CN117660303A - 一种咖啡因在促进cmv启动子控制的外源基因表达的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因表达技术领域，公开了一种咖啡因在促进CMV启动子控制的外源基因表达的应用，本发明实验证明咖啡因具有增强CMV启动子控制的外源基因表达的作用。本发明按照标准的转染实验以及慢病毒和腺病毒感染细胞的操作步骤，将带有绿色荧光报告基因的质粒pTY‑CMV‑eGFP转染到生长状态良好的293T细胞，以及用包装好的带有红色荧光报告基因的Lenti‑CMV‑RFP慢病毒、以及带有绿色荧光报告基因Ad5‑CMV‑GFP腺病毒感染相应细胞，在转染或感染若干小时后换成不同浓度的咖啡因的培养基，观察荧光表达效率，收集细胞，利用荧光定量PCR对目的表达水平进行相对定量。结果表明，经咖啡因处理后CMV控制的报告基因荧光蛋白表达得到显著提高，而这种增强作用在转录水平用荧光定量PCR得到进一步证实。
Description
技术领域
本发明涉及基因表达技术领域，特别涉及一种咖啡因在促进CMV启动子控制的外源基因表达的应用。
背景技术
利用基因工程技术高水平表达各种外源蛋白质，无论在理论研究还是实际应用上都是十分重要的。因此，如何使外源基因在宿主细胞中高效表达，成为基因工程中的关键问题。应该指出，现在基因工程所涉及的受体细胞多种多样，从细菌到高等动植物细胞，乃至动、植物个体；而所涉及到的基因也是成千上万，各不相同，这种差别使得对特定基因的表达研究就有其特定的个性。影响外源基因高效表达的各种因素包括：1、外源基因的表达效率；2、表达质粒的拷贝数和稳定性；3、表达产物的稳定性等等。
随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发展,基因治疗已成为治疗感染性疾病、遗传疾病、神经系统疾病以及肿瘤的研究热点。基因治疗依赖于外源基因在受体细胞中高效、稳定的表达，而这在很大程度上取决基因治疗所采用的载体系统。基因治疗载体可分两大类：病毒性载体和非病毒性载体。由于传统非病毒学基因转移方法效率较低，目前在临床试验的基因治疗方案中，多采用病毒学方法进行基因转导。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,这些载体均各有优缺点，可以满足不同方面的应用。然而，外源基因在这些宿主病毒细胞中的表达依然低效。
因此，现有技术还有待于提高和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种咖啡因在促进CMV启动子控制的外源基因表达的应用，旨在解决外源基因在宿主病毒细胞中的表达依然低效的问题。
本发明的技术方案如下：
一种咖啡因在促进CMV启动子控制的外源基因表达的应用。
所述的应用，其中，所述咖啡因为从茶叶或咖啡果中提炼出来的生物碱，所述生物碱的化学式为C8H10N4O2，所述生物碱的化学名为1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮。
所述的应用，其中，包括步骤：
将带有绿色荧光报告基因的pTY-CMV-eGFP质粒转染至293T细胞中，得到转染后293T细胞；
将所述转染后293T细胞转移到含有咖啡因的血清全培养基中进行培养过夜，观察荧光表达效率，收集细胞，利用荧光定量PCR对外源基因表达水平进行相对定量。
所述的应用，其中，包括步骤：
将带有红色荧光报告基因的Lenti-CMV-RFP慢病毒感染目的细胞，得到慢病毒感染细胞；
将所述慢病毒感染细胞转移到含有咖啡因的培养液进行培养，在倒置荧光显微镜观察荧光；收集细胞，收集细胞，利用荧光定量PCR对外源基因表达水平进行相对定量。
所述的应用，其中，包括步骤：
将带有绿色荧光报告基因的Ad5-CMV-GFP腺病毒感染目的细胞，得到腺病毒感染细胞；
将所述腺病毒感染细胞转移到含有咖啡因的培养液进行培养，在倒置荧光显微镜观察荧光；收集细胞，收集细胞，利用荧光定量PCR对外源基因表达水平进行相对定量。
有益效果：本发明公开了咖啡因在促进CMV启动子控制的外源基因表达的应用，实验证明咖啡因具有增强CMV启动子控制的外源基因表达的作用。本发明按照标准的转染实验以及慢病毒和腺病毒感染细胞的操作步骤，将带有绿色荧光报告基因的质粒pTY-CMV-eGFP转染到生长状态良好的293T细胞，以及用包装好的带有红色荧光报告基因的Lenti-CMV-RFP慢病毒、以及带有绿色荧光报告基因Ad5-CMV-GFP腺病毒感染相应细胞，在转染或感染若干小时后换成不同浓度的咖啡因的培养基，观察荧光表达效率，收集细胞，利用荧光定量PCR对目的表达水平进行相对定量。结果表明，经咖啡因处理后CMV控制的报告基因荧光蛋白表达得到显著提高，而这种增强作用在转录水平用荧光定量PCR得到进一步证实。
附图说明
图1为质粒pTY-CMV-eGFP转染293T细胞荧光图，在图1中从左到右分别为加入0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因培养后所拍到的荧光图片。
图2为质粒pTY-CMV-eGFP转染293T细胞后提取细胞mRNA并作QPCR分析其中eGFP表达水平，在图2中横轴代表0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因,纵轴代表eGFP的表达水平(*代表p<0.05)。
图3为Lenti-CMV-RFP感染293T细胞荧光图，图3中从左到右分别为加入0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因后所拍到的荧光图片。
图4为Lenti-CMV-RFP感染293T细胞后提取细胞mRNA并作QPCR分析其中RFP表达水平，在图4中横轴代表0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因,纵轴代表RFP的表达水平(*代表p<0.05)。
图5为Lenti-CMV-RFP感染293T细胞后，收集细胞，用流式细胞仪检测RFP细胞与总细胞的比例，在图5中横轴代表0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因,纵轴代表RFP的表达水平(*代表p<0.05)。
图6为Lenti-EF1α-eGFP感染293T细胞荧光图，在图6中从左到右分别为加入0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因后所拍到的荧光图片。
图7为Lenti-EF1α-eGFP感染293T细胞后提取细胞mRNA并作QPCR分析其中eGFP表达水平，在图4中横轴代表0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因纵轴代表eGFP的表达水平。
图8为Ad5-CMV-GFP感染DU145细胞荧光图，在图8中从左到右分别为加入0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因后所拍到的荧光图片。
图9为Ad5-CMV-GFP感染膀胱癌细胞UMUC3细胞后提取细胞mRNA并作QPCR分析其中GFP表达水平，在图9中横轴代表0nM,2nM,4nM，8nM浓度的咖啡因，纵轴代表GFP的表达水平(**代表p<0.01)。
具体实施方式
本发明提供一种咖啡因在促进CMV启动子控制的外源基因表达的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的目的在于提供咖啡因在促进带有CMV启动子的外源基因表达的应用。所述咖啡因为从茶叶或咖啡果中提炼出来的生物碱，所述生物碱的化学式为C8H10N4O2，所述生物碱的化学名为1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮，分子量为194.19。
本发明的技术方案是按照标准的转染实验以及慢病毒和腺病毒转导细胞的操作步骤，将带有绿色荧光报告基因的外源质粒pTY-CMV-eGFP转染到生长状态良好的293T细胞，以及用包装好的带有红色荧光报告基因的Lenti-CMV-RFP慢病毒以及带有绿色荧光报告基因Ad5-CMV-GFP腺病毒感染相应细胞，在转染或感染若干小时后换成不同浓度的咖啡因的培养基，观察荧光表达效率，收集细胞，利用荧光定量PCR对目的蛋白表达水平进行相对定量。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的解释说明：
实施例所采用的材料与方法说明如下。
1.实验取材
细胞：293T细胞，UMUC3细胞由本实验室保存。
质粒：含eGFP(由CMV启动子控制其表达)的转移质粒pTY-CMV-eGFP由本实验室保存。
病毒：Lenti-CMV-RFP,Lenti-EF1α-eGFP以及Ad5-CMV-GFP由本实验室包装保存。
Caffeine(咖啡因)溶液：0.388g Caffeine加入50mLDMEM中配成40mM的caffeine溶液,4℃冰箱保存，使用时再稀释成相应浓度。
2.实施方法
293T细胞传代培养
293T常规培养于DMEM高糖完全培养基中，含10％胎牛血清(FBS)，0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，于37℃恒温、5％ CO2饱和湿度条件下培养，长至80％-90％汇合即传代。其中293T细胞代次超过20代后不再使用。转染前一天消化传代293T细胞，铺两块六孔板，待第二天细胞长满至90％左右可以进行转染。
实施例1
质粒转染细胞
铺板：用293T细胞作为对象，转染前一天以合适的细胞密度接种到24孔培养板，每个孔约1*10^5个细胞，孵箱培养过夜。当细胞长至80％～90％板底面积可用于转染。
转染前换液：转染前30min换液，换成300ul无血清培养基。
配液转染：溶液1：50ul OPTI-MEM+1.0ul lipofectamine 2000per well(温育5min)；
溶液2：50ul OPTI-MEM+0.5ug pTY-CMV-eGFP质粒per well。
将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在细胞培养孵箱中保温6h。
换液：6h后，更换含4mM咖啡因血清全培养基。细胞在细胞培养孵箱培养过夜，第二天观察荧光，收集细胞，利用荧光定量PCR对外源基因表达水平进行相对定量。
实施例2
慢病毒转导细胞
第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3～5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50％左右，每孔培养基体积为300μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70％左右。
第二天，准备带有红色荧光报告基因的Lenti-CMV-RFP慢病毒：取出病毒，使用台式离心机离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可)；感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中取出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验：
a、使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基；
b、吸去培养基的培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液)；
c、在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液；
d、混匀后放于细胞培养箱孵育过夜。
第三天，更换培养液：在17小时后将含有慢病毒的培养液更换成含有咖啡因的培养液。
第五天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率；收集细胞。
实施例3
腺病毒转导细胞
第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3～5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50％左右，每孔培养基体积为300μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70％左右。
第二天，准备带有绿色荧光报告基因的Ad5-CMV-GFP腺病毒：取出病毒，使用台式离心机离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可)；感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中取出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验：
a、使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基；
b、吸去培养基的培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液)；
c、在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液；
d、混匀后放于细胞培养箱孵育2小时后将含有腺病毒的培养液更换成含有咖啡因的培养液。
第四天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计腺病毒感染目的细胞的效率；收集细胞。
测试例1
细胞总RNA提取和定量
1采用Qigen RNeasy MiNi Kit抽提细胞内总RNA：
1)收集没加咖啡因的细胞和加了咖啡因的细胞，吹打分散均匀，离心用转速300Xg5min，用移液器小心吸掉上清，注意吸干净。
2)加入Buffer RLT裂解细胞，轻弹EP管底，使细胞块变松散。加入350μl BufferRLT，涡旋或吹打混合均匀，无细胞碎片可见。均质化裂解物。
3)加入等体积的70％乙醇至上述均质化产物中，吹打混匀，不要离心。注意：均质化过程中裂解产物体积可能小于350μl，先用枪头吸量体积；从某些细胞中纯化RNA时，加入乙醇后可能看到沉淀。这不影响操作。
4)将700μl上述均质化产物(包括可能含有的沉淀)加入到RNeasy Spin column(置于2ml收集管)中，轻轻地关上盖子，≧10000rpm，15s。弃掉离下液体(如果超过700μl，用同一柱子分几次离心，每次离心后弃液体)。
5)加入700μl Buffer RW1到RNeasy Spin Column。轻轻盖上盖子，≧10000rpm，15s洗膜，弃掉滤液。注意：离心后，小心地取出RNeasy Spin Column从收集管中，使柱子不要接触到滤液，确保收集管内的液体清空。
6)加入500μl Buffer RPE到RNeasy spin column中，轻轻盖上盖子，≧10000rpm，15s洗膜，弃掉滤液。注意：Buffer RPE是浓缩液，确保RPE使用之前已按要求加入相应量的乙醇。
7)加入加入500μl Buffer RPE到RNeasy spin column中，轻轻盖上盖子，≧10000rpm，离心2min，以清洗滤膜。长时间的离心能干燥柱子滤膜，确保洗脱RNA时无乙醇。离心后，小心地取出柱子(从收集管)中，柱子不要接触到滤液。
8)将柱子重新置于一个新的2ml收集管中，弃掉旧的收集管。≧10000rpm，离心1min。
9)将柱子置于一个新的1.5ml EP管中，加入50μl RNase-free water至膜上。盖上盖子，≧10000rpm，离心1min，以洗脱RNA。
10)重复9步，重新洗脱柱子。-80℃冻存RNA。
测试例2
RNA逆转录成cDNA：
使用Takara公司的PrimeScript RT regeant对提取的细胞总RNA进行逆转录。
1)RT反应体系如下(反应液在冰上配置)
2)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。
37℃15min，85℃5sec，4℃hold。
测试例3
对cDNA产物用SYBR Real Time PCR法进行相对定量：
1)在Stratagene Mx3005P荧光定量PCR仪上进行QPCR
①反应条件如下：
注：每个样品做3个重复。
②将上述反应体系混合均匀后放入荧光定量PCR仪中进行反应。
反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火30s，40个循环进行扩增。在60℃延伸的步骤对荧光信号进行采集。
2)Real-time PCR检测在细胞内RNA的表达
取各处理组样品10ng总RNA的反转录产物为模板，按照PrimeScript RT regeant使用所述步骤分别配置相关基因和内参基因GAPDH的荧光定量PCR反应体系、进行扩增反应。
在相对定量分析中，将同一样本中目的基因的Ct值与内参基因的Ct值相减，所得出的ΔCt为目的基因相对于内参基因的表达强度，即ΔCt＝目的基因Ct－内参基因Ct。以GAPDH作为内参基因，分析相关mRNA表达水平。该实验重复三次并取其均值。
测试结果：
图1为质粒pTY-CMV-eGFP转染293T细胞荧光图，在图1中从左到右分别为加入0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因培养后所拍到的荧光图片。从图1中可以看出，转染慢病毒载体pTY-CMV-eGFP的293T细胞可观察到典型的绿色荧光，未感染的细胞无荧光，观察可见荧光强度随加入的caffeine浓度增加而加强。
图2为质粒pTY-CMV-eGFP转染293T细胞后提取细胞mRNA并作QPCR分析其中eGFP表达水平，在图2中横轴代表0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因,纵轴代表eGFP的表达水平(*代表p<0.05)。图2是提取细胞mRNA后，根据QPCR结果制表并进行统计学分析，从图2可以看出转染pTY-CMV-eGFP的293T细胞的eGFP表达水平随加入的caffeine浓度增加而提升，数据经统计学分析各组间具有显著差异。
图3为Lenti-CMV-RFP感染293T细胞荧光图，图3中从左到右分别为加入0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因后所拍到的荧光图片。从图3可以看出，慢病毒Lenti-CMV-RFP的293T细胞可观察到红色荧光，未感染细胞无荧光，观察可见荧感染光强度随加入的caffeine浓度增加而加强。
图4为Lenti-CMV-RFP感染293T细胞后提取细胞mRNA并作QPCR分析其中RFP表达水平，在图4中横轴代表0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因,纵轴代表RFP的表达水平(*代表p<0.05)。图4是提取细胞mRNA后，根据QPCR结果制表并进行统计学分析，从图4可以看出感染慢病毒Lenti-CMV-RFP的293T细胞的RFP表达水平随加入的caffeine浓度增加而提升，数据经统计学分析各组间具有显著差异。
图5为Lenti-CMV-RFP感染293T细胞后，收集细胞，用流式细胞仪检测RFP细胞与总细胞的比例，在图5中横轴代表0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因,纵轴代表RFP的表达水平(*代表p<0.05)。从图5可以看出，随加入的caffeine浓度增加RFP细胞在总细胞的比例中提高，数据经统计学分析各组间具有显著差异。
图6为Lenti-EF1α-eGFP感染293T细胞荧光图，在图6中从左到右分别为加入0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因后所拍到的荧光图片。感染慢病毒Lenti-EF1α-eGFP的293T细胞可观察到典型的绿色荧光，未感染的细胞无荧光，从图6可以看出，各组荧光强度相近。
图7为Lenti-EF1α-eGFP感染293T细胞后提取细胞mRNA并作QPCR分析其中eGFP表达水平，在图4中横轴代表0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因纵轴代表eGFP的表达水平。图7是提取细胞mRNA后，根据QPCR结果制表并进行统计学分析，可得感染慢病毒Lenti-EF1α-eGFP的293T细胞的eGFP表达水平随加入的caffeine浓度增加而提升，数据经统计学分析各组间无显著差异。
图8为Ad5-CMV-GFP感染DU145细胞荧光图，在图8中从左到右分别为加入0nM,2nM,4nM浓度的咖啡因后所拍到的荧光图片。从图8可以看出，腺病毒Ad5-CMV-GFP感染DU145细胞可观察到典型的绿色荧光，未感染的细胞无荧光，观察可见荧光强度随加入的caffeine浓度增加而加强。
图9为Ad5-CMV-GFP感染膀胱癌细胞UMUC3细胞后提取细胞mRNA并作QPCR分析其中GFP表达水平，在图9中横轴代表0nM,2nM,4nM，8nM浓度的咖啡因，纵轴代表GFP的表达水平(**代表p<0.01)。图9是提取细胞mRNA后根据QPCR结果制表并进行统计学分析，可得Ad5-CMV-GFP感染膀胱癌细胞UMUC3细胞的GFP表达水平随加入的caffeine浓度增加而提升，数据经统计学分析各组间具有显著差异。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种咖啡因在促进CMV启动子控制的外源基因表达的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述咖啡因为从茶叶或咖啡果中提炼出来的生物碱，所述生物碱的化学式为C8H10N4O2，所述生物碱的化学名为1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括步骤：
将带有绿色荧光报告基因的pTY-CMV-eGFP质粒转染至293T细胞中，得到转染后293T细胞；
将所述转染后293T细胞转移到含有咖啡因的血清全培养基中进行培养过夜，观察荧光表达效率，收集细胞，利用荧光定量PCR对外源基因表达水平进行相对定量。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括步骤：
将带有红色荧光报告基因的Lenti-CMV-RFP慢病毒感染目的细胞，得到慢病毒感染细胞；
将所述慢病毒感染细胞转移到含有咖啡因的培养液进行培养，在倒置荧光显微镜观察荧光；收集细胞，收集细胞，利用荧光定量PCR对外源基因表达水平进行相对定量。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括步骤：
将带有绿色荧光报告基因Ad5-CMV-GFP腺病毒感染目的细胞，得到腺病毒感染细胞；
将所述腺病毒感染细胞转移到含有咖啡因的培养液进行培养，在倒置荧光显微镜观察荧光；收集细胞，收集细胞，利用荧光定量PCR对外源基因表达水平进行相对定量。
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2023
- 2023-12-04 CN CN202311649694.7A patent/CN117660303A/zh active Pending
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