옥소 레티노산, 올-트랜스 레티노산 (ATRA) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, RA 경로 효능제가 10-100 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, RA 경로 효능제가 TTNPB이고, 이는 50 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, LXR 경로 효능제가 GW3965, T0901317, DMHCA, AZ876 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, LXR 경로 효능제가 250-750 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, LXR 경로 효능제가 GW3965이고, 이는 500 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mTOR 경로 길항제가 AZD3147, 라파마이신, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스, 우미롤리무스, 조타롤리무스, 토린-1, 토린-2, 비스투세르팁, MHY1485, AZD8055 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, mTOR 경로 길항제가 10-30 nM 범위 내의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, mTOR 경로 길항제가 AZD3147이고, 이는 15 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TGFβ 경로 길항제가 A 83-01, SB-431542, GW788388, SB525334, TP0427736, RepSox, SD-208 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, TGFβ 경로 길항제가 100-500 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, TGFβ 경로 길항제가 A 83-01이고, 이는 단계 (b)에서 300 nM의 농도로 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  35. 인간 OTX2+ LMX1A+ 수임 중뇌 신경 줄기 세포 (NSC)를 생성하는 방법으로서,
    인간 만능 줄기 세포를, 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여되고 WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 제0일-제3일에 배양하여, 배양 제3일에 OTX2+ LMX1A+ 수임 중뇌 NSC를 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
  36. WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된, 인간 수임 중뇌 신경 줄기 세포를 수득하기 위한 배양 배지.
  37. BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGFβ 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된, 인간 중뇌 신경 전구 세포를 수득하기 위한 배양 배지.
  38. 인간 수임 중뇌 신경 줄기 세포의 단리된 세포 배양물로서, 배양물이, WNT 경로 효능제, SHH 경로 효능제, BMP 경로 길항제, AKT 경로 길항제 및 MEK 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ LMX1A+ 수임 중뇌 신경 줄기 세포를 포함하는 것인 배양물.
  39. 인간 중뇌 신경 전구 세포의 단리된 세포 배양물로서, 배양물이, BMP 경로 효능제, RA 경로 효능제, LXR 경로 효능제, AKT 경로 길항제, mTOR 경로 길항제 및 TGFβ 경로 길항제를 포함하고 외인적으로-첨가된 성장 인자가 결여된 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 신경 전구 세포를 포함하는 것인 배양물.
  40. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 인간 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 중뇌 신경 전구 세포.
  41. 인간 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 포함하는 조성물로서, 여기서 인간 중뇌 NPC는 OTX2, FOXA2 및 LMX1A를 발현하고, GBX2의 발현이 결여된 것인 조성물.
  42. 적어도 1 x 106 OTX2+ FOXA2+ LMX1A+ 인간 중뇌 신경 전구 세포 (NPC)를 포함하는 인간 중뇌 NPC의 단리된 세포 집단으로서, 여기서 세포 집단은 GBX2-발현 신경 줄기 세포가 결여된 것인 단리된 세포 집단.
  43. 제42항에 있어서, 인간 중뇌 NPC가 인간 중뇌 NPC에 의해 발현되는 적어도 1종의 마커에 결합하는 적어도 1종의 항체와 결합된 것인 단리된 세포 집단.
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