CN117660585A - 一种发酵酒产酸菌的鉴别培养基及产酸菌检测方法和应用 - Google Patents
一种发酵酒产酸菌的鉴别培养基及产酸菌检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物检测技术领域，公开了一种发酵酒产酸菌的鉴别培养基及产酸菌检测方法和应用。本发明的鉴别培养基包括：发酵酒，蛋白胨，牛肉浸粉，酵母浸粉，磷酸氢二钾，乙酸钠，枸橼酸三铵，硫酸镁，硫酸锰，吐温‑80，葡萄糖，琼脂，复合氨基酸，核苷酸，碳酸钙和无水乙醇。本发明的鉴别培养基所提供的培养环境更有利于微生物繁殖生长，在同等程度下，产酸菌的检测效率能够提高1‑2倍。本发明能够在发酵酒后熟陈酿过程中及时准确地监控到后熟陈酿过程中的发酵酒的卫生质量情况，为酒体在风味、体态及指标的变化提供判断依据。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种发酵酒产酸菌的鉴别培养基及产酸菌检测方法和应用。
背景技术
传统酿造酒生产陈化过程中，会面临发酵酒升酸的质量波动，但是只有发酵酒酸败微生物大量繁殖并产生代谢产物后才可能检测到总酸、pH值的变化，其中部分微生物在常规培养基中难以培养，常规方法无法快速识别。
在微生物检测培养基和方法的报道中，中国发明专利文献CN201610831433.0《复合微生态制剂中乳酸菌检测用培养基及检测方法》公开了一种复合微生态制剂中乳酸菌检测用培养基及检测方法，其培养基按质量份数计包括如下组分：胰蛋白胨10-15、牛肉浸粉5-10、酵母浸粉5-8、葡萄糖5-20、硫酸镁0.1-0.3、乙酸钠3-5、柠檬酸铵10-20、硫酸锰0.05-0.1、吐温-80 1-5、琼脂粉15-20、蒸馏水1000，pH5.0-5.8，通过控制pH抑制芽孢杆菌，来突出乳酸菌生长。但是，在已经产酸的发酵酒培养出的微生物镜检时发现部分产酸菌为芽孢杆菌，该培养基及检测方法却无法识别，该专利并不适用于发酵酒领域。中国发明专利文献CN201811113012.X《一种料酒中产气菌的培养基和检测方法》公开了一种料酒中产气菌的培养基和检测方法，具体将待测料酒样品稀释，然后接种入含有培养基的发酵管中，在30℃±1℃条件下培养48±2h后，根据发酵管的产气与否来检测产气菌；培养基由以下重量份的原料组成：蔗糖10-30份，酵母膏3-6份，蛋白胨4-10份，氯化钠3-10份，黄酒2-8份，吐温-801-2份，巯基乙酸钠0.05-1份，七水硫酸镁0.2-0.6份，甲硫氨酸0.01～0.1份，半胱氨酸0.01-0.2份，蒸馏水1000份。然而，该专利仅仅对料酒中产气菌有一定效果，并不适合发酵酒陈酿过程中产酸微生物的检测。中国发明专利文献CN202010585358.0《一种用于检测食品中难培养型乳酸菌的培养基以及检测方法》公开了一种用于检测食品中难培养型乳酸菌的培养基以及检测方法，所述培养基的配方为：糖类物质10-40重量份，蛋白胨5-15重量份，酵母膏粉2-6重量份，牛肉膏粉5-15重量份，磷酸氢二钾1-3重量份，柠檬酸三铵1-3重量份，乙酸钠2.5-7.5重量份，硫酸镁0.1-0.3重量份，硫酸锰0.02-0.06重量份，吐温-80 0.5-1.5重量份，可溶性淀粉0.5-1.5重量份，产酸代谢促进因子0.2-2重量份(七水合硫酸亚铁和/或六水合氯化镍)，未受污染的样品过滤清液100-500重量份，补加蒸馏水至1000重量份，pH值调节为4-5.5；但是，该专利只能够确定腐败乳酸菌是否存在，即仅能定性判断，无法对腐败乳酸菌含量多少进行检测；且无法针对性地对产酸菌进行检测。
可见，目前暂无关于发酵酒陈酿过程产酸菌的有效鉴别方法。为确保储存发酵酒陈酿过程的品质，亟需通过优化选择性培养基来实现发酵酒中产酸菌的鉴定及其含量检测，以给发酵酒的产酸菌污染带来一种新的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种发酵酒产酸菌的鉴别培养基及产酸菌检测方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种发酵酒产酸菌的鉴别培养基，按重量计，每1000mL所述培养基包括以下组分：
所述发酵酒100mL-400mL，蛋白胨8.0g-12.0g，牛肉浸粉8.0g-12.0g，酵母浸粉1.5g-2.5g，磷酸氢二钾1.5g-2.5g，乙酸钠4.5g-5.5g，枸橼酸三铵1.5g-2.5g，硫酸镁0.1g-0.3g，硫酸锰0.03g-0.08g，吐温-80 0.5g-1.5g，葡萄糖15.0g-25.0g，琼脂20.0g-30.0g，复合氨基酸0.1g-1g，核苷酸0.1g-0.5g，碳酸钙5g-10g和无水乙醇100mL-200mL。
本发明的鉴别培养基能为发酵酒陈酿过程中产生的难培养的产酸菌提供适宜的培养环境，更有利于产酸微生物的繁殖生长，在同等程度下产酸菌的检测效率能够提高1-2倍。同时，本发明的鉴别培养基通过添加碳酸钙，能从腐败乳酸菌中分辨识别出产酸类的乳酸菌，排除其他类型乳酸菌，从而有利于提升后续检测结果的准确性。
作为本发明所述的鉴别培养基的优选实施方式，按重量计，每1000mL所述培养基包括以下组分：
所述发酵酒100mL-400mL，蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，枸橼酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801.0g，葡萄糖20.0g，琼脂25.0g，复合氨基酸0.1g-1g，核苷酸0.1g-0.5g，碳酸钙5g-10g和无水乙醇100mL-200mL。
作为本发明所述的鉴别培养基的优选实施方式，按重量计，每1000mL所述培养基包括以下组分：
所述发酵酒100mL-300mL，蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，枸橼酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801.0g，葡萄糖20.0g，琼脂25.0g，复合氨基酸0.5g-1g，核苷酸0.3g-0.5g，碳酸钙5g-8g和无水乙醇100mL-150mL。
作为本发明所述的鉴别培养基的优选实施方式，所述发酵酒为后熟期发酵酒。后熟期发酵酒即为陈酿过程中的发酵酒。
第二方面，本发明提供了一种所述鉴别培养基的制备方法，包括以下步骤：
取所述组分加水混合均匀，定容，煮沸溶解，调节pH至5.5-6.5，高压蒸汽灭菌，冷却，即成。
第三方面，本发明提供了一种发酵酒陈酿过程中产酸菌的检测方法，包括以下步骤：
S1：将所述发酵酒样品在无菌环境下，倍数稀释；
S2：取稀释样品与46℃-50℃的所述鉴别培养基混合，培养；
S3：待培养基上出现透明圈，计数所述透明光圈，计算所述发酵酒样品中产酸菌的数量。
本发明检测发酵酒陈酿过程中产酸菌的方法能够将陈酿过程发酵酒中产酸菌从腐败乳酸菌中分辨识别出来，并确认产酸菌的数量。同时，可快速识别培养的微生物是否为产酸菌。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，在步骤S2中，所述稀释样品与所述培养基的体积比为1：(20-25)。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，在步骤S2中，所述培养的条件为29℃-31℃厌氧培养。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，在步骤S2中，所述培养的时间为1-5天。
第四方面，本发明将所述鉴别培养基、所述检测方法在发酵酒陈酿过程中产酸菌的监控或检测中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
相较于传统乳酸菌培养基，本发明的鉴别培养基所提供的培养环境更有利于微生物繁殖生长，在同等程度下，产酸菌的检测效率能够提高1-2倍。为发酵酒陈化过程中产生的难培养的产酸菌提供适宜的培养环境。本发明能够在发酵酒后熟陈酿过程中及时准确地监控到后熟陈酿过程中的发酵酒的卫生质量情况，为酒体在风味、体态及指标的变化提供判断依据。
附图说明
图1为实施例1的检测方法中鉴别培养基中形成的透明光圈图之一；
图2为实施例1的检测方法中鉴别培养基中形成的透明光圈图之二。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述复合氨基酸购自万邦，所述核苷酸为NADH线粒体素，购自康峰生物。
实施例1：一种发酵酒陈酿过程中产酸菌的检测方法
该检测方法如下：
(1)产酸菌鉴别培养基的制备
取后熟期发酵酒D 100mL；蛋白胨10.0g；牛肉浸粉10.0g；酵母浸粉2.0g；磷酸氢二钾2.0g；乙酸钠5.0g；枸橼酸三铵(柠檬酸铵)2.0g；硫酸镁0.2g；硫酸锰0.05g；吐温-801.0g；葡萄糖20.0g；碳酸钙5.0g；琼脂25.0g；复合氨基酸0.5g；核苷酸0.5g；碳酸钙5g；无水乙醇100mL加蒸馏水溶解混合均匀定容至1000mL，分装于锥形瓶中，煮沸溶解，调节pH至6.0，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却备用。
(2)稀释待测样
在无菌条件下，将检样(后熟期发酵酒D)1mL添加9ml生理盐水，配成1:10的均匀稀释液，按上述操作依次做成10倍递增稀释液；
(3)接种培养
选择3个稀释度10-1、10-2、10-3接种培养，每个梯度做两平行，然后将20mL-25mL保温至46℃-50℃的鉴别培养基倾倒培养皿上，在于29℃-31℃厌氧培养3d。
结果如图1和2，及表1所示。
表1检测结果
通过数透明光圈的数量，来确定产酸菌。在图1和图2中，方框内菌落在鉴别培养基中形成的透明光圈，为产酸菌。
实施例2：一种发酵酒陈酿过程中产酸菌的检测方法
该检测方法如下：
(1)产酸菌鉴别培养基的制备
取后熟期发酵酒F 300mL；蛋白胨10.0g；牛肉浸粉10.0g；酵母浸粉2.0g；磷酸氢二钾2.0g；乙酸钠5.0g；枸橼酸三铵(柠檬酸铵)2.0g；硫酸镁0.2g；硫酸锰0.05g；吐温-801.0g；葡萄糖20.0g；琼脂25.0g；复合氨基酸1g；核苷酸0.3g；碳酸钙8g；无水乙醇150mL加蒸馏水溶解混合均匀定容至1000mL，分装于锥形瓶中，煮沸溶解，调节pH至6.0，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却备用。
(2)稀释待测样
在无菌条件下，将检样(后熟期发酵酒F)1ml添加9ml生理盐水，配成1:10的均匀稀释液，按上述操作依次做成10倍递增稀释液。
(3)接种培养
选择3个稀释度10-1、10-2、10-3接种培养，每个梯度做两平行，然后将20mL-25mL保温至46℃-50℃的鉴别培养基倾倒培养皿上，同步做同梯度的MES培养基做对照，在于29℃-31℃厌氧培养3d。
结果如表2所示。
表2检测结果
取两种培养基进行同一样品的检测，鉴别培养基对产酸菌的检测结果为4.3*102CFU/mL，常用乳酸菌培养基MRS对产酸菌的检测结果为2.8*102CFU/mL。可见，本发明可更好的模拟菌种生长环境以及相关营养物质更有利于发酵酒F产酸菌生长。
实施例3：一种发酵酒陈酿过程中产酸菌的检测方法
该检测方法如下：
(1)产酸菌鉴别培养基的制备
培养基1：取后熟期发酵酒G 250mL；蛋白胨10.0g；牛肉浸粉10.0g；酵母浸粉2.0g；磷酸氢二钾2.0g；乙酸钠5.0g；枸橼酸三铵(柠檬酸铵)2.0g；硫酸镁0.2g；硫酸锰0.05g；吐温-80 1.0g；葡萄糖20.0g；琼脂25.0g；复合氨基酸1g；核苷酸0.3g；碳酸钙8g；无水乙醇150mL加蒸馏水溶解混合均匀定容至1000mL，分装于锥形瓶中，煮沸溶解，调节pH至6.0，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却备用。
培养基2：蛋白胨10.0g；牛肉浸粉10.0g；酵母浸粉2.0g；磷酸氢二钾2.0g；乙酸钠5.0g；枸橼酸三铵(柠檬酸铵)2.0g；硫酸镁0.2g；硫酸锰0.05g；吐温-801.0g；葡萄糖20.0g；琼脂25.0g；复合氨基酸1g；核苷酸0.3g；碳酸钙8g；无水乙醇150mL加蒸馏水溶解混合均匀定容至1000mL，分装于锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却备用。
(2)稀释待测样
在无菌条件下，将检样(后熟期发酵酒G)1ml添加9ml生理盐水，配成1:10的均匀稀释液，按上述操作依次做成10倍递增稀释液。
(3)接种培养
选择3个稀释度10-1、10-2、10-3接种培养，每个梯度做两平行，然后将20mL-25mL保温至46℃-50℃的培养基1倾倒培养皿上，同步以同梯度的培养基2做对照，在于29℃-31℃厌氧培养3d。
结果如表3所示。
表3检测结果
取两种培养基进行同一样品的检测，培养基1对产酸菌的检测结果为2.3*103CFU/mL，不添加发酵酒浓缩液的培养基2对产酸菌的检测结果为1.3*103CFU/mL，说明在两种培养基上产酸菌均有生长，但添加有后熟期发酵酒G配制的培养基用于模拟菌种原有的生长环境更有利于发酵酒G中产酸菌的生长。
实施例4：一种发酵酒陈酿过程中产酸菌的检测方法
该检测方法如下：
(1)产酸菌鉴别培养基的制备
培养基1：取后熟期发酵酒H 300mL，蛋白胨10.0g；牛肉浸粉10.0g；酵母浸粉2.0g；磷酸氢二钾2.0g；乙酸钠5.0g；枸橼酸三铵(柠檬酸铵)2.0g；硫酸镁0.2g；硫酸锰0.05g；吐温-80 1.0g；葡萄糖20.0g；琼脂25.0g；复合氨基酸1g；核苷酸0.3g；碳酸钙8g；无水乙醇150mL加蒸馏水溶解混合均匀定容至1000mL，分装于锥形瓶中，煮沸溶解，调节pH至6.0，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却备用。
培养基2：取后熟期发酵酒H 300mL，蛋白胨10.0g；牛肉浸粉10.0g；酵母浸粉2.0g；磷酸氢二钾2.0g；乙酸钠5.0g；枸橼酸三铵(柠檬酸铵)2.0g；硫酸镁0.2g；硫酸锰0.05g；吐温-80 1.0g；葡萄糖20.0g；琼脂25.0g；复合氨基酸1g；核苷酸0.3g；碳酸钙8g加蒸馏水溶解混合均匀定容至1000mL，分装于锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却备用。
(2)稀释待测样
在无菌条件下，将检样(后熟期发酵酒H)1ml添加9ml生理盐水，配成1:10的均匀稀释液，按上述操作依次做成10倍递增稀释液。
(3)接种培养
选择3个稀释度10-1、10-2、10-3接种培养，每个梯度做两平行，然后将20mL-25mL保温至46℃-50℃的培养基1倾倒培养皿上，同步以同梯度的培养基2做对照，在于29℃-31℃厌氧培养3d。
结果如表4所示。
表4检测结果
取两种培养基进行同一样品的检测，培养基1对产酸菌的检测结果为5.5*103CFU/mL，不添加无水乙醇添加的培养基2对产酸菌的检测结果为2.5*103CFU/mL，说明在两种培养基上产酸菌均有生长，但添加有无水乙醇配制的培养基用于模拟菌种原有的生长环境更有利于发酵酒H中产酸菌的生长。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种发酵酒产酸菌的鉴别培养基，其特征在于，按重量计，每1000mL所述培养基包括以下组分：
所述发酵酒100mL-400mL，蛋白胨8.0g-12.0g，牛肉浸粉8.0g-12.0g，酵母浸粉1.5g-2.5g，磷酸氢二钾1.5g-2.5g，乙酸钠4.5g-5.5g，枸橼酸三铵1.5g-2.5g，硫酸镁0.1g-0.3g，硫酸锰0.03g-0.08g，吐温-80 0.5g-1.5g，葡萄糖15.0g-25.0g，琼脂20.0g-30.0g，复合氨基酸0.1g-1g，核苷酸0.1g-0.5g，碳酸钙5g-10g和无水乙醇100mL-200mL。
2.根据权利要求1所述的鉴别培养基，其特征在于，按重量计，每1000mL所述培养基包括以下组分：
所述发酵酒100mL-400mL，蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，枸橼酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801.0g，葡萄糖20.0g，琼脂25.0g，复合氨基酸0.1g-1g，核苷酸0.1g-0.5g，碳酸钙5g-10g和无水乙醇100mL-200mL。
3.根据权利要求2所述的鉴别培养基，其特征在于，按重量计，每1000mL所述培养基包括以下组分：
所述发酵酒100mL-300mL，蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，枸橼酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801.0g，葡萄糖20.0g，琼脂25.0g，复合氨基酸0.5g-1g，核苷酸0.3g-0.5g，碳酸钙5g-8g和无水乙醇100mL-150mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的鉴别培养基，其特征在于，所述发酵酒为后熟期发酵酒。
5.权利要求1～4任一项所述鉴别培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取所述组分加水混合均匀，定容，煮沸溶解，调节pH至5.5-6.5，高压蒸汽灭菌，冷却，即成。
6.一种发酵酒陈酿过程中产酸菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将所述发酵酒样品在无菌环境下，倍数稀释；
S2：取稀释样品与46℃-50℃的权利要求1～4任一项所述鉴别培养基混合，培养；
S3：待培养基上出现透明圈，计数所述透明光圈，计算所述发酵酒样品中产酸菌的数量。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述稀释样品与所述培养基的体积比为1：(20-25)。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述培养的条件为29℃-31℃厌氧培养。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述培养的时间为1-5天。
10.权利要求1～4任一项所述鉴别培养基、权利要求6～9任一项所述检测方法在发酵酒陈酿过程中产酸菌的监控或检测中的应用。
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